CN114366769A - 秦皮提取物与冰片的药物组合物、其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种秦皮提取物与冰片的药物组合物、其制备方法和用途，所述药物组合物包括3.6‑116重量份的秦皮提取物和1重量份的冰片；秦皮提取物主要以秦皮总香豆素为活性成分，秦皮总香豆素包括秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素；秦皮提取物中秦皮总香豆素的含量在75‑85wt％以上，秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量之和在55‑65wt％以上，含量之比为30.0‑40.0：2.0‑4.0：20.0‑30.0：1。秦皮提取物以中药秦皮饮片或秦皮药材为原料，采用醇提、大孔树脂柱纯化等组合工艺制备得到。本发明组合物能够显著抑制角膜中新生***的形成，对角膜损伤等病症具有较好的治疗作用。

Description

秦皮提取物与冰片的药物组合物、其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物领域，尤其是涉及一种秦皮提取物与冰片的药物组合物、其制备方法及其在制备角膜损伤药物中的用途。
背景技术
中药秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树Fraxinus rhynchophylla Hance、白蜡树Fraxinus chinensis Roxb.、尖叶白蜡树Fraxinus szaboana Lingelsh.或宿柱白蜡树Fraxinus stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮。春、秋二季剥取，晒干。主产于东北、河北、河南、内蒙古、陕西、山西等地，具有清热燥湿，收涩止痢，止带，明目的功效，用于湿热泻痢，赤白带下，目赤肿痛，目生翳膜。秦皮中含有香豆素类、酚类、皂苷、鞣质、生物碱等多种化学成分。香豆素类化合物是秦皮的主要活性成分，其中秦皮甲素和秦皮乙素是秦皮药材质量控制的指标性成分，2020版《中国药典》规定秦皮按干燥品计算，含秦皮甲素(C15H16O9)和秦皮乙素(C9H6O4)的总量，不得少于0.8％。除了秦皮甲素和秦皮乙素外，秦皮苷和秦皮素也是秦皮中主要的香豆素类成分，现有技术中已采用HPLC法建立了秦皮中4种有效成分(秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮素)的含量测定方法(叶皓,李敬伟,曾博文,等.HPLC法测定秦皮4种有效成分的含量.沈阳药科大学学报,2019,(12):6)，结果表明10批秦皮样品中秦皮甲素和秦皮乙素的总量均高于1.0％。秦皮总香豆素被认为是秦皮的主要活性成分，目前对于高纯度秦皮总香豆素(总香豆素含量75-85wt％；秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量之和为55-65wt％)的制备技术还未见报道，对秦皮总香豆素的现代制剂开发和药效评价影响较大。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种秦皮提取物与冰片药物组合物，能够显著抑制角膜***新生。
本发明的目的之二在于提供一种秦皮提取物与冰片药物组合物的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种所述秦皮提取物与冰片药物组合物在制备治疗角膜损伤药物中的用途。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明一方面提供了一种药物组合物，包括3.6-116重量份的秦皮提取物和1重量份的冰片，优选20-116重量份的秦皮提取物和1重量份的冰片。
秦皮提取物
本发明的秦皮提取物主要以秦皮总香豆素为活性成分，具有高纯度秦皮总香豆素，基于秦皮提取物的总重量，秦皮提取物中秦皮总香豆素的含量为75-85wt％；秦皮总香豆素包括秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素，秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量之和为55-65wt％；
