CN111944019B - 一种抗菌多肽类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用马里亚纳海沟表层沉积物来源真菌Acremoniumsp.HDN16‑126(保藏编号:CCTCC M 2019213)生产多肽类化合物的制备方法,同时涉及该化合物在抗菌感染中的用途,其结构式为:
Description
技术领域
本发明涉及用真菌Acremonium sp. HDN16-126 (保藏编号: CCTCC M 2019213保藏日期:2019年3月28日 保藏单位:中国典型培养物保藏中心 保藏地址:湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学) 制备一种多肽类化合物的方法;本发明还涉及该化合物在治疗细菌感染中的用途。
背景技术
本发明人从一株马里亚纳海沟表层沉积物来源真菌Acremonium sp. HDN16-126固体发酵产物中分离出一个抗菌的多肽类化合物。研究发现所示该化合物具有显著的抗菌活性,表明上述多肽类化合物具有进一步开发成新型抗菌药物的潜力。
发明内容
本发明旨在从真菌来源的次级代谢产物中提供一种结构新颖的具有抗菌感染活性的多肽类化合物。其结构式是
式Ⅰ
本发明的式Ⅰ化合物可通过微生物发酵培养来获取含有该类化合物的发酵物,然后对发酵粗提物采用C-18 ODS柱、中压MPLC和半制备HPLC等方法分离纯化得到。
本发明的下述实施例中列举了利用Acremonium sp. HDN16-126制备本发明式Ⅰ化合物的实例。
具体实施方式:
在如下的实施例中所指的化合物Ⅰ的化学结构(结构式中的***数字是化学结构中碳原子的标位)是:
化合物Ⅰ
实施例1 化合物Ⅰ的发酵生产及分离精制
1 发酵生产
生产菌的发酵培养:按培养微生物的常规方法,取Acremonium sp. HDN16-126适量,接种到PDA固体斜面培养基上,在28℃培养箱中培养5天。
取斜面培养5天的Acremonium sp. HDN16-126适量,接种到装有固体培养基[培养基组成(/瓶):燕麦50 g, 海水200 mL]的1000 mL锥型瓶中,在室温条件下静置培养45天,获得发酵产物。
2 浸膏的获得
固体培养基破碎后用甲醇浸提三次,减压浓缩除去甲醇后用乙酸乙酯萃取三次,再减压浓缩除去乙酸乙酯,得到粗浸膏,共20克。
3 化合物的分离精制
浸膏(20 g)用甲醇溶解后,以甲醇-水为流动相用C-18 ODS柱进行初步分离 ,分为6个流份。组分3以甲醇/水为流动相进行中压液相色谱分离,分为6个组分,组分3-6再经反相半制备高效液相色谱(乙腈:水=47:53)得化合物Ⅰ(10 mg)。
化合物Ⅰ为红色固体, 分子式C79H119N19O20, HR-ESI-MS m/z:1654.8952[M+ H]+,计算值1655.8909); IR (KBr) ν max 3295.74, 2985.53, 2938.03,1653.89,1539.99,1026.84 cm-1。1H and 13C NMR见表1。
表 1 化合物Ⅰ的1H和13C NMR数据(500和125 MHz,in CD3OH-d3)a
a) 本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利
b) 用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t (三重峰)和q(四重峰)、m(多重峰)表示。
c)此栏中的数字和代号分别代表在1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。
d)栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的13C核。
实施例2 化合物的抑菌活性测试
1 实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制 测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物Ⅰ纯品。精密称取适量样品,用DMSO配置成40mmol/L的母液,供给抑菌活性使用。以制霉菌素为真菌的阳性对照药,以环丙沙星为细菌的阳性对照药。阳性药配置成40 mmol/L,供测活性。
致病菌培养液的配制 配置MH培养基,将致病菌从甘油管活化,三区划线,放入28度培养箱培养,24 h后,取3-5个菌落接入100 mL的MH液体培养基中,然后放入28度摇床摇瓶培养,转速为180 rpm/min,24 h后,取5 μL加入20 ml的对应液体培养基中混匀。此时浓度约为106 cfu/mL。
抑菌活性测试方法:96孔板法
将致病菌培养液加入96孔板中,第一行每孔198 μL;以下七行为100 μL。加化合物以及阳性药各2 μL放入第一行中;搅匀后取100 μL放入第二行,再搅匀后放入第三行,依次往下,到最后一行时,混匀后吸出100 μL扔掉,最后,再在每个孔中加入100 μL菌液。此时,每孔共200 μL菌液。(化合物和药浓度为40 mmol/L。此时,第一个孔的化合物浓度为200 μmol/L。)放入28 ℃培养,24 h后观察,完全澄清孔的最小所在浓度即为MIC。本研究以环丙沙星为细菌的阳性对照药。
2 实验结果
在抑菌活性测试中,化合物Ⅰ对变形杆菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌,草分枝杆菌以及蜡状芽孢杆菌活性结果见表2。
表2化合物Ⅰ抑菌活性测试(MIC/μM)
菌株类型 | 阳性药 | 化合物Ⅰ |
变形杆菌 | 1.6 | 1.6 |
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 | 200.0 | 12.5 |
甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌 | 200.0 | 25.0 |
草分枝杆菌 | 12.5 | 6.3 |
蜡状芽孢杆菌 | 25.0 | 12.5 |
3 结论
化合物Ⅰ活性筛选结果显示化合物Ⅰ对变形杆菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌,草分枝杆菌以及蜡状芽孢杆菌等均有明显的抑制作用,可用于预防和治疗细菌感染。
Claims (3)
2.权利要求1所述化合物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:真菌Acremoniumsp.HDN16-126,保藏编号为CCTCC M 2019213,先在PDA固体斜面培养基上于28℃培养箱中培养5天,再次接种于固体发酵培养基中对该真菌在室温条件下静置培养45天;处理发酵产物时,固体培养基破碎后用甲醇浸提三次,减压浓缩除去甲醇后用乙酸乙酯萃取三次,再减压浓缩除去乙酸乙酯,得到粗浸膏;将所述粗浸膏通过C-18ODS柱进行初分离,以甲醇/水为流动相;然后用C-18ODS中压柱层析,以甲醇/水为流动相进行梯度洗脱;最后经反相半制备高效液相色谱分离纯化得权利要求1所述化合物,制备流动相为乙腈:水=47:53。
3.权利要求1所述化合物在制备抗变形杆菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌,草分枝杆菌以及蜡状芽孢杆菌感染药物中的用途。
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