CN114369162B - 抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种抗体及其应用，该抗体或抗原结合片段含有选自下列至少之一的CDR序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3；轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4～6。本发明所制备的抗体能够有效与MICA或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，可以有效治疗或预防MICA和/或MICB介导的相关疾病，如促进NK细胞杀伤肿瘤。

Description

抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及抗体及其应用，更具体地，涉及抗体或抗原结合片段、免疫缀合物、组合物、用于检测MICA和/或MICB的试剂盒、所述抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途、药物、所述抗体或抗原结合片段和/或免疫缀合物和/或组合物在制备药物中的用途、核酸、重组载体或转化子。
背景技术
NKG2D在NK细胞形成同源二聚体，并与四个DAP10分子形成六聚体。结合MICA、MICB等配体后，NKG2D六聚体向NK细胞内传导活化信号，促进NK细胞分泌IFN-γ等细胞因子、杀伤表达配体的靶细胞。MICA、MICB是由自体基因编码的蛋白，在正常组织、细胞中不表达；当细胞发生恶性转变成为肿瘤细胞后，MICA、MICB则会表达肿瘤细胞表面。NK细胞通过NKG2D-MICA/B相互作用识别并杀伤肿瘤。
肿瘤则会通过各种机制下调细胞表面MICA/B表达，其中包括基质金属蛋白酶介导的MICA/B脱落。MICA/B是种I型跨膜蛋白，其胞外段包括α1、α2、α3三个结构域，通过α1、α2结构域与NKG2D结合。在基质金属蛋白酶的作用下，MICA/B的胞外段大部分氨基酸(包括α1、α2结构域以及α3结构域的一部分)从肿瘤细胞表面脱落。NKG2D无法结合残留在细胞表面的部分α3结构域，因而肿瘤能够逃逸NK细胞的免疫监视。
研究表明，结合α3结构域的MICA抗体能够抑制MICA从肿瘤表面脱落，进而促进NKG2D-MICA/B介导的NK细胞识别，抑制肿瘤免疫逃逸，因此，开发能够结合α3结构域的MICA抗体对肿瘤的治疗具有重要价值。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
由于MICA、MICB仅表达在肿瘤细胞中，因此，制备靶向MICA、MICB的特异性抗体是潜在的***的手段。发明人将MICA胞外区Fc融合蛋白(MICA-Fc)作为抗原，免疫小鼠后，通过多次筛选，获得含有抗人MICA和MICB免疫球蛋白的小鼠，继续进行亚克隆筛选，以获得目标抗体，经过检测，所述抗体能够与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，促进MICA和/或MICB与NK细胞活化性受体NKG2D的结合，促进NK细胞杀伤肿瘤。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，含有选自下列至少之一的CDR序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3；轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4～6。根据本发明实施例的抗体或抗原结合片段，能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，所述抗体或抗原结合片段具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果，如促进NK细胞杀伤肿瘤。
GFSLTTYG(SEQ ID NO:1)。
IWTDGTT(SEQ ID NO:2)。
VRKGHGYYYAMDY(SEQ ID NO:3)。
SSVSSSY(SEQ ID NO:4)。
STS(SEQ ID NO:5)。
HQYHRSPFT(SEQ ID NO:6)。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种免疫缀合物。根据本发明的实施例，包括第一方面所述的抗体或抗原结合片段。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB蛋白的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，所述抗体或抗原结合片段具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果，如促进NK细胞杀伤肿瘤。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，包括第一方面所述的抗体和/或第二方面所述的免疫缀合物。如前所述，本发明实施例的所述抗体或抗原结合片段、免疫缀合物均能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，因此，包含上述物质的组合物具有相同的效果，更进一步地，所述组合物可以有效促进NKG2D结合MICA和/或MICB，所述抗体或抗原结合片段具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果，如促进NK细胞杀伤肿瘤。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种用于检测MICA和/或MICB的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：第一方面所述的抗体或抗原结合片段。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，因此，所述抗体或抗原结合片段可用于检测MICA和/或MICB，进一步地，可用于制备检测MICA和/或MICB的试剂盒，所述试剂盒可以有效检测MICA和/或MICB，所述试剂盒可用科学研究，如定性或定量检测生物样本中的MICA和/或MICB蛋白分子。
在本发明的第五方面，本发明提出了第一方面所述的抗体或抗原结合片段在制备试剂盒中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒用于检测MICA和/或MICB。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，因此，所述抗体或抗原结合片段可用于检测MICA和/或MICB，进一步地，可用于制备检测MICA和/或MICB的试剂盒。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，包括：第一方面所述的抗体或抗原结合片段和/或第二方面所述的免疫缀合物和/或第三方面所述的组合物。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段、免疫缀合物、组合物均存在能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合的物质，因此，包含上述物质的药物可以有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，进而促进NK细胞进行作用，如杀伤肿瘤细胞，所述药物预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果显著。
在本发明的第七方面，本发明提出了第一方面所述的抗体或抗原结合片段和/或第二方面所述的免疫缀合物和/或第三方面所述的组合物在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段、免疫缀合物、组合物均存在能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合的物质，因此，包含上述物质的药物可以有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，进而促进NK细胞进行作用，如杀伤肿瘤细胞，所述药物预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果显著。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码第一方面所述的抗体或抗原结合片段。根据本发明实施例的核酸编码的抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，所述核酸编码的蛋白具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种重组载体或转化子。根据本发明的实施例，含有第八方面所述的核酸。所述表达载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的重组载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，所述抗体或抗原结合片段具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果，如促进NK细胞杀伤肿瘤。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带第八方面所述的核酸、第九方面所述的重组载体或转化子、或第一方面所述的抗体或抗原结合片段。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达上述抗体，所述抗体能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，所述抗体或抗原结合片段具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果，如促进NK细胞杀伤肿瘤。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合人MICA的ELISA结果图；