优选地，在秦皮提取物中，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素含量之比为30.0-40.0：2.0-4.0：20.0-30.0：1，例如，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素含量之比为35:2.8:27.5:1。
本发明的秦皮提取物通过以下方法制备得到：
(a)以市售的中药秦皮饮片或者秦皮药材为原料，用乙醇水溶液加热回流提取，浓缩，制得秦皮提取液A；
(b)大孔树脂分离：将步骤(1)制得的秦皮提取液A采用大孔树脂吸附法分离，使秦皮提取液A的离心上清液或过滤液通过大孔树脂，用水洗去杂质，再用乙醇水溶液作为洗脱剂洗脱；
步骤(b)中大孔树脂为聚苯乙烯型大孔吸附树脂，例如D101、D301R、HPD100、ADS-7、AB-8、HD450、HPD500，优选为D301R或ADS-7；
(c)干燥：收集步骤(3)的洗脱液，浓缩到合适体积，水浴蒸干后，进一步真空干燥制得秦皮提取物。
制得的秦皮提取物中秦皮总香豆素的含量为75-85wt％，秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量之和为55-65wt％。
在一些实施方式中，步骤(a)中乙醇水溶液的浓度为30vol％-95vol％，优选为75vol％。
在一些实施方式中，步骤(b)中乙醇水溶液的浓度为25vol％-30vol％；洗脱剂用量为柱体积的5-7倍。
在一些实施方式中，秦皮提取液A的离心上清液或过滤液的上样体积为0.8-1.0倍柱体积。
冰片
本发明的冰片为合成龙脑(中国药典)，并非以右旋龙脑(右旋不低于96％)为主的天然冰片，本发明使用的冰片为中药材，其主要由左旋龙脑和右旋龙脑组成(例如左旋和右旋比例大概在60：40)，其中龙脑含量不低于55％，樟脑含量不超过0.5％。
在药物组合物中，相对于1重量份的冰片，秦皮提取物的重量份数典型但非限制性的例如为3.5重量份、3.613重量份、4重量份、5重量份、6重量份、8重量份、10重量份、14.467重量份、15重量份、20重量份、25重量份、28.933重量份、29重量份、30重量份、35重量份、40重量份、45重量份、50重量份、55重量份、57.867重量份、60重量份、65重量份、70重量份、75重量份、80重量份、85重量份、90重量份、95重量份、100重量份、105重量份、110重量份、115重量份、115.733重量份、116重量份，特别优选地，相对于1重量份的冰片，秦皮提取物的重量份数为29重量份、30重量份、115重量份、115.7重量份、116重量份。
本发明的秦皮提取物秦皮总香豆素纯度高，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量高，且它们之间呈一定比例，将其与特定比例的冰片制成药物组合物可以明显增强对角膜损伤中***新生的抑制作用，对角膜损伤等眼科疾病具有较好的治疗作用。
在一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料；
“药学上可接受的辅料”是指本领域通常可接受的用于将生物活性物质递送至动物(具体为哺乳动物)的介质，对此不做特别限制，可以包括(即)佐剂、赋形剂或媒介物，例如稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调控剂、促渗透剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、增甜剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂等，这取决于给药模式和剂型的性质。
在一些实施方式中，所述药物组合物的剂型为滴眼液、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、气雾剂、乳膏剂、透皮贴剂、注射剂或纳米制剂，优选地，所述药物组合物的剂型为滴眼液、颗粒剂、咀嚼片、泡腾片或胶囊剂。
本发明另一方面提供了一种所述药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)获取秦皮提取物：以秦皮为原料，用乙醇溶液加热回流提取，浓缩，得到秦皮提取液A；将秦皮提取液A采用大孔树脂吸附法纯化分离；收集洗脱液，浓缩、干燥获得秦皮提取物；
