CN114349849A

CN114349849A - 一种具有降血糖功效的胶原蛋白酶解物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114349849A
Application number: CN202111587117.0A
Authority: CN
Inventors: 郑淋; 徐琼瑶; 赵谋明; 赵翊君
Original assignee: Guangdong Huatai Biological Technology Co ltd; South China University of Technology SCUT
Current assignee: Guangdong Huatai Biological Technology Co ltd; South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: CN114349849B

Abstract

本发明公开了一种具有降血糖功效的胶原蛋白酶解物及其制备方法和应用，所述酶解物含有由4‑7个氨基酸残基组成的Gly‑Pro‑型肽，质量占比为30‑45％；所述由4‑7个氨基酸残基组成的Gly‑Pro‑型肽，其序列通式为Gly‑Pro‑Xaa1‑Gly‑[Xaa2]_r‑[Xaa3]_s‑[Gly]_t。本发明提供的制备方法，首次制得一种具有强DPP‑IV抑制活性的酶解物，其在终浓度为1mg/mL下DPP‑IV抑制率高达68％；该酶解物中富含由4‑7个氨基酸残基组成的Gly‑Pro‑型肽，肽得率高达45％；经动物实验验证，该酶解物能调节二型糖尿病大鼠的空腹血糖并且改善其口服葡萄糖耐受能力。

Description

一种具有降血糖功效的胶原蛋白酶解物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及针对2型糖尿病的生物活性肽，具体涉及一种具有降血糖功效的胶原蛋白酶解物及其制备方法和应用。

背景技术

二肽基肽酶-IV(DPP-IV)是治疗2型糖尿病的重要靶点。目前，已被批准在临床中使用的DPP-IV抑制剂主要有西格列汀、沙格列汀等。这些药物虽然能够有效调节糖尿病患者的血糖水平，但或多或少会带来一些副作用，如恶心、瘙痒和鼻咽炎等，而且还一直存在着关于长期服用是否会产生严重副作用的争议。因此，如果能从天然食物中获得具有DPP-IV抑制活性的功能物质，将对人类健康带来益处。

目前，有报道某些多肽具有相对较好的DPP-IV抑制活性，但如何将这些DPP-IV抑制肽从胶原蛋白中释放出来，从而制备具有较强DPP-IV抑制活性的胶原蛋白酶解物，仍是一个技术难点，至今还未有突破。

发明内容

本发明通过对酶解方案的优化，从鱼皮酶解分离得到具有较强DPP-IV抑制活性、长度为4-7个氨基酸残基的Gly-Pro-型肽，及富含上述多肽的鱼皮酶解物，为治疗二型糖尿病提供了更好的替代方案。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种酶解物，含有由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽；

所述由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽，其序列通式为Gly-Pro-Xaa1-Gly-[Xaa2]_r-[Xaa3]_s-[Gly]_t；

所述的Xaa1为Ile(I)、Ala(A)、Leu(L)、Thr(T)、Val(V)、Ser(S)、His(H)、Hyp(O)或Pro(P)；

所述的r为0或1；

当r为0时，所述s、t均为0；当r为1时，所述s为0或1；

所述的Xaa2为Gly(G)、Glu(E)或Pro(P)；

所述的s为0或1；

当s为0时，所述t为0；当s为1时，所述t为0或1；

所述的Xaa3为Arg(R)、Ala(A)、Ser(S)、Val(V)、Hyp(O)或Pro(P)；

优选地，所述的由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽包括以下多肽：GPIG、GPAG、GPLG、GPTG、GPVG、GPOG、GPPG、GPAGG、GPOGE、GPIGPR、GPAGPA、GPAGPR、GPSGPR、GPVGPSG、GPAGPAG、GPHGPVG、GPSGPAG、GPAGPOG、GPOGPOG和GPOGPPG；

所述Gly-Pro-型肽中的氨基酸残基均为L构型；

优选地，上述由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽在酶解物中的质量占比为30-45％；

所述的酶解物，是由富含胶原蛋白的动物原料酶解得到；

所述富含胶原蛋白的动物原料优选为牛、猪、羊或鱼等动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腿、韧带、血管、肌隔膜、肌束膜或肌细胞膜等；

