CN114377738B - 液滴生成方法、***及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液滴生成方法、***及其应用，该方法包括：S1、将第二液体移送至所述液滴生成管中，第二液体为与第一液体不混溶的液体；S2、将液滴生成管***到第一液体中，使液滴生成管的第二端口位于第一液体的液面之下；S3、控制容纳腔使其容积发生周期性变化，以及向流体通路内注入驱动流体以驱动第二液体运动。本发明提供了全新的液滴生成方法，突破现有纳升量级液滴生成技术必须采用0.1毫米以下微管道的限制，用显著降低的成本即可实现小体积均一液滴的制备。

Description

液滴生成方法、***及其应用

技术领域

本发明属于液滴生成技术领域，具体涉及一种新的液滴生成方法，及用于该方法的***，以及还涉及该液滴生成方法和该液滴生成***在临床诊断、基因表达分析、微生物检测等领域中的应用。

背景技术

在生物分子诊断方面通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），将样本提取纯化后的核酸（DNA/RNA模板）和Mix；探针引物混合，将液体分割成均匀的液滴；每个液滴包含几个或0个模板，PCR反应后进行信号放大检测，通过泊松分布计算达到对样本病原体的绝对定量，即数字PCR。数字PCR检测方法在基因突变检测分析以及靶向用药伴随检测、癌症的标志物检测、下一代基因测序等领域都有重要的应用。

随着科技发展，微流控与微液滴的结合为一些微反应、微萃取提供了新的方向。在这些应用中，微液滴稳定均一的制备显得尤为重要。传统的液滴制备技术大多使用微管道，利用油相与液相相互形成剪切力形成油包水的微液滴，或是使用物理切割成的微孔来分割液滴。

参见公开号为CN 112439470 A的专利，其公开了一种制备微液滴的加样针以及微液滴的制备方法，其中加样针采用“上部设有用于连接供液适配器的适配部，中部设有用于样品储存的储液部，下部设有用于微液滴生成的吐液部，适配部的上端开口为供液开口，吐液部的下端开口为吐液开口，从供液开口到所述吐液开口直径依次递减，吐液开口内径为25～200微米，外径为200～800微米，加样针与样品溶液以及所述油性液体接触时，接触角均不小于80°”的设计，通过所述加样针制备微液滴时，加样针在油性液体内做速度变化的周期性往复运动，从而使得所述样品溶液在吐液开口处受到油性液体周期性的剪切力，进而使得所述加样针内的所述样品溶液进入所述油性液体内，实现了微液滴生成。显然，该专利中对于加样管的内径、厚度、锥度、角度等均有着严格的要求，加工成本高。

参见公开号为CN 111841439 A的专利，其公开了一种高通量制备均匀单乳液滴的装置及方法，其制备液滴时，先向腔体内持续通入驱动相液体，以形成稳定驱动相流场，接着，向分散相液体通道的入口端持续通入分散相液体，致动单元通过扰动接口输入扰动给分散相液体通道内的分散相液体，实现对分散相液体射流破碎的控制，分散相液体从毛细结构的出口端排出，经过驱动相液体包裹，从排出孔排出，形成单乳液滴。该专利在进行液滴制备时，分散相液体、驱动相液体均是射流状态，第一两股射流的控制比较困难，并且生成的液滴收集时需要在空气中形成，受外部因素影响而造成污染，同时不利于收集和后续的分析；进一步由其结构特点可知，该液滴生成方式并不适合数字PCR液滴或单细胞液滴等生物检测领域的液滴制备，原因是，在这些领域中，待检测样本量通常比较小，不足以如该专利中所介绍的那样能够形成稳定可控的射流。此外，该装置本身结构比较复杂，成本很高。

发明内容

为了克服现有数字PCR液滴、单细胞液滴等液滴制备存在的问题，本发明提供一种新型液滴生成方法。

本发明还进一步提供新型的液滴生成装置和液滴生成***。并且，在此基础上，进一步提供它们在临床诊断、基因表达分析、微生物检测等领域中的应用。

为解决以上技术问题，本发明采取的一种技术方案是：

一种液滴生成方法，该方法采用液滴生成装置和液滴接收器，液滴接收器内放置第一液体，液滴生成装置包括流体通路、容积可变化的容纳腔、以及液滴生成管，液滴生成管具有相对远离的第一端口和第二端口，其中第一端口与容纳腔连通，液滴生成方法包括如下步骤：

S1、将第二液体移送至所述液滴生成管中，第二液体为与第一液体不混溶的液体；

S2、将液滴生成管***到第一液体中，使液滴生成管的第二端口位于第一液体的液面之下；

S3、控制容纳腔使其容积发生周期性变化，以及向流体通路内注入驱动流体以驱动第二液体运动。

根据本发明的液滴生成方法的进一步内容，步骤S3中，所述液滴在所述液滴生成管内形成并随后自所述第二端口流出并进入到所述液滴接收器中。这是非常独特的，相比之下，现有技术中的液滴生成方法，总是在微管道之外才会形成液滴。

根据本发明的液滴生成方法的进一步内容，步骤S3中，所述液滴生成管与液滴接收器二者之间保持相对静止即可，不需要如现有技术那样必须驱动液滴生成管使其往复振动。

根据本发明的液滴生成方法的进一步内容，步骤S3中，容纳腔的周期性变化表现为有一定规律的变化，可以是压缩-恢复的往复变化，或者为膨胀-恢复的往复变化，或者为压缩-恢复-膨胀-恢复的往复变化。在一个具体实施方式中，周期性变化为容纳腔的体积从V0减小为V1，然后再由V1恢复至V0，如此，循环往复。

