CN114404616A - 一种itga4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用 - Google Patents
一种itga4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114404616A CN114404616A CN202111573516.1A CN202111573516A CN114404616A CN 114404616 A CN114404616 A CN 114404616A CN 202111573516 A CN202111573516 A CN 202111573516A CN 114404616 A CN114404616 A CN 114404616A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plko
- cells
- itga4
- leukemia
- puro
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 title claims abstract description 64
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 63
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 17
- 101100397497 Homo sapiens ITGA4 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 12
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 claims description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 claims description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 claims description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 claims description 2
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 abstract description 47
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 abstract description 46
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 abstract description 42
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 38
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 abstract description 32
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 11
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 131
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 27
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 19
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 14
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 14
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 13
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 13
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 12
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 9
- 208000036676 acute undifferentiated leukemia Diseases 0.000 description 9
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 9
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 2
- 101000716729 Homo sapiens Kit ligand Proteins 0.000 description 2
- 101000799461 Homo sapiens Thrombopoietin Proteins 0.000 description 2
- 101000694103 Homo sapiens Thyroid peroxidase Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 208000032852 chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N framycetin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O2)N)O[C@@H]1CO PGBHMTALBVVCIT-VCIWKGPPSA-N 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 2
- 102000055151 human KITLG Human genes 0.000 description 2