步骤(1)中大孔树脂吸附法所用吸附树脂选自D101、D301R、HPD100、ADS-7、AB-8、HD450、HPD500中的一种，优选为D301R和ADS-7；
可选地，步骤(1)中乙醇溶液的浓度为30vol％-95vol％，优选为75vol％；
可选地，步骤(1)中大孔树脂吸附法分离所用洗脱剂为乙醇水溶液，浓度为25vol％-30vol％；洗脱剂用量为柱体积的5-7倍；
可选地，秦皮提取液A的上样体积为0.8-1.0倍柱体积；
得到的秦皮提取物中秦皮总香豆素的含量为75-85wt％以上，秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量之和为55-65wt％以上；
优选地，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素含量之比为30.0-40.0：2.0-4.0：20.0-30.0：1；
(2)将秦皮提取物与冰片以重量比3.6-116混合，优选以重量比20-116：1混合得到药物组合物。
关于(2)秦皮提取物与冰片的混合与上文药物组合物中相关内容一致，在此不再赘述。
本发明再一方面提供了一种所述药物组合物或所述制备方法制备得到的药物组合物在制备治疗角膜损伤药物中的用途。
角膜损伤包括角膜碱烧伤、角膜炎、角膜溃疡等眼科疾病，但不仅限于此。
本发明的药物组合物通过抑制角膜中新生***的形成治疗角膜损伤。
本发明上述实施例的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明采用大孔树脂柱纯化技术，提高了秦皮提取物秦皮总香豆素中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮素的含量。通过活性药物含量的提高，进而与冰片组合，提高药物对小鼠角膜碱烧伤模型***新生的抑制作用，该作用强于秦皮总香豆素含量较低的秦冰滴眼液(院内制剂)。
(2)本发明还发现，本发明含高纯度秦皮总香豆素的秦皮提取物只有与冰片在一定含量比复配形成组合物，才能显著抑制角膜中新生***的形成，对角膜损伤等具有较好的治疗作用，且最优比例为20-115.7重量份的秦皮提取物和1重量份的冰片。
(3)本发明中的含高纯度秦皮总香豆素的秦皮提取物与冰片的药物组合物能够抑制角膜***新生，且其作用活性显著高于秦皮提取物，在提取物与冰片的最优比例下，作用优于阳性药环孢素A。且秦皮提取物与冰片组合中冰片本身不具备抑制角膜***新生的作用。
(4)本发明人还意外地发现，在秦皮提取物的制备中，通过控制秦皮乙醇提取物的大孔树脂上样体积，可以制备含特定比例的秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素和秦皮素的秦皮提取物，将该提取物与冰片以特定含量比进行组合可以显著提升药物组合物对于新生***形成的抑制作用。
在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的混标色谱图。
图2为实施例2中秦皮提取物供试品色谱图。
图3为实施例5冰片对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性结果图。
图4为实施例5秦皮提取物对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性结果图。
图5为实施例5秦皮提取物添加右旋龙脑对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性结果图。
图6为实施例5秦皮提取物添加冰片对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性结果图。
图7为实施例5不同秦皮提取物添加冰片对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，提供以下实施例仅出于说明目的并不构成对本发明要求保护范围的限制。
除特殊说明外，在实施例中所采用的原料、试剂、方法等均为本领域常规的原料、试剂、方法。
缩写：DYY(秦冰滴眼液)，TQW(秦皮提取物)，BP(冰片)。
仪器：
紫外-可见分光光度计
液相色谱
荧光显微镜为Nikon ECLIPSE Ti2。
试剂：
以下实施例所用的秦冰滴眼液和冰片来源于上海中医药大学附属龙华医院；环孢素滴眼液(田可明，3ml，30mg CypA)购自京东普生集大药房旗舰店；右旋龙脑购自上海迈瑞尔化学技术有限公司，