根据本发明的液滴生成方法的进一步内容，第二端口的内径不低于0.1毫米。优选地，第二端口的内径大于0.2毫米，具体优选为0.2毫米-1毫米。更优选地，第二端口的内径为0.3-0.6毫米。这是非常独特的，相比之下，现有技术中为了获得微液滴，微管道的出口内径总是在0.1毫米以下。该独特的特点给本发明方案带来了显著优势，一是，由于均一液滴的制备受微管道加工精度的影响减小，液滴均一可控性明显提高，二是，加工制造成本显著降低。该独特特点是由于本发明液滴生成原理与现有液滴生成原理截然不同带来的。基于本发明的液滴生成原理，第二端口的内径不能低于0.1毫米，否则无法生成液滴，而超过0.2毫米是优选的，基本上，当第二端口的内径超过0.2毫米，则在一个相当宽泛的条件范围下均可以稳定获得均一的小体积液滴，特别是在0.3毫米-0.6毫米时，此时可适用的条件范围是最为宽泛的。

优选地，所述第一端口的内径大于所述第二端口的内径。

优选地，液滴生成管包括锥形管部，锥形管部的两端分别形成所述第一端口和第二端口，所述锥形管部的锥度为0.05-0.2。在这里，锥度是指锥形管部的进口直径（第一端口的内径）与锥形管部的出口直径（第二端口的内径）的差值与锥形管部的长度的比值。基于本发明的液滴生成方法，锥形管部的锥度对于液滴的生成有着重要的影响，体现在通过锥度的调整可以使得即使在较高的周期性变化频率（例如振动频率）下，也能够获得稳定的液滴。因此，通过锥度的设计可以扩大装置适用的频率范围，满足更广泛的需求。

优选地，所述周期性变化的频率为10Hz-1KHz，优选为50Hz-600Hz，进一步优选为80Hz-600Hz，更优选为100Hz-600Hz，进一步优选为150Hz-600Hz，更进一步优选为150Hz-500Hz；特别优选为150Hz-300Hz。

根据本发明的又一个具体实施和优选方面，步骤S3中，容纳腔、液滴生成管和液滴接收器自上而下依次设置，液滴生成管的第一端口与容纳腔的底部连通，容纳腔的中心线、液滴生成管的轴心线、第一端口的中心线、第二端口的中心线重合，且均沿着竖直方向延伸。

根据本发明的又一个具体实施和优选方面，构成所述容纳腔的壁的至少一部分为活动部，该活动部在外力作用下产生向外或向内的运动，从而增加或减小所述容纳腔的容积。

优选地，活动部由金属或非金属膜构成。

进一步地，所述的容纳腔的顶部或四周侧中的一个或者多个中设有所述活动部。在一个优选实施方式中，所述的容纳腔的单侧壁上设有所述活动部，进一步优选地，该活动部设置在容纳腔的顶侧，构成所述容纳腔的顶壁。

在一些优选实施方式中，将活动部通过连接机构与振动机构连接，从而在步骤S3中，通过振动机构带动所述活动部同步往复振动以控制所述容纳腔的容积发生周期性变化。优选地，往复振动的方向为上下方向。

在另一些优选实施方式中，使振动机构抵接于活动部上，由振动机构的往复振动传递至活动部，使其产生振动从而控制所述容纳腔的容积发生周期性变化。优选地，往复振动的方向为上下方向。

根据本发明，振动机构的类型例如可以是现有技术中已经使用的那些，本发明对此并无特别要求。但作为本发明优选的实施方式，在进行液滴生成时，可采用的振动频率为10Hz-1KHz；可采用的振动幅度为5微米-1000微米。进一步优选地，振动频率为50Hz-600Hz，进一步优选地，振动频率为80Hz-600Hz，更进一步优选地，振动频率为100Hz-600Hz，还进一步优选为150Hz-600Hz，更进一步优选为150Hz-500Hz，还进一步优选为150Hz-300Hz。在一些具体实施方式中，振动的频率为100-300Hz。所述振动的幅度优选为5微米-600微米，更优选为5微米-300微米，进一步优选为5微米-100微米，更进一步为5微米-60微米。在一些实施方式中，振动的幅度为5微米-50微米，在另一些实施方式中，振动的幅度为20微米-60微米。

根据本发明的进一步优选方案，当所述锥形管部的锥度为0.05-0.1时，设置所述振动频率为100Hz-600Hz，所述振动的幅度为10微米-300微米。当所述锥形管部的锥度为0.1-0.2时，设置所述振动的频率为100-300HZ，所述振动的幅度为10微米-600微米。

优选地，步骤S3中，流体为液体。进一步地，其注入速度为2-200微升/分钟，优选为10-50微升/分钟。

优选地，容纳腔为环形腔体，其内径为4-6毫米。此外，优选将容纳腔的内周侧壁设置为沿竖直方向延伸。而且还优选地，容纳腔的内壁表面为光滑表面。

进一步地，根据本发明，步骤S1可在步骤S2之前进行，或者，步骤S1也可在步骤S2之后进行，二者之间的顺序对于液滴的生成效果没有影响。

根据本发明的一个具体实施和优选方面，步骤S1中，将第二液体自液滴生成管的第二端口吸入，并且在之后吸入一部分第一液体，或者不吸入第一液体。

在一些实施方式中，将第二液体自液滴生成管的第二端口吸入，并且在之后吸入一部分第一液体，这样，在开始步骤S3之前，使液滴生成管内的液体自上而下依次分为驱动流体段、第二液体段以及第一液体段。这样做的好处是，能够提高全程制备的液滴的均一性。

在一些实施方式中，将第二液体自液滴生成管的第二端口吸入后不再吸入第一液体，这样，在开始步骤S3之前，液滴生成管内的液体自上而下依次分为驱动流体段、第二液体段。

根据本发明的又一个具体实施和优选方面，液滴生成方法还包括一次液滴生成结束后或下一次液滴生成开始前对所述容纳腔及液滴生成管进行清洗和/或排泡的步骤。

优选地，分别采用容积大小不同的两个柱塞泵来控制驱动流体，结合三通阀来进行切换控制，其中体积较大的柱塞泵用来在清洗和/或排泡的步骤中使用，体积较小的柱塞泵用于在形成液滴的步骤中使用。

