CN114350527A - 一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法及其用途 - Google Patents
一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及提供一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法及其用途，该方法选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗，并依次70%乙醇、5.25%次氯酸钠、70%乙醇浸泡，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位压碎获得组织液，再分别用蒸馏水，各孵化得到组织液；将组织液加入到由PDA培养基和抗菌剂氯霉素中，在温度28℃下培养，培养后在PDA培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用PDA培养基培养1周，将不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌。并对获得的9种植物内生真菌进行活性试验。结果表明：获得的内生真菌在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌中具有抑制活性；在促进黑色素中具有活性。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性技术领域，具体涉及一种驱虫斑鸠菊地上部位内生真菌的分离纯化方法及其用途。
背景技术
驱虫斑鸠菊(Vernonia anthelmintica)野生(Baccharoides anthelmintica(L.)Moench)，又名Baccharoides anthelmintica(L.)Moench)，隶属菊科，有1000余种，广泛分布于亚热带和热带沼泽、稀树大草原、干旱平原、沙漠地区(中国、斯里兰卡、老挝、缅甸、尼泊尔、印度、巴基斯坦)。这种植物是一年生的直立多叶植物，高约1.5m，叶长5-9cm，宽2.5-3.2cm，茎和叶上覆盖着细毛，小花是紫罗兰色或紫色，单生，同***配，圆锥花序，顶生头直径1.3-2cm，种子是黑色的，有苦味和恶心的味道，含有20-30％的油。
驱虫斑鸠菊已被用于中医及民族医药学。此外，这种植物的种子已经在印度和巴基斯坦的民间医药中使用，用于治疗各种各样的疾病。尤其是种子提取物是维吾尔族治疗白癜风最流行的药物之一。然而，驱虫药被用于改善疼痛，胃痛，肝脏疾病和作为驱虫药和消肿在中亚。在印度传统医学中，广泛用于治疗梅毒、便秘、霍乱、消化不良、肠胃气胀、发热、咽喉肿痛、咳嗽和皮肤等人类杂症。
近年来对驱虫斑鸠菊的化学成分进行了充分的研究。经过详细的文献调查，已从不同部位分离鉴定出化合物。从该植物的不同部位分离出不同类别的成分，如黄酮类、萜类、脂肪酸、查尔酮和酚酸。这些化合物是从植物不同部位分离得到的，如必需脂肪酸从虫草种子中分离得到，多酚类黄酮类化合物从种子中分离得到。此外，从粉状种子的乙醇提取物中发现了新的类黄酮，而在种子油中发现了萜类化合物。因此，本发明从药用植物驱虫草的地上部分分离并***地研究了驱虫草内生真菌。
植物内生菌通常包括细菌和真菌，在其生命周期中生活在植物组织中，并与宿主表现出复杂的伙伴关系，不会引起明显的疾病症状。植物内生菌通过提供养分、调节生理过程和减轻机体对非生物和生物胁迫的抗性而使寄主植物受益。内生微生物的另一个功能是控制寄主植物的生长发育。而且，寄生在宿主体内的内生微生物从宿主分离出来后，也可以脱离宿主植物生长，可能具有与宿主相似的生物活性和产生相似的代谢产物。内生真菌：近年来从不同植物中分离到几种内生真菌，并对其化学成分和药理特性进行了研究。
通常，内生菌的分离采用表面杀菌，对于内生微生物的鉴定可以通过形态学和分子***发育(rDNA、16S rDNA序列)技术进行。
植物组织内内生微生物的多样性和生理特性受到植物化学成分的强烈影响。特别是内生真菌是生物活性次级代谢产物的关键来源。通常内生菌合成的次生代谢物在遗传水平上受到高度调控；然而，当外部环境受到生理影响时，这些基因进一步响应激活。此外，这些化合物通过增加对外部生物和非生物因素的抗性，以及增强对昆虫和植物病原体的抗性，支持宿主植物的生长。许多代谢物具有一系列的生物活性，是药物创新和发现的重要驱动力。
这种有效生产次级代谢物的方法以发酵为代表，这是一种微生物驱动的过程，酶将底物转化为生物活性化合物。相反，内生菌可能产生新的具有药理活性和结构多样性的次生代谢产物，而这些次生代谢产物并不存在于宿主的组织中，即内生菌可以独立生存并在宿主植物中产生次生代谢产物。因此，植物相关的内生真菌是新型、独特和具有生物活性的天然产物的来源。
具有生物活性的天然化合物，如各种多糖类、香豆素类、黄酮类、萜类、生物碱、多酚类和巯基等，是植物产生的次生代谢产物，包括用于治疗不同疾病的传统药用植物。尽管在以天然产物为基础的研究和药物开发中存在一些挑战，特别是水溶性差、代谢快和高分子量可能会阻碍它们的药用价值，新的天然化合物仍然是药物发现的重要来源。植物内生真菌是一类具有生物活性的次生代谢产物的丰富来源。这些微生物寄生在植物的内部组织中，不会引起明显的疾病症状。一种有效生产次级代谢产物的方法是发酵，这是一种微生物驱动的过程，通过酶将底物转化为生物活性化合物。内生真菌产生的这些生物活性和结构多样的天然产物不仅有助于保护宿主植物免受食草动物和微生物的攻击，而且在医药、制药工业和农业中发挥着重要作用。例如，各种疾病，包括炎症相关疾病、各种感染和神经***疾病、心血管和代谢疾病，以及癌症化疗，经常用天然产物或其衍生物来治疗。植物内生次生代谢产物及其生物学特性已在陆生植物和海洋生物中得到研究。有机化学和药物化学从天然产物中生成基于化学支架的衍生物。生物化学和分子生物学发展了大规模生产天然产物的技术(如酶的生物转化、生物合成途径的探索及其在微生物中的异种表达等)。
发明内容
