CN114354916A - 一种酶联免疫荧光法检测试剂盒及其在检测蛋白含量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶联免疫荧光法检测试剂盒及其在检测蛋白含量中的应用。本发明采用双抗夹心法原理设计,捕获抗体包被于固相基材或介质上,加入含待检测物的样品和碱性磷酸酶标记的检测抗体后,则形成双抗体夹心结构的复合物,清洗去除游离成分后再加入聚集诱导发光型荧光底物,酶促反应产生的荧光信号与样品中的待检测物浓度呈正比。本发明开发的检测试剂盒,包括微孔板、磁珠溶液(与预包被微孔板二选一)、校准品、质控品和碱性磷酸酶标记抗体,聚集诱导发光型荧光底物,检测缓冲液,洗液。本发明的检测试剂盒,采用双抗体夹心酶联免疫荧光法,本发明的制备方法制备出的检测试剂盒使用时具有良好的灵敏度和精密度。
Description
技术领域
本发明属于医学检验技术领域,具体涉及一种酶联免疫荧光法检测试剂盒及其在检测蛋白含量中的应用。
背景技术
传统比色酶联免疫法因为操作耗时,灵敏度不足或检测范围窄等原因,其应用市场在持续萎缩,逐渐为化学发光法替代。
铁蛋白(Ferritin,Fer)是动植物体内广泛存在的一类贮存铁的蛋白。在哺乳类动物的肝和脾中含量最多。其外径约12~14nm,空囊腔径长约6nm,外壳(即脱铁Fer)由24个亚基组成,每个亚基约含163个氨基酸残基,每个分子最多可结合4500个铁原子。分子量约为450KDa。结合铁的Fer是“溶”于水的,血浆Fer的浓度与体内储存的铁成正比。正常人血清中含有少量Fer,一般正常均值男性约15-200μg/L;女性约12-150μg/L,Fer含量测定是目前诊断隐性贫血最早最准确的指标,诊断符合率达95%以上。
在临床上,Fer既是诊断缺铁性贫血的重要指标,也是恶性肿瘤的标志物之一。Fer的测定适用于了解体内铁代谢的情况,在治疗初期检测铁蛋白可反映当时体内铁的储量,可以早期发现铁储存的不足。正常情况下储存铁可用于血红蛋白的合成,低于12ng/mL,判断为潜伏期铁不足。如果Fer水平较高,又排除供铁不正常的可能性,则反映体内铁过量的状况。另外,Fer也是一种广谱肿瘤标志物,可用于肝癌、肺癌等肿瘤的辅助诊断。Fer测定以400ng/mL为正常上限,某些肿瘤常常升高且大于此值,常见于急性白血病、何杰金氏病、肺癌、结肠癌、肝癌和***癌。检测Fer对肝脏转移性肿瘤有诊断价值,76%的肝转移病人的Fer含量高于400ng/mL,与AFP联合检测,尤其是AFP正常的肝癌患者,可提高诊断正确率。
龙琦等在研究重型β-地中海贫血患儿脑组织T2*与铁过载关系时,将研究对象依据血清铁蛋白水平的不同分为轻度组(血清铁蛋白水平在1000~2500μg/mL之间)与重度组(血清铁蛋白水平>2500μg/mL)(龙琦,王舞妮,陈光福.重型β-地中海贫血患儿脑组织T2*与铁过载关系及其发病机制研究[J].现代医院,2019,19(01):70-73.)。铁蛋白定量检测试剂盒的最新版行业标准对检测的线性范围要求为不窄于[10,500]ng/mL(YYT 1456-2016铁蛋白定量检测试剂(盒))。这表明在实际应用中需求具有更宽的检测线性范围。
CA15-3,是一种乳腺组织抗原蛋白,呈“Y”形,由正常的或癌变的乳腺细胞分泌,其分子量约400KDa(300~450KDa)。CA15-3是粘蛋白1(MUC-1)的糖蛋白,正常情况下,MUC-1仅在质膜顶端表达,糖基化正常。而当发生癌变时,MUC-1表达升高且极性消失从而扩展到整个质膜表面,被人体免疫***识别,形成肿瘤抗原。另外,MUC-1的胞外区也在解朊作用下失去了附着力量而融入血液中,或是MUC-1在癌变中发生可变剪接失去跨膜区而溶入血液中,即临床检测到的CA15-3。
CA15-3存在于多种腺癌细胞内,是乳腺癌最重要的特异性标志物,其含量的变化与治疗效果密切相关,是乳腺癌患者诊断和监测术后复发、观察疗效的最佳指标。一般,血清CA15-3的参考值为<30U/mL。
乳腺癌常有CA15-3升高,在乳腺癌初期敏感性较低,约60%,而转移性乳腺癌的阳性率可达80%。在欧洲,CA15-3常用来作为乳腺癌辅助诊断指标,也是用于术后随访,监测肿瘤复发,转移的指标。但是其他肿瘤如肺癌,肾癌,结肠癌,胰腺癌,卵巢癌,肝癌等也可能有不同程度的升高。患者血清CA15-3水平的消长与乳腺癌病情变化相平行,是复发和转移的重要信号,而且这种信号的发出要比临床症状的出现和用诸如B超、X线或CT等检出复发和转移的时间要早。据分析研究,乳腺癌患者血清CA15-3水平变化与其局部***及远处转移情况之间存在改变的一致性,尤其是有远处转移灶者,其CA15-3表达水平及阳性率均显著增加。因此,CA15-3具有监视乳腺癌转移的作用,如其血清水平持续升高,则应开始或加强化疗、放疗或改用内分泌治疗等。