根据本发明，第一液体通常为连续相，第二液体通常为分散相；和/或，第一液体通常为油相，第二液体通常为水相。

根据本发明的又一个具体实施和优选方面，第一液体中添加有表面活性剂；第二液体为包含了待检测生物或化学物质的水相。

优选地，液滴为数字PCR液滴或单细胞液滴。液滴的直径为50微米-250微米，优选为200微米以下，更优选为150微米以下，进一步优选为120微米以下，更进一步优选为110微米以下。

本发明采取的另一技术方案是：一种液滴生成***，包括液滴生成装置和液滴接收器，液滴接收器用于收容第一液体和液滴，液滴生成装置包括容积可变化的容纳腔、用于控制容纳腔容积使其呈周期性变化的控制机构、以及具有相对远离的第一端口和第二端口的液滴生成管，液滴生成管的第一端口与容纳腔连通，液滴生成装置还包括用于向容纳腔内通入驱动流体的驱动流体机构，液滴生成管的第二端口的内径在0.1毫米以上。

如上文所阐述的，第二端口的内径优选为大于0.2毫米，具体优选为0.2毫米-1毫米。更优选地，第二端口的内径为0.3-0.6毫米。还优选地，第一端口的内径大于第二端口的内径。液滴生成管包括锥形管部，锥形管部的两端分别形成所述第一端口和第二端口，所述锥形管部的锥度为0.05-0.2。

进一步地，液滴生成管的容积可以为10-200微升。实验表明，液滴生成管的容积对于液滴生成效果的影响较小，这也是本发明液滴生成方法的优势之一。

根据本发明的一个具体实施和优选方面，周期性变化为压缩-恢复的往复变化，或者为膨胀-恢复的往复变化，或者为压缩-恢复-膨胀-恢复的往复变化。

根据本发明的一个具体实施和优选方面，驱动流体机构包括泵和流体通路，液滴生成装置包括基体，基体提供柱形孔和流体通路，并且提供连接液体生成管的连接部，同一基体上，柱形孔、流体通路、连接部各自的数量为一个或多个，柱形孔是上下均开口的圆柱形，在各柱形孔上覆设有膜片，柱形孔和膜片共同构成容纳腔。

优选地，容纳腔、液滴生成管和液滴接收器自上而下依次设置，液滴生成管的第一端口与容纳腔的下开口连通，容纳腔的中心线、液滴生成管的轴心线、第一端口的中心线、第二端口的中心线重合，且均沿着竖直方向延伸。

优选地，各膜片分别包括主体部和活动部，主体部与基体相固定连接，活动部位于柱形孔的正上方，且活动部通过连接件连接于控制机构。

进一步地，膜片可以是金属（例如不锈钢）或非金属膜片；膜片的厚度可以为5微米-2毫米。

优选地，在膜片与基体之间设置有密封结构以使容纳腔始终保持较好的密封。

优选地，控制机构为振动机构，振动机构包括振镜电机、压电陶瓷、音圈电机中的一种或多种，没有特别限制。根据本发明的一个具体优选方面，振动机构优选包括压电陶瓷。

优选地，振动机构提供的振动方向为上下方向，提供的振动频率至少包括50-600Hz，使用时，可以在此范围内具体选择，提供的振动幅度优选至少包括5微米-300微米。

优选地，液滴生成管与所述连接部相可拆卸地连接。如此，液滴生成管部分可以独立于整个***，在完成一次样本溶液的液滴生成时可以拆卸更换。在一些实施方式中，液滴生成管可以直接采用已市售的相应规格的喷头。当然，将液滴生成管与连接部做成一体也是可以的，并不会影响液滴生成效果。

优选地，同一所述基体上，所述的柱形孔、流体通路、连接部各自的数量为2~20个，优选为4~10个。

优选地，柱形孔、流体通路、连接部有多个，基体的两相对侧部分别高于该两相对侧部之间的中间部位，多个柱形孔彼此独立地分布于基体的中间部位且排成二排，各流体通路包括在所述基体的两相对侧部上形成的竖直通路和将该竖直通路与所述柱形孔对应连通的水平通路。采取该结构设计，使装置整体上较为紧凑并且方便操作和控制。

根据本发明的一个具体实施和优选方面，水平通路的端口与容纳腔的内周侧壁之间形成引流部，以使来自水平通路的液体以正切于容纳腔的周向进入容纳腔。

根据本发明的一个具体实施和优选方面，流体通路的一端部与所述基体的容纳腔连通，并且当流体被驱动从流体通路进入容纳腔，流体在所述容纳腔及液滴生成管内形成沿容纳腔及液滴生成管的周向转动的涡流。

根据本发明的又一个具体实施和优选方面，流体通路的一端部与基体的容纳腔连通，流体从流体通路排出的方向偏离容纳腔的轴心线。

以上，通过流体通路与容纳腔等结构设计，整体上可以使得在进行液滴生成之前可以非常方便地将***腔体内的气泡排走，避免气泡存在对于液滴生成的不利影响。

根据本发明，液滴接收器是具有容纳腔的器件，可以是密闭或者非密闭形式，没有特别限制。

本发明采取的另一技术方案是：一种液滴生成装置，其涉及的结构与上述液滴生成***中液滴生成装置相同，只是不包含液滴接收器。

本发明的另一技术方案是：一种上述液滴生成方法、液滴生成***及液滴生成装置在临床诊断、基因表达分析、微生物检测中的应用。

本发明中，对于油相没有特别限制，可以是现有技术所报道的任何合适的油相。优选地，油相包括油和表面活性剂。具体地，所述油可以是例如氟碳油、硅油、矿物油、烃油、植物油中的一种或多种的组合。所述表面活性剂一般具有3~6的亲水亲脂平衡值（HLB）。表面活性剂在油相中的含量一般为0.1wt%~20wt%，优选为0.1%~10%。

适于产生油包水的液滴的表面活性剂在现有技术中已有大量报道，它们均适用于本发明所述的油相中。

作为本发明的一个具体且优选方面，当油是氟碳油时，表面活性剂是含氟表面活性剂，具体例如全氟辛醇、全氟癸醇、全氟十四酸、全氟聚醚羧酸及其衍生物等。

作为本发明的又一具体且优选方面，当油是硅油时，表面活性剂可以为非离子表面活性剂如聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）、硅氧链非离子表面活性剂如ABIL EM90，阴离子表面活性剂如SDS等。