所述的鱼包括罗非鱼、鲢鱼、鳕鱼、触须鱼、竹荚鱼、比目鱼、虹鳟鱼等。

上述酶解物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将经过碱处理和热处理的富含胶原蛋白的动物原料冷却至40-60℃，调节体系pH值为6.0-8.0，加入在非Gly残基羧基端切割的蛋白酶，酶解一段时间，灭酶；

步骤(1)所述在非Gly残基羧基端切割的蛋白酶为胰蛋白酶、碱性蛋白酶或风味蛋白酶中的一种以上，所述蛋白酶的添加量为动物原料质量的0.1-2％，优选0.1-1.2％；

(2)步骤(1)所得酶解液，调节pH值至6.0-8.0，加入在Gly残基羧基端切割的蛋白酶，酶解一段时间，灭酶，所得二次酶解液即含有所述的酶解物；

步骤(2)所述在Gly残基羧基端切割的蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或中性蛋白酶中的一种以上；所述的蛋白酶添加量为动物原料质量的0.1-2％，优选0.1-1.2％；

步骤(1)所述的碱处理，是将动物原料加入碱液中浸泡0.5-8h，流水洗至中性；

所述的碱液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，浓度0.01％-2％。

步骤(1)所述的热处理，是将动物原料在60-100℃热水中浸泡0.5-12h。

步骤(1)和(2)所述的酶解优选酶解1-12h；

步骤(1)和(2)所述的灭酶，是90-100℃下处理5-30min；

所得二次酶解液冷却至室温后离心，上清液加入吸附材料，加热处理后过滤，滤液灭菌、浓缩、喷雾干燥，得到可产业化应用的酶解物粉末；

所述的离心优选4000-8000rpm离心10-30min；

所述的吸附材料优选硅藻土和/或活性炭；

所述灭菌处理为高温高压瞬时灭菌；

所述浓缩为将过滤后的酶解液浓缩至固形物含量为25-45％；

所述喷雾干燥的压力为0.2-0.4MPa，喷雾干燥的进口温度为175-195℃，喷雾干燥的出口温度为80-100℃。

本发明酶解物的DPP-IV抑制率在53-68％(终浓度为1mg/mL，以蛋白含量计)，IC₅₀值为600μg/mL，还具有体内降血糖活性，可用于制备治疗二型糖尿病的药物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的制备方法，首次制得一种具有强DPP-IV抑制活性的酶解物，其在终浓度为1mg/mL下DPP-IV抑制率高达68％(IC₅₀值为600μg/mL)；该酶解物中富含由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽，肽得率高达45％；经动物实验验证，该酶解物能调节二型糖尿病大鼠的空腹血糖并且改善其口服葡萄糖耐受能力。

(2)本发明提供的制备方法，工艺简单，实现了目标多肽的酶解控释，且整个工艺流程均可达食品级要求，可应用于降血糖相关的药品、保健品和食品中。

附图说明

图1为对比例1-6中所用蛋白酶在罗非鱼皮胶原蛋白上的裂解位点Weblogo图。

图2为实施例1-4和对比例1-14中所得鱼皮酶解物的DPP-IV抑制率(终浓度为1mg/mL)。

图3为实施例1-4和对比例1-14中所得鱼皮酶解物中由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的质量百分比。

图4为实施例1-4和对比例1-14中所得鱼皮酶解物的DPP-IV抑制率与其中由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的得率之间的相关性。

图5为实施例4所得鱼皮酶解物对二型糖尿病大鼠空腹血糖值的作用效果柱状图。

图6为实施例4所得鱼皮酶解物灌胃二型糖尿病大鼠8周后，进行口服葡萄糖耐受量测试所得血糖-时间变化曲线。

图7为实施例4所得鱼皮酶解物对二型糖尿病大鼠口服葡萄糖耐受量的作用效果柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

鱼皮酶解物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将1kg鱼皮(罗非鱼鱼皮，下同)解冻，沥干水分，然后加入6L浓度为0.05％的氢氧化钠溶液，浸泡4h后，流水洗至中性，得到碱处理鱼皮；