本发明目的在于，提供一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法及其用途，该方法2020年8月从新疆和田地区采集的的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗，并依次70％乙醇、5.25％次氯酸钠、70％乙醇浸泡，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位压碎获得组织液，再分别用蒸馏水，各孵化得到组织液；将组织液加入到由PDA培养基和抗菌剂氯霉素中，在温度28℃下培养，培养后在PDA培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用PDA培养基培养1周，将不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌。并对获得的9种植物内生真菌进行活性试验结果表明：获得的内生真菌在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌中具有抑制活性；在促进黑色素中具有活性。
发明所述的一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法，按下列步骤进行：
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡1-2min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡2-5min和浓度为70％乙醇浸泡30-60s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养7-10天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosumNR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12，利用DNA基因序列对内生真菌进行鉴定。
所述方法获得的内生真菌在制备抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌中的用途。
所述方法获得的内生真菌在促进黑色素中的用途。
本发明所述的一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法及其用途，该方法2020年8月首次从新疆和田产驱虫斑鸠菊的花、茎、叶等地上部分中分离鉴定出9种植物内生真菌。抗菌实验对该方法中分离纯化的大多数菌株分别进行组织培养发酵，发现其粗提取和乙酸乙酯萃取部位具有较强的抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等病原微生物的活性；同时，5种菌株的培养液总提取物乙酸乙酯萃取部位对小鼠B16细胞黑色素合成有较大影响，7种菌株培养液粗提物具有很强的细胞毒活性，其在10μg/mL浓度时能杀灭小鼠B16细胞；此外，2种菌株培养液乙酸乙酯萃取物在10μg/mL下促进黑色素合成的活性强于阳性对照8-甲氧补骨脂素。通过本发明所述方法得到的驱虫斑鸠菊地上部位内生菌发酵液的代谢物具有较强的抗菌、细胞毒性和促进黑色素合成等广泛生物活性，其有效成分可进一步应用于功能食品、药品和化妆品的开发。
本发明所述的一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法及其用途，该方法将驱虫斑鸠菊的花、茎、叶组织液的提取(图1)，并涂布于含有氯霉素(100μg/mL)为抗菌剂的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上面孵化，得到粗纯化真菌，其再在PDA培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落,培养1周，以确保分离菌的纯度。不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，利用DNA基因序列对内生真菌进行了鉴定：
DNA分离纯化及其真菌的鉴定：
DNA提取采用热处理方案，将小菌落转移到2mL试管中，加入1.5mL无菌水混匀10s，试管在温度90℃的干燥加热器中孵育20min，以12,000rpm离心5min，取含DNA的上清液，并温度-20℃保存；使用水平凝胶电泳(0.8％琼脂糖)检测DNA；
聚合酶链反应(PCR)：提取的DNA作为模板进行16S rRNA基因分析，PCR扩增16SrRNA基因，引物为:16SF 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO)和16SR 5'-GAAAGGAGGTGATCCAGCC-3'(Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO)；PCR反应混合物包含1μL的模板DNA，5μL 5x的Taq标准反应缓冲液(生物学实验室，新英格兰)，0.5μL 10毫米混合核苷酸(热科学)，1μL 0.1％的牛血清白蛋白(豆类生物Inc.)，0.125μL聚合酶(生物学实验室、新英格兰)和16.375μL灭菌水；使用PTC-200热循环仪(BioRad)和以下PCR程序进行PCR：在温度94℃下加热30s，然后在温度94℃下进行15s变性30次，在温度55℃下退火30s，在温度68℃下延长1.5min，然后在温度68℃下20min，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳检查PCR扩增产物；
限制性片段长度多态性(RFLP)分析：为了确定在颜色、形状和大小上相似的分离物的差异，本发明按照Jinneman等人的描述对16S rRNA产物进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析；用凝胶电泳(1％琼脂糖凝胶)检测酶切的RNA片段；凝胶电泳完成后，使用数字凝胶成像***(gel-doc XR TM+，Bio-Rad)对凝胶进行可视化，鉴定相同的分离株，以减少需要测序的菌株数量；
测序和***发育分析：测序前，使用PCR胶回收试剂盒(Affymetrix,