Figure BDA0003496529090000051
50购自维克贸易(上海)有限公司；盐酸赛拉嗪注射液购自吉林省华牧动物保健品有限公司；小鼠购自上海中医药大学实验动物中心(北京维通利华实验动物技术有限公司)；
氢氧化钠、PFA、Triton X-100购自上海泰坦科技股份有限公司；生理盐水购自华裕(无锡)制药有限公司；PBS购自GE Healthcare；山羊血清购自上海碧云天生物技术有限公司。
实施例1静态吸附法筛选大孔树脂
称取100g秦皮药材，加入8倍量(800ml)75％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，提取液减压回收乙醇并减压浓缩至133ml，为秦皮提取液。
采用25g不同类型大孔树脂(D101、D301R、HPD100、ADS-7、HD450、HPD500)与10ml秦皮提取液进行静态吸附，计算吸附率。
吸附率(％)＝(原液中总香豆素浓度-吸附后滤液中总香豆素浓度)×滤液体积/原液中总香豆素的含量。
结果表明：D101、D301R、HPD100、ADS-7、HD450、HPD500上述7种大孔树脂对秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮苷元的吸附率均高于50％，其中D301R和ADS-7对秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮苷元的吸附率最高，均高于80％。
实施例2秦皮提取物的制备
称取100g秦皮药材，加入8倍量(800ml)75％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，提取液减压回收乙醇并减压浓缩至133ml(0.75g生药/ml)。上样体积为0.8倍柱体积(BV)，以2BV/h体积流量过已处理好的(用95％乙醇冲至无浑浊，再蒸馏水冲至无醇味)ADS-7大孔树脂，2倍柱体积水洗脱除去杂质，之后用6倍柱体积的25％乙醇洗脱，弃掉前1倍柱体积洗脱液，收集第2-6倍柱体积的25％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得到秦皮提取物。
秦皮提取物中活性成分测定：
1、秦皮提取物中总香豆素的含量测定
(1)对照品溶液的制备
精密称取秦皮甲素对照品5mg置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为200μg/ml的对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
取秦皮提取物60mg，于100ml容量瓶中，甲醇定容，超声5分钟，混匀。
(3)样品的测定
采用紫外-可见分光光度计，取上述(1)秦皮甲素对照品溶液和上述(2)供试品溶液，以甲醇为空白，选择秦皮甲素对照品溶液的最大吸收波长334nm作为测定波长，测定样品溶液中总香豆素的含量。
2、秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量测定
(1)对照品溶液的制备
取秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素对照品适量，精密称定，甲醇溶解，摇匀，即得秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素混合对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
取秦皮提取物60mg，于100ml容量瓶中，甲醇定容，超声5分钟，混匀。从中取1ml到25ml容量瓶中，甲醇定容，滤过，即得。
(3)色谱条件和***适应性
采用液相色谱，色谱柱为Aglient TC-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液：0～20min，8％乙腈；20～30min，8％～80％乙腈；30.1～32min，100％乙腈；32.1～40min,8％乙腈；柱温30℃，体积流量1.0ml/min，检测波长334nm，进样量10μL。混标色谱图见图1，供试品色谱图见图2。
经测定，秦皮提取物中总香豆素含量为81.4±1.3％，其中以秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素为主要成分，含量分别为32.1±1.1％、3.4±1.8％、26.5±2.1％和0.8±0.1％，总含量为62.8％±3.8％。