图2为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合MICA α3结构域的ELISA结果图；
图3为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合CHO-K1-MICA结果图；
图4为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合CHO-K1-MICB结果图；
图5为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合CHO-K1-Rhesus MIC1结果图；
图6为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合CHO-K1-Rhesus MICB结果图；
图7为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合黑色素瘤A375细胞结果图；
图8为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合肺癌NCI-H1299细胞结果图；
图9为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合K562细胞结果图；
图10为根据本发明具体实施方式的MICA抗体用于Western blot检测的结果图；
图11为根据本发明具体实施方式的MICA抗体促进NKG2D-Fc结合CHO-K1-MICA细胞的结果图；
图12为根据本发明具体实施方式的MICA抗体促进NK92细胞杀伤A375细胞的结果图；
图13为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合MICAα3*002变体的结果图；
图14为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合MICAα3*004变体的结果图；
图15为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合MICAα3*005变体的结果图；
图16为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合MICAα3*008变体的结果图；以及
图17为根据本发明具体实施方式的MICA抗体结合MICBα3*005变体的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本文中，在可变区中某些区域氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度，称为高变区(Hypervariable region，HVR)，高变区为抗原和抗体结合的位置，因此也称为决定簇互补区(complementarity-determining region，CDR)。重链可变区和轻链可变区上均有三个CDR区。
本文中，“抗体”如前所述，本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，或可以被修饰影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗MICA抗体。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以例如增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能的抗体。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
本文所使用的术语“抗原结合片段”尤其是指抗体的部分片段如Fv、scFv(sc指单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者双抗体(diabody)、或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇，如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab’)2-PEG或Fab’-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)，所述片段具有MICA和/或MICB结合活性。优选地，所述抗原结合片段将由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含轻、重链可变区的部分序列，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于和/或MICB，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种抗原结合片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。
本文中，为了进一步提高抗体的生物可接受性，还可以对抗体进行人源化，即，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”是指利用重组DNA技术，将来自一个物种(如小鼠)的单克隆抗体的恒定区氨基酸序列替换为来自另一个物种(如人)的抗体的恒定区而获得的重组抗体。术语“人源化抗体”是指利用重组DNA技术，将来自一个物种(如小鼠)的单克隆抗体的恒定区和可变区的非CDR(Fv骨架区(FR))氨基酸序列全部替换为来自另一个物种(如人)的抗体的恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列而获得的重组抗体。也即，一个抗体的恒定区被人源化时称为嵌合抗体，而恒定区和可变区的非CDR氨基酸序列全部人源化后称为人源化抗体。人源化的方法可以参照常规的抗体工程技术进行，在此不再赘述。
同源性，本发明，为了比较两个或更多个核苷酸序列，可以通过将[第一序列中与相应位置的核苷酸相同的核苷酸的数目相除]来计算第一序列和第二序列之间的“序列同源性”的百分比。第二个序列中的核苷酸]减去[第一个序列中核苷酸的总数]，然后乘以[100％]，其中第二个核苷酸序列中每个核苷酸的缺失，***，取代或添加-相对于第一核苷酸序列-被认为是单个核苷酸(位置)上的差异。
或者，可以使用标准设置，使用用于序列比对的已知计算机算法，例如NCBI Blastv2.0，计算两个或多个核苷酸序列之间的序列同一性程度。
用于确定序列同一性程度的一些其他技术，计算机算法和设置例如在WO 04/037999，EP 0 967 284，EP 1 085 089，WO 00/55318，WO 00/78972，WO 98/49185和GB2357768-A。
对于多肽而言，术语“(实质)同源性”表示，两个多肽或其指定序列在最佳比对及比较(其中适当***或缺失核苷酸)时有至少约80％的氨基酸、通常至少约90％至95％、且更优选至少约98％至99.5％的氨基酸相同。
两条序列之间的同源性％在最佳比对序列时随这些序列所共享的相同位置数而变化(即同源性％＝相同位置数/总位置数×100)，其中最佳比对系考虑到为达成两条序列的最佳比对而需要引入的空位数及每一空位的长度来确定。两条序列之间的序列比较及同一性百分数测定可使用数学算法来完成，如下文非限制性实施例中所述。
在不实质性影响抗体活性(保留至少95％的活性)的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与参比序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性(或同源性)。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明述及的氨基酸序列均按照N端至C端的方式示出。
本文中，“保守修饰形式的氨基酸序列”指这样的氨基酸修饰，所述修饰不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性，该修饰包括氨基酸置换、增加和缺失。修饰可通过例如定点诱变和PCR介导的诱变等标准技术引入本发明的抗体中。保守氨基酸置换系其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域中已经确定具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-支化侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且使可用此处说明的功能测定方法对经改变的抗体的保留功能进行测试。优选的是，保守修饰在数目上不超过1个或2个。
本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种抗体或抗原结合片段，含有选自下列至少之一的CDR序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～3或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:4～6或其保守修饰形式的氨基酸序列。SEQ ID NO:1～6所示的任一氨基酸序列进行保守修饰后不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体或抗原结合片段的结合特性，因此，根据本发明实施例的包含SEQ ID NO:1～6中的至少之一和/或SEQ ID NO:1～6所示的氨基酸序列进行保守修饰后获得的氨基酸序列的至少之一抗体或抗原结合片段，能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，可以有效治疗或预防MICA和/或MICB介导的相关疾病，如促进NK细胞杀伤肿瘤。
GFSLTTYG(SEQ ID NO:1)。
IWTDGTT(SEQ ID NO:2)。
VRKGHGYYYAMDY(SEQ ID NO:3)。
SSVSSSY(SEQ ID NO:4)。
STS(SEQ ID NO:5)。
HQYHRSPFT(SEQ ID NO:6)。