(2)将碱处理鱼皮加入到10L温度为90℃的热水中，热处理5h，得到热处理后鱼皮溶液；

(3)将热处理后鱼皮溶液冷却至37℃，调节溶液pH值为8.0，向其中加入1g胰蛋白酶，酶解8h后，于95℃下灭酶处理30min，得到一次酶解后的溶液；

(4)将一次酶解后的溶液冷却至50℃，调节pH值为7.0，向其中加入1g菠萝蛋白酶和1g中性蛋白酶，酶解6h后，于95℃下灭酶处理30min，得到二次酶解后的溶液，酶解液冷却至室温，然后在25℃，4000rpm下离心20min，取上清液。

(5)向上清液加入6％硅藻土和8％活性炭，搅拌且加热处理45min(温度为75℃)，板框过滤，得到过滤后的酶解液。

(6)将过滤后的酶解液进行高温蒸汽灭菌处理，真空浓缩后，进行喷雾干燥，喷雾干燥的压力为0.2MPa、进口温度为180℃、出口温度为95℃，得到所述富含4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的鱼皮酶解物。

实施例2

鱼皮酶解物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将1.4kg鱼皮解冻，沥干水分，然后加入7L浓度为2％的氢氧化钠溶液，浸泡2h后，流水洗至中性，得到碱处理鱼皮；

(2)将碱处理鱼皮加入到21L温度为95℃的热水中，热处理4h，得到热处理后鱼皮溶液；

(3)将热处理后鱼皮溶液冷却至50℃，调节溶液pH值为7.0，向其中加入1.2g风味蛋白酶，酶解6h后，于95℃下灭酶处理30min，得到一次酶解后的溶液；

(4)将一次酶解后的溶液冷却至50℃，调节pH值为7.0，向其中加入1.5g中性蛋白酶和1.5g木瓜蛋白酶，酶解6h后，于95℃下灭酶处理30min，得到二次酶解后的溶液，酶解液冷却至室温，然后在25℃，4000rpm下离心20min，取上清液。

(5)向上清液加入15％硅藻土和9％活性炭，搅拌且加热处理45min(温度为75℃)，板框过滤，得到过滤后的酶解液。

实施例3

鱼皮酶解物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将0.6kg鱼皮解冻，沥干水分，然后加入4L浓度为1.5％的氢氧化钠溶液，浸泡2.5h后，流水洗至中性，得到碱处理鱼皮；

(2)将碱处理鱼皮加入到5L温度为85℃的热水中，热处理6h，得到热处理后鱼皮溶液；

(3)将热处理后鱼皮溶液冷却至37℃，调节溶液pH值为8.0，向其中加入2g胰蛋白酶，酶解4h后，于95℃下灭酶处理30min，得到一次酶解后的溶液；

(4)将一次酶解后的溶液冷却至50℃，调节pH值为7.0，向其中加入1.5g菠萝蛋白酶和1g木瓜蛋白酶，酶解10h后，于95℃下灭酶处理30min，得到二次酶解后的溶液，酶解液冷却至室温，然后在25℃，4000rpm下离心20min，取上清液。

(5)向上清液加入9％硅藻土和15％活性炭，搅拌且加热处理1h(温度为65℃)，板框过滤，得到过滤后的酶解液。

实施例4

鱼皮酶解物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将2kg鱼皮解冻，沥干水分，然后加入20L浓度为1.2％的氢氧化钠溶液，浸泡3h后，流水洗至中性，得到碱处理鱼皮；

(2)将碱处理鱼皮加入到12L温度为80℃的热水中，热处理8h，得到热处理后鱼皮溶液；

(3)将热处理后鱼皮溶液冷却至55℃，调节溶液pH值为7.5，向其中加入1g碱性蛋白酶和0.5g风味蛋白酶，酶解8h后，于95℃下灭酶处理30min，得到一次酶解后的溶液；

(4)将一次酶解后的溶液冷却至55℃，调节pH值为7.0，向其中加入1.5kg中性蛋白酶和1g菠萝蛋白酶，酶解4h后，于95℃下灭酶处理30min，得到二次酶解后的溶液，酶解液冷却至室温，然后在25℃，4000rpm下离心20min，取上清液。