作为本发明的还一具体且优选方面，当油是烃油时，表面活性剂可以为非离子表面活性剂如吐温20、吐温80、硅氧链非离子表面活性剂如ABIL EM90，阴离子表面活性剂如SDS，磷脂等。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明提供了全新的液滴生成方法，突破现有纳升量级液滴生成技术必须采用0.1毫米以下微管道的限制，用显著降低的成本即可实现小体积均一液滴的制备。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1的液滴生成装置的结构示意图；

图2为图1的局部结构示意图；

图3为图2中局部结构示意图；

图4为图3的剖视示意图；

图5为实施例1的液滴生成装置中单个液滴生成单元的剖视示意图；

图6为图5中A-A向剖视示意图；

图7为实施例1的液滴生成***的结构剖视示意图；

图8为实施例1中单个液滴生成单元中充满驱动油的剖视示意图；

图9为实施例1中单个液滴生成单元中形成驱动流体段和第二液体段的剖视示意图；

图10为实施例2的液滴生成***的结构剖视示意图；

图11至图16分别为实施例3至7中所制备的液滴的显微镜图；

图17为显示了液滴生成管靠近出口处的速度场分布的示意图；

附图中：1、液滴生成装置；10、基体；10a、中间部位；10b、左凸起边缘部位；10c、右凸起边缘部位；100、柱形孔；101、连接部；t、通道；11、液滴生成单元；110、容纳腔；111、控制机构；112、液滴生成管；a1、第一端口；a2、第二端口；c1、连接管部；c2、锥形管部；113、驱动流体机构；d1、泵；d2、流体通路；d21、竖直通路；d22、水平通路；d3、引流部；114、膜片；b1、主体部；b2、活动部；115、连接件；y1、第一液体；y2、第二液体；y3、流体；116、密封圈；2、液滴接收器。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体的连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

现有技术中，用于生成微液滴的微管道普遍被认为较小是有利的，因此，实际采用的微管道的内径通常都在0.1毫米以下。同时，现有技术中微液滴的生成技术主要包括共流聚焦方式和微管道振动方式，对于共流聚焦方式而言，分散相液体被振动喷射到连续相中并被连续相包裹后，一起从喷射孔喷射出形成液滴，对于微管道振动方式而言，则需要微管道（加样管）本身做往复振动以产生液滴。

本发明的发明人在大量的实验研究中发现，仅仅是结合分散相振动和适当内径的微管道就实现了均一液滴的制备。基于此发现，发明人进一步对于其机理进行了研究，对影响液滴生成的关键影响因素进行了仿真结构分析，并通过进一步实验进行了验证。研究表明，本发明的液滴生成具有显著不同于现有技术的任一种液滴生成方式的全新生成原理，相比现有的液滴生成方式，该液滴生成方式可以在真正意义上实现非微流控尺度的结构（本发明披露的所有与生成过程相关的腔体和耗材的几何尺度都在0.1毫米尺度以上；一般来说0.1毫米为区分微流控的关键尺寸）生成纳升体积微滴。而现有技术中在数字PCR、单细胞分选等领域的微滴生成技术所实际能够真正使用的结构尺度都是小于或者接近纳升微滴的直径0.1毫米的。利用该液滴生成技术可以用远远大于纳米微滴尺寸的结构产生纳米级微滴，是实现微滴式数字PCR使用成本的核心技术突破。基于该液滴生成技术，甚至可以直接采用一般的移液枪头作为关键的生成耗材。该液滴生成技术，除了分散相的微运动外，无其他机械运动，我们将该技术定名为无振弹射技术（non-vibrational ejection）。本发明披露了一种通过液滴生成管道内的速度梯度造成分散相失稳而生成液滴的技术，实现了纳升精度的控制。

本发明的液滴生成原理描述如下：

驱动机构（例如振动机构）通过与活动部（例如弹性膜片）的直接相连来推拉活动部或者通过与活动部的接触来触动活动部，使得活动部产生周期性振动，带动容纳腔体里面的液体（第二液体/分散相/水相）产生周期性运动，同时持续向腔体注入驱动流体（驱动油），则在液滴生成管出口（第二端口）的油水界面（第一液体与第二液体之间的界面），产生包括前推弹射与回抽运动的周期性运动。在前推弹射阶段，根据管状流体特性，由泊肃叶流动可知，管中间的流速会大于近壁面的流速（如图17所示，其中显示了液滴生成管出口的速度场分布，亮度表示速度大小，可见出口中心的速度为最大，这会拉伸油水界面），导致中间界面的移动速度，大于靠近壁面的界面的移动速度，从而导致油水界面形成锥形界面，界面不断被拉长，由于油水界面处的表面张力具有收缩趋势，将界面切断成液滴的趋势，当拉伸的界面逐渐细长，根据拉普拉斯方程可知，界面张力逐渐增大，超过一定临界值即可切断界面，发生瑞利泰勒不稳定性现象，形成液滴。这也是液滴生成管出口远远大于微滴直径(~0.1mm)时还可以生成的关键原因。后续的回抽运动会拉回锥形界面完成一个周期运动。另外一点需要指出的是，研究发现，液滴生成的确切位置在液滴生成管道内（在一些具体的实验中，液滴在距离出口大约0.5mm处生成），与其他生成技术中液滴形成在管道出口外不同。这也体现了本发明技术的独特性。

