CN114381462B - 草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用，所述草果AtDRM1基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。一种草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用，包括以下步骤：1)扩增草果AtDRM1基因；2)用限制性内切酶对质粒双酶切，将线性化质粒与草果AtDRM1基因进行同源重组反应，产物转化至DH5α感受态中，并在涂布有抗生素的培养基上培养，对培养基上的单菌落进行阳性验证，获得重组质粒；3)重组质粒转化至农杆菌，并利用农杆菌侵染植物，筛选及鉴定转基因植株，即得耐热性提高的植物。本发明通过构建转休眠相关基因DRM的植物，提高植物对热胁迫的耐受性，为培育耐热性植物提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。更具体地说，本发明涉及一种草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用。
背景技术
草果(Amomum tsaoko)为姜科豆蔻属多年生草本植物。其果实既是一种香料，也是一种重要的药材，具有温中、健胃、消食、顺气的功能，主治心腹疼痛、脘腹胀满、恶心呕吐、咳嗽痰多、疟疾寒热等。目前，国内外有关草果的研究大多集中在化学成分、药理作用以及栽培繁育方面，对其生长适应性方面的研究较少。草果生物学特性特殊，对温度要求较高，适生范围狭窄，主要分布于我国云南省东南部和广西西部。生产上草果多栽培于海拔1100～1800m的阔叶林下，生长地区年平均温度要求在16～22℃。杨耀文等(2016)研究发现，草果花柱卷曲的性状极易受温度和湿度的影响，当平均温度大于18℃时存在花柱卷曲滞后现象，进而影响其植株繁育。崔晓龙等(1995)发现草果花粉在高温与低湿条件下生活力极易丧失，花粉萌发和花粉管生长的最适温度是12～24℃之间。这些研究结果表明，温度是影响草果生长与繁育的主要因素之一。然而，目前尚未有提高草果对温度适应性的研究报道。
休眠相关基因(DRM)是DRM1/ARP(休眠相关基因/生长素抑制蛋白)家族的成员，参与调节分生组织或器官的休眠。多种证据表明，DRM参与种子休眠维持、芽休眠及激素信号调控，然而，目前尚未有应用DRM基因提高植物温度适应性的报道。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用，其能够提高植物对热胁迫的耐受性。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用，所述草果AtDRM1基因的DNA序列如SEQ ID NO.1。
草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用，包括以下步骤：
1)扩增草果AtDRM1基因；
2)用BglⅡ和BstEⅡ限制性内切酶对质粒pCAMBIA1301双酶切，使质粒pCAMBIA1301线性化，将线性化质粒pCAMBIA1301与草果AtDRM1基因进行同源重组反应，产物转化至DH5α感受态中，并在涂布有抗生素的培养基上培养，对培养基上的单菌落进行阳性验证，获得pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒；
3)pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒转化至农杆菌，并利用农杆菌侵染植物，筛选及鉴定转基因植株，即得耐热性提高的植物。
优选的是，草果AtDRM1基因的提取方法包括以下步骤：
a)取草果叶片0.2-1g，放入含研磨珠的离心管中，液氮速冻，研磨成粉，获得粉体；
b)提取粉体中的植物总RNA，并将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化，获得草果AtDRM1基因。
优选的是，步骤b)中，以cDNA为模板进行PCR扩增时的上游引物为SEQ ID NO.2:actcttgaccatggtagatctgatggttctccttgataagatgtgg；下游引物为SEQ ID NO.3:ggggaaattcgagctggtcacctcaacggtgggtgctcttcg。
优选的是，以cDNA为模板进行PCR扩增时反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；反应体系为：高保真酶25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，cDNA 2μL，ddH2O 19μL。
优选的是，利用农杆菌侵染植物的方法为将植物种子消毒，并用无菌水清洗干净，置于培养基上培养，种子发芽并长出2-4片叶后，将幼苗转移至泥炭土中培养，待植物开花时，利用含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌对花序浸染，即实现农杆菌对植物的浸染。
优选的是，用含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌对花序浸染的方法为吸取2-5mL含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌接种于100-200mL含50-100mg/L卡那霉素和50-100mg/L利福平的YEP液体培养基中，25-30℃，200-250rpm下培养至OD值为1.0-1.2。将菌液转移至无菌离心管中，5000-6000rpm下离心10-15min，弃上清，用转化液重悬菌体至OD600为0.8-1.0，获得含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌浸染液，将植株的花序浸泡在农杆菌浸染液中30-60s，避光培养24-36h，重复转化1-2次。
优选的是，筛选及鉴定转基因植株的方法为利用农杆菌侵染植物后收获植物的种子T0，将种子T0消毒并用无菌水清洗干净，置于抗性培养基上培养，选择正常生长的植株进行培养，收获种子T1；对种子T1进行分离比例筛查，选择符合3:1分离比例的植株培养，收获T2代种子；用抗性平板筛选种子T2，选择出苗并成活的植株继续培养，收获T3代种子，提取T3代植株叶片的DNA，进行PCR验证；提取T3代植株叶片的总RNA，反转录为cDNA，荧光定量PCR检测表达量，即获得阳性且基因表达量高的植株。