(5)向上清液加入6％硅藻土和12％活性炭，搅拌且加热处理45min(温度为75℃)，板框过滤，得到过滤后的酶解液。

对比例1

对比例1在实施例3的基础上，改变步骤(3)和步骤(4)中的酶解方案，将这两个酶解步骤直接更换成单酶酶解，步骤(3)和步骤(4)采用的蛋白酶为胰蛋白酶，蛋白酶添加量为3g，酶解pH为8.0、酶解温度为37℃、酶解时间为12h。除酶解条件(蛋白酶、蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)改变外，其他条件均与实施例3相同。

对比例2

对比例2在实施例3的基础上，改变步骤(3)和步骤(4)中的酶解方案，将这两个酶解步骤直接更换成单酶酶解，步骤(3)和步骤(4)采用的蛋白酶为碱性蛋白酶，蛋白酶添加量为2.5g，酶解pH为8.0、酶解温度为55℃、酶解时间为12h。除酶解条件(蛋白酶、蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)改变外，其他条件均与实施例3相同。

对比例3

对比例3在实施例3的基础上，改变步骤(3)和步骤(4)中的酶解方案，将这两个酶解步骤直接更换成单酶酶解，步骤(3)和步骤(4)采用的蛋白酶为风味蛋白酶，蛋白酶添加量为3.5g，酶解pH为8.0、酶解温度为50℃、酶解时间为12h。除酶解条件(蛋白酶、蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)改变外，其他条件均与实施例3相同。

对比例4

对比例4在实施例3的基础上，改变步骤(3)和步骤(4)中的酶解方案，将这两个酶解步骤直接更换成单酶酶解，步骤(3)和步骤(4)采用的蛋白酶为中性蛋白酶，蛋白酶添加量为3g，酶解pH为7.0、酶解温度为50℃、酶解时间为12h。除酶解条件(蛋白酶、蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)改变外，其他条件均与实施例3相同。

对比例5

对比例5在实施例3的基础上，改变步骤(3)和步骤(4)中的酶解方案，将这两个酶解步骤直接更换成单酶酶解，步骤(3)和步骤(4)采用的蛋白酶为菠萝蛋白酶，蛋白酶添加量为2.8g，酶解pH为7.0、酶解温度为45℃、酶解时间为12h。除酶解条件(蛋白酶、蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)改变外，其他条件均与实施例3相同。

对比例6

对比例6在实施例3的基础上，改变步骤(3)和步骤(4)中的酶解方案，将这两个酶解步骤直接更换成单酶酶解，步骤(3)和步骤(4)采用的蛋白酶为木瓜蛋白酶，蛋白酶添加量为3.3g，酶解pH为7.0、酶解温度为55℃、酶解时间为12h。除酶解条件(蛋白酶、蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)改变外，其他条件均与实施例3相同。

对比例7

对比例7是实施例1中两步酶解操作的反序对照，它在实施例1的基础上，改变两步酶解操作中蛋白酶的顺序，也就是第一步先用在Gly残基羧基端切割的蛋白酶(菠萝蛋白酶和中性蛋白酶)进行酶解，第二步再用在非Gly残基羧基端切割的蛋白酶(胰蛋白酶)进行酶解。除酶解条件(蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)随着两步酶解所用的蛋白酶改变外，其他条件均与相应的实施例相同。

对比例8

对比例8是实施例2中两步酶解操作的反序对照，它在实施例2的基础上，改变两步酶解操作中蛋白酶的顺序，也就是第一步先用在Gly残基羧基端切割的蛋白酶(中性蛋白酶和木瓜蛋白酶)进行酶解，第二步再用在非Gly残基羧基端切割的蛋白酶(风味蛋白酶)进行酶解。除酶解条件(蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)随着两步酶解所用的蛋白酶改变外，其他条件均与相应的实施例相同。

对比例9

对比例9是实施例3中两步酶解操作的反序对照，它在实施例3的基础上，改变两步酶解操作中蛋白酶的顺序，也就是第一步先用在Gly残基羧基端切割的蛋白酶(菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶)进行酶解，第二步再用在非Gly残基羧基端切割的蛋白酶(胰蛋白酶)进行酶解。除酶解条件(蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)随着两步酶解所用的蛋白酶改变外，其他条件均与相应的实施例相同。