本发明所基于的无振弹射技术，相比采用微管道在油性液体中不断高频振动的液滴生成方法来说，具有明显优势，一方面，对微管道伸入油相液体的深度无需严格的要求，并且不会对已经生成的液滴产生破坏，整体生成过程中液滴的品质和生成的操作均更加可控；另一方面，现有技术中对于微管道内径的要求均在0.1毫米以内，内径越大，要求施加的高频摆动频率越高，控制要求高，稳定性较差，同时对于微管道本身制造时一致性的要求也越高，本发明通过对水相液体施加振动，实现液滴的生成，对于微管道的液体进出口内径的要求降低（可以大于0.1毫米，优选0.3毫米以上），既可以保证液滴均一、控制也更加容易，显著降低了加样管加工难度和降低了加工成本。而相比共流聚焦方式来说，本发明在实现液滴生成的均一性和稳定性的前提下，***的结构可以大大简化，结构更加简单、操作更加方便，成本显著降低。

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1至图9所示，本实施例涉及的液滴生成***，包括液滴生成装置1和液滴接收器2。

液滴生成装置1包括基体10、设置在基体10上的多个液滴生成单元11，其中多个液滴生成单元11并联设置，也可以实现单路或多路同时生成液滴。

结合图2所示，基体10为铝块且呈长条形，同时自长条形的中部自表面向下凹陷形成中间部位10a和左凸起边缘部位10b和右凸起边缘部位10c，其中多个液滴生成单元11沿着基体10的长度方向并排且均匀间隔分布。

结合图3和图4所示，在基体10的中间部位10a上设有八个上下延伸的柱形孔100、在每个柱形孔100的下方对应设有连接部101，八个柱形孔10分成两排，其中每排柱形孔10有四个且均匀间隔分布，左右两排柱形孔10左右对齐设置。

结合图5所示，各液滴生成单元11分别包括容积可变化的容纳腔110、用于控制容纳腔110容积使其呈周期性变化的控制机构111、具有相对远离的第一端口a1和第二端口a2的液滴生成管112、用于向容纳腔110内通入驱动流体的驱动流体机构113。

本例中，在柱形孔100上覆设有膜片114，柱形孔100和对应的膜片114共同形成容纳腔110。控制机构111为振动机构，其安装在柱形孔100上方且通过连接件115与膜片114连接，从而控制膜片114的运动实施容纳腔110的容积变化。液滴生成管112竖直设置，其中上端部与连接部101连通，下端部形成液滴出口。驱动流体机构113设置在柱形孔100所靠近的左凸起边缘部位10b或右凸起边缘部位10c。

容纳腔110的中心线、液滴生成管112的轴心线、第一端口a1的中心线、第二端口a2的中心线重合，且均沿着竖直方向延伸。容纳腔110为环形腔体，内径约5毫米，且内周侧壁沿竖直方向延伸。构成容纳腔110的顶部的膜片114（不锈钢材质）分别包括主体部b1和活动部b2，其中主体部b1与基体10相固定连接，活动部b2位于柱形孔100的正上方，且活动部b2通过连接件115连接于控制机构111。控制机构111具体包括压电陶瓷，其可提供上下往复振动，当其往复振动时，会带动活动部b2相对于容纳腔110向内或向外运动，从而相应周期性地改变容纳腔110的容积，相应地，位于容纳腔110内的液体则因该周期性地体积改变而扰动。进一步地，周期性变化可以为压缩-恢复的往复变化，或者为膨胀-恢复的往复变化，或者为压缩-恢复-膨胀-恢复的往复变化。在本例中，至少可以提供的周期性变化包括压缩-恢复的往复变化。进一步的压电陶瓷为40VS12（具有与连接件115相对接的内螺纹）。

液滴生成管112包括连接管部c1和锥形管部c2。锥形管部c2具有第一端口a1和第二端口a2。锥形管部c2的内径自第一端口a1向着第二端口a2逐渐减小，该内径的变化呈现的锥度对于液滴的生成效果有重要的影响。设第一端口a1的内径为R1，第二端口a的内径为R2，第一端口a1和第二端口a2之间的距离（即锥形管部的长度c1）为L，锥度为R1-R2/L。则本例中，采用的锥形管部c2的锥度为0.12，第二端口a2的内径R2为0.5±0.1mm。液滴生成管112的容积为10微升左右。

连接管部c1与锥形管部c2在第一端口a1处相交，其用于可拆卸地套接在连接部101上上，其锥度没有特别要求，但优选大于锥形管部c2的锥度。其中连接部101的中部形成有与容纳腔110相连通的流道t。在将液滴生成管112安装于连接部101上后，容纳腔110通过流道t与液滴生成管112连通。

结合图6所示，驱动流体机构113包括泵d1和流体通路d2，其中流体通路d2包括在基体10的左凸起边缘部位10b上形成的竖直通路d21和将该竖直通路d21与柱形孔100对应连通的水平通路d22。为了有助于排出***腔体内的气泡，在水平通路d22的端口与容纳腔110的内周侧壁之间形成引流部d3，以使来自水平通路d2的液体以正切于容纳腔110的周向进入容纳腔110，如此，流体便在容纳腔110及液滴生成管112内形成沿容纳腔110及液滴生成管112的周向转动的涡流，由此可以容易地排走气泡。在另外一些实施例中，引流部的设置不是必需的，只要是能够使流体从流体通路d22排出的方向偏离容纳腔的轴心线，都可以较好地实现排泡的效果。

本例中，分别采用容积大小不同的两个柱塞泵来控制驱动流体，结合三通阀来进行切换控制，其中体积较大的柱塞泵用来在清洗和/或排泡的步骤中使用，体积较小的柱塞泵用于在形成液滴的步骤中使用。

本例中， 还在膜片114与基体10之间设置有密封圈116以提高容纳腔的密封性。

结合图7所示，液滴接收器2位于第二端口a2的下方，且用于收容第一液体y1和液滴。

在数字PCR领域，第一液体y1通常是配方油，如矿物油，其中优选添加有表面活性剂。第二液体y2通常是待检测生物或化学物质的水相。

结合图8所示，流体y3（驱动油）充满流体通路d2、容纳腔110及液滴生成管112的内腔。进一步的，流体y3和第一液体y1可以采用同一种矿物油。

结合图9所示，通常，在进行液滴生成时，使液滴生成管112内的液体自上而下依次分为驱动流体段和第二液体段。或者，使液滴生成管112内的液体自上而下依次分为驱动流体段、第二液体段和第一液体段；之后，开启驱动机构和流体驱动机构，开始生成液滴。