- 102000053400 human TPO Human genes 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229940053050 neomycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108010093960 2-((1-(3,5-dichlorobenzenesulfonyl)pyrrolidine-2-carbonyl)amino)-4-(4-methyl-2-(methyl-(2-(4-(3-o-tolylureido)phenyl)acetyl)amino)pentanoylamino)butyric acid Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000004736 B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010839 B-cell chronic lymphocytic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000932480 Homo sapiens Fms-related tyrosine kinase 3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010041012 Integrin alpha4 Proteins 0.000 description 1
- 102000012355 Integrin beta1 Human genes 0.000 description 1
- 108010022222 Integrin beta1 Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- 208000031422 Lymphocytic Chronic B-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000004880 explosion Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 108700014844 flt3 ligand Proteins 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000005338 frosted glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 210000003692 ilium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010832 independent-sample T-test Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000011368 intensive chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000003914 myeloid leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 206010036807 progressive multifocal leukoencephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供一种ITGA4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明发现ITGA4是难治或复发白血病的潜在治疗靶点，因此选用了一种抑制剂包括核酸序列为SEQ ID NO:1所述的shRNA和/或那他珠单克隆抗体。并将该抑制剂运用在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用。本发明明确减低ITGA4表达或活性，白血病细胞的增殖受到抑制；显著延长白血病小鼠的生存；减弱白血病细胞的归巢。
Description
技术领域
本发明生物医药技术领域，尤其是指一种ITGA4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用。
背景技术
急性髓系白血病(AML)是骨髓性白细胞异常增殖的血液肿瘤，是成年人中最常见的血液***恶性肿瘤之一，致死率占各种肿瘤的前十位。约10-40％年轻AML患者和40-60％老年患者诱导化疗无法获得完全缓解，强化化疗后，60岁以下的AML患者10年无病生存率为16％，60岁以上患者10年无病生存率仅为2％。近50％的患者在诱导化疗后复发。复发或难治性AML患者的预后较差，3年总生存期(OS)不超过10％。
近年来，随着诊疗手段的发展，造血干细胞移植、靶向药物和细胞免疫治疗改善了部分患者的预后。但是难治或复发患者仍然缺乏有效的治疗手段。难治或复发患者再次进行加强化疗的效果不佳，挽救化疗完全缓解(CR)率低于50％。该类患者现有的治疗靶点覆盖率低，靶向治疗的可能性低于40％。造血干细胞移植对于难治患者的预后提升有限，难治患者移植后5年的生存率低于20％。而移植后复发的AML患者生存更差，5年生存率不超过10％。另外，AML的CAR-T治疗存在着缺乏有效靶点，治疗效果不佳、脱靶和复发等问题。因此，寻找难治或复发AML的治疗靶点是改善此类患者生存的迫切需求。
白血病细胞具有强大的的归巢和迁移能力，它们能迅速归巢到骨髓微环境中，扰乱正常造血干细胞的微环境结构和功能，建立异常的骨髓微环境(白血病微环境)并“劫持”正常的造血干细胞使其“受困”于白血病微环境。白血病微环境的建立进一步促使白血病干细胞大量增殖，加速白血病的进展。整合素α4(ITGA4基因)与整合素β1组成的二聚体VLA-4在白血病干细胞和白血病细胞中高表达，其介导白血病细胞与细胞外基质或间充质细胞的粘附。VLA-4在白血病及其白血病干细胞(LSCs)中高表达，在AML、慢性淋巴细胞白血病和急性B淋巴细胞白血病(ALL)中，VLA4的高表达与不良预后密切相关。