实施例3秦皮提取物的制备
称取100g秦皮药材，加入8倍量75％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，提取液减压回收乙醇并减压浓缩至133ml(0.75g生药/ml)。上样体积为0.8倍柱体积(BV)，以2BV/h体积流量过已处理好的D301R大孔树脂，2倍柱体积水洗脱除去杂质，之后用7倍柱体积的30％乙醇洗脱，弃掉前1倍柱体积洗脱液，收集第3-7倍柱体积的30％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得到秦皮提取物。
按照上述实施例2方法测定，秦皮提取物中总香豆素含量为77.6±2.1％，其中以秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素为主要成分，含量分别为31.5±2.2％、3.5±1.2％、23.8±1.5％和1.1±0.2％，总含量为59.9％±2.1％。
实施例4秦皮提取物的制备工艺中不同上样体积的影响
称取100g秦皮药材，加入8倍量75％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，提取液减压回收乙醇并减压浓缩至133ml(0.75g生药/ml)。不同的上样体积下以2BV/h体积流量过已处理好的D301R大孔树脂，2倍柱体积水洗脱除去杂质，之后用7倍柱体积的30％乙醇洗脱，弃掉前1倍柱体积洗脱液，收集第3-7倍柱体积的30％乙醇洗脱液，减压浓缩干燥，得到秦皮提取物。
按上述操作考察不同上样体积对秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素洗脱率和含量的影响。
洗脱率计算公式为：Y(％)＝Q2/Q1×100％；其中：Y为对各成分的洗脱率(％)；Q1为树脂未经洗脱前的各秦皮香豆素的吸附容量mg·g-1；Q2为树脂经过洗脱剂一次洗脱后各秦皮香豆素的洗脱量mg·g-1。
总香豆素、秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量测定方法同实施例2。
结果如表1。
表1
Figure BDA0003496529090000081
结果表明，随着上样体积的增加，获得的秦皮提取物中总香豆素含量和四种香豆素含量逐步降低，但是秦皮乙素和秦皮素的柱吸附率在0.3BV和0.5BV的上样体积时，洗脱率较低，最高为51.3％，主要原因是秦皮乙素和秦皮素在提取物中含量较低，过大孔树脂柱时容易发生死吸附，洗脱率较低，因此优选的上柱体积为0.8BV和1.0BV，其产物中四种香豆素含量比分别为35:2.8:27.5:1和32.3：3.3：25.3：1。
实施例5秦皮提取物和冰片组合物对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性研究
1、冰片对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性研究
试验过程：
构建小鼠眼角膜碱烧伤模型：
首先应用舒泰(75mg/kg体重)和盐酸赛拉嗪注射液(10mg/kg体重)麻醉小鼠，麻醉剂腹腔注射。将直径2mm的圆形滤纸片于1mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡30s后取出，吸走表面多余氢氧化钠溶液，将滤纸片置于小鼠眼角膜中央30s，产生急性碱烧伤区域，取走滤纸片，用生理盐水冲洗眼睛，洗去残留氢氧化钠溶液。
测定冰片对碱烧伤角膜***的抑制作用：
以秦冰滴眼液和0.1％CypA(环孢素滴眼液稀释10倍)作为对照。
实验分组为对照组(Ctrl，角膜未经碱烧伤)、模型组(Model，碱烧伤，用生理盐水滴眼)、秦冰滴眼液组(DYY，碱烧伤，用秦冰滴眼液滴眼)、冰片组(0.75mg/ml BP，碱烧伤，用0.75mg/ml冰片滴眼)和阳性对照组(0.1％CpyA，碱烧伤，用0.1％CpyA滴眼)。
给药方式为滴眼，10μl/次，4次/天，给药七天。
