CN114380821B - 黄精碱a的对照品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种黄精碱A的对照品的制备方法，其包括富集浓缩工序、正相色谱纯化工序、中压反相色谱纯化工序、高压反相色谱纯化工序和固体化工序。本发明的制备方法具有高通量，能提供高***精碱A，且适合大量制备的黄精碱A对照品制备方法，并且该方法的黄精碱A的提取率也比较高。本发明能迅速获得纯度大于98％的黄精碱A。

Description

黄精碱A的对照品的制备方法

技术领域

本发明涉及一种黄精碱A的对照品的制备方法，尤其涉及能够制备高纯度的黄精碱A的固体对照品的制备方法。

背景技术

黄精为百合科黄精属多年生草本植物，中国药典2015年版收载了黄精的3个来源，分别为滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎。作为我国的传统中药，黄精别名为“仙人余粮”、“救命草”、“老虎姜”等，体现其药食两用性，其用药历史已有2000 多年。黄精早在晋代《名医别录》中就有记载，至今也已有两千多年的药用历史《神农本草经》中把黄精列为上品，称“黄精主补中益气，除风湿，安五脏”。《本草纲目》载:“黄精补诸虚，填精髓，平补气血而润”。称其“得坤土之精，为补养中宫之胜品”。黄精具有宽中益气、益肾填精、滋阴润肺、生津补脾之功效，主治肺燥干咳、体虚乏力、心悸气短、久病津亏口干、糖尿病、高血压等病症，对治疗心血管疾病、结核病、慢性肝炎以及抗菌、解毒、抗疲劳、抗衰老等方面均有较好作用。作为常用的黄精的中药材，一般使用酒黄精，就是将黄精这个药物加黄酒炙用后使用，一般认为酒黄精能加强其治疗疾病的功效。

黄精碱A是黄精中的常见成分，其结构式如下：

黄精碱A在生黄精中含量很低，而炮制后的黄精中的黄精碱A含量则变得较大。因此，黄精碱A是有效区分生品黄精和炮制品的重要指标成分，对于黄精相关的中药现代化有着重要意义。

目前市场上能够采购获得的黄精碱A标准品的渠道并不丰富。非专利文献1 和2提供了黄精碱A的提取方法研究，但这些方法并不适合商品化大规模的获得黄精碱A。而且现有文献中获得的黄精碱A的纯度都较低，均未报道有分离得到纯度98％以上及大量的单体化合物，而且只是获得少量核磁结构鉴定的样品。

非专利文献1和2中，黄精碱A分离技术主要是通过正相硅胶柱层析，凝胶柱层析多次重复使用，工艺繁复，尤其是凝胶层析的使用，极大的提高了成本，也限制了制备生产的速度和通量。

非专利文献：

1.宁火华,袁铭铭,邬秋萍,平欲晖,周志强,许妍,吴毅,殷海霞.多花黄精化学成分分离鉴定[J].中国实验方剂学杂志,2018,24(22):77-82.

2.余亚鸣.黄精的活性成分研究[D].天津医科大学,2017.。

现实情况是，迫切需要开发足够简便快速、提取率高、纯度达到98％以上的黄精碱A的提取方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量、能提供高***精碱A，且适合大量制备的黄精碱A对照品制备方法，并且该方法的黄精碱A的提取率也比较高。本发明分离到黄精碱A能够获得HPLC纯度98％以上的纯品固体；本发明的通量以及工业化放大的潜力也很优异。

具体而言，本发明提供一种黄精碱A的对照品的制备方法，其能够以较高的效率和收率获得纯度很高的黄精碱A，特征在于，依次包括以下步骤：

富集浓缩工序：将含有黄精碱A的原料提取物粗品用水溶解，上样至苯乙烯类-二乙烯苯骨架大孔树脂吸附柱，用大孔树脂吸附柱体积10～30倍的水洗脱去除杂质，再利用用大孔树脂吸附柱体积3～10倍的以体积比计30～60％的甲醇水溶液或者30～60％的乙醇水溶液洗脱获得含目标物的溶液，浓缩得到含有黄精碱A的第二粗品的工序；

正相色谱纯化工序：将含有黄精碱A的第二粗品上样至正相色谱柱，用含有卤代烷烃类溶剂、醇类溶剂的混合洗脱液进行洗脱，卤代烷烃类溶剂：醇类溶剂的比例以体积比计为120～8：1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥，得到第三粗品粉末；