因此,实现高灵敏度和精密度的蛋白含量检测是目前研究的重点,具有重要的应用前景。
发明内容
针对传统(比色型)酶联免疫法技术的不足,本发明的目的是提供一种(荧光型)酶联免疫荧光法检测试剂盒及其在检测蛋白含量中的应用;本发明基于“聚集诱导发光”的新型荧光分子,其具有抗光漂白能力强,发光效率高等特点,所以本发明采用酶联免疫法原理,利用“聚集诱导发光”型荧光分子作为底物,构建一种酶联免疫荧光检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
本发明公开了一种(荧光型)酶联免疫荧光法检测试剂盒及其在检测血液或其它组织液中一种或多种蛋白含量中的应用。该方法采用双抗夹心法原理设计,捕获抗体包被于固相基材或介质上,加入含待检测物的样品和碱性磷酸酶标记的检测抗体后,则形成双抗体夹心结构的复合物,清洗去除游离成分后再加入聚集诱导发光型荧光底物,酶促反应产生的荧光信号与样品中的待检测物浓度呈正比。用于包被捕获抗体的基材包括聚苯乙烯材质微孔板和磁珠。应用该方法开发的检测试剂盒,因其捕获抗体固相化介质选用不同而呈现出两种形态。
一种酶联免疫荧光法检测试剂盒,包括两种形态:
(1)包括预包被微孔板、校准品、质控品和碱性磷酸酶标记抗体、聚集诱导发光型荧光底物溶液、检测缓冲液、洗液;所述微孔板上预包被有捕获抗体,用于捕获样品中的待检测物;所述校准品和质控品由不同浓度的待检测物基因工程重组蛋白或提取的人天然蛋白配制而成,所述校准品至少包括5个浓度,所述质控品至少包括1个浓度;或
(2)包括预处理微孔板/反应管/反应杯、磁珠溶液、校准品、质控品和碱性磷酸酶标记抗体、聚集诱导发光型荧光底物溶液、检测缓冲液、洗液;所述磁珠上预包被有捕获抗体,用于捕获样品中的待检测物;所述校准品和质控品由不同浓度的待检测物基因工程重组蛋白或提取的人天然蛋白配制而成,所述校准品至少包括5个浓度,所述质控品至少包括1个浓度。
优选的,所述碱性磷酸酶标记抗体的效价范围为1:(400~1000);进一步优选的,所述碱性磷酸酶标记抗体的效价范围为1:400。
优选的,所述预包被的捕获抗体和碱性磷酸酶标记的检测抗体,二者对待检测物应具有不同的结合位点。
优选的,所述聚集诱导发光型荧光底物为TPE-phos、AE-phos;所述聚集诱导发光型荧光底物经碱性磷酸酶催化生成新的产物分子继而聚集形成微小聚集体,在激发光下发射出强烈的荧光。进一步优选的,所述底物溶液TPE-phos的工作浓度范围为80μmol/L~100μmol/L,所述底物溶液AE-phos的工作浓度范围为400μmol/L~500μmol/L。
优选的,所述底物溶液为即用型的,或是由底物原液经由底物稀释液现配现用型的。
优选的,所述捕获抗体为蛋白的鼠单克隆抗体。
优选的,所述校准品的浓度为0~1000ng/mL;所述质控品的浓度为50~500ng/mL。
优选的,所述预包被微孔板的制备包括以下步骤:
1)取捕获抗体,用CBS缓冲液稀释;
2)向微孔板各孔中加入稀释后所得抗体溶液,2~8℃冰箱或室温18~25℃静置8-16h,然后弃去孔中溶液,再向每孔中加入200μL 1%BSA溶液,室温静置1~2小时后弃去,干燥,铝箔袋密封包装。
进一步优选的,所述稀释后所得抗体溶液的浓度范围为5.0~10.0μg/mL;更优选为5.0μg/mL。
优选的,所述预包被有捕获抗体磁珠的制备包括以下步骤:
1)取羧基磁珠溶液,磁力保留磁珠弃去上清液;用预冷MES缓冲液涡旋振荡清洗至少3次;
2)磁力保留磁珠弃去上清液,加入NHS溶液,振荡分散均匀;再加入EDC溶液,振荡混匀;室温下在四维混合仪上持续混合20~40min,此期间每隔2~5min振荡混匀1次;
3)磁力保留磁珠弃去上清液,加入预冷MES缓冲液振荡清洗至少2次,最后重悬于预冷MES缓冲液中;
4)将3)中所得的磁珠悬液分至少3次转移到MES缓冲液溶解的预冷捕获抗体溶液中,每次加入磁珠悬液后,立即振荡混匀,完成后静置10~15min,期间每间隔2~4min再混匀一次;最后,将混悬液于室温下持续温和振荡混合90~120min;
5)磁力保留磁珠弃去上清液;
6)加入封闭液,温和振荡混匀,室温反应20~40min;
7)磁力分离弃去上清液,加入洗涤液,用移液枪吹打洗涤至少3次;
8)磁力分离弃去上清液,加入保存液将抗体偶联磁珠浓度调节为2~3mg/mL,温和振荡混匀,2~8℃保存备用。
上述的酶联免疫荧光法检测试剂盒在检测蛋白含量中的应用。
优选的,所述蛋白为血液或其它组织液中一种或多种。
优选的,检测方法包括一步法和二步法。
优选的,所述蛋白为铁蛋白、糖蛋白CA15-3等。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明是一种蛋白检测试剂盒,采用双抗体夹心酶联免疫荧光法,本发明的制备方法制备出的蛋白检测试剂盒使用时具有良好的灵敏度和精密度。