由于VLA-4-VCAM1介导炎症反应中免疫细胞的迁移，VLA-4主要做为治疗自身免疫性疾病的靶点。2004年VLA-4的阻断性抗体那他珠单克隆抗体(Natalizumab，NZM)被FDA批准用于治疗多发性硬化症和克罗恩病，然而，由于该药的副作用导致的罕见“进行性多灶性白质脑病”而撤市。2006年在疾病治疗的迫切需求下重新上市。VLA-4的小分子抑制剂BIO5192被报道抑制VLA-4介导的造血干细胞归巢，动员造血干细胞至外周血中。由于VLA-4在白血病细胞中高表达且与预后密切相关，多个研究表明减低VLA-4的表达或抑制VLA-4与VCAM1的结合能显著增加化疗耐受的ALL细胞、CLL细胞和AML细胞对化疗药物的敏感性。
然而，VLA-4在难治或复发白血病中的作用尚未有报道，VLA-4能否做为治疗难治或复发AML的靶点尚不明确。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种ITGA4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用。
一种ITGA4基因抑制剂，所述抑制剂包括核酸序列为SEQ ID NO:1所述的shRNA和/或那他珠单克隆抗体。
一种重组载体，包含能够转录所述shRNA的序列，将所述序列嵌入载体。
在本发明的一个实施例中，序列SEQ ID NO:1为GCTCCGTGTTATCAAGATTATCTCGAGATAATCTTGATAACACGGAGCTTTTTG。
在本发明的一个实施例中，所述载体为慢病毒载体。
在本发明的一个实施例中，所述慢病毒载体选自pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。
一种慢病毒，由所述重组载体经过细胞包装后得到。
一种药物组合物，所述药物组合物包括所述ITGA4基因抑制剂、所述重组载体或所述慢病毒。
在本发明的一个实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
在本发明的一个实施例中，所述载体选自崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
一种试剂盒，所述试剂盒包括所述ITGA4基因抑制剂、所述重组载体、所述慢病毒或所述的药物组合物。
本发明还提供所述ITGA4基因抑制剂、所述重组载体、所述慢病毒、所述的药物组合物或所述试剂盒在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用。
本发明提供一个难治或复发急性髓系白血病治疗的潜在靶点及其在抑制难治或复发白血病细胞增殖和迁移粘附中的应用。
具体的，基因敲低VLA-4α4亚基(ITGA4)的表达或用NZM抑制其与VCAM-1的结合，用于抑制AML细胞株MV4-11的克隆集落形成，抑制AML细胞的增殖，阻滞AML细胞周期至G1期。
具体地，敲低ITGA4的表达或NZM处理用于抑制AML细胞的迁移和粘附能力。
具体地，敲低ITGA4的表达用于延长MV4-11细胞构建的AML小鼠的生存，抑制AML细胞的疾病重建，抑制AML细胞在肝脏和脾脏的浸润。
具体地，敲低ITGA4的表达用于抑制AML细胞向骨髓和脾脏造血组织的归巢。
具体地，NZM用于抑制难治和复发患者白血病细胞及白血病干细胞的克隆集落形成、迁移和粘附能力。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供一个难治或复发急性髓系白血病治疗的潜在靶点及其在抑制难治或复发白血病细胞增殖和迁移粘附中的应用。本发明在AML细胞株MV4-11，白血病细胞动物模型和难治或复发AML患者的白血病细胞层面，通过shRNA干扰ITGA4基因的表达或用NZM抑制ITGA4的活性，利用增殖、迁移、粘附和归巢实验明确ITGA4是难治或复发白血病的潜在治疗靶点。
干扰ITGA4的表达或NZM抑制其活性，显著抑制AML细胞的增殖，减弱其克隆形成能力，降低AML细胞的归巢，显著延长AML小鼠的生存，延缓白血病的进展。尤其是在缺乏治疗手段的难治或复发AML细胞中，ITGA4活性的抑制也显著降低难治或复发患者AML细胞的增殖和迁移粘附能力。ITGA4是难治或复发白血病的潜在治疗靶点。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明敲减ITGA4表达或那他株单抗处理的MV4-11细胞的克隆集落数量。与未敲除组或IgG处理的对照组相比，敲减ITGA4表达或那他株单抗处理组克隆集落数量显著减少，其中#表示P≥0.05，*表示P<0.05，***表示P<0.001。
图2是本发明敲减ITGA4表达或那他株单抗处理MV4-11细胞，MV4-11细胞培养7天的动态增殖曲线。与未敲除组或IgG处理的对照组相比，敲减ITGA4表达或那他株单抗处理组细胞增长缓慢，增殖受到抑制，其中*表示P<0.05。
图3是本发明敲减ITGA4表达或那他株单抗处理MV4-11细胞，与未敲除组或IgG处理的对照组相比，敲减ITGA4表达或那他株单抗处理组G1期细胞比例显著增加，其中#表示P≥0.05，*表示P<0.05。
图4是本发明敲减ITGA4表达或那他株单抗处理MV4-11细胞，与未敲除组或IgG处理的对照组相比，敲减ITGA4表达或那他株单抗处理组发生迁移的细胞比例减低。#表示P≥0.05，*表示P<0.05，***表示P<0.001。
图5是本发明敲减ITGA4表达或那他株单抗处理MV4-11细胞，与未敲除组或IgG处理的对照组相比，敲减ITGA4表达或那他株单抗处理组发生粘附的细胞比例减低。#表示P≥0.05，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
图6是本发明敲减ITGA4表达的MV4-11细胞移植到免疫缺陷小鼠，与未敲除组对照相比，敲减ITGA4表达组小鼠的生存时间延长。
图7是本发明敲减ITGA4表达的MV4-11细胞移植到免疫缺陷小鼠，与未敲除组对照相比，敲减ITGA4表达组小鼠移植后15天的骨髓、肝脏和脾脏中白血病细胞重建减低。*表示P<0.05，***表示P<0.001。
图8是本发明敲减ITGA4表达的MV4-11细胞移植到免疫缺陷小鼠，与未敲除组对照相比，敲减ITGA4表达组小鼠移植后15天的骨髓、肝脏和脾脏的白血病细胞浸润减低。