中压反相色谱纯化工序：将第三粗品粉末上样至反相色谱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以0.5～1Mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.8:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液在 50℃以下的温度减压浓缩，去除其中的乙腈或甲醇，得到含有黄精碱A的第四粗品粉末；

高压反相色谱纯化工序：将第四粗品粉末上样至反相色谱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以1～15Mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.05～0.15:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，得到含有黄精碱A的溶液；

固体化工序：将含有黄精碱A的溶液在50℃的温度以下避光浓缩至无甲醇或者乙腈味，将该溶液吸附于反相色谱柱，利用90％～95％的乙腈或甲醇冲洗反相色谱柱，得到目标流份，在45℃下避光浓缩、冷冻干燥，得到黄精碱A对照品固体。

在本发明的优选实施方式中，所述含有黄精碱A的原料提取物粗品的制备方法为，将原料中药材酒黄精粉碎，利用醇系的水溶液浸泡，过滤，滤液在30～80℃的温度下避光浓缩至无醇味，获得含有黄精碱A的原料提取物粗品。在本发明的优选实施方式中，醇系的水溶液为60％～90％的甲醇水溶液或者60％～90％的乙醇水溶液。

在本发明的优选实施方式中，富集浓缩工序中，苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔树脂，为选自AB-8大孔树脂、HPD-100大孔树脂、D-101大孔树脂中的任意种，苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔树脂的孔径为5nm～100nm，利用35％～45％的乙醇水溶液洗脱获得含目标物的溶液。

在本发明的优选实施方式中，正相色谱纯化工序中，所述卤代烷烃类溶剂为二氯甲烷，所述醇类溶剂为甲醇。

在本发明的优选实施方式中，中压反相色谱纯化工序中，使用乙腈：水洗脱液，溶液的比例以体积比计为0.40～0.45:1进行洗脱。

在本发明的优选实施方式中，正相色谱纯化工序中，正相色谱柱的填料为粒径为100～300目的硅胶。

在本发明的优选实施方式中，在高压反相色谱纯化工序中，使用乙腈：水洗脱液，溶液的比例以体积比计为0.08～0.12:1进行洗脱，反相色谱柱的填料为粒径为 5-10μm的十八烷基硅烷键合硅胶。

在本发明的优选实施方式中，在固体化工序中，进一步将去除有机溶剂所得到的固体，在利用8％以下的乙腈或8％以下的甲醇洗脱去除前杂之后，利用90～95％的乙腈洗脱含目标物的纯品。

本发明还提供一种纯度为98％以上的黄精碱A的固体对照品，其通过本发明的制备方法制备得到。

本发明制备的黄精碱A纯度较文献及以往的发明报导提高很多，能迅速获得纯度达到98％以上的黄精碱A，提取率和通量上有较大改进。

具体而言，本发明具有如下特点：

本发明操作简单高效，能够进行工艺放大，能够分离得到大量黄精碱A高纯度固体。本发明分离过程中采用利用了苯乙烯类-二乙烯苯骨架大孔树脂吸附性和层析的协同效应，对黄精碱A的HPLC纯度有显著的提升。通过本发明实验方案能够分离得到HPLC纯度大于98％以上的单体，可以作为对照品。作为炮制黄精质量控制的指标成分，以完善炮制黄精饮片的质量标准，为其炮制方法的研究和质量控制提供参考数据。

附图说明

图1为本发明实施例1的黄精碱A提取大致的流程图；

图2为本发明实施例1获得的黄精碱A纯品的MS图谱；

图3为黄精碱A纯品的H-NMR图谱(CD₃OD-d₄，500MHz)；

图4为黄精碱A纯品的C-NMR图谱(CD₃OD-d₄，150MHz)；

图5为本发明实施例1的黄精碱A产物的HPLC图谱；

图6为本发明比较例1的黄精碱A产物的HPLC图谱。

具体实施方式

以下记载本发明的具体实施方式。

本发明中，黄精碱A有时也称为目标物、或分离目标物。如果并未特殊说明，本发明中目标物的纯度和含量的百分数，为以质量比计的含量。如果并未特殊说明，本发明中液体与液体含量配比的百分数，例如甲酸在水溶液中的含量配比，以体积分数计量。