附图说明
图1为本发明产品内外包装3D图。
图2为本发明实施例1中试剂盒的检测标准曲线图。
图3为本发明实施例4中试剂盒的检测标准曲线图。
图4为本发明实施例7中试剂盒的检测标准曲线图。
图5为本发明实施例中所用聚集诱导发光型荧光底物TPE-phos的结构式。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明酶联免疫荧光法检测蛋白试剂盒的制备方法包括以下步骤:
1)制备预包被第一鼠抗蛋白单克隆抗体的微孔板或第一鼠抗蛋白单克隆抗体偶联磁珠;
2)制备碱性磷酸酶标记鼠抗蛋白单克隆抗体;
3)制备蛋白校准品制剂;
4)制备蛋白质控品制剂;
5)制备底物溶液;
6)配制检测缓冲液;
7)配制浓缩洗液。
优选的,所述包被有鼠抗蛋白单克隆抗体的微孔板的制备包括以下步骤:
1)取鼠抗蛋白单克隆抗体,用10mmol/L的CBS缓冲液(pH9.6)稀释;
2)稀释后所得抗体溶液浓度约为5.0μg/mL,然后向微孔板各孔中加入100μL,2~8℃冰箱或室温(18~25℃)过夜,然后弃去孔中溶液,再向每孔中加入200μL1%BSA溶液,室温静置1~2小时后弃去,并将微孔板移至干燥间抽干,铝箔袋密封包装。
优选的,所述第一鼠抗蛋白单克隆抗体偶联磁珠的制备包括以下步骤:
1)取0.5mg均匀分散的羧基磁珠溶液到2.0mL圆底离心管中,磁力保留磁珠弃去上清液;用预冷MES缓冲液每次200μL涡旋振荡清洗3次;
2)磁力保留磁珠弃去上清液,迅速加入100μL NHS溶液,立即振荡分散均匀;再加入100μL EDC溶液,立即振荡混匀;室温下在四维混合仪上持续混合30min,此期间每隔2~5min振荡混匀1次;
3)磁力保留磁珠弃去上清液,每次加入200μL预冷MES缓冲液振荡清洗2次,最后重悬于100μL预冷MES缓冲液中。
4)取MES缓冲液溶解的预冷抗体溶液10μg(0.5mg/mL)于圆底离心管中;将3)中活化的磁珠悬液分3次转移到管中(维持混悬液在4℃左右);每次加入磁珠后,立即温和振荡混匀;完成后继续保持在4℃左右10~15min,并间隔3min再混匀一次;最后,将混悬液于室温下持续温和振荡混合约90min。
5)磁力保留磁珠弃去上清液。
6)加入200μL封闭液(1.0M甘氨酸),温和振荡混匀,室温反应约30min。
7)磁力分离弃去上清液,每次加入200μL洗涤液(0.01M PBS缓冲液),用移液枪吹打洗涤3次。
8)磁力分离弃去上清液,加入保存液(20mM HEPES缓冲液)将抗体偶联磁珠浓度调节为2.5mg/mL,温和振荡混匀,2~8℃保存备用。
以下实施例1~6以酶联免疫荧光法检测铁蛋白试剂盒,实施例7~9以酶联免疫荧光法检测糖类抗原CA15-3试剂盒为例进行具体说明。
实施例1
(一)本实施例所述的Fer检测试剂盒(如图1)的主要组成成份如下:
1.微孔板(预包被第一鼠抗Fer单克隆抗体)
鼠抗Fer单克隆抗体预包被的条形微孔板(12条×8孔),置于框架中,且微孔板材质为PS(聚苯乙烯),具有强度高、耐疲劳性、尺寸稳定、蠕变小等优点;
2.Fer校准品
Fer校准品是溶于磷酸盐缓冲液中的提取的人天然Fer溶液,其6种浓度分别为0、40.0、76.9、120.0、254.9、1000.0ng/mL,分别标号1-6,每种浓度分装为一瓶,共有6瓶;
3.Fer质控品
Fer质控品是溶于磷酸盐缓冲液中的提取的人天然Fer溶液,共设置有2种浓度,浓度分别约为50.0ng/mL和250.0ng/mL,分别标号1和2,每种浓度分装为一瓶,共有2瓶;
4.检测缓冲液
可以直接使用的10mmol/L的PBS缓冲液,共1瓶,检测缓冲液每瓶至少20.0mL;
5.碱性磷酸酶标记的第二鼠抗Fer单克隆抗体
此酶标记抗体溶于含防腐剂的PBS缓冲溶液中,共1管,体积至少0.2mL;
6.底物溶液
可直接使用的含有TPE-phos(结构式如图5)的Tris缓冲溶液,共1瓶,体积至少10.0mL;
7.浓缩洗液
含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液,共1瓶,使用时用纯化水作10倍稀释,体积至少20.0mL;
8.封板膜
孵育时密封微孔板的粘性薄膜,2片;
(二)、本实施例所述的Fer检测试剂盒的制备方法过程如下:
1、制备预包被有第一鼠抗Fer单克隆抗体的微孔板
取鼠抗Fer单克隆抗体(IgG),用10mmol/L的CBS缓冲液(pH9.6)稀释,所得抗体溶液浓度约为5.0μg/mL;然后向微孔板各孔中加入100μL,2~8℃冰箱或室温(18~25℃)过夜,然后弃去孔中溶液,再向每孔中加入200μL 1%BSA溶液,室温静置1~2小时后弃去,并将微孔板移至干燥间抽干,铝箔袋密封包装。