图9是本发明敲减ITGA4表达的MV4-11细胞移植到免疫缺陷小鼠，与未敲除组对照相比，敲减ITGA4表达组小鼠移植后16小时的骨髓和脾脏中归巢的白血病细胞比例减低。**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图10是本发明那他株单抗处理难治或复发AML细胞，与IgG处理的对照组相比，那他株单抗处理组克隆集落数量显著减少。**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图11是本发明那他株单抗处理难治或复发AML细胞，与IgG处理的对照组相比，那他株单抗处理组发生迁移的细胞比例减低。**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图12是本发明那他株单抗处理难治或复发AML细胞，与IgG处理的对照组相比，那他株单抗处理组粘附的细胞比例减低。**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图13是本发明那他株单抗处理难治或复发AML的白血病干细胞，与IgG处理的对照组相比，那他株单抗处理组克隆集落数量显著减少。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图14是本发明那他株单抗处理难治或复发AML的白血病干细胞，与IgG处理的对照组相比，那他株单抗处理组发生迁移的细胞比例减低。#表示P≥0.05，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图15是本发明那他株单抗处理难治或复发AML的白血病干细胞，与IgG处理的对照组相比，那他株单抗处理组粘附的细胞比例减低。*表示P<0.05，***表示P<0.001。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例
一：材料和方法
(一)、细胞株
人AML细胞株MV4-11培养于含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基中，37℃、5％CO2饱和湿度细胞培养箱中培养，(0.4-1)×106/mL培养，每2天传代，取对数生长期细胞用于实验。
(二)、临床标本
收集2018年1月到2020年7月在苏州大学附属第一医院诊治的AML患者骨髓单个核细胞标本，并收集了AML患者完整的临床资料。本研究已被苏州大学附属第一医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。
AML患者的原始细胞和白血病干细胞用含1％AA，20ng/mL重组人TPO，20ng/mL重组人SCF和20ng/mL重组人FLT3-Ligand的StemSpanTMSFEM按5×106/mL的密度来培养。
(三)、实验动物
健康SPF(无特定病原体)级NOD/SCID雌性小鼠，周龄为6～8周，体重约20～22g，购自上海斯莱克实验动物中心。小鼠饲料和垫料均经过辐照灭菌，饮用灭菌酸化水，移植后饮用水加入硫酸新霉素。小鼠饲养于苏州大学实验动物中心SPF级环境中。所有动物实验均得到苏州大学伦理委员会的批准。
(四)、主要试剂及耗材
NZM(natalizumab，那他珠单抗)：英国absolute antibody公司
IgG抗体：美国Merck Millipore公司
胎牛血清(Fatal bovine serum，FBS)：以色列Biological Industries公司
RPMI(Roswell ParkMemorial Institute，洛斯维·帕克纪念研究所)-1640培养基：美国Thermo Hyclone公司
IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium，Iscove的改良Dulbecco培养基)：美国Thermo Hyclone公司
青霉素：上海生物工程有限公司
链霉素：上海生物工程有限公司
StemSpanTMSFEM(Serum-free medium for culture and expansion ofhematopoietic cells，用于培养和扩增造血细胞的无血清培养基)：美国StemCellTechnologies公司
Recombinant Human SCF(Stem cell factor，干细胞因子)：美国PeproTech公司
Recombinant HumanFLT3-ligand(Fms-like tyrosine kinase 3ligand，Fms样酪氨酸激酶3配体)：美国PeproTech公司
Recombinant Human TPO(Thrombopoietin，血小板生成素)：美国PeproTech公司
MethoCultTMH4100：加拿大STEMCELL Technologies
MethoCultTMH4435：加拿大STEMCELLTechnologies
fibrogen：美国sigma公司
Transwell：美国Corning公司
瑞氏姬姆萨染液：中国Solarbio公司
二、实验方法
1、药物处理细胞
MV4-11细胞或原代白血病细胞按10μg/mL的浓度加入那他株单抗，对照组加相同浓度IgG作为对照，处理1-3天后进行体外实验。
2、细胞增殖
将细胞接种于96孔板，每组3到5副孔，20000细胞/孔，100μL/孔。37℃，5％CO2培养箱中培养，每天对细胞进行计数，连续检测细胞生长7天的增殖水平，每天同一时间检测，第三天起给每孔细胞换液。
3、细胞周期
将细胞按5×105/mL培养，在生长处于对数期时检测细胞周期。将细胞500g5min离心，弃去上清，用PBS洗一遍，加200μL Cytofix/CytopermBuffer固定破膜，冰上30min，加1mL 1×BD Perm/WashBuffer终止，500g 5min离心，弃去上清，加200μL含1％BSA的PBS和2μL Ki67-APC抗体，冰上30min，加3mL含1％BSA的PBS终止，500g 5min离心，弃去上清，加200μL含1％BSA的PBS和2μL DAPI，室温20min，加3mL含1％BSA的PBS终止，500g 5min离心，弃去上清，加500μL含1％BSA的PBS用流式细胞仪检测细胞周期，上样速度低于在100/s。
4、克隆形成实验