本发明的发明人发现，常规的逐渐增加色谱分离的梯度的分离方法，无法得到大量得到纯度很高的黄精碱A，猜测原因可能是黄精碱A因有羟基和双键的存在，易被氧化羧基，故稳定性较差，稳定性受光照、温度、PH等因素影响较大。然而为了获得更高纯度使用的高压液相色谱制备工序中，会存在需要将大量的浓度较低溶液干燥去除溶剂的情况，在该过程中，难以保证目标物的稳定，即使是低温蒸发溶剂、冷冻干燥等手段，也难以获得纯度较高的黄精碱A。本发明在固体化工序中，利用 C18填料和目标物的吸附性，将高压反相制备中获得的高纯度的黄精碱A溶液中的水迅速脱除，避免长时间加热浓缩造成目标化合物的变质，可以在短时间内实现目标物的固体化，使的大量制备对照品固体成为可能。

本发明中过滤的方法没有特别限制，可以使用常规的过滤器、抽滤装置、微孔滤膜装置进行过滤。本发明中的干燥也没有特别限制，可以使用烘箱、红外灯、加热板等，干燥的温度，本领域人员可以适当选择。本发明中，浓缩方法以及除去有机溶剂的方法，没有特别限制，可以使用加热蒸发浓缩，旋转蒸发仪浓缩等。本发明中使用的水，没有特别限制，可以使用自来水、蒸馏水、去离子水等常用的水。

具体而言，本发明通过简单高效的操作流程，能够分离得到纯度很高的黄精碱 A。本发明的制备分离方法依次包括以下步骤：

富集浓缩工序：将含有黄精碱A的原料提取物粗品用水溶解，上样至苯乙烯类-二乙烯苯骨架大孔树脂吸附柱，用大孔树脂吸附柱体积10～30倍的水洗脱去除杂质，再利用大孔树脂吸附柱体积3～10倍的以体积比计30～60％的甲醇水溶液或者30～60％的乙醇水溶液洗脱获得含目标物的溶液，浓缩得到含有黄精碱A的第二粗品的工序；

正相色谱纯化工序：将含有黄精碱A的第二粗品上样至正相色谱柱，用含有卤代烷烃类溶剂、醇类溶剂的混合洗脱液进行洗脱，卤代烷烃类溶剂：醇类溶剂的比例以体积比计为120～8：1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥，得到第三粗品粉末；

中压反相色谱纯化工序：将第三粗品粉末上样至反相色谱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以0.5～1Mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.8:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液在 50℃以下的温度减压浓缩，去除其中的乙腈或甲醇，得到含有黄精碱A的第四粗品粉末；

高压反相色谱纯化工序：将第四粗品粉末上样至反相色谱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以1～15Mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.05～0.15:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，得到含有黄精碱A的溶液；

固体化工序：将含有黄精碱A的溶液在50℃的温度以下避光浓缩至无甲醇或者乙腈味，将该溶液吸附于反相色谱柱，利用90％～95％的乙腈或甲醇冲洗反相色谱柱，得到目标流份，在45℃下避光浓缩、冷冻干燥，得到黄精碱A对照品固体。

上述工序的顺序很重要，不能轻易替换。本发明的分离方法一个特别之处在于色谱柱分离工序和大孔树脂吸附柱的有机组合和协同，利用大孔树脂的吸附作用，迅速提高目标物纯度，是本发明首次使用的方法。具体进行以下说明。

富集和浓缩工序中利用苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔树脂对于黄精碱A的特异性吸附作用，可以迅速的提高目标物的纯度，具体原因尚不清楚，可能是由于苯乙烯 -二乙烯苯骨架的大孔树脂的特定结构对于黄精碱A特异性更强，发明人也尝试过苯乙烯-丙烯酸酯类的大孔树脂，发现收率上会比苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔树脂差。因此在富集和浓缩步骤中，优选使用苯乙烯-二乙烯苯骨架，作为常用的苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔树脂，可以使用AB-8、HPD-100、D-101等型号的大孔树脂等。苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔树脂的孔径、粒度等没有特别的限制，从吸附的效果来看，优选使用孔径为5nm～100nm的大孔树脂。在富集和浓缩工序中，从毒性角度出发，优选利用35％～45％的乙醇水溶液洗脱获得含目标物的溶液，更优选使用 38％～42％的乙醇水洗脱获得目标物溶液，特别优选使用40％的乙醇水洗脱。