2、制备碱性磷酸酶标记第二鼠抗Fer单克隆抗体溶液
采用商品化的标记试剂盒(如DOJINDO LABORATORISE的ALP标记试剂盒AlkalinePhosphatase Labeling Kit-NH2)按照其说明书操作进行标记鼠抗Fer单克隆抗体(IgG)。
3、制备Fer校准品制剂
取外购的提取的人天然Fer溶液,经国家标准品标定浓度后用10mmol/L的PBS缓冲液稀释至Fer浓度分别为0、40.0、76.9、120.0、254.9、1000.0ng/mL,各取0.4mL分装,密封保存。
4、制备Fer质控品制剂
取外购的提取的人天然Fer溶液,经国家标准品标定浓度后用10mmol/L的PBS缓冲液稀释配制,质控品1中Fer浓度约为50.0ng/mL,质控品2中Fer浓度约为250.0ng/mL,并加入0.1%的BSA和0.01%的Proclin 300作为稳定剂和防腐剂,各取0.4mL分装,密封保存。
5、制备底物溶液
用1.0mol/L的Tris缓冲液(pH8.0)稀释DMSO溶解的TPE-phos溶液使其终浓度为100μM即得。
6、其他
检测缓冲液(10mM PBS,pH7.4)和浓缩洗液(100mM PBST,10×)为实验室常规用试液,自行配制或从其他商业公司采购。
实施例2
运用实施例1所述的试剂盒对Fer参考品进行检测
本发明所述试剂盒采用双抗体夹心磁酶联免疫荧光法,是基于一种Fer抗原先与包被在微孔板上的单克隆抗体结合,再与碱性磷酸酶标记的Fer抗体结合的方法。
首先,加入的参考品/质控品/校准品中的Fer与微孔板中的固相化抗体(第一鼠抗Fer单克隆抗体IgG)结合,然后加入碱性磷酸酶标记的鼠抗Fer单克隆抗体选择性结合目标物Fer,形成夹心复合物,经过洗涤后再加入底物溶液,底物在酶催化后可激发发射荧光,荧光的强弱和标本中的Fer呈正相关。在多功能酶标仪490nm下测定相对荧光强度。
1、检验操作。使用前,将所有溶液平衡至室温(18~25℃),确定实验所需微孔板数量,每一样本设两个平行孔,将适当数量的微孔板置于塑料框架上,将未使用的微孔板条与干燥剂一起密封于铝箔袋中放回原环境保存。本试剂盒既可以用一步法,也可以用两步法;
A.一步法具体步骤如下:
1)向适当的孔中先加入50μL Fer校准品、质控品和参考品,再加入50μL碱性磷酸酶标记鼠抗Fer抗体溶液,用封板膜封盖微孔板,室温孵育1小时。
2)清洗
每孔加入250μL稀释好的洗液,清洗3次,末次清洗后在吸水纸上拍干,弃去残余液体。
3)加入底物溶液孵育
向各孔加入100μL底物溶液,用封板膜封盖,室温下200rpm振荡孵育30~60分钟。
4)测定相对荧光强度
在多功能酶标仪上测定490nm下的RFU(激发波长340nm)。
B.两步法具体步骤如下:
1)一次孵育
向适当的孔中加入100μL Fer校准品、质控品和参考品,用封板膜封盖微孔板,室温200rpm振荡孵育1小时。
2)清洗
每孔加入250μL稀释好的洗液,清洗3次,末次清洗后在吸水纸上拍干,弃去残余液体。
3)二次孵育
向各孔加入100μL碱性磷酸酶标记鼠抗Fer抗体溶液,用封板膜封盖,室温200rpm振荡孵育1小时。
4)清洗
同2)。
5)加入底物溶液孵育
向各孔加入100μL底物溶液,用封口膜封盖,室温200rpm振荡孵育30~60分钟。
6)测定相对荧光强度
在多功能酶标仪上测定490nm下的RFU(激发波长340nm)。
2、检测范围
如果待测样本的RFU高于校准品6,建议将样本做1:11稀释(1+10,如10μL样本+100μL检测缓冲液)后重新检测。
实施例3
实施例2检测的试剂盒质量分析(两步法)
一、标准曲线
校准品的浓度和荧光强度如表1:
表1
校准品浓度(X值) | RFU(Y值) |
0 | 3664 |
40.0 | 24024 |
76.9 | 63302 |
120.0 | 103148 |
254.9 | 188994 |
1000.0 | 252771 |
注:测试用多功能酶标仪为美国伯腾H1MF,荧光测试模式为扩展模式。
测试结果RFU对校准品浓度作四参数曲线回归,所得标准曲线如图2所示;其中,四参数回归方程为:y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
A=261139.2;B=-1.81098;C=152.5276;D=3675.461
r^2=0.9999。
二、灵敏度
对试剂盒组份检测缓冲液,重复测定20次,计算测试结果RFU的平均值加两倍标准差所对应的浓度,结果如表2所示:
表2
三、精密度
用试剂盒检测2份Fer参考品各10次,结果如表3所示:
表3