优选的是，荧光定量PCR的上游引物为SEQ ID NO.4:ggtctctccaaagccttt；下游引物为SEQ ID NO.5:agatattgaacggtggaacat。
本发明至少包括以下有益效果：本发明通过构建转休眠相关基因DRM的植物，提高了植物对热胁迫的耐受性，为培育耐热性植物提供了新思路。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明构建的pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒示意图；
图2为温度胁迫的植株生长变化图；其中，1表示热胁迫前；2表示40℃胁迫24h；3表示恢复生长第7d；
图3为温度胁迫后植株生长比例变化图；
图4为温度胁迫后植株抗氧化酶活性以及丙二醛(MDA)含量变化图；
图5为温度胁迫后与胁迫应答相关基因的表达变化图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明提供了一种草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用，所述草果AtDRM1基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用，包括以下步骤：
1)扩增草果AtDRM1基因；
2)用BglⅡ和BstEⅡ限制性内切酶对质粒pCAMBIA1301双酶切，使质粒pCAMBIA1301线性化，将线性化质粒pCAMBIA1301与草果AtDRM1基因进行同源重组反应，产物转化至DH5α感受态中，并在涂布有抗生素的培养基上培养，对培养基上的单菌落进行阳性验证，获得pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒；
3)pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒转化至农杆菌，并利用农杆菌侵染植物，筛选及鉴定转基因植株，即得耐热性提高的植物。
在另一种技术方案中，草果AtDRM1基因的扩增方法包括以下步骤：
a)取草果叶片0.2-1g，放入含研磨珠的离心管中，液氮速冻，研磨成粉，获得粉体；
b)提取粉体中的植物总RNA，并将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化，获得草果AtDRM1基因。
在另一种技术方案中，以cDNA为模板进行PCR扩增时的上游引物为SEQ ID NO.2:actcttgaccatggtagatctgatggttctccttgataagatgtgg；下游引物为SEQ ID NO.3:ggggaaattcgagctggtcacctcaacggtgggtgctcttcg。
在另一种技术方案中，以cDNA为模板进行PCR扩增时反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；反应体系为：高保真酶25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，cDNA 2μL，ddH2O 19μL。
在另一种技术方案中，利用农杆菌侵染植物的方法为将植物种子消毒，并用无菌水清洗干净，置于培养基上培养，种子发芽并长出2-4片叶后，幼苗转移至泥炭土中培养，待植物开花时，利用含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌对花序浸染，即实现农杆菌对植物的浸染。
在另一种技术方案中，用含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌对花序浸染的方法为吸取2-5mL含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌接种于100-200mL含50-100mg/L卡那霉素和50-100mg/L利福平的YEP液体培养基中，25-30℃，200-250rpm下培养至OD值为1.0-1.2。将菌液转移至无菌离心管中，5000-6000rpm下离心10-15min，弃上清，用转化液重悬菌体至OD600为0.8-1.0，获得含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌浸染液；将植株的花序浸泡在农杆菌浸染液中30-60s，避光培养24-36h，重复转化1-2次。
在另一种技术方案中，筛选及鉴定转基因植株的方法为利用农杆菌侵染植物后收获植物的种子T0，将种子T0消毒并用无菌水清洗干净，置于抗性培养基上培养，选择正常生长的植株进行培养，收获种子T1；对种子T1进行分离比例筛查，选择符合3:1分离比例的植株培养，收获T2代种子；用抗性平板筛选种子T2，选择出苗并成活的植株继续培养，收获T3代种子，提取T3代植株叶片的DNA，进行PCR验证；提取T3代植株叶片的总RNA，反转录为cDNA，荧光定量PCR检测表达量，即获得阳性且基因表达量高的植株。
在另一种技术方案中，荧光定量PCR的上游引物为SEQ ID NO.4:ggtctctccaaagccttt；下游引物为SEQ ID NO.5:agatattgaacggtggaacat。
<实施例>
一种草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用方法，其包括以下步骤：
一、草果AtDRM1基因的DNA片段获取
取草果叶片0.2g，放入含研磨珠的2.0mL离心管中，液氮速冻，使用组织研磨仪(上海净信，JXFSTPRP-64L)研磨成粉末。采用Takara公司的TaKaRa MiniBEST Plant RNAExtraction Kit试剂盒提取植物总RNA，使用Takara公司PrimeScriptTM RT reagent Kitwith gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒将RNA反转录为cDNA。根据所述草果AtDRM1基因序列SEQ ID NO.1，设计并合成上游引物SEQ ID NO.2:actcttgaccatggtagatctgatggttctccttgataagatgtgg，其中，actcttgaccatggtagatct为PCAMBIA1301部分载体序列，该载体可通过市售的商业渠道获得；设计并合成下游引物SEQ ID NO.3:ggggaaattcgagctggtcacctcaacggtgggtgctcttcg，其中，ggggaaattcgagctggtcacc为pCAMBIA1301部分载体序列。使用诺唯赞高保真酶2×Phanta Max Master Mix，以草果cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；反应体系为：高保真酶25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，cDNA 2μL，ddH2O 19μL。使用天根生化科技有限公司DNA纯化回收试剂盒进行胶回收。