实施例2

如图10所示，本实施例提供的液滴生成装置，其基本同实施例1，不同的是，其中液滴生成管的第一端口a1至第二端口a2的长度为2L，相应地，液滴生成管112的锥形管部c2所对应的锥度为0.06，即本例中液滴生成管112的锥形管部的锥度为实施例1相应锥度的一半。

实施例3

本实施例的液滴生成方法，其采用实施例中所涉及的液滴生成***，实施过程如下：

S1、采用体积较大的泵（柱塞泵）将流体（驱动油）充满流体通路、容纳腔及液滴生成管的内腔，接着将待测水相（第二液体）经过第二端口吸入液滴生成管内，然后再吸入一段配方油（第一液体），这样，液体生成管内的液体就包括了三段结构，自上而下依次为驱动油段、水相段、配方油段；

S2、将液滴生成管***到配方油中，使液滴生成管的第二端口位于配方油液面下方2mm左右；

S3、在振动机构的振动驱动下直接推拉膜片的活动部同步上下往复振动，控制容纳腔使其容积发生周期性变化，以及向流体通路内注入驱动油以驱动水相运动，此时在液滴生成管的锥形管部内生成液滴，随后所形成的液滴经过液滴生成管的第二端口流出并进入到液滴接收器中，此过程中无需驱动液滴生成管运动，液滴生成管与液滴接收器二者之间保持相对静止。

本例中，按上述步骤，采用水为第二液体，在驱动油的注入速度为36.5微升/分钟，压电陶瓷的振动频率150Hz，振动幅度50微米，输入电压2.5v的条件下制备的液滴如图11、图12所示，其中可见，成功制备了非常均一大小的液滴，且液滴的直径在104微米~106微米之间。

实施例4

本实施例的液滴生成方法，其步骤与实施例3基本相同，不同之处在于：改变驱动油的注入速度。

在驱动油的注入速度为19.5微升/分钟，压电陶瓷的振动频率150Hz，振动幅度50微米，输入电压2.5v的条件下制备液滴，所形成液滴直径参见图13a所示，生成液滴直径为85±1微米左右。

在驱动油的注入速度为15.0微升/分钟，压电陶瓷的振动频率150Hz，振动幅度50微米，输入电压2.5v的条件下制备液滴，所形成液滴直径参见图13b所示，生成液滴直径为78±1微米左右。

实施例5

本实施例的液滴生成方法，其步骤与实施例3基本相同，不同之处在于：改变振动频率。

在驱动油的注入速度为48.7微升/分钟，压电陶瓷的振动频率200Hz，振动幅度50微米，输入电压2.5v的条件下制备液滴，所形成液滴直径参见图14a所示，生成液滴直径在104.00~107.00微米之间。

在驱动油的注入速度为60.8微升/分钟，压电陶瓷的振动频率250Hz，振动幅度50微米，输入电压2.5v的条件下制备液滴，所形成液滴直径参见图14b所示，生成液滴直径在103.00~108.50微米之间。

在驱动油的注入速度为73.0微升/分钟，压电陶瓷的振动频率300Hz，振动幅度50微米，输入电压2.5v的条件下制备液滴，所形成液滴直径参见图14c和图14d所示，生成液滴直径在93.00~106.00微米之间。

由本实施例可见，本发明的液滴生成方法在不同频率下均可以获得较为均一的液滴。

实施例6

本实施例采用实施例2中所涉及的液滴生成装置即采用锥度更小的液滴生成管，在不同振动频率下进行了实验，结果表明，在压电陶瓷的振动频率为600Hz时，仍然能够得到均一的液滴。与实施例3在150Hz下制备液滴的效果相当。

实施例7

本实施例的液滴生成方法，其步骤与实施例3基本相同，不同之处在于：使用RCR试剂代替水作为第二液体来进行液滴生成。RCR试剂使用20ul体系：伯乐supermix 10ul+伯乐demo kit dna 1ul+ fam探针1ul + hex探针1ul +水7ul。

所制备的液滴如图15、图16所示，其中可见，成功制备了非常均一大小的液滴，且液滴的直径均为约104~107微米。

在上述各个实施例中，为防止不同样本的交叉污染可更换，使用后可以将液滴生成管可以拆卸更换，同时上述的液滴生成方案还可以在以下领域应用。

定量：1）、转基因成分分析。微生物检测：1）、水样微生物检测；2）、病原微生物检测。

由以上实施例可知，本发明在液滴的制备上具有多种技术优势，包括但不限于：

1、通过简单的结构即可形成均一微量的液滴，具有可重复连续制备等技术优势，在临床诊断、基因表达分析、微生物检测等场合中均能够应用，具有很好的实用性；

2、液滴在液滴生成管内即生成，在装置既定的情况下，液滴的生成效果主要受振动频率影响，对液滴生成管内径的微小变化、对于液滴生成管***油相界面以下的位置、对于油相的配方组成等等均不敏感，因此，液滴生成的一致性和可控性得到显著提升；

3、装置本身内设排泡结构和功能，在清洗的同时有效实现排泡，避免由于气泡存在对于液滴生成产生干扰；

4、对液滴生成管的内径控制要求显著下降，相应地可以明显降低成本，因此，液滴生成管可作为耗材，防止所生成样品间的相互污染，可以采用一次性液滴生成管；

5、所制备的液滴直接保存在液滴接收器中，无需进行转移，制备完的液滴可以直接进行PCR扩增以及分析，实现液滴生成、分析的一体化；

6、上述应用可将样本分割成大小均一的微量微液滴进行检测，具有检测结果特异性高、灵敏度高、精准度高等优势；同时还可以通过对单个微液滴的检测更利于在微观层面对样本进行分析研究；