上述的正相色谱纯化工序的目的是将极性差别较大的杂质与目标物区分开，正相色谱纯化工序中，原料粗品上样的方式并无特别限制，可以采用良溶剂溶解滴加上样，也可以通过填料拌样上样，为了将上样体积压缩的较低，优选拌样填料上样。

正相色谱纯化工序所使用的正相色谱柱的填料，可以用公知的正相填料，所谓正相填料，就是固定相的极性大于流动相的极性的填料，如果流动相为有机溶剂，常用的填料为硅胶(具体为SiO₂，二氧化硅)、Al₂O₃、极性键合相填料等，本发明中优选使用硅胶。硅胶的粒径大小没有特别限制，从效率和填料易得的角度出发，在优选的本发明的制备方法中，第一正相色谱柱提纯工序中，正相色谱柱的填料为粒径为100～300目的硅胶。为了更好的获得分离效率，并且从分离度和吸附损失的角度出发，优选使用硅胶，进一步优选使用100～300目的硅胶。

正相色谱纯化工序中，卤代烷烃类溶剂和醇类溶剂的混合洗脱液，将目标物与杂质区分开的效果较好，其中，作为卤代烃溶剂，是指1或2个碳原子的饱和的或不饱和的氯代烃，通常是选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1， 2-二氯乙烷、1，1，1-三氯乙烷、1，1，2-三氯乙烷、1，1，1，2-四氯乙烷、1，1， 2，2-四氯乙烷、五氯乙烷、1，1-二氯乙烯、1，2-二氯乙烯、三氯乙烯及四氯乙烯。更好地是二氯甲烷、三氯甲烷、1，1，1-三氯乙烷、三氯乙烯及四氯乙烯，进一步优选的是二氯甲烷、三氯甲烷。醇类溶剂，可使用常用的甲醇、乙醇、异丙醇。作为本发明中的优选组合，可以使用二氯甲烷和甲醇的组合，获得更好的分离效果。

在正相色谱纯化工序中，为了增加正相色谱纯化工序中的分离度其中的卤代烷烃类溶剂：醇类溶剂的比例，优选为100～10：1。

本发明中，反相色谱纯化工序用于将与目标物极性有差异的其他成分分离。为了获得更好的分离效率本发明中采用中压的反相色谱纯化工序和高压反相色谱纯化工序先后进行。

本发明中，中压反相色谱纯化工序用于将与目标物极性有差异的其他成分分离，采用0.05～0.5Mpa的洗脱压力能够实现分辨率和速度之间的平衡，中压柱分离工序中，中压反相色谱柱的压力优选为0.1Mpa～0.2Mpa，此压力因为能平衡分离效果和分离速度而特别优选。本发明的中压反相色谱纯化工序中，进一步优选使用乙腈水溶液以压力为0.1～0.3Mpa进行洗脱，乙腈：水的比例优选为0.40～0.45:1。本发明中色谱柱制备工序中使用的反相色谱柱的反相填料，可以用公知的非极性的，键合的官能团为烷烃的(例如：C18(ODS)、C8、C4等)的硅胶。优选C18(ODS) 硅胶柱，即十八烷基硅烷键合硅胶，优选使用40～60μm的填料，合理的粒径有利于维持适当的柱压和分辨率，十八烷基硅烷键合硅胶在市场上易于购买。从效率和填料易得的角度出发，在优选的本发明的制备方法中，反相色谱柱的填料为粒径为 40～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶。

所谓的高压反相色谱柱纯化，通常指洗脱压力大于1Mpa的色谱柱分离技术。本发明中，以1～15.0Mpa压力进行洗脱，实现分辨率和速度之间的平衡。本发明的高压反相色谱纯化工序中，进一步优选以8～10Mpa压力用乙腈水溶液洗脱，乙腈：水的比例优选为0.08～0.12:1。

高压反相色谱柱可以是任意的高压反相色谱柱，只要填料承载量能够满足目标物的容量的反相色谱柱即可。该工序中采用5～15Mpa的洗脱压力能够实现分辨率和速度之间的平衡，进一步优选的柱压力是5～10Mpa。分离工序中，反相色谱柱的压力更进一步优选为5～8Mpa，此压力因为能平衡分离效果和分离速度而特别优选。作为本发明中的高压反相色谱分离工序中的反相填料，可以用公知的非极性的，键合的官能团为烷烃的(例如：C18(ODS)、C8、C4等)的硅胶。优选C18(ODS)硅胶柱，即十八烷基硅烷键合硅胶，优选使用5-60μm的填料，合理的粒径有利于维持适当的柱压和分辨率，十八烷基硅烷键合硅胶在市场上易于购买。从效率和填料易得的角度出发，在优选的本发明的制备方法中，反相色谱柱的填料为粒径为5～10μm的十八烷基硅烷键合硅胶。