准备MethoCultH4100半固体培养基，在40mL原液中加入10mL FBS和1mL双抗，加入IMDM培养基补足100mL，剧烈震荡，静置至气泡消失后分装为3mL一管。将细胞计数，取600个重悬于300μl完全培养基中，缓慢滴加至H4100半固体培养基上，剧烈震荡，静置至气泡消失后，用注射器将混合液转移至3个35mm培养皿中，200细胞/皿。将3皿放入15cm细胞培养皿中，另放3个水盘保持培养基湿度。在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养7到10天后，在显微镜下计数长出的克隆集落数目。原代细胞用H4435半固体培养基，在24孔板中250μL/孔，一般种2000CD34+群体/孔。将周围的孔补水保持培养基湿度。在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养10到14天后，在显微镜下计数长出的克隆集落数目。
5、细胞迁移实验
准备Transwellplates，6.5mm直径，8μm的孔径，将Transwell小室的的分隔用20g/mL的bovine fibronectin(FN)(PBS配制)于4℃孵育过夜。第二天用含0.5％BSA的IMDM培养基洗涤3次。3×105AML细胞重悬于100μL含0.5％BSA的IMDM培养基中，加入到上室内。下室添加600μL的含0.5％BSA的IMDM培养基。每组设3个复孔。另准备3×105的AML细胞用600μL的含0.5％BSA的IMDM重悬，不放上室，作为input control。将Transwellplates于37℃，5％CO2培养12h。迁移到下室的细胞AML和input control细胞分别收集到流式管中，分别加入100μL带GFP的MV4-11 NSC细胞1×105，流式检测GFP-细胞所占百分比，以input control的百分比为100％，计算AML细胞的迁移比例。
6、粘附实验
用10μg/mL的FN预铺96孔板，70μL/孔，4℃过夜，PBS洗涤3遍，再用1％BSA于37℃封闭1h，PBS洗3遍。含0.5％BSA的IMDM重悬细胞，调整浓度为5×105/mL，分别接种于96孔板中，每孔50000个细胞，每组设3个复孔，37℃，1h后，PBS轻柔洗去未粘附的细胞。按照每孔加入100μL甲醇，固定15min，每孔加入50μL瑞氏姬姆萨染液A液，染色30s，每孔加入50μL瑞氏姬姆萨染液B液，染色5min，用培养基洗去染色液，倒置显微镜下每孔随机取10个视野，拍照并计数粘附细胞数量，统计结果。
7、小鼠移植
购买6～8周NOD/SCID小鼠，饲养在SPF级动物房中2周稳定状态。取准备移植的NOD/SCID小鼠在X射线辐照仪中进行半致死量辐照2.0Gy，辐照后按10μg/g小鼠的剂量进行腹腔注射anti-CD122抗体，清除掉固有免疫(NS122免疫缺陷小鼠，构建方法的来源：DuanCW,Shi J,Chen J,Wang B,Yu YH,Qin X,et al.Leukemia propagating cells rebuildan evolving niche in response to therapy.Cancer Cell2014,25(6):778-793)。在24小时内，尾静脉移植分选的GFP+白血病细胞。将细胞重悬于含1％BSA的PBS中，按每只小鼠100μL，1×105细胞的量，归巢实验按每只小鼠150μL，2×106细胞的量重悬。用1mL注射器或胰岛素注射器将细胞沿尾静脉注射进小鼠体内，给小鼠打上耳标做标记。将小鼠放回SPF环境，连喂两周含1.1mg/mL硫酸新霉素的灭菌酸化水。每天观测小鼠的生存状态，并记录小鼠的体重。当小鼠明显体重下降，出现弓背、炸毛、行动迟缓等状态时表示小鼠发病。
8、小鼠骨髓细胞的获取
将小鼠用颈椎脱臼的方法处死，喷75％酒精，将小鼠固定在操作台上。剪开皮肤、筋膜，剪下股骨、胫骨、髂骨，剔除肌肉，将骨组织放入倒有预冷的含1％BSA的IMDM的研钵中，研碎骨头将骨髓细胞释放出来。将悬液通过70μm滤网过滤，得到骨髓细胞悬液置于冰上。将细胞悬液按600g 5min离心，弃上清，加入5mL红细胞裂解液ACK，室温静置10min，加入10mLPBS终止裂解。600g 5min离心，弃去上清，用含1％BSA的IMDM重悬，置于冰上备用。
9、小鼠肝、脾细胞的获取
将小鼠用颈椎脱臼的方法处死并喷75％酒精后，剪开皮肤和腹膜，剪下肝和脾的相关韧带，取下肝、脾分别放入预冷的含1％BSA的IMDM中，用磨砂玻片轻柔研磨，将悬液通过70μm滤网过滤，得到肝、脾细胞悬液置于冰上。将细胞悬液按600g 5min离心，弃上清，加入5mL红细胞裂解液ACK，室温静置10min，加入10mL PBS终止裂解。600g 5min离心，弃去上清，用含1％BSA和2mM EDTA的IMDM重悬，置于冰上备用。
10、流式检测小鼠重建
取小鼠骨髓、肝、脾细胞50～100μL，用含1％BSA的PBS重悬于200μL，按1:100加入CD45-APC抗体，4℃避光孵育30min，加入3mLPBS终止，600g5min离心，弃去上清，200μL PBS重悬后上NovoCyte流式细胞仪检测CD45+GFP+细胞群体。
11、质粒扩增
质粒由金唯智公司合成，将ITGA4的小干扰RNA(sh-ITGA4)和无干扰寡核苷酸序列(NSC)分别***plko.1-EGFP慢病毒载体中。
质粒转化：配制含100μg/μL氨苄青霉素的LB培养基，含100μg/μL氨苄青霉素的固体培养板。将感受态冰上融化，取10μL感受态，加入1μL质粒(100ng/μL)。冰上静置30min后，热激42℃90s，置于冰上2～3min。加入500μL含100μg/μL氨苄的LB培养基，取250μL混合液加至含氨苄青霉素的LB固体培养板上，用灭菌的涂布棒或滚珠涂布均匀。待菌液吸收后，培养板倒置于37℃培养12到16小时。
培养板长处菌落后，挑取单克隆菌落，在3mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中培养，在摇床中37℃250rpm摇6～8h，转入200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在摇床中37℃250rpm摇12～16h。