对比例10

对比例10是实施例4中两步酶解操作的反序对照，它在实施例4的基础上，改变两步酶解操作中蛋白酶的顺序，也就是第一步先用在Gly残基羧基端切割的蛋白酶(菠萝蛋白酶和中性蛋白酶)进行酶解，第二步再用在非Gly残基羧基端切割的蛋白酶(碱性蛋白酶和风味蛋白酶)进行酶解。除酶解条件(蛋白酶添加量、酶解pH、酶解温度、酶解时间)随着两步酶解所用的蛋白酶改变外，其他条件均与相应的实施例相同。

对比例11

对比例11是实施例1中两步酶解操作的混合对照，在实施例1的基础上，将两步酶解操作中用到的所有蛋白酶(胰蛋白酶、菠萝蛋白酶以及中性蛋白酶)一次性加入到热处理后鱼皮溶液中，进行一步混合酶解。为保证各蛋白酶的活力，适当调整酶解条件(酶解pH：7.5；酶解温度：45℃；酶解时间：8h)，其他条件均与相应的实施例相同。

对比例12

对比例12是实施例2中两步酶解操作的混合对照，在实施例2的基础上，将两步酶解操作中用到的所有蛋白酶(风味蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶)一次性加入到热处理后鱼皮溶液中，进行一步混合酶解。为保证各蛋白酶的活力，适当调整酶解条件(酶解pH：7；酶解温度：50℃；酶解时间：6h)，其他条件均与相应的实施例相同。

对比例13

对比例13是实施例3中两步酶解操作的混合对照，在实施例3的基础上，将两步酶解操作中用到的所有蛋白酶(胰蛋白酶、菠萝蛋白酶以及木瓜蛋白酶)一次性加入到热处理后鱼皮溶液中，进行一步混合酶解。为保证各蛋白酶的活力，适当调整酶解条件(酶解pH：7.5；酶解温度：45℃；酶解时间：6h)，其他条件均与相应的实施例相同。

对比例14

对比例14是实施例4中两步酶解操作的混合对照，在实施例4的基础上，将两步酶解操作中用到的所有蛋白酶(碱性蛋白酶、风味蛋白酶。菠萝蛋白酶以及中性蛋白酶)一次性加入到热处理后鱼皮溶液中，进行一步混合酶解。为保证各蛋白酶的活力，适当调整酶解条件(酶解pH：7；酶解温度：50℃；酶解时间：8h)，其他条件均与相应的实施例相同。

蛋白酶在鱼皮明胶上的酶切位点的偏好性：将对比例1-6酶解工艺制得的酶解液(步骤5所得)在4℃、10000g离心10～15min，取上清液用流动相0.1％甲酸水稀释至5mg/mL，过0.22μm滤膜于液相小瓶中，待进行质谱分析。使用超高效液相色谱联用质谱(UPLC-MS/MS)鉴定鱼皮酶解物中所有多肽组分，采用梯度洗脱色谱分离，联用二级质谱鉴定定量，洗脱速度为0.2mL/min，进样量为2μL。流动相A为0.1％甲酸水，B为乙腈(质谱纯)，洗脱程序为：0～10min，100％～70％A；10～12min，70％～10％A；12～14min，10％A；14～15min，10％～100％A；15～18min，100％A平衡至初始状态。质谱参数：电子轰击离子源能量7eV，毛细管电压4500V，离子源温度200℃，干燥气体流量8.0L/min，雾化器压力1.5bar，质量扫描范围m/z 50～1500。结合Mascot与de novo解析了不同蛋白酶制备的鱼皮酶解物中的全部肽序列结构，并对其中肽的序列进行位点分析与统计(统计内容：肽的N端(N1’)以及C端(C1)，前一条肽的C端(N1)以及后一条肽的N端(C1’)的氨基酸组成情况)，进而可以了解蛋白酶在罗非鱼皮明胶上的切割位点及其偏好。