二、载体连接
使用天根质粒小提试剂盒提取pCAMBIA1301质粒，用BglⅡ和BstEⅡ进行双酶切，使载体线性化。使用诺唯赞ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit，将纯化产物与线性化载体进行同源重组反应，反应条件为37℃，30min。取10μL重组反应产物转化至DH5α感受态中，涂布在含50mg/L卡那霉素的LB培养基上，使用引物(上游引物SEQ ID NO.2:actcttgaccatggtagatctgatggttctccttgataagatgtgg；下游引物SEQ ID NO.3:ggggaaattcgagctggtcacctcaacggtgggtgctcttcg)对单菌落进行PCR验证，将阳性克隆进行测序。将测序正确的阳性克隆命名为pCAMBIA1301-AtDRM1，载体构建示意图如图1所示。
三、遗传转化
使用热击法将pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒转化至农杆菌GV3101。按以下步骤培养拟南芥并使用花序侵染法进行遗传转化，具体步骤为：
1、将野生型Col-0拟南芥种子用75％乙醇浸泡30s，转入25％次氯酸钠中浸泡10min，用无菌水冲洗3-5次。用无菌枪头将种子接种至MS基本培养基上，置于4℃冰箱中春化2-3d后，转入25℃光照培养箱中进行培养。
2、长出2-4片叶后，将拟南芥幼苗转移至泥炭土中，置于22℃，光照强度为100-150μmol·m-2·s-1的培养室中培养。当主花序结荚，次花序约2-10cm长且少量开花时，利用浸染液对拟南芥花序进行侵染。
侵染液的制备方法为吸取2mL含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌GV3101接种于100mL含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平的YEP液体培养基中，28℃，200rpm下培养至OD值为1.0-1.2。将菌液转移至50mL无菌离心管中，6000rpm下离心10min，弃上清。用转化液(含5％蔗糖，0.02％Silwet，用1/2MS配制)重悬菌体至OD600为0.8-1.0，获得含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌GV3101浸染液。
利用农杆菌GV3101浸染液对拟南芥花序进行侵染的方法为将拟南芥植株的花序浸泡在农杆菌GV3101浸染液中30-60s，避光培养24h。重复转化1-2次，收获的种子记为T0。
四、纯合子筛选及转基因植株鉴定
1、取T0种子，用75％乙醇浸泡30s，转入25％次氯酸钠中浸泡10min，用无菌水冲洗3-5次。用无菌枪头将种子接种至抗性平板(含50mg/L潮霉素的MS基本培养基)上，置于4℃冰箱中春化2-3d后，转入25℃光照培养箱中进行培养。
2、选择在抗性平板上正常生长的植株进行培养，收获T1代种子。对T1代种子进行分离比例筛查，选择符合3:1的分离比例的植株进一步培养，收获T2代种子。用抗性平板筛选T2代种子，选择全部出苗并成活的植株用于培养，收获T3代种子。
3、转基因植株鉴定：采用CTAB法提取T3代植株叶片DNA，使用引物(上游引物SEQID NO.2:actcttgaccatggtagatctgatggttctccttgataagatgtgg；下游引物SEQ ID NO.3:ggggaaattcgagctggtcacctcaacggtgggtgctcttcg)进行PCR验证。采用Takara公司RNA提取试剂盒提取T3代植株叶片总RNA，反转录为cDNA，使用引物(上游引物SEQ ID NO.4:ggtctctccaaagccttt；下游引物SEQ ID NO.5:agatattgaacggtggaacat)进行qRT-PCR验证(荧光定量PCR检测所用试剂盒为诺唯赞公司ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，仪器为罗氏LightCycler 96)。选择鉴定结果为阳性且基因表达量高的三个株系，命名为OE-3、OE-27、OE-34。
<效果验证>
为研究草果AtDRM2基因在热胁迫下的生物学功能，对野生型拟南芥幼苗和转基因拟南芥幼苗进行40℃热胁迫处理。处理后统计叶片萎蔫植株比例、成活植株比例、正常生长植株比例，取叶片进行抗氧化酶活性和MDA含量测定。取野生型拟南芥和过表达植株叶片，使用Takara公司RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录为cDNA，使用特异性引物进行热胁迫响应基因表达量检测，特异性引物如表1所示。以管家基因Actin作为内参基因(上游引物SEQID NO.6:gcaccctgttcttcttaccga；下游引物SEQ ID NO.7:agtaaggtcacgtccagcaagg)，采用2-△△CT法计算待测基因的相对表达量。
实验结果表明，经热胁迫处理24h，野生型拟南芥叶片萎焉的植株比例达90％以上，而转基因拟南芥叶片萎蔫植株比例低于60％。热胁迫使野生型拟南芥成活植株比例明显下降，仅54.1％，恢复生长7d后可正常生长的植株比例仅15.8％；而热胁迫处理后转基因拟南芥成活植株比例达90％以上，恢复生长7d后有80％以上的植株能正常生长，如图2、图3所示。过表达AtDRM1能够提高热胁迫条件下植株叶片超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性，减少膜脂过氧化程度，如图4所示，有助于提高热胁迫的耐受性。过表达AtDRM1还能够显著提高热胁迫应答基因的表达，这些基因包括AtHsp25.3-P、AtHsp18.2-CI、AtHsp70B、AtHsp101、AtHsfA2、AtHsfB1、AtHsfB2a、AtGolS和AtMBF1c，说明过表达AtDRM1能够提高植物的耐热性，如图5所示。