质粒抽提：将菌液在高速离心机中按8000g，10min，4℃高速离心，弃去上清，PBS洗一遍，离心弃去上清。用MN质粒抽提试剂盒，将细菌沉淀用8mL含有RNase的重悬液RES-EF重悬，轻柔加入8mL碱裂解液LYS，缓慢颠倒5到8次，不能超过5min。加入8mL酸终止液NEU，轻柔颠倒至指示颜色消失。冰上静置5min。用15mL盐平衡液EQU浸润内毒素过滤柱中的滤纸，将裂解产物摇至均质状倒入滤纸中央，过滤柱不再滴时用5mLFIL-EF洗滤纸。滴完时弃去滤纸，在内毒素过滤柱中加35mL ENDO-EF。滴完后，加15mLWASH-EF。滴完后，加5mL预热至65℃的ELU-EF，用干净离心管收集滤液。加3.5mL异丙醇，颠倒混匀，15000g 40min4℃高速离心。弃去上清，加2mL 70％EtOH，15000g 10min4℃离心。吸净上清，200μL H2O-EF重悬沉淀，Nanodrop测DNA浓度。质粒可-20℃储存。
12、慢病毒包装，浓缩，测定滴度，感染细胞
准备293T细胞，传代后24小时，细胞生长至融合度约60％～80％时进行转染。对于1皿10cm细胞培养皿的细胞，按以下体系配质粒-氯化钙混合液：
混匀后，在液面上方轻柔滴入2×HBSS 500μL，静置30min。将1mL混合液均匀轻柔滴加至293T液面上，“十”字形上下左右摇匀培养皿5到10次，放入37℃，5％CO2培养箱中。6小时后，将293T吸去8mL培养基，加入预热至37℃的新鲜完全培养基。48小时后，荧光显微镜下观察GFP荧光，收取产出病毒的上清，补加新鲜的完全培养基。继续培养至72小时，收取含病毒的培养基。将收取的病毒液用0.45μm的滤头过滤。
将病毒上清用超速离心机按25000rpm，1h 30min，4℃离心，弃尽上清，用含1％BSA的PBS按1:500重悬病毒沉淀，浓缩的病毒可以储存于负80度，但避免反复冻融。
将293T细胞传代至6孔板，24小时后进行病毒滴度测定。取浓缩的病毒1.3μL，用完全培养基梯度稀释至1000倍，104倍，105倍和106倍4组。将6孔板的293T细胞取其中一孔细胞计数，其余孔细胞各弃去1mL培养基，加入1mL稀释后的病毒液，放入培养箱中。48小时后流式细胞仪检测各孔细胞的GFP阳性率。选择百分比在1％到10％的组来计算病毒滴度：病毒滴度＝GFP阳性率×稀释倍数×感染前细胞数。
将白血病细胞按5×105/mL的浓度重悬于完全培养基，按MOI＝50计算病毒浓缩液需要量，即细胞数×MOI/病毒滴度。加入病毒浓缩液后吹打混匀，37℃，5％CO2培养箱中培养。24小时后将培养基换位新鲜完全培养基，继续培养。72小时GFP蛋白完全表达后分选细胞。
13、流式细胞分选
将感染3天后的细胞离心1000rpm 5min，弃去上清，PBS洗一次，用含1％BSA的PBS重悬，用流式分选仪分选GFP+细胞群体，接收管中加入200μL含1％BSA的PBS。分选出来的细胞用2％anti-anti抗生素处理37℃30min，离心1000rpm 5min，弃去上清，用含10％FBS和1％青霉素-链霉素的1640培养基重悬于5×105/mL培养。
14、统计学分析：
对照组与实验组的比较用独立样本t检验，移植小鼠的生存用Kaplan–Meier分析方法，log-rank检验进行比较。所有实验重复三次以上，结果用均值±标准差表示。用SPSS软件进行统计分析，Graphpad prism软件进行绘图，P<0.05为有统计学差异，用*表示，P<0.01用**表示，P<0.001用***表示。
三、实验结果
1.减低ITGA4的表达或活性抑制AML细胞的扩增。
在AML细胞株MV4-11中，利用shRNA干扰ITGA4的表达或用NZM阻滞ITGA4的活性。敲减或抑制ITGA4后，MV4-11细胞的克隆数量显著降低。(图1)上述处理后的MV4-11细胞体外培养7天，动态监测细胞数量显示细胞增殖显著抑制。(图2)将处理后的MV4-11细胞固定破膜，标记DAPI和ki67，流式分析显示处于G1期的细胞比例增加。(图3)
2.减低ITGA4的表达或活性抑制AML细胞的迁移和粘附能力。
敲减或抑制ITGA4后，MV4-11细胞迁移至transwell plate下室的数量显著减少，(图4)粘附至fibronectin包被的板子上的MV4-11细胞数量显著减少(见图5)。
3.敲低ITGA4的表达延长MV4-11细胞构建的AML小鼠的生存。
将ITGA4 shRNA与NSC对照病毒转染MV4-11细胞，流式分选出GFP+的群体。通过尾静脉注射1.0×105细胞/只至半致死量辐照2.0Gy的NS122小鼠，监测小鼠生存时间。与NSC组相比，敲减ITGA4组小鼠的生存时间显著延长。(图6)移植后第15天，处死小鼠，分离小鼠的骨髓造血细胞，脾脏细胞和肝脏细胞，标记人CD45，流式检测CD45+GFP+白血病的比例。与NSC组相比，敲减ITGA4组小鼠骨髓细胞中白血病细胞的比例显著减少，肝脏和脾脏中白血病细胞的比例也显著减少。(图7)将移植NC和sh-ITGA4细胞15天的小鼠股骨、肝和脾组织切片做HE染色，结果NSC组小鼠骨髓、肝脾组织结构破坏，有大量白血病细胞浸润，敲减ITGA4组小鼠骨髓、肝脾组织白血病浸润显著减少(图8)。
4.敲低ITGA4的表达抑制AML细胞向骨髓和脾脏造血组织的归巢。
将敲减ITGA4或NC的MV4-11细胞尾静脉注射至半致死量剂量辐照的免疫缺陷小鼠中，每只移植小鼠注射2.0×106细胞，移植后16小时处死小鼠，流式检测小鼠骨髓和脾脏中白血病细胞的比例。与NSC对照组相比，敲减ITGA4的MV4-11细胞归巢至骨髓和脾脏中的比例均显著降低。(图9)
5.NZM抑制难治和复发患者白血病细胞及白血病干细胞的克隆集落形成、迁移和粘附能力。
收集难治或复发AML患者骨髓细胞，编号#61、#58和#59的标本为难治AML，编号#11的标本为复发AML。分离其白血病细胞，用IgG或NZM处理白血病细胞48小时后，进行克隆集落形成实验、迁移和粘附实验。与IgG组相比，NZM处理后，难治或复发患者AML细胞的克隆集落形成显著减少(图10)，迁移细胞的比例减少(图11)，粘附的细胞数量显著减少(图12)。
流式分选难治或复发患者的CD34+白血病干细胞群体。编号#60、#62、#56和#63的标本为难治AML的标本，编号#69的标本为复发AML的标本。用IgG或NZM处理分选获得的白血病干细胞48小时，进行克隆集落形成实验、迁移和粘附实验。与白血病细胞相似，NZM处理同样抑制难治或复发患者AML白血病干细胞的克隆集落形成(图13)，迁移(图14)和粘附(图15)。