本发明的固体化工序，目的是迅速的将目标物从洗脱溶液中提取出来，防止其由于自身稳定性问题导致分解。本发明的发明人发现，从反相色谱分离工序获得的含有目标物的洗脱液直接浓缩，无论如何也无法获得高纯度的目标物，原因很可能是浓缩时间无法满足化合物本身稳定化要求，该化合物在利用高压反相色谱获得高纯度的同时，存在容易变质的问题。

本发明中的所谓浓缩至无甲醇或者乙腈味，实质混合溶液中的甲醇或者乙腈基本已经被蒸发去除了，仅剩下难以蒸干的水。此时几乎是将目标物的水溶液直接上样至反相色谱柱上，由于极性关系，几乎所有的目标物，都会吸附在色谱柱上。此时再通过有机溶剂，例如甲醇或乙腈，进行洗脱，可以得到目标物溶解在的甲醇或者乙腈中的洗脱液，该洗脱液可以快速的进行浓缩。为了进一步提高纯度，优选在目标物的水溶液直接上样至反相色谱柱之后，利用低浓度的甲醇或乙腈，例如用3～6％的甲醇水溶液或者乙腈水溶液冲洗反相色谱柱，去除前杂，在利用90～96％的甲醇水或者乙腈水洗脱获得目标物。

此时洗脱的目标物溶液，非常容易在低温下(45℃以下)快速浓缩。可能是由于大大压缩了纯化样品的回收时间，抑制了化合物本身的分解变质，因此突破了无法超过98％的纯度障碍，是的快速获得大量的目标物固体粉末得到可能。产品回收中使用的反相色谱柱可以与本发明的中压的反相色谱纯化工序中的色谱柱相同，也可以与高压反相色谱纯化工序中的色谱柱相同。

本发明中，所谓的含有黄精碱A的原料提取物粗品，可以是任意的含黄精碱A 的提取物，例如市售的酒黄精提取物。注意，如果是生黄精的提取物，黄精碱A 含量很少，因此不优选。为了使本发明获得更优异的分离效果和回收率，本发明中，优选含有黄精碱A的原料提取物粗品的获得方法为：

将原料酒黄精粉碎，利用醇系的水溶液浸泡，过滤，滤液在30～80℃的温度下避光浓缩至浸膏。此时，在本发明优选的实施方式中，上述的醇系的水溶液为80％～ 95％的甲醇水溶液或者80％～95％的乙醇水溶液。

本发明还提供一种纯度为98％以上的黄精碱A的固体对照品，其通过上述制备方法制备得到。

基于以上说明可知，本发明具有以下特点：本发明操作简单高效，能够进行工艺放大，分离得到大量黄精碱A单体。本发明，通过深入研究黄精碱A与杂质溶解性差异，在分离过程的特定阶段，结合溶剂处理工序，极大简化了分离过程，降低分离难度。本发明中还通过深入研究黄精碱A的稳定性情况，改进了最终的固体化工序，使得快速获得高于98％的纯度的黄精碱A成为可能，特别适合作为高质量的对照品使用。同时整个过程适合工艺放大，可以极大的提高对照品的制备通量。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。

实施例中所使用的试剂购自Aldrich公司、国药试剂公司等公司。仪器条件如下：

MS分析条件

Sciex Triple TOF 4600LC/MS

检测模式ESI-Negative/Positive ion mode

ESI源参数：

采用以下的HPLC色谱条件对实施例1和比较例1提取的目标物进行检测，

供试品溶液取1mg样品，加1mL水溶液溶解，配成1mg/mL样品，现配现测。

仪器：Agilent 1220

色谱柱：Welch Ultimate XB-C18 4.6*250mm，5μm

柱温：35℃

进样量：5μL

检测器：DAD

检测波长：304nm

流动相组成：A-0.1％甲酸水，B-乙腈

梯度变化程序

实施例1酒黄精中黄精碱A对照品的制备方法

其按如下工艺步骤进行，流程可参考图1：

A.原料提取：采购酒黄精药材300Kg，产地四川，用粉碎机粉碎成粗颗粒状，注意不可粉碎过细，否则会导致药材粉末阻力大，不利于溶剂充分扩散。加入80％乙醇 3000L，于提取罐中冷浸提取72h，提取1次，过滤得提取液，注意过滤很重要，否则引入的药渣将影响下一步树脂富集效果。滤液于60℃下浓缩至浸膏，共352kg；