表1
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
<110>广西壮族自治区药用植物园
<120>草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 378
<212> DNA
<213> Amomum tsaoko
<400> SEQ ID NO.1
atggttctcc ttgataagat gtgggacgac gtcttcggcg gtcctcagcc tgagaaaggc 60
ctaggcaagc tgaggaaggt ctctccaaag cctttgtcca tcaaagaagg ggaaggcagc 120
agtgaaggtg gcggcatgtt ccaccgttca atatctctac cccagacgcc gacgacgccg 180
accactccag tgacgccgtc gtcgtccagc tactccccga ctcagcggca gggcaacgtg 240
tggaggagcg tgttcaaccc cggcagcaac ctcgccacca agactgtcgg agctcactat 300
ttcgacaagc cccaacccaa ctcccccact gtctacgact ggttgtacag cggtgagacg 360
aagagcaccc accgttga 378
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> SEQ ID NO.2
actcttgacc atggtagatc tgatggttct ccttgataag atgtgg 46
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.3
ggggaaattc gagctggtca cctcaacggt gggtgctctt cg 42
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.4
ggtctctcca aagccttt 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.5
agatattgaa cggtggaaca t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.6
gcaccctgtt cttcttaccg a 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.7
agtaaggtca cgtccagcaa gg 22
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.8
acggagtcct ctttatcact atccc 25
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.9
gatcgagtcc tactgaatct gg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.10
ttcacgccat cttctgcgtt gg 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.11
tgtaaacgct gccacatcac gag 23
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.12
agctattggt atcgatctcg gcactac 27
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.13
aagcctcagc gacttccttc atcttcac 28
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.14
accgagaaga agtcctctgg c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.15
tttcccacga agcttctcaa c 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.16
tggtgtgctt gtagctgagg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.17
cataaccgca aactgctgaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.18
tcgtgtggaa aacagcagag 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.19
atttacgccg tcgtatgtcc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.20
aacgaagacga ctgggaatg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.21
cgggagaata actccgatca 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.22
agccgttcat caccgctctt ac 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.23
actcctggca acattcaagc ag 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.24
agaggtgagg ttgatgatac 20
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
<400> SEQ ID NO.25
gcacagcctg attagga 17
Claims (9)
1.草果AtDRM1基因在提高植物耐热性中的应用，所述草果AtDRM1基因的DNA序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)扩增草果AtDRM1基因；