以表1所示数据建立的标曲计算表2的铁蛋白检测灵敏度和表3的精密度,分别得灵敏度3.1ng/mL(小于行标要求5ng/mL),精密度分别是6.7%和5.7%(小于行标要求CV<15%)。可满足临床应用要求。
实施例4
(一)本实施例所述的Fer检测试剂盒的主要组成成份如下:
1.磁珠溶液(第一鼠抗Fer单克隆抗体偶联磁珠)
鼠抗Fer单克隆抗体偶联磁珠溶液,共1瓶,体积至少10mL;
2.Fer校准品
Fer校准品是溶于磷酸盐缓冲液中的提取的人天然Fer溶液,其6种浓度分别为0、15.6、62.5、125.0、250.0和500ng/mL,分别标号1-6,每种浓度分装为一瓶,共有6瓶;
3.Fer质控品
Fer质控品是溶于磷酸盐缓冲液中的提取的人天然Fer溶液,共设置有2种浓度,浓度分别约为20.0ng/mL和200.0ng/mL,分别标号1和2,每种浓度分装为一瓶,共有2瓶;
4.检测缓冲液
可以直接使用的10mmol/L的PBS缓冲液,共1瓶,检测缓冲液每瓶至少20.0mL;
5.碱性磷酸酶标记的第二鼠抗Fer单克隆抗体
此酶标记抗体溶于含防腐剂的PBS缓冲溶液中,共1管,体积至少0.2mL;
6.底物溶液
可直接使用的含有TPE-phos(结构式如图5)的Tris缓冲溶液,共1瓶,体积至少10.0mL;
7.浓缩洗液
含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液,共1瓶,使用时用纯化水作10倍稀释,体积至少20.0mL;
10.预处理微孔板
微孔板(12条×8孔),材质为PS(聚苯乙烯),经由1%BSA溶液封闭处理;
11.封板膜
孵育时密封微孔板的粘性薄膜,2片;
(二)、本实施例所述的Fer检测试剂盒的制备方法采用本实验室自建方法标记,过程如下:
1、制备第一鼠抗Fer单克隆抗体偶联磁珠溶液
1)取0.5mg均匀分散的羧基磁珠溶液到2.0mL圆底离心管中,磁力保留磁珠弃去上清液;用预冷MES缓冲液每次200μL涡旋振荡清洗3次;
2)磁力保留磁珠弃去上清液,迅速加入100μL NHS溶液,立即振荡分散均匀;再加入100μL EDC溶液,立即振荡混匀;室温下在四维混合仪上持续混合30min,此期间每隔2~5min振荡混匀1次;
3)磁力保留磁珠弃去上清液,每次加入200μL预冷MES缓冲液振荡清洗2次,最后重悬于100μL预冷MES缓冲液中。
4)取MES缓冲液溶解的预冷抗体溶液10μg(0.5mg/mL)于圆底离心管中;将3)中活化的磁珠悬液分3次转移到管中(维持混悬液在4℃左右);每次加入磁珠后,立即温和振荡混匀;完成后继续保持在4℃左右10~15min,并间隔3min再混匀一次;最后,将混悬液于室温下持续温和振荡混合约90min。
5)磁力保留磁珠弃去上清液。
6)加入200μL封闭液(1.0M甘氨酸),温和振荡混匀,室温反应约30min。
7)磁力分离弃去上清液,每次加入200μL洗涤液(0.01M PBS缓冲液),用移液枪吹打洗涤3次。
8)磁力分离弃去上清液,加入保存液(20mM HEPES缓冲液)将抗体偶联磁珠浓度调节为2.5mg/mL,温和振荡混匀,2~8℃保存备用。
2、制备碱性磷酸酶标记第二鼠抗Fer单克隆抗体溶液
如实施例1所述,采用商品化的标记试剂盒按照其说明书操作进行标记。
3、制备Fer校准品制剂
取外购的提取的人天然Fer溶液,经国家标准品标定浓度后用10mmol/L的PBS缓冲液稀释至Fer浓度分别为0、15.6、62.5、125.0、250.0和500ng/mL,各取0.4mL分装,密封保存。
4、制备Fer质控品制剂
取外购的提取的人天然Fer溶液,经国家标准品标定浓度后用10mmol/L的PBS缓冲液稀释配制,质控品1中Fer浓度约为20.0ng/mL,质控品2中Fer浓度约为200.0ng/mL,并加入0.1%的BSA和0.01%的Proclin300作为稳定剂和防腐剂,各取0.4mL分装,密封保存。
5、制备底物溶液
用10mmol/L的Tris缓冲液(pH8.0)稀释DMSO溶解的TPE-phos溶液使其终浓度为100μM即得。
6、其他
检测缓冲液(10mM PBS,pH7.4)和浓缩洗液(100mM PBST,10×)为实验室常规用试液,自行配制或从其他商业公司采购。
实施例5
运用实施例4所述的试剂盒对Fer参考品进行检测
本发明所述试剂盒采用双抗体夹心磁酶联免疫荧光法,是基于一种Fer抗原先与偶联在磁珠上的单克隆抗体结合,再与碱性磷酸酶标记的Fer抗体结合的方法。
首先,加入的参考品/质控品/校准品中的Fer与磁珠上的固相化抗体(第一鼠抗Fer单克隆抗体IgG)结合,然后加入碱性磷酸酶标记的鼠抗Fer单克隆抗体选择性结合目标物Fer,形成夹心复合物,经过洗涤后再加入底物溶液,底物在酶催化后可激发发射荧光,荧光的强弱和标本中的Fer呈正相关。在多功能酶标仪490nm下测定相对荧光强度。