products,USA)对PCR产物进行纯化。接收的数据使用Chromas(v.2.6.5)软件进行分析和校正；使用EMBOSS Explorer(http://emboss.bioinformatics.nl/)手动合并修正的序列；使用基本局部比对搜索工具(BLAST)识别序列，并与国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank核苷酸数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比较；16S rRNA基因序列以MK478835-MK478844的登录号保存在GenBank中；使用ClustalX 2.1软件对所有序列进行比对，并使用FASTA格式文件构建***发育树；***发育树分枝长度之和为0.96928586；在分支前面，可以看到使用bootstrap测试将相对类群分组在一起的重复树的百分比(500个重复)；该树按比例绘制，分支长度与用于产生***发育树的进化距离的单位相同；进化距离是通过最大综合似然法计算的，以每个位点的碱基替换数为单位；分析涉及35个核苷酸序列；删除所有数据缺失和空白的位置；最终的数据集包括1278个位置；MEGA6来进行进化分析；
真菌鉴定结果表明：本发明从驱虫斑鸠菊的叶子、花、茎部中分离鉴定了9个内生真菌,它们分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianumNR-02、Ovatospora senegalensis NR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielaviasubthermophila NR-06、Thielavia microspore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12；本发明选择了Mucorcircinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12为研究对象，初步筛选得到的粗提物具有良好的抑菌活性。所有真菌菌株均经DNA测序鉴定并在GenBank中注册(登录号：MW996740、MW996741、MW996742、MW996743、MW996745、MW996747、MW996749、MW996750和MW996751；www.ncbi.nlm.nih.gov)。各菌株与A.terreus,T.harzianum,O.senegalensis,Ch.Globosum,Th.subthermophila,Th.Microspore,A.calidoustus,M.circinelloidesand Aspergillus sp.同源性为98％—100％之间。三个菌株属于曲霉菌属，两个真菌属于细条霉属。
表1驱虫斑鸠菊地上部分分离纯化的9种内生真菌与GenBank序列的相似性分析
附图说明
图1为本发明从药用植物茎、叶、花瓣中分离出真菌菌株V.anthelmintica.图；
图2为本发明分离纯化不同内生菌所产生次生代谢产物产量(g/L)；
图3为本发明以抑菌圈直径(mm)评价S.commune和A.terreus的抗菌活性(*L1-A.terreus；L2-T.harzianum；L3-O.senegalensi；L4-Ch.globosum；L6-Th.Subthermophila；L9-Th.Microspore；L10-A.calidoustus；S1-M.circinelloides；S4-Aspergillus sp.)；
图4为本发明分离纯化9种内生菌次生代谢产物促B16细胞黑色素活性图，其中a为50μg/mL真菌O.senegalensis和Th.Microspore的细胞内黑色素含量；b为10μg/mL真菌A.terreus、T.harzianum、A.calidoustus的细胞内黑色素含量；c为5μg/mL真菌M.circinelloides、Th.Subthermophila、Ch.globosum、Aspergillus sp.的细胞内黑色素含量；
图5为本发明分离纯化内生菌次生代谢产物不同浓度促B16细胞黑色素活性图，其中a为真菌A.terreus和T.harzianum不同浓度下促B16细胞黑色素活性；b为真菌A.terreus和T.harzianum不同浓度下对酪氨酸酶活性的测定。
具体实施方式
实施例1
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡1min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡2min和浓度为70％乙醇浸泡30s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养7天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12；
将内生真菌NR-01 A.Terreus(MW996740)培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后用真空过滤培养物，再用2×300mL乙酸乙酯用分液漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其抗菌及促进黑色素活性，其得到的量是0.15g/L。
实施例2
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡2min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡5min和浓度为70％乙醇浸泡60s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入3mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养8天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12，