结果如图1所示，可知，胰蛋白酶、碱性蛋白酶以及风味蛋白酶更偏向于生成N端为Gly残基的肽，这是由于它们偏好作用于Ala、Arg、Lys以及Ser残基羧基端，而这些氨基酸残基在罗非鱼皮胶原序列中经常位于Gly残基的前面，因此它们被分类为在非Gly残基羧基端切割的蛋白酶。而中性蛋白酶、菠萝蛋白酶以及木瓜蛋白酶更偏向于生成C端为Gly残基的肽，因此它们被分类为在Gly残基羧基端切割的蛋白酶。

DPP-IV抑制率的测定：用Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)将鱼皮酶解物干粉配制成2.5mg/mL的样品溶液。在96孔酶标板中，加入80uL样品溶液与80uL 0.5mM底物(Gly-Pro-pNA)，混合后在37℃下孵育10min，然后加入40uL 12.5mU/mL DPP-IV反应液，混匀后在37℃下精确孵育120min，期间每隔2min测一次405nm下的吸光值。根据下列公式计算待测样品的DPP-IV抑制率。

DPP-IV抑制率计算：选取两个时间点T1和T2，其吸光值在线性范围内变化，计算斜率△A/min。

斜率Slope＝(A2-A1)/(T2-T1)；

DPP-IV抑制率(％)＝(Slope_对照组-Slope_样品组)*100/Slope_对照组。

结果如图2所示。在同等浓度下(终浓度为1mg/mL)，这些鱼皮酶解物的DPP-IV抑制率在15～68％之间，经控制酶解技术定向所得的鱼皮酶解物(实施例1-4)DPP-IV抑制活性明显高于单酶作用的酶解物(对比例1-6)，DPP-IV抑制率在53～68％之间，这说明多种蛋白酶的作用使得明胶中的DPP-IV抑制肽得到了有效地释放。

同样是多种蛋白酶的作用，两步反序酶解所得的鱼皮酶解物(对比例7-10)以及一步混合酶解所得的鱼皮酶解物(对比例11-14)的DPP-IV抑制率在26-42％之间，均显著低于实施例1-4所得的鱼皮酶解物的活性，这说明蛋白酶的使用顺序严重影响了明胶中DPP-IV抑制肽的释放。

根据明胶氨基酸序列的组成特征，可以推测，鱼皮酶解物中的DPP-IV抑制肽主要是Gly-Pro-型肽，因此第一步酶解若采用在Gly残基羧基端具有强切割作用的蛋白酶来酶解明胶，会大大减少Gly-Pro-型肽的生成量，从而导致所得的鱼皮酶解物具有较低的DPP-IV抑制活性。若第一步使用在非Gly残基羧基端具有强切割作用的蛋白酶来酶解明胶，则会有助于生成与保护Gly-Pro-型长肽，因此第二步再使用在Gly残基羧基端具有强切割作用的蛋白酶来进一步地酶解，则有助于长度适中且活性更高的Gly-Pro-型肽的生成，从而制备出DPP-IV抑制活性更高的鱼皮酶解物。

4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的鉴定与定量：由酶解工艺制得的酶解液(步骤5所得)在4℃、10000g离心10～15min，取上清液用流动相0.1％甲酸水稀释至5mg/mL，过0.22μm滤膜于液相小瓶中，待进行质谱分析。使用超高效液相色谱联用质谱(UPLC-MS/MS)鉴定鱼皮酶解物中4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽，采用梯度洗脱色谱分离，联用二级质谱鉴定定量，洗脱速度为0.2mL/min，进样量为2μL。流动相A为0.1％甲酸水，B为乙腈(质谱纯)，洗脱程序为：0～10min，100％～70％A；10～12min，70％～10％A；12～14min，10％A；14～15min，10％～100％A；15～18min，100％A平衡至初始状态。质谱参数：电子轰击离子源能量7eV，毛细管电压4500V，离子源温度200℃，干燥气体流量8.0L/min，雾化器压力1.5bar，质量扫描范围m/z 50～1500。

对实施例1-4和对比例1-14所得成品鱼皮酶解物中的多肽组分进行质谱鉴定分析，所得数据如图3所示。

图3中结果显示，实施例1-4采用两步控制酶解技术所得鱼皮酶解物中由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的质量百分比在30-45％之间。