综上所述，本发明对ITGA4做为难治或复发AML治疗的靶点及应用进行了评估。本发明明确减低ITGA4表达或活性，白血病细胞的增殖受到抑制；显著延长白血病小鼠的生存；减弱白血病细胞的归巢。ITGA4的封闭性抗体NZM能显著性抑制难治或复发AML患者白血病细胞和白血病干细胞的克隆形成，迁移和粘附。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州大学
<120> 一种ITGA4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工合成）
<400> 1
gctccgtgtt atcaagatta tctcgagata atcttgataa cacggagctt tttg 54
Claims (10)
1.一种ITGA4基因抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括核酸序列为SEQ ID NO:1所述的shRNA和/或那他珠单克隆抗体。
2.一种重组载体，其特征在于，包含能够转录权利要求1所述shRNA的序列，将所述序列嵌入载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述慢病毒载体选自pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。
5.一种慢病毒，其特征在于，由权利要求2中所述重组载体经过细胞包装后得到。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述ITGA4基因抑制剂、权利要求2所述重组载体或权利要求5中所述慢病毒。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述载体选自崩解剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、湿润剂、矫味剂、助悬剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述ITGA4基因抑制剂、权利要求2所述重组载体、权利要求5中所述慢病毒或权利要求6所述的药物组合物。
10.权利要求1所述ITGA4基因抑制剂、权利要求2所述重组载体、权利要求5中所述慢病毒、权利要求6所述的药物组合物或权利要求9所述试剂盒在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111573516.1A CN114404616A (zh) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | 一种itga4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111573516.1A CN114404616A (zh) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | 一种itga4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114404616A true CN114404616A (zh) | 2022-04-29 |
Family
ID=81266565
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111573516.1A Pending CN114404616A (zh) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | 一种itga4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114404616A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003097097A1 (fr) * | 2002-05-15 | 2003-11-27 | Yoshiro Niitsu | Procede pour traiter et/ou prevenir la leucemie aigue au moyen d'une composition pharmaceutique pour utilisation therapeutique contenant un antagoniste de vla4, et procede pour etablir un pronostic diagnostique de la leucemie aigue en se servant de vla4 comme indicateur |
| US20100266587A1 (en) * | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions and Methods to Treat Acute Myelogenous Leukemia |
| US20100278837A1 (en) * | 2009-03-09 | 2010-11-04 | The Regents Of The University Of California | Compositions And Methods For Reducing Cancer And Inflammation |
-
2021
- 2021-12-21 CN CN202111573516.1A patent/CN114404616A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003097097A1 (fr) * | 2002-05-15 | 2003-11-27 | Yoshiro Niitsu | Procede pour traiter et/ou prevenir la leucemie aigue au moyen d'une composition pharmaceutique pour utilisation therapeutique contenant un antagoniste de vla4, et procede pour etablir un pronostic diagnostique de la leucemie aigue en se servant de vla4 comme indicateur |