给药七天后处死小鼠，摘取眼球，进行角膜免疫荧光染色。用4％的PFA(多聚甲醛溶液)固定眼球1小时后，取出角膜，将角膜置入4％PFA溶液中固定过夜，PBS清洗角膜，去除残留PFA。角膜于阻断缓冲液(5ml山羊血清+500μl Triton X-100+94.5ml PBS)中孵育2小时，使组织通透，随后加入一抗(Mouse LYVE-1MAb，R&D systems，5μg/ml)孵育过夜，洗涤除去未结合的一抗后，于二抗(Anti-rat IgG(H+L)Alexa
Figure BDA0003496529090000091
488Conjugate，CellSignaling Technology，2μg/ml)中孵育2小时，将角膜从周围向中心做四个切口(蝴蝶状)，平铺于载玻片上，用50％甘油封片，应用荧光显微镜进行拍照。照片采用Image J1.52a软件计算***面积，用GraphPad Prism软件作图，所有实验结果用Mean±SD表示，组间比较用配对t检验，多组间比较用One-Way ANOVA检验。
结果如图3所示(**和***表示与模型组(Model组)对比，有非常显著性差异(p<0.01)和极显著性差异(p<0.001))，秦冰滴眼液组(DYY)和阳性对照组(0.1％CpyA)均能显著抑制角膜中新生***的形成，而冰片组(0.75mg/ml BP，该剂量为滴眼液配制时所用剂量)对角膜中新生***的形成无显著抑制活性。说明在秦冰滴眼液中作为辅料的冰片不能抑制角膜***新生。
2、秦皮提取物对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性研究
应用小鼠角膜碱烧伤模型，测定秦皮提取物对***新生的抑制作用。小鼠碱烧伤模型同上。
实验分组为对照组(Ctrl，角膜未经碱烧伤)、模型组(Model，碱烧伤，用含1％DMSO的生理盐水滴眼)、秦冰滴眼液组(DYY，碱烧伤，用秦冰滴眼液滴眼)、100mg/ml秦皮提取物组(100mg/ml TQW，碱烧伤，用100mg/ml秦皮提取物(实施例2)滴眼)、50mg/ml秦皮提取物组(50mg/ml TQW，碱烧伤，用50mg/ml秦皮提取物(实施例2)滴眼)和25mg/ml秦皮提取物组(25mg/ml TQW，碱烧伤，用25mg/ml秦皮提取物(实施例2)滴眼)，药物均用含1％DMSO的生理盐水配置，滴眼方式、用量及给药时间同上。角膜免疫荧光染色方法同上。
结果如图4所示(**表示与模型组(Model组)对比，有非常显著性差异(p<0.01))，秦冰滴眼液组(DYY)能够显著抑制角膜中新生***的形成，但不同剂量的秦皮提取物组(100mg/ml TQW，50mg/ml TQW和25mg/ml TQW)均不能显著抑制角膜***新生。说明单独使用秦皮提取物中的活性成分可能由于透过性不佳，难以进入角膜损伤部位并发挥作用。冰片具有促透作用，可能在促进秦冰滴眼液中活性成分渗透进入角膜过程中发挥重要作用。
3、秦皮提取物添加右旋龙脑对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性研究
应用小鼠角膜碱烧伤模型，测定秦皮提取物添加右旋龙脑RLN对***新生的抑制作用。小鼠碱烧伤模型同上。
实验分组为对照组(Ctrl，角膜未经碱烧伤)、模型组(Model，碱烧伤，用含1％DMSO的生理盐水滴眼)、秦冰滴眼液组(DYY，碱烧伤，用秦冰滴眼液滴眼)、50mg/ml秦皮提取物(实施例2)添加0.75mg/ml右旋龙脑组(50mg/ml TQW+RLN，碱烧伤)、25mg/ml秦皮提取物(实施例2)添加0.75mg/ml右旋龙脑组(25mg/ml TQW+RLN，碱烧伤)和12.5mg/ml秦皮提取物(实施例2)添加0.75mg/ml右旋龙脑组(12.5mg/ml TQW+RLN，碱烧伤)，药物均用含1％DMSO的生理盐水配置，滴眼方式、用量及给药时间同上。角膜免疫荧光染色方法同上。
结果如图5所示(*和***表示与模型组(Model组)对比，有显著性差异(p<0.05)和极显著性差异(p<0.001))，秦冰滴眼液组(DYY)能够显著抑制角膜中新生***的形成，不同剂量的秦皮提取物添加0.75mg/ml右旋龙脑(100mg/ml TQW+RLN，50mg/ml TQW+RLN和25mg/ml TQW+RLN)均能够显著抑制角膜中新生***的形成，但作用效果比秦冰滴眼液差。
4、秦皮提取物添加冰片对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性研究
应用小鼠角膜碱烧伤模型，测定秦皮提取物添加冰片对***新生的抑制作用。小鼠碱烧伤模型同上。