B.大孔树脂富集：称取300kg D101大孔吸附树脂，乙醇浸泡除去杂质，水洗至无醇，装柱，将步骤A的浸膏用水溶解，在大孔树脂动态吸附上样，然后用3000L 的水洗脱杂质，再用1000L的40％乙醇溶液洗脱目标物质，收集洗脱液，浓缩至23.86kg；

C.正相纯化：将步骤B的洗脱液，与6kg的100-200目硅胶拌样，硅胶产自烟台江友硅胶开发有限公司，于60℃烘干24h，用粉碎机粉碎过筛，备用。装硅胶柱一根，取100-200目烟台江友硅胶8.0Kg，加二氯甲烷：甲醇＝100:1溶剂充分搅拌，装柱。待硅胶柱装好后，上样，先以二氯甲烷：甲醇＝100:1洗脱3个柱体积，二氯甲烷：甲醇＝30:1洗脱3个柱体积，除去色素和低极性杂质，最后改用二氯甲烷：甲醇＝10:1 洗脱目标，前期用TLC点板，待目标开始洗脱下来，改用HPLC检测跟踪。收集目标流份，于35℃下浓缩至200ml，得黄精碱A浓缩液；

D.中压制备：将步骤C的浓缩液，用纯甲醇溶解，体积约500mL左右，上2根中压制备柱，中压制备柱型号100×460mm，为苏州汇通色谱公司生产，填料为大曹 ODS-RPS，粒径40-60μm。上样后，先用5％乙腈水以30mL/min的流速洗脱5个柱体积，除去前杂；改用30％乙腈水以50mL/min的流速等度洗脱，HPLC检测，收集目标流份，得到HPLC 86％左右的黄精碱A。

E.高压制备：将步骤D所得到的HPLC 86％左右的黄精碱A用10％乙腈水溶解，体积约100ml，进行高压制备，高压制备仪器为岛津LC-20AP，为岛津企业管理(中国)生产，自制高压制备柱型号50×250mm，填料为YMC-Triart C18，粒径7μm。用10％乙腈水以50mL/min的流速等度洗脱，在304nm下检测，收集目标流份；

F.产品回收：将步骤E中得到的高压流份在45℃下避光浓缩至无乙腈味，用中压C18柱脱水，中压C18柱型号46×150mm，为苏州汇通色谱公司生产，填料为大曹 ODS-RPS，粒径40-60μm；上样吸附后，直接利用95％乙腈洗脱目标，得到含高比例乙腈的目标流份，在45℃下避光浓缩，达到快速除水，减小水溶液体积；将水溶液冷冻干燥，得到HPLC纯度98.3％的黄精碱A单体20.5g。

上述工艺步骤中使用的溶剂均为分析纯，30L/桶，为上海星可高纯度溶剂有限公司生产。

获得的黄精碱A。核磁共振图谱参考图3和图4，质谱检测图参考图2。HPLC 纯度检测图谱在图5中。

比较例1

取与实例1同一产地的中药材酒黄精300kg，前处理阶段与实施例1步骤A、B、C、D、E相同。将E步骤获得的含有黄精碱A的水溶液，利用旋转蒸发仪浓缩去除乙腈，将所得的水溶液冷冻干燥，获得固体黄精碱A。因E步骤获得含有黄精碱A 的水溶液体积较大，共约20L，为低比例乙腈，低温浓缩难度加大，使得整个去除乙腈和冷冻干燥的过程耗时约48小时。产品送纯度检测的HPLC图谱参考图6，纯度与实施例1相比要低很多，主峰主要为杂质。高压制备的部分直接进行蒸留冻干导致产物纯度下降严重，不能实现高通量的产物制备。