根据本发明一些具体的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体的实施例，包含：具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链CDR1，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链CDR2，具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链CDR3，具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链CDR1，具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链CDR2，具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链CDR3。
根据本发明的一些具体实施例，编码所述重链可变区CDR的基因具有SEQ ID NO:15～17所示的核苷酸序列中的至少之一。
GGGTTTTCACTGACAACTTACGGC(SEQ ID NO:15)。
ATTTGGACTGATGGGACCACA(SEQ ID NO:16)。
GTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTAT(SEQ ID NO:17)。
根据本发明的一些具体实施例，编码所述轻链可变区CDR的基因具有SEQ ID NO:18～20所示的核苷酸序列中的至少之一。
AGCAGCGTGTCCAGCTCCTAC(SEQ ID NO:18)。
TCCACCTCC(SEQ ID NO:19)。
CATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACT(SEQ ID NO:20)。
根据本发明一些具体的实施例，包括重链可变区和轻链可变区，其中，(i)所述重链可变区包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列及其保守修饰形式的氨基酸序列至少之一至少80％同源性的氨基酸序列；和/或，(ii)所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列及其保修修饰形式的氨基酸序列至少之一至少80％同源性的氨基酸序列。
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCIVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGMIWTDGTTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQADDTGIYYCVRKGHGYYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)。
QILLTQSPAILSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTVSNMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:8)。
根据本发明的一些具体实施例，编码所述重链可变区的基因具有SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。
CAGGTGCAGTTGAAACAGTCTGGTCCTGGGCTTGTACAGCCATCTCAGTCTCTGTCTATTACCTGTATTGTGTCCGGGTTTTCACTGACAACTTACGGCGTGCACTGGGTTAGGCAGTCTCCAGGTAAGGGCTTGGAGTGGCTTGGCATGATTTGGACTGATGGGACCACAGACTACAACGCTGCTTTCATCAGTCGCCTGTCCATCAATAAGGACAACTCTAAAAGCCAGGTATTTCTGAAGATGAACAGCTTGCAAGCTGACGACACCGGAATTTACTACTGCGTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGCGTCACAGTATCCTCT(SEQ ID NO:21)。
根据本发明的一些具体实施例，编码所述轻链可变区的基因具有SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
CAGATCCTGTTGACCCAAAGTCCAGCTATTCTTTCAGCCTCTTTGGGCGAACGTGTGACTATGACCTGCACTGCTTCCAGCAGCGTGTCCAGCTCCTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGTTCATCCCCTAAGCTGTGGATCTATTCCACCTCCAACCTCGCTTCAGGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGAGGCGGAAGTGGCACTTCCTACTCACTTACAGTCAGCAACATGGAGGCAGAGGACGCAGCTACCTACTACTGCCATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACTTTCGGGTCCGGTACCAAGCTCGAGATCAAA(SEQ ID NO:22)。
根据本发明一些具体的实施例，所述重链可变区包含与选自(i)中的重链可变区至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或者100％同源性的氨基酸序列；所述轻链可变区包含与选自(ii)中的轻链可变区至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或者100％同源性的氨基酸序列。
根据本发明一些具体的实施例，进一步包括Fc区，所述Fc区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一；
根据本发明一些具体的实施例，所述Fc区的至少一部分来自鼠源、人源、灵长目源IgG抗体或其突变体。
根据本发明一些具体的实施例，所述Fc区的至少一部分来自鼠源IgG2a抗体、人源、灵长目源IgG1抗体或其突变体。
根据本发明一些具体的实施例，所述Fc区的至少一部分来自鼠源IgG2a抗体或其突变体。
根据本发明一些具体的实施例，所述Fc区具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:14)。
根据本发明一些具体的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCIVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGMIWTDGTTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQADDTGIYYCVRKGHGYYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK(SEQ ID NO:9)。
QILLTQSPAILSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTVSNMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQID NO:10)。
根据本发明一些具体的实施例，其中，所述的抗体或抗原结合片段为IgG1、IgG2或IgG4。
根据本发明一些具体的实施例，其中，所述抗体为单克隆抗体、鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、Fv、单链抗体(scFv)、Fab、Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2。
根据本发明一些具体的实施例，其中，所述抗体或其抗原结合片段能够结合SEQID NO:11所示的氨基酸序列。
MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA(SEQ ID NO:11)。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种免疫缀合物，含有治疗剂以及上述抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与所述治疗剂偶联。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB蛋白的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，所述抗体或抗原结合片段具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果，如促进NK细胞杀伤肿瘤，所述抗体或抗原结合片段与治疗剂进行偶联后获得的免疫缀合物同样具有上述功能。
在本发明的再一方面，本发明提出了一种组合物，该组合物含有前面所述的抗体或其抗原结合片段和/或前面所述的免疫缀合物。如前所述，本发明实施例的所述抗体或抗原结合片段、免疫缀合物均能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，因此，包含上述物质的组合物具有相同的效果，如食品组合物或药物组合物，更进一步地，所述组合物可以有效促进NKG2D结合MICA和/或MICB，具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果，如促进NK细胞杀伤肿瘤。
根据本发明的具体实施例，所述组合物进一步包括药学上可接受的载体。