1、检验操作。使用前,将所有溶液平衡至室温(18~25℃),确定实验所需微孔板条数量,每一样本设两个平行孔,将适当数量的微孔板条置于塑料框架上,将未使用的微孔板条与干燥剂一起密封于铝箔袋中放回原环境保存。本试剂盒既可以用一步法,也可以用两步法,本实施例选择一步法,其具体步骤如下:
1)先向每孔中加入100μL磁珠溶液,然后向适当的孔中分别加入50μL Fer校准品、质控品和参考品,再各加入50μL碱性磷酸酶标记鼠抗Fer抗体溶液,用封板膜封盖微孔板,室温200rpm振荡孵育1小时。
2)清洗
每孔加入250μL稀释好的洗液,清洗3次。
3)加入底物溶液孵育
向各孔加入100μL底物溶液,用封板膜封盖,室温200rpm振荡孵育30~60分钟。
4)测定相对荧光强度
在多功能酶标仪上测定490nm下的RFU(激发波长340nm)。
注:清洗时须正确使用磁力板。
2、检测范围
如果待测样本的RFU高于校准品6,建议将样本做1:11稀释(1+10,如10μL样本+100μL检测缓冲液)后重新检测。
实施例6
实施例5检测的试剂盒质量分析
一、标准曲线
校准品的浓度和荧光强度如表4:
表4
校准品浓度(X值) | RFU(Y值) |
0 | 212 |
15.6 | 406 |
62.5 | 943 |
125.0 | 1358 |
250.0 | 1794 |
500.0 | 1845 |
测试结果RFU对校准品浓度作四参数曲线回归,所得标准曲线如图3所示。
其中,四参数回归方程:y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
A=1997.46735;B=-1.48184;C=80.58513;D=232.85348
r^2=0.996。
二、灵敏度
取试剂盒组份检测缓冲液,重复测定20次,计算测试结果RFU的平均值加两倍标准差所对应的浓度,结果如表5所示。
表5
三、精密度
用试剂盒检测2份Fer参考品各10次,计算变异系数,结果如表6所示。
表6
以表4所示数据建立的标曲计算表5的铁蛋白检测灵敏度和表6的精密度,分别得灵敏度4.4ng/mL(小于行标要求5ng/mL),精密度分别是5.3%和7.2%(小于行标要求CV<15%)。可满足临床应用要求。
实施例7
(一)本实施例所述的糖类抗原CA15-3检测试剂盒的主要组成成份如下:
1.微孔板(预包被第一鼠抗CA15-3单克隆抗体)
鼠抗CA15-3单克隆抗体预包被的条形微孔板(12条×8孔),置于框架中,且微孔板材质为PS(聚苯乙烯),具有强度高、耐疲劳性、尺寸稳定、蠕变小等优点;
2.CA15-3校准品
CA15-3校准品是溶于磷酸盐缓冲液中的提取的人天然CA15-3溶液,其7种浓度分别为0、7.8、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0U/mL,分别标号1-7,每种浓度分装为一瓶,共有7瓶;
3.CA15-3质控品
CA15-3质控品是溶于磷酸盐缓冲液中的提取的人天然CA15-3溶液,共设置有2种浓度,浓度分别约为50.0U/mL和200.0U/mL,分别标号1和2,每种浓度分装为一瓶,共有2瓶;
4.检测缓冲液
可以直接使用的10mmol/L的PBS缓冲液,共1瓶,检测缓冲液每瓶至少20.0mL;
5.碱性磷酸酶标记的第二鼠抗CA15-3单克隆抗体
此酶标记抗体溶于含防腐剂的PBS缓冲溶液中,共1管,体积至少0.2mL;
6.底物溶液
可直接使用的含有TPE-phos(结构式如图5)的Tris缓冲溶液,共1瓶,体积至少10.0mL;
7.浓缩洗液
含有去污剂和防腐剂的浓缩清洗缓冲液,共1瓶,使用时用纯化水作10倍稀释,体积至少20.0mL;
8.封板膜
孵育时密封微孔板的粘性薄膜,2片;
(二)、本实施例所述的CA15-3检测试剂盒的制备方法过程如下:
1、制备预包被有第一鼠抗CA15-3单克隆抗体的微孔板
取鼠抗CA15-3单克隆抗体(IgG),用10mmol/L的CBS缓冲液(pH9.6)稀释,所得抗体溶液浓度约为5.0μg/mL;然后向微孔板各孔中加入100μL,2~8℃冰箱或室温(18~25℃)过夜,然后弃去孔中溶液,再向每孔中加入200μL 1%BSA溶液,室温静置1~2小时后弃去,并将微孔板移至干燥间抽干,铝箔袋密封包装。
2、制备碱性磷酸酶标记第二鼠抗CA15-3单克隆抗体溶液
采用商品化的标记试剂盒(如DOJINDO LABORATORISE的ALP标记试剂盒AlkalinePhosphatase Labeling Kit-NH2)按照其说明书操作进行标记鼠抗CA15-3单克隆抗体(IgG)。
3、制备CA15-3校准品制剂