所述的Gly-Pro-型肽包括以下多肽：GPIG、GPAG、GPLG、GPTG、GPVG、GPOG、GPPG、GPAGG、GPOGE、GPIGPR、GPAGPA、GPAGPR、GPSGPR、GPVGPSG、GPAGPAG、GPHGPVG、GPSGPAG、GPAGPOG、GPOGPOG和GPOGPPG；

其中实施例4的制备方法所制得的鱼皮酶解物中由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽含量最高，达到45％，而对比例1-6采用单酶酶解所制得的鱼皮酶解物中由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的得率相对较低，得率在1-20％之间，其中由胰蛋白酶(对比例1)和中性蛋白酶(对比例4)所制备的鱼皮酶解物中4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的得率最低(<2％)。

另外，两步反序酶解和一步混合酶解所得的鱼皮酶解物中由4-7个氨基酸组成的Gly-Pro-型肽的得率在7-19％之间，数值接近单酶作用的结果，均显著低于实施例1-4选用控制酶解方案所制得的鱼皮酶解物中的得率，该结果直接说明蛋白酶的使用顺序的确会影响具有高DPP-IV抑制活性贡献的Gly-Pro-型肽的生成量。两种类型的蛋白酶经合理地搭配，分步酶解所生成的鱼皮酶解物中由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的得率大大提升，说明此种分步复合酶解作用实现了目标肽的高效且定向制备。

图4中呈现了实施例1-4、对比例1-14中所制备的鱼皮酶解物的DPP-IV抑制活性与其中由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的得率之间的相关性。数据表明，由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的得率与鱼皮酶解物的DPP-IV抑制活性呈现线性正相关(R²＝0.95)，Gly-Pro-型肽得率越高，相应的酶解物DPP-IV抑制活性越高，这说明鱼皮胶原蛋白中由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的高效且定向制备，是实现高DPP-IV抑制活性的鱼皮酶解物的制备的可行方案之一。

实施例4所得鱼皮酶解物中鉴定出的所有由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的含量(用相对峰强表示)及其抑制DPP-IV酶50％活性时的浓度(IC₅₀值)的活性见表1。

由表1可知，实施例4所得鱼皮酶解物中鉴定出的由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽，除了4条GPO-型肽和1条GPP-型肽的DPP-IV抑制活性较差外，其他15条肽均具有很好的DPP-IV抑制活性，IC₅₀值要低于实施例4所得鱼皮酶解物整体的DPP-IV抑制活性(IC₅₀值为600μg/mL)，这也进一步证明了这15条肽对鱼皮酶解物DPP-IV抑制活性具有较大的贡献度。

表1实施例4所得鱼皮酶解物中由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽

注：氨基酸采用单字母缩写形式表示，其中O代表羟脯氨酸

体内降血糖功效评价：

利用二型糖尿病大鼠模型研究富含4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽的鱼皮酶解物在体内的降血糖功效，具体操作如下：

(1)实验动物：雄性SD大鼠，21d龄，100～110g，购于广东省医学实验动物中心。

(2)动物饲养环境：室温25±1℃，相对湿度55±15％，每日光照黑暗各12小时，饮用水采用反渗透紫外灭菌水。

(3)动物实验：适应性饲养7天结束后，随机分为5组(每组12只大鼠)：正常组、模型组、二西格列汀组、实施例4鱼皮酶解物低剂量组(200mg/kg)、实施例4鱼皮酶解物高剂量组(400mg/kg)。模型组、西格列汀组、鱼皮酶解物低高剂量组连续12周以高脂饲料喂养，在第5周时腹腔注射低剂量链脲佐菌素(25mg/kg,3天)进行造模。正常组连续12周以正常饲料喂养，第5周腹腔注射等量生理盐水。

造模后连续8周，鱼皮酶解物/西格列汀组大鼠每日口服相应剂量的鱼皮酶解物/西格列汀。模型组和正常组大鼠连续8周口服生理盐水。在造模后第0周、2周、4周、6周和8周时，禁食12小时后，尾静脉采集血液，用血糖仪和血糖试纸按制造商(欧姆龙)说明测量空腹血糖浓度。在造模后第7周时，禁食12小时后，灌胃葡萄糖溶液(1.5g/kg)，用血糖仪和血糖试纸测定口服葡萄糖后0、30、60、120min时的血糖值，评价大鼠的葡萄糖耐受能力。