需要注意的是，所述组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述组合物中所含的成分可以以整体施用于受试者，或者分开施用于受试者。当所述组合物中所含的成分分开地施用于受试者时，各个成分可以同时或依次施用于受试者。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种用于检测MICA和/或MICB的试剂盒，其中，所述试剂盒含有前面所述的抗体或抗原结合片段。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，因此，所述抗体或抗原结合片段可用于检测MICA和/或MICB，进一步地，可用于制备检测MICA和/或MICB的试剂盒，所述试剂盒可以有效检测MICA和/或MICB，所述试剂盒可用科学研究，如定性或定量检测生物样本中的MICA和/或MICB蛋白分子，更具体的，可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用MICA和/或MICB蛋白与其抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、MICA和/或MICB抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂。MICA和/或MICB抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试MICA和/或MICB相关疾病。
在本发明的另一方面，本发明提出了前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测MICA和/或MICB。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，因此，所述抗体可用于检测MICA和/或MICB，进一步地，可用于制备检测MICA和/或MICB的试剂盒，所述试剂盒可以有效检测MICA和/或MICB，所述试剂盒可用科学研究，如定性或定量检测生物样本中的MICA和/或MICB蛋白分子更具体的，可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用MICA和/或MICB与其抗体或结合片段特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、MICA和/或MICB抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂。MICA和/或MICB抗体或抗原片段可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试MICA和/或MICB相关疾病。
在本发明的又一个方面，本发明提出了一种药物，包括：前面所述的抗体或抗原结合片段和/或前面所述的缀合物和/或前面所述的组合物，所述药物用于预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病。如前所述，本发明实施例的抗体或抗原结合片段、免疫缀合物、组合物均存在能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合的物质，因此，包含上述物质的药物可以有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，所述药物预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果显著。
根据本发明的一些具体实施例，上述药物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施例，所述MICA和/或MICB介导的疾病为癌症或移植排斥、自身免疫病、感染性疾病。
根据本发明的一些具体实施例，所述癌症为肺癌，肝癌，卵巢癌，***，皮肤癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少一种。
根据本发明的一些具体实施例，包括药学上可接受的载体和有效量的所述抗体活性成分。
如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
本发明的药物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物宜在无菌条件下制造。
本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种核酸，包含编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的序列。根据本发明实施例的核酸编码的抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，促进NKG2D结合MICA和/或MICB，所述核酸编码的蛋白具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果。
根据本发明的具体实施例，所述核酸具有SEQ ID NO:12、13所示的核苷酸序列。
编码所述抗体或抗原结合片段的重链的基因具有如下所示的核苷酸序列：
CAGGTGCAGTTGAAACAGTCTGGTCCTGGGCTTGTACAGCCATCTCAGTCTCTGTCTATTACCTGTATTGTGTCCGGGTTTTCACTGACAACTTACGGCGTGCACTGGGTTAGGCAGTCTCCAGGTAAGGGCTTGGAGTGGCTTGGCATGATTTGGACTGATGGGACCACAGACTACAACGCTGCTTTCATCAGTCGCCTGTCCATCAATAAGGACAACTCTAAAAGCCAGGTATTTCTGAAGATGAACAGCTTGCAAGCTGACGACACCGGAATTTACTACTGCGTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGCGTCACAGTATCCTCTGCCAAAACAACTGCACCATCTGTTTATCCACTGGCCCCCGTTTGCGGGGATACCACTGGTAGCTCTGTCACCCTCGGCTGTCTGGTCAAAGGATATTTCCCCGAGCCTGTGACACTTACCTGGAATTCAGGCAGCTTGTCCTCCGGCGTGCATACTTTCCCTGCAGTCCTGCAGTCAGATCTGTACACCCTCAGCTCATCTGTGACTGTCACAAGTTCTACCTGGCCATCCCAGAGTATTACATGCAACGTGGCCCACCCAGCAAGTTCAACAAAAGTTGACAAGAAGATTGAGCCAAGAGGCCCTACTATCAAGCCCTGTCCCCCCTGTAAGTGTCCTGCACCCAATCTGCTGGGGGGCCCATCTGTGTTTATTTTCCCCCCAAAGATTAAGGACGTCCTCATGATTAGCCTGTCCCCAATCGTGACATGTGTGGTGGTGGATGTTTCTGAGGACGACCCAGACGTACAGATCTCTTGGTTCGTGAACAATGTCGAGGTGCATACAGCCCAGACCCAGACCCATCGGGAAGACTACAACTCTACATTGAGAGTGGTGTCCGCTTTGCCCATCCAGCATCAGGACTGGATGTCCGGCAAGGAGTTTAAATGTAAGGTCAACAACAAGGACCTGCCCGCTCCAATAGAGAGAACTATCTCAAAGCCTAAAGGTAGTGTTCGAGCCCCCCAGGTATACGTACTGCCACCCCCTGAGGAGGAGATGACCAAGAAGCAGGTGACACTGACCTGCATGGTGACAGACTTCATGCCAGAAGACATTTATGTCGAATGGACTAATAATGGCAAGACCGAACTGAATTATAAAAATACCGAACCAGTGCTGGACTCCGACGGGTCCTATTTCATGTACTCTAAGCTCCGTGTCGAAAAGAAGAACTGGGTGGAACGAAACTCTTACTCCTGCAGTGTTGTGCACGAGGGGCTTCACAACCATCATACAACCAAGTCCTTCTCCAGGACACCTGGGAAG(SEQ ID NO:12)。
编码所述抗体或抗原结合片段的轻链的基因具有如下所示的核苷酸序列：
CAGATCCTGTTGACCCAAAGTCCAGCTATTCTTTCAGCCTCTTTGGGCGAACGTGTGACTATGACCTGCACTGCTTCCAGCAGCGTGTCCAGCTCCTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGTTCATCCCCTAAGCTGTGGATCTATTCCACCTCCAACCTCGCTTCAGGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGAGGCGGAAGTGGCACTTCCTACTCACTTACAGTCAGCAACATGGAGGCAGAGGACGCAGCTACCTACTACTGCCATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACTTTCGGGTCCGGTACCAAGCTCGAGATCAAACGAGCTGATGCTGCCCCCACTGTCTCTATTTTTCCTCCTAGTAGTGAGCAGCTGACATCTGGAGGCGCCTCCGTGGTGTGCTTCCTGAATAACTTTTACCCTAAGGACATCAATGTGAAGTGGAAGATCGACGGGAGTGAGAGGCAGAATGGCGTACTGAATTCCTGGACTGATCAGGACTCTAAAGATAGCACCTATAGCATGTCCTCCACCCTCACACTGACAAAGGACGAATACGAACGGCATAACTCCTATACATGTGAGGCTACCCACAAGACATCCACCTCACCAATCGTCAAGAGCTTCAACCGGAATGAGTGT(SEQ ID NO:13)。
需要说明的是，对于本发明说明书和权利要求书中所提及的核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种重组载体或转化子，含有前面所述的核酸。所述重组载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。本发明实施例所提出的重组载体可在适合的宿主细胞中高效表达所述抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，所述抗体或抗原结合片段具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果，如促进NK细胞杀伤肿瘤。