7、本发明的液滴生成***及方法应用领域广泛，可以应用的领域包括但不限于以下各方面：

临床诊断：1）、无创产前诊断：通过母体游离的DNA片段对胎儿遗传性疾病的检测；2）、癌症标志物检测；3）、病毒检测；4）、拷贝数变异分析；5）、突变检测。

基因表达分析（主是分析细胞之间遗传基因差异）：1）、基因表达分析；2）、单细胞基因表达分析。

下一代测序方面：1）、测序结果验证；2）、测序文库质控。

转基因成分定量：转基因成分分析。

微生物检测：1）、水样微生物检测；2）、病原微生物检测。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (57)

1.一种液滴生成方法，所述的液滴生成方法采用液滴生成装置和液滴接收器，所述液滴接收器内放置第一液体，其特征在于，所述液滴生成装置包括流体通路、容积可变化的容纳腔、以及液滴生成管，所述的液滴生成管具有相对远离的第一端口和第二端口，其中所述第一端口与所述容纳腔连通，所述液滴生成方法包括如下步骤：

S1、将第二液体移送至所述液滴生成管中，所述第二液体为与所述第一液体不混溶的液体；

S2、将所述液滴生成管***到所述第一液体中，使所述液滴生成管的第二端口位于所述第一液体的液面之下；

S3、控制所述容纳腔使其容积发生周期性变化，以及向所述流体通路内注入驱动流体以驱动所述第二液体运动，所述周期性变化为压缩-恢复的往复变化，或者为膨胀-恢复的往复变化，或者为压缩-恢复-膨胀-恢复的往复变化。

2.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：步骤S3中，所述液滴在所述液滴生成管内形成并随后自所述第二端口流出并进入到所述液滴接收器中。

3.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：步骤S3中，所述液滴生成管与所述液滴接收器二者之间保持相对静止。

4.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：步骤S3中，所述容纳腔、所述液滴生成管和所述液滴接收器自上而下依次设置，所述液滴生成管的第一端口与所述容纳腔的底部连通，所述容纳腔的中心线、所述液滴生成管的轴心线、所述第一端口的中心线、所述第二端口的中心线重合，且均沿着竖直方向延伸。

5.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第二端口的内径不低于0.1毫米。

6.根据权利要求5所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第二端口的内径大于0.2毫米。

7.根据权利要求6所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第二端口的内径为0.2毫米-1毫米。

8.根据权利要求7所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第二端口的内径为0.3毫米-1毫米。

9.根据权利要求8所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第二端口的内径为0.3毫米-0.6毫米。

10.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第一端口的内径大于所述第二端口的内径；和/或，所述液滴生成管包括锥形管部，所述锥形管部的两端分别形成所述第一端口和第二端口，所述锥形管部的锥度为0.05-0.2。

11.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述周期性变化的频率为10Hz-1KHz。

12.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述周期性变化的频率为50Hz-600Hz。

13.根据权利要求12所述的液滴生成方法，其特征在于：所述周期性变化的频率为80Hz-600Hz。

14.根据权利要求13所述的液滴生成方法，其特征在于：所述周期性变化的频率为100Hz-600Hz。

15.根据权利要求14所述的液滴生成方法，其特征在于：所述周期性变化的频率为150Hz-600Hz。

16.根据权利要求15所述的液滴生成方法，其特征在于：所述周期性变化的频率为150Hz-500Hz。

17.根据权利要求16所述的液滴生成方法，其特征在于：所述周期性变化的频率为150Hz-300Hz。

18.根据权利要求1至17中任一项权利要求所述的液滴生成方法，其特征在于：构成所述容纳腔的壁的至少一部分为活动部，该活动部在外力作用下产生向外或向内的运动，从而增加或减小所述容纳腔的容积。

19.根据权利要求18所述的液滴生成方法，其特征在于：所述活动部由金属或非金属膜构成；和/或，所述的容纳腔的顶部或四周侧壁中的一个或者多个中设有所述活动部。

20.根据权利要求18所述的液滴生成方法，其特征在于：所述活动部通过连接机构与振动机构连接，从而在步骤S3中，通过振动机构带动所述活动部同步往复振动以控制所述容纳腔的容积发生周期性变化；或者使振动机构抵接于所述活动部上，由所述振动机构的往复振动传递至活动部，使其产生振动从而控制所述容纳腔的容积发生周期性变化。

21.根据权利要求20所述的液滴生成方法，其特征在于：所述往复振动的方向为上下方向；和/或，所述振动的幅度为5微米-1000微米。

22.根据权利要求21所述的液滴生成方法，其特征在于：所述振动的幅度为5微米-600微米。

23.根据权利要求22所述的液滴生成方法，其特征在于：所述振动的幅度为5微米-300微米。

24.根据权利要求23所述的液滴生成方法，其特征在于：所述振动的幅度为5微米-100微米。

25.根据权利要求24所述的液滴生成方法，其特征在于：所述振动的幅度为5微米-60微米。

26.根据权利要求20所述的液滴生成方法，其特征在于：所述液滴生成管包括锥形管部，所述锥形管部的两端分别形成所述第一端口和第二端口，当所述锥形管部的锥度为0.05-0.1时，设置所述振动频率为100Hz-600Hz，所述振动的幅度为10微米-300微米；当所述锥形管部的锥度为0.1-0.2时，设置所述振动的频率为100-300HZ，所述振动的幅度为10微米-600微米。

27.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：步骤S3中，所述流体为液体，其注入速度为2-200微升/分钟。

28.根据权利要求27所述的液滴生成方法，其特征在于：所述流体的注入速度为10-50微升/分钟。

29.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述容纳腔为环形腔体，其内径为4-6毫米；和/或，所述的容纳腔的内周侧壁沿竖直方向延伸。

30.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述步骤S1在步骤S2之前进行，或者，所述步骤S1在步骤S2之后进行。

31.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述步骤S1中，将所述第二液体自所述液滴生成管的第二端口吸入，并且在之后吸入一部分第一液体，或者不吸入第一液体。

32.根据权利要求1或31所述的液滴生成方法，其特征在于：在开始步骤S3之前，使所述液滴生成管内的液体自上而下依次分为驱动流体段和第二液体段；或者，使所述液滴生成管内的液体自上而下依次分为驱动流体段、第二液体段以及第一液体段。