取外购的提取的人天然CA15-3溶液,经国家标准品标定浓度后用10mmol/L的PBS缓冲液稀释至CA15-3浓度分别为0、7.8、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0U/mL,各取0.4mL分装,密封保存。
4、制备CA15-3质控品制剂
取外购的提取的人天然CA15-3溶液,经国家标准品标定浓度后用10mmol/L的PBS缓冲液稀释配制,质控品1中CA15-3浓度约为50.0U/mL,质控品2中CA15-3浓度约为200.0U/mL,并加入0.1%的BSA和0.01%的Proclin 300作为稳定剂和防腐剂,各取0.4mL分装,密封保存。
5、制备底物溶液
用1.0mol/L的Tris缓冲液(pH8.0)稀释DMSO溶解的TPE-phos溶液使其终浓度为100μM即得。
6、其他
检测缓冲液(10mM PBS,pH7.4)和浓缩洗液(100mM PBST,10×)为实验室常规用试液,自行配制或从其他商业公司采购。
实施例8
运用实施例7所述的试剂盒对CA15-3参考品进行检测
本发明所述试剂盒采用双抗体夹心磁酶联免疫荧光法,是基于一种CA15-3抗原先与包被在微孔板上的单克隆抗体结合,再与碱性磷酸酶标记的CA15-3抗体结合的方法。
首先,加入的参考品/质控品/校准品中的CA15-3与微孔板中的固相化抗体(第一鼠抗CA15-3单克隆抗体IgG)结合,然后加入碱性磷酸酶标记的鼠抗CA15-3单克隆抗体选择性结合目标物CA15-3,形成夹心复合物,经过洗涤后再加入底物溶液,底物在酶催化后可激发发射荧光,荧光的强弱和标本中的CA15-3呈正相关。在多功能酶标仪490nm下测定相对荧光强度。
1、检验操作。使用前,将所有溶液平衡至室温(18~25℃),确定实验所需微孔板数量,每一样本设两个平行孔,将适当数量的微孔板置于塑料框架上,将未使用的微孔板条与干燥剂一起密封于铝箔袋中放回原环境保存。本试剂盒采用两步法,步骤如下:
1)一次孵育
向适当的孔中加入100μL配制好的CA15-3校准品、质控品和参考品,用封板膜封盖微孔板,室温200rpm振荡孵育1小时。
2)清洗
每孔加入250μL稀释好的洗液,清洗3次,末次清洗后在吸水纸上拍干,弃去残余液体。
3)二次孵育
向各孔加入100μL碱性磷酸酶标记鼠抗CA15-3抗体溶液,用封板膜封盖,室温200rpm振荡孵育1小时。
4)清洗
同2)。
5)加入底物溶液孵育
向各孔加入100μL底物溶液,用封口膜封盖,室温200rpm振荡孵育10~30分钟。
6)测定相对荧光强度
在多功能酶标仪上测定490nm下的RFU(激发波长340nm)。
2、检测范围
如果待测样本的RFU高于校准品7,建议将样本做1:11稀释(1+10,如10μL样本+100μL检测缓冲液)后重新检测。
实施例9
实施例8检测的试剂盒质量分析(两步法)
一、标准曲线
校准品的浓度和荧光强度如表7:
表7
校准品浓度(X值) | RFU(Y值) |
0 | 998 |
7.8 | 1382 |
31.2 | 3702 |
62.5 | 7708 |
125.0 | 13525 |
250.0 | 20104 |
500.0 | 26239 |
注:测试用多功能酶标仪为美国伯腾H1MF。
测试结果RFU对校准品浓度作四参数曲线回归,所得标准曲线如图4所示;其中,四参数回归方程为:y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D
A=28277.99485;B=-1.43698;C=138.62195;D=961.13705r^2=0.9998。
二、灵敏度
对试剂盒组份检测缓冲液,重复测定20次,计算测试结果RFU的平均值加两倍标准差所对应的浓度,结果如表8所示:
表8
三、精密度
用试剂盒检测2份CA15-3参考品各10次,结果如表9所示:
表9
以表7所示数据建立的标曲计算表8的CA15-3检测灵敏度和表9的精密度,分别得灵敏度3.53U/mL,精密度分别是5.3%和6.9%(小于通用要求CV<15%)。可满足临床应用要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酶联免疫荧光法检测试剂盒,其特征在于,包括两种形态:
(1)包括预包被微孔板、校准品、质控品和碱性磷酸酶标记抗体、聚集诱导发光型荧光底物溶液、检测缓冲液、洗液;所述微孔板上预包被有捕获抗体,用于捕获样品中的待检测物;所述校准品和质控品由不同浓度的待检测物基因工程重组蛋白或提取的人天然蛋白配制而成,所述校准品至少包括5个浓度,所述质控品至少包括1个浓度;或