重组载体可以指克隆载体，也可以指表达载体，可以通过将所述核酸与商购的载体(如质粒或病毒载体)可操作地连接而获得，本发明中的重组载体不受特别限制，常用的质粒均可使用，如pSeTag2、PEE14、pMH3等。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组细胞，所述重组细胞携带前面所述的核酸、重组载体或转化子、或抗体或抗原结合片段。所述重组细胞是通过转染或者转化所述表达载体获得的。根据本发明的实施例，所述重组细胞在合适条件下可高效表达上述抗体，所述抗体能够有效与MICA和/或MICB的α3结构域进行结合，进一步地，所述抗体或抗原结合片段具有良好的预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病的效果，如促进NK细胞杀伤肿瘤。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述重组抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合重组抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述重组抗体表达的条件。
下面将对实施例作具体介绍。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1抗体的制备
本实施例主要包括以下内容：
通过生成针对人MICA的鼠源单克隆抗体，然后，用纯化的重组MICA胞外区Fc融合蛋白(MICA-Fc)(重组MICA胞外区Fc融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)作为抗原，免疫Balb/c小鼠(9周龄，购自上海莱斯克，体重20g左右)。免疫小鼠使用纯化抗原和完全弗氏佐剂进行3次免疫，将免疫后的小鼠进行尾静脉放血后，通过ELISA、流式细胞术进行检测，以获得有抗人MICA免疫球蛋白的小鼠。
EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:23)。
从获得的含有抗人MICA免疫球蛋白的小鼠中选取抗MICA免疫球蛋白含量最高的小鼠，取出其脾细胞与鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(ATCC编号CRL-1581)进行融合，制备杂交瘤的具体实验操作为本领域的常规操作。利用融合后的杂交瘤细胞进行抗体筛选，从而得到鼠单抗。
将候选杂交瘤细胞总数量培养到106个，于800rpm条件下离心10分钟收集细胞，并以Trizol试剂盒(Invitrogen)提取杂交瘤细胞的总RNA；以总RNA为模板，逆转录合成cDNA文库(Invitrogen)，又以cDNA为模板PCR扩增杂交瘤细胞中所含抗体所对应的可变区核酸序列。PCR扩增反应中所使用的引物序列与抗体可变区第一框架区或信号肽区和恒定区互补(Larrick，J.W.，et al.，(1990)Scand.J.Immunol.，32，121-128和Coloma，J.J.et al.，(1991)BioTechniques，11，152-156)。在50μL反应体系中，分别加入cDNA 2μL，10×PCR缓冲液5μL，上游及下游引物2μL(5μmol)，dNTP 2μL，Taq酶1μL(Takara，Ex Taq)，H2O 38μL；95℃预变性5min，进入温度循环，进行PCR扩增。反应条件为：94℃变性30S，58℃退火45S，72℃延伸50S，共32个循环，然后72℃延长7min。将扩增产物测序后，得到鼠单抗的重链可变区(SEQID NO:21)和轻链可变区(SEQ ID NO:22)核苷酸序列。鼠单抗的重链可变区(SEQ ID NO:7)和轻链可变区(SEQ ID NO:8)氨基酸序列。
CAGGTGCAGTTGAAACAGTCTGGTCCTGGGCTTGTACAGCCATCTCAGTCTCTGTCTATTACCTGTATTGTGTCCGGGTTTTCACTGACAACTTACGGCGTGCACTGGGTTAGGCAGTCTCCAGGTAAGGGCTTGGAGTGGCTTGGCATGATTTGGACTGATGGGACCACAGACTACAACGCTGCTTTCATCAGTCGCCTGTCCATCAATAAGGACAACTCTAAAAGCCAGGTATTTCTGAAGATGAACAGCTTGCAAGCTGACGACACCGGAATTTACTACTGCGTGCGGAAGGGCCATGGGTACTACTATGCCATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCAGCGTCACAGTATCCTCT(SEQ ID NO:21)。
CAGATCCTGTTGACCCAAAGTCCAGCTATTCTTTCAGCCTCTTTGGGCGAACGTGTGACTATGACCTGCACTGCTTCCAGCAGCGTGTCCAGCTCCTACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGCCTGGTTCATCCCCTAAGCTGTGGATCTATTCCACCTCCAACCTCGCTTCAGGAGTGCCTGCCAGATTTTCCGGAGGCGGAAGTGGCACTTCCTACTCACTTACAGTCAGCAACATGGAGGCAGAGGACGCAGCTACCTACTACTGCCATCAGTATCATAGGTCCCCTTTCACTTTCGGGTCCGGTACCAAGCTCGAGATCAAA(SEQ ID NO:22)。
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCIVSGFSLTTYGVHWVRQSPGKGLEWLGMIWTDGTTDYNAAFISRLSINKDNSKSQVFLKMNSLQADDTGIYYCVRKGHGYYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:7)。
QILLTQSPAILSASLGERVTMTCTASSSVSSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTVSNMEAEDAATYYCHQYHRSPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:8)。
实施例2MICA抗体ELISA结合实验
ELISA实验被用于检测实施例1获得的MICA抗体的结合特性。将上述MICA胞外区Fc融合蛋白(MICA-Fc)包被到96孔板中，抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和MICA的结合特性。
用PBS缓冲液将MICA-Fc融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)稀释为1μg/mL，以100μL/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2 PBS含0.1％Tween 20)缓冲液洗板6次后，加入200μL/孔PBS/10％BSA，37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，采用100μL/孔的PBST/0.05％BSA将待测MICA抗体稀释至合适浓度，然后，于37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠抗体二抗(博士德，BA1050)，于37℃条件下孵育1h。孵育结束后用PBST洗板6次后，加入80μL/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。具体的实验结果如图1所示，表明本发明的抗体能够结合MICA。
EPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:23)。
实施例3 MICA抗体ELISA结合实验
ELISA实验被用于检测MICA抗体的结合特性。MICA胞外区α3结构域Fc融合蛋白(MICAα3-Fc)包被到96孔板中，抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和MICA的结合特性。
用PBS缓冲液将MICAα3-Fc融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示)稀释为1μg/mL，以100μL/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2 PBS含0.1％Tween 20)缓冲液洗板6次后，加入200μL/孔PBS/10％BSA，37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，加入100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释至合适浓度的待测MICA抗体，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠抗体二抗(博士德，BA1050)，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μL/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果(图2)表明本发明的抗体能够结合MICAα3结构域。
VLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:24)。
实施例4 CHO-K1过表达细胞构建