将内生真菌NR-02 T.harzianum(MW996741)培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后用真空过滤过滤培养物，再用2×300mL乙酸乙酯用分离漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其抗菌及促进黑色素活性，其得到的量是0.7g/L。
实施例3
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡1min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡5min和浓度为70％乙醇浸泡60s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养9天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12；
将内生真菌NR-03 O.senegalensis(MW996742)培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后用真空过滤过滤培养物。再用2×300mL乙酸乙酯用分离漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其抗菌及促进黑色素活性，其得到的量是1.7g/L。
实施例4
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡2min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡2min和浓度为70％乙醇浸泡30s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养10天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12，
将内生真菌NR-04 Ch.globosum(MW996743)培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后用真空过滤过滤培养物，再用2×300mL乙酸乙酯用分离漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其抗菌及促进黑色素活性，其得到的量是0.9g/L。
实施例5
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡1min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡3min和浓度为70％乙醇浸泡40s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养7天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12；
将内生真菌NR-06 Th.Subthermophila(MW996745)培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后用真空过滤过滤培养物，再用2×300mL乙酸乙酯用分离漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其抗菌及促进黑色素活性，其得到的量是0.6g/L。
实施例6
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡1.5min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡4min和浓度为70％乙醇浸泡45s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养8天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12，
将内生真菌NR-08 Th.microspore(MW996747)培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后用真空过滤过滤培养物。再用2×300mL乙酸乙酯用分离漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其抗菌及促进黑色素活性，其得到的量是0.7g/L。
实施例7
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡2min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡5min和浓度为70％乙醇浸泡50s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养9天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12；
将内生真菌NR-10 A.calidoustus(MW996749)培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后用真空过滤过滤培养物，再用2×300mL乙酸乙酯用分离漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其抗菌及促进黑色素活性，其得到的量是0.3g/L。
实施例8
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡1min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡5min和浓度为70％乙醇浸泡60s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养10天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12；