| US20100278837A1 (en) * | 2009-03-09 | 2010-11-04 | The Regents Of The University Of California | Compositions And Methods For Reducing Cancer And Inflammation |
| US20100266587A1 (en) * | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Biogen Idec Ma Inc. | Compositions and Methods to Treat Acute Myelogenous Leukemia |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JIE XIE等: ""Integrin α4 up-regulation activates the hedgehog pathway to promote arsenic and benzo[α]pyrene co-exposure-induced cancer stem cell-like property and tumorigenesis"", 《CANCER LETTER》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101590199B1 (ko) | 수지상 세포를 생산하는 방법 | |
| JP5156382B2 (ja) | Ｔ細胞集団の製造方法 | |
| JP2021522860A (ja) | キメラ抗原受容体で修飾されたγδ Ｔ細胞を生産する方法 | |
| KR20180128039A (ko) | 신규 rna 구축물 및 세포독성 세포 및 줄기 세포의 치료 효과를 증진시키기 위한 그의 사용 방법 | |
| CN112830974B (zh) | 一种嵌合抗原受体、载体、人树突状细胞、细胞系、实体肿瘤治疗药物及制备方法和应用 | |
| US20170081637A1 (en) | Development Of Natural Killer Cells And Functional Natural Killer Cell Lines | |
| EA038848B1 (ru) | Способ пролиферации естественных клеток-киллеров и композиции для пролиферации естественных клеток-киллеров | |
| JP6073417B2 (ja) | 自然殺害細胞増殖方法、及び自然殺害細胞増殖用の組成物 | |
| Kobune et al. | Indian hedgehog gene transfer augments hematopoietic support of human stromal cells including NOD/SCID–ß2m–/–repopulating cells. | |
| JP2017141273A (ja) | 移植片対宿主病を治療または予防する方法 | |
| WO2017193009A1 (en) | Maintenance, enrichment, enhancement and expansion of human hematopoietic stem cells | |
| CA3149478A1 (en) | Cellular compositions comprising viral vectors and methods of treatment | |
| Wickström et al. | Expansion of tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma tumors | |
| WO2000070022A9 (en) | Ex vivo expansion of mammalian hematopoietic stem cells | |
| CN114209814A (zh) | Tnfsf15蛋白在促进骨髓干细胞分化为巨噬细胞并扩增中的用途 | |
| JP2024501127A (ja) | 腫瘍浸潤リンパ球培地及びその使用 | |
| CN113663056A (zh) | Tnfsf15蛋白作为淋巴细胞免疫增强剂的应用及其活化方法 | |
| US20220378740A1 (en) | Compositions and methods of making expanded hematopoietic stem cells using derivatives of carbazole | |
| CN110551688B (zh) | 一种诱导体细胞重编程为造血干/祖细胞且促进造血干/祖细胞体外扩增的组合物及其应用 | |
| CN114404616A (zh) | 一种itga4基因抑制剂及其在制备难治或复发急性髓系白血病药物中的应用 | |
| CA2307624A1 (en) | Hematopoietic stem cells | |
| WO2022143675A1 (zh) | 用于扩增并维持HSCs自我更新能力和分化潜能的培养基组合物及其应用 | |
| US20230212515A1 (en) | Method for obtaining car-nk cells | |
| CN111286512A (zh) | 靶向人源化酪氨酸激酶孤儿受体1的嵌合抗原受体及其用途 | |
| CN116179606B (zh) | 转录因子tcf1在抵抗car-t细胞耗竭和终末分化中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220429 |