HEK293T细胞按照5×105细胞/孔铺六孔板，用不含双抗的DMEM培养基培养过夜。转染前弃去培养基，加入1mL新鲜的不含双抗的DMEM培养基。将含有目的基因的pLVX-EF1a-IRES-puro载体(pLVX-EF1a-IRES-pruo载体的酶切位点EcoRI与BamHI之间分别***编码MICA(SEQ ID NO:25)、MICB(SEQ ID NO:26)、Rhesus MIC1(SEQ ID NO:27)、Rhesus MICB(SEQ ID NO:28)的核苷酸序列(苏州金唯智合成)、pMD2G、psPAX2载体(共3μg)按照2:1:1的比例加入200μL无血清DMEM培养基中，加入12μg聚醚酰亚胺(PEI，Polysciences有限公司)。混匀后静置16min，然后将全部液体加入铺有HEK293T细胞的六孔板中。培养6h后，弃去培养基，加入新鲜的完全DMEM培养基培养。转染48h后，收细胞培养上清，过0.45μm滤器(Millipore)，即为病毒上清。将病毒上清全部加入含有1×104CHO-K1细胞的6孔板中，加入终浓度4μg/mL的聚凝胺(Sigma)，培养12h。随后弃尽上清，加入新鲜的完全DMEM培养基。所得细胞即为CHO-K1-MICA、CHO-K1-MICB、CHO-K1-Rhesus MIC1、CHO-K1-Rhesus MICB细胞，分别可以表达MICA(SEQ ID NO:11)、MICB(SEQ ID NO:29)、Rhesus MIC1(SEQ ID NO:30)、Rhesus MICB(SEQ ID NO:31)蛋白。
ATGGGCCTTGGCCCTGTGTTTCTGTTGCTTGCTGGGATTTTTCCATTCGCACCTCCCGGTGCCGCCGCAGAGCCCCACAGCTTGCGGTACAATTTGACCGTGCTGTCCTGGGATGGCAGTGTACAAAGCGGCTTTCTGACCGAGGTTCATCTGGATGGACAACCATTCCTGCGCTGCGACAGACAGAAGTGTCGAGCAAAACCCCAGGGTCAGTGGGCAGAAGATGTACTCGGCAATAAGACATGGGATCGAGAAACAAGAGACCTCACAGGAAATGGTAAAGATCTCCGCATGACCCTTGCACACATTAAGGATCAGAAAGAAGGACTGCACTCCCTCCAGGAGATTCGAGTGTGTGAGATTCACGAGGATAACAGCACAAGAAGCTCACAGCATTTTTATTACGATGGAGAACTGTTTCTCAGCCAAAACCTGGAGACCAAAGAGTGGACTATGCCACAGTCCTCCAGAGCTCAGACCCTGGCTATGAATGTCCGTAATTTTTTGAAAGAGGACGCAATGAAGACCAAGACTCACTACCATGCCATGCACGCCGACTGCCTGCAGGAGTTGAGACGATACCTCAAATCCGGGGTTGTGCTCAGGCGGACAGTGCCCCCAATGGTAAACGTGACTCGGTCTGAAGCTTCTGAAGGAAACATCACAGTCACCTGCAGAGCTAGCGGTTTTTACCCCTGGAACATCACTCTCTCCTGGAGACAGGACGGTGTGTCCCTCAGCCATGATACCCAGCAGTGGGGAGACGTGCTGCCCGATGGCAACGGCACTTATCAGACTTGGGTGGCTACTCGAATTTGTCAAGGAGAGGAGCAGCGATTCACATGTTACATGGAGCACTCCGGGAATCATTCAACTCACCCAGTACCCAGCGGAAAGGTCCTTGTGCTGCAGAGTCATTGGCAGACATTTCACGTATCCGCTGTGGCAGCCGCCGCAATTTTCGTCATCATCATTTTCTATGTTCGCTGTTGTAAAAAAAAGACAAGCGCTGCCGAGGGGCCCGAACTGGTGAGCCTCCAGGTGCTGGACCAACATCCCGTGGGCACCAGCGACCATCGCGATGCCACCCAGCTTGGCTTCCAGCCATTGATGTCAGACCTCGGCAGCACAGGCAGCACTGAGGGCGCT(SEQ ID NO:25)。
ATGGGATTGGGTAGGGTTTTGCTTTTTCTCGCTGTGGCTTTCCCCTTTGCACCTCCTGCTGCAGCCGCAGAACCCCATAGCCTTAGGTATAACCTGATGGTGCTCAGTCAAGATGAATCCGTGCAGTCCGGATTTCTTGCCGAGGGCCATCTGGATGGACAACCTTTCTTGCGTTACGATAGGCAGAAACGACGAGCTAAACCACAGGGTCAGTGGGCAGAGGACGTGCTGGGAGCTAAGACTTGGGACACCGAGACCGAGGATCTGACTGAGAACGGGCAGGACCTGAGAAGGACTCTGACACACATCAAGGACCAGAAGGGAGGGTTGCACTCCCTGCAGGAAATCCGCGTGTGTGAGATTCACGAGGACTCATCAACCCGAGGCAGTAGGCACTTTTACTACGATGGAGAGCTGTTTCTGAGTCAGAATCTGGAGACACAAGAGAGCACTGTGCCACAGTCATCTCGGGCTCAGACTCTGGCTATGAACGTTACCAATTTCTGGAAAGAAGATGCTATGAAAACAAAGACCCATTATAGAGCTATGCAGGCCGATTGCCTGCAGAAGTTGCAGCGTTATTTGAAGTCTGGTGTTGCTATCAGGCGGACCGTTCCCCCCATGGTGAATGTGACTTGCTCCGAGGTTTCCGAAGGTAACATTACTGTTACCTGTCGAGCTAGCTCCTTCTACCCACGGAACATTACATTGACATGGAGGCAGGATGGCGTTAGTCTGAGCCATAATACTCAGCAGTGGGGAGACGTTCTGCCTGACGGAAATGGCACATACCAGACCTGGGTTGCCACCAGAATCCGACAGGGCGAAGAGCAGAGGTTTACCTGTTATATGGAGCACAGCGGAAATCATGGGACTCATCCCGTGCCTAGTGGGAAGGTGCTCGTTCTCCAGTCTCAGCGCACTGACTTTCCTTACGTGTCTGCCGCTATGCCATGCTTCGTCATCATTATCATCCTCTGTGTGCCATGCTGCAAGAAGAAAACATCTGCAGCCGAGGGGCCTGAACTTGTGTCCCTGCAGGTTCTGGACCAGCACCCTGTTGGCACCGGAGATCACCGAGACGCAGCCCAACTGGGCTTCCAACCTCTGATGAGCGCCACTGGATCTACTGGTTCTACCGAGGGAGCC(SEQ ID NO:26)。
ATGGGCCCTGGGAGGGTTTTGCTCTTTCTGACCTCTATTTTTCCCTTCGCTAGACCAGGCGCTCCAACAGAGCTCCACAGCTTGCGCTACAACGTGACAGTTCTCAGCAGGGATGGGTCCGTGCAGTCCGATTTCCTCGCTGAGGGCCATCTTGATAGCCAACTCTTCGTCCGCTACGACCGCGAGACACGGCGGGCAAGGCCACAAGGACAGTGGGCCGAGGCTGTGCTGGGCGCAAAAACATGGGACACTGAAACTGGCGATCTCACAGAGAATGGGAAGGACCTGCGGCGTACCCTGACTCACATTGAGGGACAAAAGGGTGGCCTCCACAGCTTGCAGGATATACAGAATTGTGAGATTTACGAGGACGGCTCTACTGGAGGTTCCAGGCATTTTTACTATGATGGGGAGAGATTTCTGTCCCTTAATCTGGCCACTCAGGAGTGGACAGTAGCACAGTCTAGCCGAGCACAGACTCTGGCCATGAACTTCTGGAAGGAAGATACTATGAAAACAAATACACACTACCACGCAATGCAGGCCGATTGCCTGAAAAAGCTGAGACGCTACCAAAAGTCCAGAGTGGCTGTACGACGCACCGCCCCTCCTATGGTGAATGTGACACATTCCGAGGCTAGTGAGGGTAATATTACAGTGACCTGCCGCGCTTCTGGTTTCTACCCCAGAAATATAGCCTTGACCTGGCGACAGGACGGTGTTTCATTGAACCACGACGCCCAGCAGTGGGGCGGCATACTGCCAGACCAGAATGGCACTTACCAGACTTGGGTGGCCACCAGGATTCGGCAGGGCGAGGAACAGCGTTTCGCCTGCTATATGGAGCATAGCGGTAATCACTCTACCCATCCCGTGCCTAGCGGAAAGGTCCTGGTCTTTCAATCTCAGTGGCTGGATATTCCATACGTGCTGGGTGTAGCCGCTGCCGCCGTGGCCGCCGCTGCCGCAATTTTCGTTATTATCCTGTACGTTCTGTGTTGCAAGAAAAAGACTTCAGCCGCCGAAGGCCCCGAGCTCGTGAGTCTGCGCACCCTGGATCAGCACCCCGTTGGTACTGGAGATCACCGTGACGCAACC(SEQ ID NO:27)。