实验分组为对照组(Ctrl，角膜未经碱烧伤)、模型组(Model，碱烧伤，用含1％DMSO的生理盐水滴眼)、秦冰滴眼液组(DYY，碱烧伤，用秦冰滴眼液滴眼)、86.8mg/ml秦皮提取物(实施例2)添加0.75mg/ml冰片组(86.8mg/ml TQW+BP，碱烧伤)、43.4mg/ml秦皮提取物(实施例2)添加0.75mg/ml冰片组(43.4mg/ml TQW+BP，碱烧伤)、21.7mg/ml秦皮提取物(实施例2)添加0.75mg/ml冰片组(21.7mg/ml TQW+BP，碱烧伤)、15mg/ml秦皮提取物(实施例2)添加0.75mg/ml冰片组(15mg/ml TQW+BP，碱烧伤)、10.85mg/ml秦皮提取物(实施例2)添加0.75mg/ml冰片组(10.85mg/ml TQW+BP，碱烧伤)、2.71mg/ml秦皮提取物(实施例2)添加0.75mg/ml冰片组(2.71mg/ml TQW+BP，碱烧伤)和阳性对照组(0.1％CpyA，碱烧伤，用0.1％CpyA滴眼)，药物均用含1％DMSO的生理盐水配置，滴眼方式、用量及给药时间同上。角膜免疫荧光染色方法同上。
结果如图6所示(*、**和***表示与模型组(Model组)对比，有显著性差异(p<0.05)、非常显著性差异和极显著性差异(p<0.001))，秦冰滴眼液组(DYY)和阳性对照组(0.1％CpyA)能够显著抑制角膜中新生***的形成，不同剂量的秦皮提取物添加0.75mg/ml冰片(86.8mg/ml TQW+BP，43.4mg/ml TQW+BP，21.7mg/ml TQW+BP，15mg/ml TQW+BP，10.85mg/mlTQW+BP和2.71mg/ml TQW+BP)均能够显著抑制角膜中新生***的形成。其中21.7mg/ml的秦皮提取物相当于秦冰滴眼液中按照药材配比剂量。说明在秦皮提取物中加入冰片后，能够显著抑制角膜***新生，且其作用活性与秦冰滴眼液和环孢素A相当。结果显示，秦皮提取物与冰片含量之比在3.6-115.7范围，对角膜中新生***的形成具有较好的抑制作用，其中最佳配比为20-115.7，对角膜中新生***的形成的抑制作用，效果最好，这优于院内制剂秦冰滴眼液。
5、不同秦皮提取物添加冰片对小鼠角膜碱烧伤模型中***新生的作用活性研究
应用小鼠角膜碱烧伤模型，测定不同秦皮提取物添加冰片对***新生的抑制作用。小鼠碱烧伤模型同上。
实验分组为对照组(Ctrl，角膜未经碱烧伤)、模型组(Model，碱烧伤，用含1％DMSO的生理盐水滴眼)、秦冰滴眼液组(DYY，碱烧伤，用秦冰滴眼液滴眼)、采用实验例4中不同秦皮提取物添加0.75mg/ml冰片组(86.8mg/ml TQW，0.3BV：四种香豆素含量比133:5.4:100:1；0.8BV：四种香豆素含量比35:2.8:27.5:1)和阳性对照组(0.1％CpyA，碱烧伤，用0.1％CpyA滴眼)，药物均用含1％DMSO的生理盐水配置，滴眼方式、用量及给药时间同上。角膜免疫荧光染色方法同上。
结果如图7所示(*、**和***表示与模型组(Model组)对比，有显著性差异(p<0.05)、非常显著性差异和极显著性差异(p<0.001))，采用0.8BV上样体积制备的秦皮提取物+BP对角膜中新生***的形成的抑制作用明显优于0.3BV上样体积制备的秦皮提取物+BP。结果显示，采用0.8-1.0BV上样体积制备的秦皮提取物中秦皮乙素和秦皮素含量高于0.3BV上样体积制备的样品，其对角膜中新生***的形成的抑制作用也最优。
实施例6秦皮提取物和冰片滴眼液制备
称取秦皮提取物21.7g用重蒸馏水溶解，得到秦皮提取物溶液；另取硼酸8g，硼砂6g，硫代硫酸钠1g，羟苯乙酯0.3g，加注射用水400ml加热使溶解，搅匀，加入上述秦皮提取物溶液，放冷，得到溶液A；再取冰片0.75g，加二甲亚砜10g，搅拌使溶解，缓缓加至溶液A中，边加边搅拌，加注射用水至1000ml，搅匀，过滤，取滤液蒸汽灭菌30分钟，放冷，无菌分装。
实施例7秦皮提取物和冰片颗粒制备
称取秦皮提取物217g和冰片7.5g，加适量糊精和蔗糖可溶性淀粉(提取物：糊精：可溶性淀粉1:40:60)，用乙醇制软材，16目筛制颗粒，60℃以下干燥，得到颗粒。
实施例8秦皮提取物和冰片咀嚼片制备
称取秦皮提取物21.70g和冰片0.75g,分别加入微晶纤维素85g、甘露醇40g搅拌均匀，放入干燥箱内120℃烘干，研磨，细粉过100目筛，加入单晶冰糖细粉30g，搅拌均匀，过筛，在制好的颗粒中加入千分之一的硬脂酸镁，压片，0.8g/片，得到咀嚼片。