将内生真菌NR-11 M.circinelloides(MW996750)培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后用真空过滤过滤培养物，再用2×300mL乙酸乙酯用分离漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其抗菌及促进黑色素活性，其得到的量是1.2g/L。
实施例9
前处理及组织液的获取：
a、选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70％乙醇浸泡2min、浓度为5.25％次氯酸钠浸泡4min和浓度为70％乙醇浸泡55s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3mL蒸馏水，各孵化3min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100μL，在温度28℃下培养7-10天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、Ovatospora senegalensisNR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielaviamicrospore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloides NR-11和Aspergillus sp.NR-12，
将内生真菌NR-12 NR-12 Aspergillus sp.(MW996751)培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后用真空过滤过滤培养物，再用2×300mL乙酸乙酯用分离漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其抗菌及促进黑色素活性，其得到的量是0.3g/L。
实施例10
驱虫斑鸠菊内生真菌体外生物活性筛选：
驱虫斑鸠菊内生真菌的抑菌活性：C.albicans(CA),E.coli(EC),S.aureus(SA).本研究的一部分集中于内生真菌粗提物的***筛选。本发明选定的内生菌株A.terreusNR-01,T.harzianum NR-02,O.senegalensis NR-03,Ch.globosum NR-04,Th.subthermophila NR-06,Th.microspore NR-08,A.calidoustus NR-10,M.circinelloides NR-11and Aspergillus sp.NR-12的抗菌性能；利用三种病原微生物金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌对真菌粗提物的抗菌性能进行了评价：
将内生真菌培养于1升PDB液体培养基(葡萄糖20g/L，马铃薯提取物4g/L)中，温度28℃，160转摇床培养4周，然后使用真空过滤培养物；
用2×300mL乙酸乙酯用分离漏斗(溶剂-溶剂萃取)提取培养滤液，乙酸乙酯萃取物旋蒸浓缩，得到粗提物，将粗提物溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，评价其白色念珠菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌生物活性；
O.senegalensis NR-03粗提物(PDB培养滤液中的乙酸乙酯提取物)对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抗菌活性(26和19毫米抑制区ZOI)，对白色念珠菌株菌株的抑菌作用较低；T.harzianum NR-02粗提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抗菌活性(19和14毫米ZOI)，对白色念珠菌有中等抑菌活性，抑菌圈为10mm，粗提物Ch.globosum NR-04和粗提物Aspergillus sp.NR-12对金黄色葡萄球菌表现出强烈的生长抑制作用(分别为20毫米和18毫米ZOI)；真菌菌株A.calidoustus NR-10对所有病原微生物白色念珠菌、大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌均具有中等的抑制效果，抑制区分别为7.5、9和14mm，见表2：
表2用抑菌圈直径(mm)评价真菌菌株粗提物抗菌活性
在所制备的内生菌中，O.senegalensis NR-03对所有病原微生物均表现出明显的抑制作用，T.harzianum NR-02和Ch.globosum NR-04提取物对病原微生物大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均表现出明显的抗菌活性(图3)；
最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定：从驱虫斑鸠菊的地上部分分离得到的菌株A.terreus NR-01、T.harzianum NR-02、O.senegalensis NR-03、Ch.globosumNR-04、A.calidoustus NR-10、M.circinelloides NR-11、Aspergillus sp.NR-12乙酸乙酯粗提物具有较强的抑菌活性；因此，本发明还研究了它们的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定；以阳性对照氨苄西林和两性霉素B进行比较；A.terreus NR-01、O.senegalensis NR-03和Aspergillus sp.NR-12乙酸乙酯粗提物抑菌作用相似，MIC值为62.5μg/mL和MBC值为125μg/mL，(表3)；
表3分离纯化内生真菌的次生代谢产物的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)