33.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述液滴生成方法还包括一次液滴生成结束后或下一次液滴生成开始前对所述容纳腔及液滴生成管进行清洗和/或排泡的步骤。

34.根据权利要求33所述的液滴生成方法，其特征在于：分别采用容积大小不同的两个柱塞泵来控制驱动流体，结合三通阀来进行切换控制，其中体积较大的柱塞泵用来在清洗和/或排泡的步骤中使用，体积较小的柱塞泵用于在形成液滴的步骤中使用。

35.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第一液体为连续相，所述第二液体为分散相；和/或，所述第一液体为油相，所述第二液体为水相。

36.根据权利要求1或35所述的液滴生成方法，其特征在于：所述第一液体中添加有表面活性剂；所述第二液体为包含了待检测生物或化学物质的水相。

37.根据权利要求1所述的液滴生成方法，其特征在于：所述液滴为数字PCR液滴或单细胞液滴；和/或，所述液滴的直径为50微米-250微米。

38.根据权利要求37所述的液滴生成方法，其特征在于：所述液滴的直径为200微米以下。

39.根据权利要求38所述的液滴生成方法，其特征在于：所述液滴的直径为150微米以下。

40.根据权利要求39所述的液滴生成方法，其特征在于：所述液滴的直径为120微米以下。

41.根据权利要求40所述的液滴生成方法，其特征在于：所述液滴的直径为110微米以下。

42.一种液滴生成***，包括液滴生成装置和液滴接收器，所述液滴接收器用于收容第一液体和液滴，其特征在于：所述液滴生成装置包括容积可变化的容纳腔、用于控制所述容纳腔容积使其呈周期性变化的控制机构、以及具有相对远离的第一端口和第二端口的液滴生成管，所述液滴生成管的第一端口与所述容纳腔连通，所述液滴生成装置还包括用于向所述容纳腔内通入驱动流体的驱动流体机构，所述液滴生成管的第二端口的内径在0.1毫米以上，所述周期性变化为压缩-恢复的往复变化，或者为膨胀-恢复的往复变化，或者为压缩-恢复-膨胀-恢复的往复变化。

43.根据权利要求42所述的液滴生成***，其特征在于，所述液滴生成管的第二端口的内径大于0.2毫米而小于等于1毫米；和/或，所述第一端口的内径大于所述第二端口的内径；和/或，所述液滴生成管的容积为10-200微升。

44.根据权利要求42所述的液滴生成***，其特征在于，所述液滴生成管的第二端口的内径为0.3-0.6毫米。

45.根据权利要求42所述的液滴生成***，其特征在于，所述驱动流体机构包括泵和流体通路，所述液滴生成装置包括基体，所述基体提供柱形孔和所述流体通路，并且提供连接所述液滴 生成管的连接部，同一所述基体上，所述柱形孔、流体通路、所述连接部各自的数量为一个或多个，所述柱形孔是上下均开口的圆柱形，在各所述柱形孔上覆设有膜片，所述柱形孔和所述膜片共同构成所述容纳腔。

46.根据权利要求45所述的液滴生成***，其特征在于：所述容纳腔、所述液滴生成管和所述液滴接收器自上而下依次设置，所述液滴生成管的第一端口与所述容纳腔的下开口连通，所述容纳腔的中心线、所述液滴生成管的轴心线、所述第一端口的中心线、所述第二端口的中心线重合，且均沿着竖直方向延伸。

47.根据权利要求45所述的液滴生成***，其特征在于：各所述膜片分别包括主体部和活动部，所述主体部与所述基体相固定连接，所述活动部位于所述柱形孔的正上方，且所述活动部通过连接件连接于所述控制机构。

48.根据权利要求45至47中任一项权利要求所述的液滴生成***，其特征在于：所述膜片为金属或非金属膜片；和/或，所述膜片的厚度为0.005-2mm；和/或，在所述膜片与所述基体之间设置有密封结构以密封所述容纳腔。

49.根据权利要求42至47中任一项权利要求所述的液滴生成***，其特征在于：所述控制机构为振动机构。

50.根据权利要求49所述的液滴生成***，其特征在于：所述振动机构包括振镜电机、压电陶瓷、音圈电机中的一种或多种；和/或，所述振动机构提供的振动方向为上下方向。

51.根据权利要求45所述的液滴生成***，其特征在于：所述液滴生成管与所述连接部相可拆卸地连接；和/或，同一所述基体上，所述柱形孔、流体通路、所述连接部各自的数量为2~20个。

52.根据权利要求45所述的液滴生成***，其特征在于：所述柱形孔、流体通路、所述连接部均有多个，所述基体的两相对侧部分别高于该两相对侧部之间的中间部位，所述多个柱形孔彼此独立地分布于所述基体的中间部位且排成二排，各所述流体通路包括在所述基体的两相对侧部上形成的竖直通路和将该竖直通路与所述柱形孔对应连通的水平通路。

53.根据权利要求52所述的液滴生成***，其特征在于：所述水平通路的端口与所述容纳腔的内周侧壁之间形成引流部，以使来自所述水平通路的液体以正切于所述容纳腔的周向进入所述容纳腔。

54.根据权利要求52所述的液滴生成***，其特征在于：所述流体通路的一端部与所述容纳腔连通，并且当流体被驱动从所述流体通路进入所述容纳腔，所述流体在所述容纳腔及液滴生成管内形成沿所述容纳腔及所述液滴生成管的周向转动的涡流。

55.根据权利要求52所述的液滴生成***，其特征在于：所述流体通路的一端部与所述容纳腔连通，流体从所述流体通路排出的方向偏离所述容纳腔的轴心线。

56.一种液滴生成装置，其特征在于：如权利要求42至55中任一项权利要求所述。

57.一种如权利要求1至41中任意一项权利要求所述的液滴生成方法、如权利要求42-55中任意一项权利要求所述的液滴生成***及如权利要求56所述的液滴生成装置在临床诊断、基因表达分析或微生物检测中的应用。

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