(2)包括预处理微孔板/反应管/反应杯、磁珠溶液、校准品、质控品和碱性磷酸酶标记抗体、聚集诱导发光型荧光底物溶液、检测缓冲液、洗液;所述磁珠上预包被有捕获抗体,用于捕获样品中的待检测物;所述校准品和质控品由不同浓度的待检测物基因工程重组蛋白或提取的人天然蛋白配制而成,所述校准品至少包括5个浓度,所述质控品至少包括1个浓度。
2.如权利要求1所述的酶联免疫荧光法检测试剂盒,其特征在于,所述预包被的捕获抗体和碱性磷酸酶标记的检测抗体,二者对待检测物应具有不同的结合位点。
3.如权利要求1所述的酶联免疫荧光法检测试剂盒,其特征在于,所述聚集诱导发光型荧光底物为TPE-phos、AE-phos;所述聚集诱导发光型荧光底物经碱性磷酸酶催化生成新的产物分子继而聚集形成微小聚集体,在激发光下发射出强烈的荧光。
4.如权利要求1所述的酶联免疫荧光法检测试剂盒,其特征在于,所述底物溶液为即用型的,或是由底物原液经由底物稀释液现配现用型的;所述捕获抗体为蛋白的鼠单克隆抗体。
5.如权利要求3所述的酶联免疫荧光法检测试剂盒,其特征在于,所述底物溶液TPE-phos的工作浓度范围为80μmol/L~100μmol/L,所述底物溶液AE-phos的工作浓度范围为400μmol/L~500μmol/L。
6.如权利要求1所述的酶联免疫荧光法检测试剂盒,其特征在于,所述校准品的浓度为0~1000ng/mL;所述质控品的浓度为50~500ng/mL。
7.如权利要求1所述的酶联免疫荧光法检测试剂盒,其特征在于,所述预包被微孔板的制备包括以下步骤:
1)取捕获抗体,用CBS缓冲液稀释;
2)向微孔板各孔中加入稀释后所得抗体溶液,2~8℃冰箱或室温18~25℃静置8-16h,然后弃去孔中溶液,再向每孔中加入200μL 1%BSA溶液,室温静置1~2小时后弃去,干燥,铝箔袋密封包装。
8.如权利要求1所述的酶联免疫荧光法检测试剂盒,其特征在于,所述预包被有捕获抗体磁珠的制备包括以下步骤:
1)取羧基磁珠溶液,磁力保留磁珠弃去上清液;用预冷MES缓冲液涡旋振荡清洗至少3次;
2)磁力保留磁珠弃去上清液,加入NHS溶液,振荡分散均匀;再加入EDC溶液,振荡混匀;室温下在四维混合仪上持续混合20~40min,此期间每隔2~5min振荡混匀1次;
3)磁力保留磁珠弃去上清液,加入预冷MES缓冲液振荡清洗至少2次,最后重悬于预冷MES缓冲液中;
4)将3)中所得的磁珠悬液分至少3次转移到MES缓冲液溶解的预冷捕获抗体溶液中,每次加入磁珠悬液后,立即振荡混匀,完成后静置10~15min,期间每间隔2~4min再混匀一次;最后,将混悬液于室温下持续温和振荡混合90~120min;
5)磁力保留磁珠弃去上清液;
6)加入封闭液,温和振荡混匀,室温反应20~40min;
7)磁力分离弃去上清液,加入洗涤液,用移液枪吹打洗涤至少3次;
8)磁力分离弃去上清液,加入保存液将抗体偶联磁珠浓度调节为2~3mg/mL,温和振荡混匀,2~8℃保存备用。
9.权利要求1-8任一项所述的酶联免疫荧光法检测试剂盒在检测蛋白含量中的应用。
10.如权利要求9所述的酶联免疫荧光法检测试剂盒在检测蛋白含量中的应用,其特征在于,检测方法包括一步法和二步法;所述蛋白为铁蛋白、糖蛋白CA15-3。
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CN (1) | CN114354916A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN116067926A (zh) * | 2022-12-19 | 2023-05-05 | 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 | 一种基于聚集诱导发光分子的潜血显现试剂及其制备方法与应用 |
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2021
- 2021-12-24 CN CN202111603162.0A patent/CN114354916A/zh active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN116067926A (zh) * | 2022-12-19 | 2023-05-05 | 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 | 一种基于聚集诱导发光分子的潜血显现试剂及其制备方法与应用 |
CN116067926B (zh) * | 2022-12-19 | 2023-07-28 | 广东省大湾区华南理工大学聚集诱导发光高等研究院 | 一种基于聚集诱导发光分子的潜血显现试剂及其制备方法与应用 |
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