实施例9秦皮提取物和冰片泡腾片制备
称取秦皮提取物21.70g和冰片0.75g、淀粉150g，碳酸氢钠150g，柠檬酸150g，甜蜜素9g，混合后用无水乙醇制粒，干燥后压制成片，0.8g/片，得到泡腾片。
实施例10秦皮提取物和冰片胶囊的制备
称取秦皮提取物217g和冰片7.5g，与淀粉按照1：10混匀，装入1号空心胶囊，即得胶囊剂。
以上各实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：在没有脱离本发明权利要求所限定的精神和实质的范围内，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换仍然在本发明权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括3.6-116重量份的秦皮提取物和1重量份的冰片；
其中，所述秦皮提取物以秦皮总香豆素为活性成分，秦皮总香豆素包括秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素；
基于秦皮提取物的总重量，秦皮提取物中秦皮总香豆素的含量为75-85wt％，秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量之和为55-65wt％。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素含量之比为30.0-40.0：2.0-4.0：20.0-30.0：1，例如，秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素含量之比为35:2.8:27.5:1。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括20-116重量份的秦皮提取物和1重量份的冰片。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料；
所述药物组合物的剂型为滴眼液、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、气雾剂、乳膏剂、透皮贴剂、注射剂或纳米制剂。
5.一种药物组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取秦皮提取物：以秦皮为原料，用乙醇溶液加热回流提取，浓缩，得到秦皮提取液A；将秦皮提取液A采用大孔树脂吸附法纯化分离；收集洗脱液，浓缩、干燥，获得秦皮提取物；
步骤(1)中，大孔树脂吸附法所用吸附树脂选自D101、D301R、HPD100、ADS-7、AB-8、HD450、HPD500中的一种，优选为D301R或ADS-7；
其中，步骤(1)得到的秦皮提取物中秦皮总香豆素的含量为75-85wt％，秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素的含量之和为55-65wt％；
(2)将秦皮提取物与冰片以重量比3.6-116：1混合，优选以重量比20-116：1混合，得到所述药物组合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)得到的秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素含量之比为30.0-40.0：2.0-4.0：20.0-30.0：1。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的乙醇溶液的浓度为30-95vol％，优选为75vol％。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的大孔树脂吸附法中秦皮提取液A的上样体积为0.8-1.0倍柱体积；
优选地，步骤(1)的大孔树脂吸附法所用的洗脱液为25-30vol％的乙醇。
9.一种如权利要求1-4任一项所述的药物组合物或如权利要求5-8任一项所述的制备方法制备得到的药物组合物在制备治疗角膜损伤治疗药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述药物组合物通过抑制角膜中新生***的形成达到治疗角膜损伤的作用。
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