T.harzianum NR-02菌株的提取物对金黄色葡萄球菌表现出更为良好的活性，MIC值为15.625μg/mL，MBC值为31.25。
实施例11
内生真菌对B16细胞黑色素含量及酪氨酸酶活性的影响：
内生真菌乙酸乙酯提取物的次生代谢产物以剂量依赖性方式促进小鼠B16细胞黑色素合成，其活性相当于对照药物8-甲氧补骨脂素(8-MOP)；测定了所有内生真菌菌株的粗提取物A.terreus NR-01,T.harzianum NR-02,O.senegalensis NR-03,Ch.globosum NR-04,Th.subthermophila NR-06,Th.microspore NR-08,A.calidoustus NR-10,M.circinelloides NR-11 and Aspergillus sp.NR-12，在温度50℃时对黑色素合成的影响μg/mL浓度；真菌菌株A.terreus NR-01,T.harzianum NR-02,Ch.globosum NR-04,Th.subthermophila NR-06,Th.microspore NR-08,A.calidoustus NR-10 andM.circinelloides NR-11粗提物具有很高的细胞毒活性，能杀灭小鼠B16细胞，因此筛选出较低浓度(5和10μg/mL)；A.terreus NR-01和T.harzianum NR-02乙酸乙酯提取物在10μg/mL下强烈增加黑色素合成133.24％和168.40％，而阳性对照8-MOP仅增加129.99％的合成；A.calidoustus粗提物(10μg/mL,114.097％)对B16细胞黑色素合成有中度影响(图4)；M.circinelloides的粗提物(5μg/mL,131.15％)增加了黑色素的合成；Aspergillus sp.,Ch.globosum and Th.Subthermophila对B16细胞黑色素合成的影响较阳性对照组小，分别为94.88、101.93和110.40％(5μg/mL)；由于A.terreus NR-01和T.harzianum NR-02粗提物在不同浓度的小鼠B16细胞中具有较强的黑色素合成和酪氨酸酶活性，因此选择A.terreusNR-01和T.harzianum NR-02粗提物作为进一步研究的对象(1,5and 10μg/mL)；菌株A.terreus NR-01(1μg/mL,107.99％；5μg/mL,111.33％and10μg/mL,133.81％)和T.harzianum NR-02(1μg/mL,110.52％；5μg/mL,116.63％and 10μg/mL,142.92％；8-MOP50μg/mL,125.51％)也以剂量依赖的方式增加黑色素的合成；
同时测定了这些菌株在B16细胞中的酪氨酸酶活性，乙酸乙酯粗提物的处理反应也同样增加(图5)，用选定的内生真菌粗提物处理，浓度为1到10μg/mL使细胞内酪氨酸酶活性增强；(A.terreus NR-01，1μg/mL，114.54％；5μg/mL，112.75％；10μg/mL，113.12％；8-MOP 50μM，124.09％(T.harzianum NR-02,1μg/mL,10.6.48％；5μg/mL,114.02％；10μg/mL,12126％；8-MOP 50μM,124.09％).)；结果表明：与8-MOP相比，次级代谢产物(粗提物中非分离次生代谢产物的影响)对小鼠B16细胞黑色素合成活性有明显的影响；需要对这些化合物进行进一步的分离和纯化，以确定哪些次生代谢物(粗提物中)影响活性，待进一步研究。
Claims (3)
1.一种驱虫斑鸠菊地上部位组织中内生真菌的分离纯化方法，其特征，按下列步骤进行：
a、前处理及组织液的获取：选用新疆和田地区的驱虫斑鸠菊的花、茎、叶分别用水清洗泥土后，使用蒸馏水冲洗6次，并依次浓度为70%乙醇浸泡1-2 min、浓度为5.25%次氯酸钠浸泡2-5 min和浓度为70%乙醇浸泡30-60s，再用蒸馏水冲洗，将冲洗后的花、茎、叶各部位取2g并压碎获得组织液，再分别加入2-3 mL蒸馏水，各孵化3 min，得到组织液；
b、选择氯霉素100μg/mL 作为抗菌剂；
c、选择固体培养基PDA由马铃薯提取物4 g/L、葡萄糖20g/L和琼脂15 g/L组成，pH为6.0；
d、将步骤c中的培养基PDA经温度120℃高压灭菌20 min，加入步骤b中的抗菌剂混合，倒入平板培养皿中，再加入步骤a得到的花、茎、叶各部位组织液100µL，在温度28℃下培养7-10天，得到粗纯化真菌；
e、培养后在培养基平板上划线不同颜色、形状和浓度的菌落，利用培养基PDA培养1周，对不同颜色、形状和大小的均匀菌落用于DNA分离，得到9种植物内生真菌，分别是Aspergillus terreus NR-01、Trichoderma harzianum NR-02、 Ovatospora senegalensis NR-03、Chaetomium globosum NR-04、Thielavia subthermophila NR-06、Thielavia microspore NR-08、Aspergillus calidoustus NR-10、Mucor circinelloidesNR-11 和 Aspergillus sp. NR-12，利用DNA基因序列对内生真菌进行鉴定。
2.根据权利要求1所述方法获得的内生真菌在制备抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌中的用途。
3.根据权利要求1所述方法获得的内生真菌在促进黑色素中的用途。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117210337A (zh) * | 2023-09-07 | 2023-12-12 | 贵州大学 | 一种具有鸡羽毛降解活性的卵孢菌及其用途 |
| CN117210337B (zh) * | 2023-09-07 | 2024-05-17 | 贵州大学 | 一种具有鸡羽毛降解活性的卵孢菌及其用途 |
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