对具有最高DPP-IV抑制活性的实施例4所得鱼皮酶解物进行体内降血糖功效评估，观测了其对二型糖尿病大鼠空腹血糖值以及口服葡萄糖耐受量的影响，结果如图5、图6和图7所示。带“#”符号表示在相同时期条件下,该组与正常组的空腹血糖值相比具有显著性差异(p<0.05)，带“*”符号表示在相同时期条件下,该组与模型组的空腹血糖值相比具有显著性差异(p<0.05)。

由图5可知，在适应性饲养结束时，各组大鼠空腹血糖值没有显著性差异。在造模后，各实验组大鼠之间空腹血糖值没有显著差异，而各实验组均与正常组大鼠空腹血糖值具有显著性差异。通过连续8周的灌胃实验后，西格列汀组与鱼皮酶解物低高剂量组的大鼠空腹血糖值均显著下降，其中鱼皮酶解物高剂量组在第4周时与糖尿病模型组大鼠具有显著性差异，而西格列汀和鱼皮酶解物低剂量组在第六周时与糖尿病模型组大鼠具有显著性差异，并直至实验结束。由此说明，鱼皮酶解物能够有效降低二型糖尿病大鼠的空腹血糖值，且具有剂量效应。

由图6和图7可知，鱼皮酶解物和西格列汀能够改善二型糖尿病大鼠的口服葡萄糖耐量，且鱼皮酶解物效果接近或者略优于西格列汀。这主要得益于鱼皮酶解物能抵抗口服葡萄糖引起的糖尿病大鼠血糖快速升高，从而在口服同等剂量的葡萄糖溶液30min后，鱼皮酶解物和西格列汀组大鼠的血糖值明显低于模型组大鼠，因此可避免高糖引起的脏器损伤。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种酶解物，其特征在于含有由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽；

所述由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽在酶解物中的质量占比为30-45％；

所述的酶解物，是由富含胶原蛋白的动物原料酶解得到。

2.根据权利要求1所述的酶解物，其特征在于：

所述的Xaa2为Gly(G)、Glu(E)或Pro(P)；

所述的Xaa3为Arg(R)、Ala(A)、Ser(S)、Val(V)、Hyp(O)或Pro(P)。

3.根据权利要求1所述的酶解物，其特征在于：所述的由4-7个氨基酸残基组成的Gly-Pro-型肽包括以下多肽：GPIG、GPAG、GPLG、GPTG、GPVG、GPOG、GPPG、GPAGG、GPOGE、GPIGPR、GPAGPA、GPAGPR、GPSGPR、GPVGPSG、GPAGPAG、GPHGPVG、GPSGPAG、GPAGPOG、GPOGPOG和GPOGPPG。

4.根据权利要求1所述的酶解物，其特征在于：所述富含胶原蛋白的动物原料为牛、猪、羊或鱼的皮、骨、软骨、牙齿、肌腿、韧带、血管、肌隔膜、肌束膜或肌细胞膜。

5.根据权利要求4所述的酶解物，其特征在于：所述的鱼包括罗非鱼、鲢鱼、鳕鱼、触须鱼、竹荚鱼、比目鱼、虹鳟鱼。

6.权利要求1-5任一项所述的酶解物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤(1)所述在非Gly残基羧基端切割的蛋白酶为胰蛋白酶、碱性蛋白酶或风味蛋白酶中的一种以上；

步骤(2)所述在Gly残基羧基端切割的蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或中性蛋白酶中的一种以上。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶的添加量为动物原料质量的0.1-2％。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)和(2)所述的酶解是酶解1-12h。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所得二次酶解液冷却至室温后离心，上清液加入吸附材料，加热处理后过滤，滤液灭菌、浓缩、喷雾干燥，得到酶解物粉末。

10.权利要求1-5任一项所述的酶解物在制备治疗二型糖尿病的药物中的应用。