2)用BglⅡ和BstEⅡ限制性内切酶对质粒pCAMBIA1301双酶切，使质粒pCAMBIA1301线性化，将线性化质粒pCAMBIA1301与草果AtDRM1基因进行同源重组反应，产物转化至DH5α感受态中，并在涂布有抗生素的培养基上培养，对培养基上的单菌落进行阳性验证，获得pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒；
3)pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒转化至农杆菌，并利用农杆菌侵染植物，筛选及鉴定转基因植株，即得耐热性提高的植物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，草果AtDRM1基因的扩增方法包括以下步骤：
a)取草果叶片0.2-1g，放入含研磨珠的离心管中，液氮速冻，研磨成粉，获得粉体；
b)提取粉体中的植物总RNA，并将RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，纯化，获得草果AtDRM1基因。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以cDNA为模板进行PCR扩增时的上游引物为SEQ ID NO.2:actcttgaccatggtagatctgatggttctccttgataagatgtgg；下游引物为SEQ IDNO.3:ggggaaattcgagctggtcacctcaacggtgggtgctcttcg。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以cDNA为模板进行PCR扩增时反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环；反应体系为：高保真酶25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，cDNA 2μL，ddH2O 19μL。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用农杆菌侵染植物的方法为将植物种子消毒，并用无菌水清洗干净，置于培养基上培养，种子发芽并长出2-4片叶后，将幼苗转移至泥炭土中培养，待植物开花时，利用含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌对花序浸染，即实现农杆菌对植物的浸染。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，用含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌对花序浸染的方法为吸取2-5mL含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌接种于100-200mL含50-100mg/L卡那霉素和50-100mg/L利福平的YEP液体培养基中，25-30℃，200-250rpm下培养至OD值为1.0-1.2；将菌液转移至无菌离心管中，5000-6000rpm下离心10-15min，弃上清，用转化液重悬菌体至OD600为0.8-1.0，获得含有pCAMBIA1301-AtDRM1重组质粒的农杆菌浸染液，将植株的花序浸泡在农杆菌浸染液中30-60s，避光培养24-36h，重复转化1-2次。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，筛选及鉴定转基因植株的方法为利用农杆菌侵染植物后收获植物的种子T0，将种子T0消毒并用无菌水清洗干净，置于抗性培养基上培养，选择正常生长的植株进行培养，收获种子T1；对种子T1进行分离比例筛查，选择符合3:1分离比例的植株培养，收获T2代种子；用抗性平板筛选种子T2，选择出苗并成活的植株继续培养，收获T3代种子，提取T3代植株叶片的DNA，进行PCR验证；提取T3代植株叶片的总RNA，反转录为cDNA，荧光定量PCR检测表达量，即获得阳性且基因表达量高的植株。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，荧光定量PCR的上游引物为SEQ ID NO.4:ggtctctccaaagccttt；下游引物为SEQ ID NO.5:agatattgaacggtggaacat。
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| CN107099599A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-08-29 | 红河学院 | 一种基于srap标记的草果种质资源遗传多样性分析方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2656258A1 (en) * | 2006-06-20 | 2007-12-27 | Wageningen Universiteit | Use of plant chromatin remodeling genes for modulating plant architecture and growth |
-
2022
- 2022-01-18 CN CN202210056548.2A patent/CN114381462B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107099599A (zh) * | 2017-05-26 | 2017-08-29 | 红河学院 | 一种基于srap标记的草果种质资源遗传多样性分析方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DRM1 and DRM2 expression regulation: potential role of splice variants in response to stress and environmental factors in Arabidopsis;Georgina M. Rae 等;《Mol Genet Genomics》;第289卷;第317-332页 * |
| 草果种子休眠解除过程中qRT-PCR 内参基因筛选;姚李祥 等;《中国中药杂志》;第22卷;第1-7页 * |
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