上述披露的各技术特征并不限于已披露的与其它特征的组合，本领域技术人员还可根据发明之目的进行各技术特征之间的其它组合，以实现本发明之目的，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种黄精碱A的对照品的制备方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

富集浓缩工序：将含有黄精碱A的原料提取物粗品用水溶解，上样至苯乙烯类-二乙烯苯骨架大孔树脂吸附柱，用大孔树脂吸附柱体积10～30倍的水洗脱去除杂质，再利用大孔树脂吸附柱体积3～10倍的以体积比计30～60％的甲醇水溶液或者30～60％的乙醇水溶液洗脱获得含目标物的溶液，浓缩得到含有黄精碱A的第二粗品的工序，苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔树脂为选自AB-8大孔树脂、HPD-100大孔树脂、D-101大孔树脂中的任意种；

正相色谱纯化工序：将含有黄精碱A的第二粗品上样至正相色谱柱，用含有卤代烷烃类溶剂、醇类溶剂的混合洗脱液进行洗脱，卤代烷烃类溶剂：醇类溶剂的比例以体积比计为120～8：1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液浓缩、干燥，得到第三粗品粉末，卤代烷烃类溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氯化碳、1，1-二氯乙烷、1，2-二氯乙烷，醇类溶剂选自甲醇、乙醇；

中压反相色谱纯化工序：将第三粗品粉末上样至粒径为40～60μm的十八烷基硅烷键合硅胶填料的反相色谱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以0.5～1Mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.4～0.8:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，将洗脱液在50℃以下的温度减压浓缩，去除其中的乙腈或甲醇，得到含有黄精碱A的第四粗品粉末；

高压反相色谱纯化工序：将第四粗品粉末上样至粒径为5-10μm的十八烷基硅烷键合硅胶填料的反相色谱柱，用乙腈水溶液或甲醇水溶液的混合洗脱剂，以1～15Mpa压力进行洗脱，其中，乙腈或甲醇：水的比例以体积比计为0.05～0.15:1，根据TLC或者HPLC检测收集洗脱液，得到含有黄精碱A的溶液；

固体化工序：将含有黄精碱A的溶液在50℃的温度以下避光浓缩至无甲醇或者乙腈味，将该溶液吸附于反相色谱柱，利用90％～95％的乙腈或甲醇冲洗反相色谱柱，得到目标流份，在45℃下避光浓缩、冷冻干燥，得到黄精碱A对照品固体。

2.根据权利要求1所述的黄精碱A的对照品的制备方法，其特征在于，

所述含有黄精碱A的原料提取物粗品的制备方法为，将原料中药材酒黄精粉碎，利用醇系的水溶液浸泡，过滤，滤液在30～80℃的温度下避光浓缩至无醇味，获得含有黄精碱A的原料提取物粗品。

3.根据权利要求1所述的黄精碱A的对照品的制备方法，其特征在于，

富集浓缩工序中，苯乙烯-二乙烯苯骨架大孔树脂的孔径为5nm～100nm，利用35％～45％的乙醇水溶液洗脱获得含目标物的溶液。

4.根据权利要求1所述的黄精碱A的对照品的制备方法，其特征在于，正相色谱纯化工序中，所述卤代烷烃类溶剂为二氯甲烷，所述醇类溶剂为甲醇。

5.根据权利要求2所述的黄精碱A的对照品的制备方法，其特征在于，

醇系的水溶液为60％～90％的甲醇水溶液或者60％～90％的乙醇水溶液。

6.根据权利要求1所述的黄精碱A的对照品的制备方法，其特征在于，

中压反相色谱纯化工序中，使用乙腈：水洗脱液，溶液的比例以体积比计为0.40～0.45:1进行洗脱。

7.根据权利要求1所述的黄精碱A的对照品的制备方法，其特征在于，

正相色谱纯化工序中，正相色谱柱的填料为粒径为100～300目的硅胶。

8.根据权利要求1所述的黄精碱A的对照品的制备方法，其特征在于，

在高压反相色谱纯化工序中，使用乙腈：水洗脱液，溶液的比例以体积比计为0.08～0.12:1进行洗脱。

9.根据权利要求1所述的黄精碱A的对照品的制备方法，其特征在于，

在固体化工序中，进一步将去除有机溶剂所得到的固体，在利用8％以下的乙腈或8％以下的甲醇洗脱去除前杂之后，利用90～95％的乙腈洗脱含目标物的纯品。

Images