ATGGGTCTGGGAAGAGTATTGCTGTTTCTGGGTCGAGTCCTGCTGTTTCTCGCCTCCATTTTCTCTTTTACTCGACCTCGAGCCGCTGCTGAGCTGCACTCACTCAGATACAACGTGACCGTCTTGTCTAGAGATGGGTCAGTGCAGAGCGAGTTTTTGGCAGAGGGCCATTTGGATGGTCAGCTCTTTGTGAGGTACGATAGGGAAACACGACGTGCTAGACCTCAGGGACAGTGGGCAGAGGCAGTGTTGGGGGACCAGGAGACAGAGGACTTGACCGAGAACGCACAGGACCTGCGCAGAACACTGACCCACATTGAAGGCCAGAAGGGCGGCCTGCATAGTCTGCAGAAGATAAAAATCTGCGAAATTTATGAGGATGGCTCTACTGGCGGATTTTGGCATTTTTATTACGACGGGGAGCTGTTTCTGTCCCTTAATCTGGAGACACAGAAGTGGACAGTAGCTCAGTCATCCCGCGCTCAAACCCTGGCAATGAATTTCTGGAAGGAGGACACTATGAAAACTAATACACACTATAGAGCCATGAGGGCCGATTGCTTGAAAAAACTGTGGAGATACCAGAAGTCTCGGGTTGCTGTGAGAAGGACAGTTCCCCCTATGGTGAATGTCACTCATGGGGAGGCCTCTGAGGGCAACATAACAGTCACATGCAGGGCTTCAGGCTTTTACCCTGGAAACATCACTCTGACTTGGAGACAAGATGGCGTGTCCCTGAGTCACGACGCACAACAGTGGGGCGACGTCCTGCCTGATTGGAATGGCACCTATCAGACATGGGTCGCCACAAGAATCCGACAGGGAGAGGAACAGCGTTTTGCCTGTTACATGGAGCATAGCGGCAATCATTCCACACATCCTGTGCCTTCTGGCAAGCCACCAGTGCTCCAGTCCGAACGGTTGAATCTGCTGTATGTCCCCGTAGCAGTGGCTGTTGCTGTTGTCACTGCCTTTATCATTATCTGCGTTCACCGATGTAAAAAGAAAAAAACATCAGCTGCCGAGGGCCCAGAGTTGGTATCCCTCAGAACTCTTGACCAACACCCTGTCGGAACTGGGGATCATAGAGATGCTACCCAGCTGGGATTCCAGCCTCTCATGAGCGCTCCAGGGTCCACCGGATCAACTGAAGGGGCC(SEQ ID NO:28)。
MGLGPVFLLLAGIFPFAPPGAAAEPHSLRYNLTVLSWDGSVQSGFLTEVHLDGQPFLRCDRQKCRAKPQGQWAEDVLGNKTWDRETRDLTGNGKDLRMTLAHIKDQKEGLHSLQEIRVCEIHEDNSTRSSQHFYYDGELFLSQNLETKEWTMPQSSRAQTLAMNVRNFLKEDAMKTKTHYHAMHADCLQELRRYLKSGVVLRRTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWQTFHVSAVAAAAIFVIIIFYVRCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTSDHRDATQLGFQPLMSDLGSTGSTEGA(SEQ ID NO:11)。
MGLGRVLLFLAVAFPFAPPAAAAEPHSLRYNLMVLSQDESVQSGFLAEGHLDGQPFLRYDRQKRRAKPQGQWAEDVLGAKTWDTETEDLTENGQDLRRTLTHIKDQKGGLHSLQEIRVCEIHEDSSTRGSRHFYYDGELFLSQNLETQESTVPQSSRAQTLAMNVTNFWKEDAMKTKTHYRAMQADCLQKLQRYLKSGVAIRRTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLVLQSQRTDFPYVSAAMPCFVIIIILCVPCCKKKTSAAEGPELVSLQVLDQHPVGTGDHRDAAQLGFQPLMSATGSTGSTEGA(SEQ ID NO:29)。
MGPGRVLLFLTSIFPFARPGAPTELHSLRYNVTVLSRDGSVQSDFLAEGHLDSQLFVRYDRETRRARPQGQWAEAVLGAKTWDTETGDLTENGKDLRRTLTHIEGQKGGLHSLQDIQNCEIYEDGSTGGSRHFYYDGERFLSLNLATQEWTVAQSSRAQTLAMNFWKEDTMKTNTHYHAMQADCLKKLRRYQKSRVAVRRTAPPMVNVTHSEASEGNITVTCRASGFYPRNIALTWRQDGVSLNHDAQQWGGILPDQNGTYQTWVATRIRQGEEQRFACYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVFQSQWLDIPYVLGVAAAAVAAAAAIFVIILYVLCCKKKTSAAEGPELVSLRTLDQHPVGTGDHRDAT(SEQ IDNO:30)。
MGLGRVLLFLGRVLLFLASIFSFTRPRAAAELHSLRYNVTVLSRDGSVQSEFLAEGHLDGQLFVRYDRETRRARPQGQWAEAVLGDQETEDLTENAQDLRRTLTHIEGQKGGLHSLQKIKICEIYEDGSTGGFWHFYYDGELFLSLNLETQKWTVAQSSRAQTLAMNFWKEDTMKTNTHYRAMRADCLKKLWRYQKSRVAVRRTVPPMVNVTHGEASEGNITVTCRASGFYPGNITLTWRQDGVSLSHDAQQWGDVLPDWNGTYQTWVATRIRQGEEQRFACYMEHSGNHSTHPVPSGKPPVLQSERLNLLYVPVAVAVAVVTAFIIICVHRCKKKKTSAAEGPELVSLRTLDQHPVGTGDHRDATQLGFQPLMSAPGSTGSTEGA(SEQ ID NO:31)。
实施例5 MICA抗体流式细胞术结合实验
流式细胞术实验被用于检测MICA抗体的结合特性，于实施例4中获得的CHO-K1-MICA、CHO-K1-MICB、CHO-K1-Rhesus MIC1、CHO-K1-Rhesus MICB细胞中分别加入实施例1制备的MICA抗体(编号为5A1)以及对照组抗体小鼠IgG1(Biolegend，MG1-45)，抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和MICA、MICB、Rhesus MIC1、Rhesus MICB蛋白的结合特性。
用PBS将CHO-K1-MICA、CHO-K1-MICB、CHO-K1-Rhesus MIC1、CHO-K1-Rhesus MICB细胞稀释为2×106/mL，以100μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管山羊血清，于4℃封闭30min。加入不同浓度(10-4、10-3、10-2、10-1、100、101μg/mL)的MICA抗体，于4℃条件下孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃、3500rpm条件下离心5min，弃尽上清，将沉淀再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬含有细胞的沉淀，向其中加入0.1μL/管Alexa-647标记的山羊抗小鼠抗体二抗(Biolegend，405322)，于4℃、避光条件下孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬含有细胞的沉淀，用流式细胞仪进行检测，结果如图3、4、5、6所示，进一步显示本发明的该抗体能够结合MICA、MICB、RhesusMIC1和Rhesus MICB蛋白。
实施例6 MICA抗体流式细胞术结合肿瘤细胞实验
流式细胞术实验被用于检测MICA抗体结合肿瘤细胞的特性，于肺癌NCI-H1299细胞中分别加入MICA抗体(编号为5A1)以及对照组小鼠抗体IgG1(Biolegend，MG1-45)，抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和肿瘤细胞的结合特性。
用PBS将NCI-H1299细胞稀释为2×106/mL，以100μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管山羊血清，于4℃封闭30min。加入不同浓度(10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、100、101、102μg/mL)的MICA抗体、对照组抗体IgG1，于4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃、3500rpm条件下离心5min，弃尽上清，所得沉淀再用PBS洗一遍，再次离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬含有细胞的沉淀，向其中加入0.1μL/管Alexa-647标记的山羊抗小鼠抗体二抗(Biolegend，405322)，于4℃、避光条件下孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，结果如图7、8、9所示，进一步显示本发明的该抗体能够结合黑色素瘤A375细胞、肺癌NCI-H1299细胞、人红白血病K562细胞。
实施例7 MICA抗体的抗原表位特性判断
Western blot实验被用于判断MICA抗体的抗原表位特性。
将实施例4中构建的CHO-K1-MICA、CHO-K1细胞，用PBS洗两遍。然后加入RIPA裂解液，于冰上裂解15min，4℃、15000g条件下离心5min，收集上清。利用BCA试剂盒对裂解上清进行蛋白定量。然后用SDS-PAGE loading buffer配制样品，加样量为50ug/孔。电泳后转膜到硝酸纤维素膜，利用5％脱脂奶粉室温封闭1h。然后加入1:2000(w/v)稀释的MICA抗体，4℃孵育过夜。利用1‰PBST洗膜5min×6次，然后加入1:5000(v/v)稀释的HRP-羊抗小鼠IgG，室温孵育1h。利用1‰PBST洗膜5min×6次。利用ECL底物显影，检测化学发光。结果如图8所示，进一步显示本发明的该抗体能够结合MICA蛋白线性表位。
实施例8抗体促进MICA结合NKG2D能力的筛选
MICA抗体是通过和MICA胞外区的结合，从而促进MICA和其受体NKG2D的信号通路，本实施例通过流式细胞术实验检测MICA抗体对MICA与其受体NKG2D结合的影响。
用PBS将实施例4获得的CHO-K1-MICA细胞稀释为2×106个/mL，以100μL/管的体积加于1.5mL EP管中，向其中加入10μL/管小鼠血清，于4℃封闭30min。加入一系列稀释梯度(10-4、10-3、10-2、10-1、100、101μg/mL)的MICA抗体(编号为5A1)以及对照组抗体IgG1(Biolegend，MG1-45)，于4℃孵育30min。加入2μg/管NKG2D胞外区Fc融合蛋白(NKG2D-Fc，SEQ ID NO:32，本实验室表达获得)，4℃孵育30min。向EP管中加入1mL PBS，于4℃、3500rpm条件下离心5min，弃尽上清，再用PBS洗一遍。离心后弃尽上清，用100μL/管PBS重悬细胞，向其中加入1μL/管647标记的小鼠抗人抗体二抗(Biolegend，HP6017)，4℃、避光条件下孵育30min。用PBS洗两遍，离心后弃尽上清。用200μL/管PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测，结果如11所示，可以看出，本发明的抗体能够促进MICA与受体NKG2D的结合。
IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:32)。
实施例9 MICA抗体促进NK92细胞抗肿瘤
本实施例为体外杀伤实验，用于检测MICA抗体对NK92细胞(ATCC编号CRL-2407)杀伤肿瘤细胞的影响。共设置2组，其中，使用的肿瘤细胞为黑色素瘤A375细胞(ATCC编号CRL-1619)，具体实验操作如下：
(1)A375肿瘤细胞用无血清DMEM培养基洗两遍，于4℃、200g条件下离心5min，弃尽上清；用1mL无血清DMEM培养基重悬获得的沉淀，加入终浓度5μM CTV，于37℃孵育30min。
(2)孵育结束后，向培养体系中加入200μL预冷的胎牛血清终止标记，4℃、200g条件下离心5min，弃尽上清；用含10％胎牛血清的完全RPMI-1640培养基洗细胞沉淀两遍，弃尽上清；用完全RPMI-1640培养基重悬沉淀，进行细胞计数，并用完全RPMI-1640培养基稀释为1.25×105个/mL。
(3)用含10％胎牛血清的完全RPMI-1640培养基将NK92细胞稀释为一系列浓度(2×105个/mL、4×105个/mL、8×105个/mL、1.6×106个/mL)。
(4)将稀释后的PBMC(NK92)以100μL/孔的体积加入96孔圆底板中。
(5)用完全RPMI-1640培养基稀释MICA抗体(5A1)或对照鼠IgG为50μg/mL，以20μL/孔的体积将稀释后的MICA抗体或鼠IgG加入96孔圆底板中。
(6)将稀释后的肿瘤细胞以80μL/孔的体积加入96孔圆底板中。
(7)将步骤(6)获得的96孔圆底板于4℃、1500rpm条件下离心1min，离心后的96孔板于37℃孵育4h。
(8)以1μL/孔的体积向96孔圆底板中加入7-AAD(BD，559925)，混匀。将孔中所有液体转入流式管，利用流式细胞仪进行检测，具体实验结果如图12所示，可以看出，本发明的抗体能够促进NK92细胞杀伤肿瘤。
实施例10：MICA抗体ELISA结合实验
本实施例通过ELISA检测MICA抗体和MICA、MICB的α3结构域的结合特性。发明人将获得的多种MICA、MICB变体胞外区α3结构域(MICAα3*-002、004、005、008，MICBα3*-005)Fc融合蛋白(MICAα3-Fc、MICBα3-Fc)，以及对照组抗体IgG包被到96孔板中，抗体加入后信号的强弱用于判断抗体和MICA、MICB的结合特性。
用PBS缓冲液将融合蛋白(MICA*002α3-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；MICA*004α3-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示；MICA*005α3-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；MICA*008α3-Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示；MICB*005α3-Fc氨基酸序列如SEQ IDNO:37所示)稀释为1μg/ml，以100μL/孔的体积加于96孔板中，于4℃放置过夜。将96孔板中PBS缓冲液吸掉，用PBST(pH7.2 PBS含0.1％Tween 20)缓冲液洗板6次后，加入200μL/孔PBS/10％BSA，37℃孵育2h进行封闭。移去封闭液，用PBST洗板6次后，加入100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释至合适浓度(10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2、10-1、100、101、102μg/mL)的待测MICA抗体，37℃孵育1h。移去反应体系，用PBST洗板6次后，以100μL/孔用PBST/0.05％BSA稀释HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠抗体二抗，37℃孵育1h。用PBST洗板6次后，加入80μL/孔TMB(四甲基联苯胺)，于室温孵育3min，加入80μL/孔4M硫酸终止反应。用酶标仪在450mm处读取吸光值。结果如图13、14、15、16、17，表明本发明的抗体能够结合MICA*002、MICA*004、MICA*005、MICA*008、MICB*005。
RTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASGFYPWNITLSWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:33)。
RRVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHDTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRICQGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:34)。
RTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:35)。
RTVPPMVNVTRSEASEGNITVTCRASSFYPRNIILTWRQDGVSLSHDTQQWGGVLPDGNGTYQTWVATRICRGEEQRFTCYMEHSGNHSTHPVPSGKVLVLQSHWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:36)。
RTVPPMVNVTCSEVSEGNITVTCRASSFYPRNITLTWRQDGVSLSHNTQQWGDVLPDGNGTYQTWVATRIRQGEEQRFTCYMEHSGNHGTHPVPSGKVLALQSQWPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:37)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (14)

1.一种抗MICA和/或MICB抗体或其抗原结合片段，其特征在于，含有如下序列所示的CDR区：
重链可变区CDR序列：SEQ ID NO: 1~3；
轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO: 4~6。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：重链和轻链，所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体、鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、Fv、单链抗体（scFv）、Fab、Fab’，Fab’-SH或F(ab’)2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段能够结合SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列中的至少一部分。
6.一种免疫缀合物，其特征在于，包括治疗剂以及权利要求1-5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与治疗剂偶联。
7.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求6所述的免疫缀合物。
8.一种用于检测MICA和/或MICB的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-5中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段。
9.权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒的中的用途，所述试剂盒用于检测MICA和/或MICB。
10.一种药物，其特征在于，包括：权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求6所述的免疫缀合物和/或权利要求7所述的组合物。
11.权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求6所述的免疫缀合物和/或权利要求7所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗MICA和/或MICB介导的疾病；
任选地，所述MICA和/或MICB介导的疾病为癌症或移植排斥、自身免疫病、感染性疾病；
任选地，所述癌症为肺癌，肝癌，卵巢癌，***，皮肤癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌和头颈癌中的至少一种。
12.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
任选地，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12和13所示。
13.一种重组载体或转化子，其特征在于，含有权利要求12所述的核酸。
14.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求12所述的核酸、权利要求13所述的重组载体或转化子、或权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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