CN114342961A - 一种防治小麦赤霉病的混合剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及小麦病害防治方法领域，具体公开了一种防治小麦赤霉病的混合剂及其制备方法和应用，所述混合剂由仙人掌提取物和蜡状芽孢杆菌菌悬液按照用量比为3‑5g:10mL混合而成，所述蜡状芽孢杆菌菌悬液的有效活菌数为5ⅹ106‑5ⅹ107cfu/mL。本发明制备得到的混合剂能够抑制禾谷镰刀菌的生长，从而实现小麦赤霉病的防治。

Description

一种防治小麦赤霉病的混合剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及小麦病害防治方法领域，具体涉及一种防治小麦赤霉病的混合剂及其制备方法和应用。
背景技术
小麦赤霉病又称烂穗病、麦秸枯、烂麦头、红麦头、红头瘴，是由多种镰刀菌侵染所引起的、发生在小麦上的病害。从苗期到穗期均可发生，引起苗腐、茎基腐、秆腐和穗腐，以穗腐危害最大。小麦受到病害侵染后粒重降低，发芽率下降，发芽势减弱，出粉率低，面粉质量差。从而严重影响其生产和经济效益。
小麦赤霉病在中国南方冬麦区，如长江中、下游冬麦区，川滇冬麦区和华南冬麦区等地经常流行为害，主要以多雨潮湿的温带发生严重。一般大流行年病穗率达50-100％，产量损失10-20％，中等发生年病穗率30-50％，产量损失5-10％。因此，小麦赤霉病的防治极为重要。
目前小麦赤霉病的防治方法主要是以化学防治为重点，以选用抗病品种为出发点，尽可能获得抗小麦赤霉病的品种，但是这种方法用时长，不稳定，化学药剂的使用也起到副作用，因此，生物防治方法渐渐走进人们的视线。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种防治小麦赤霉病的混合剂及其制备方法和应用，通过仙人掌提取物和蜡状芽孢杆菌菌悬液混合制备混合剂，所述混合剂能够抑制禾谷镰刀菌的生长，从而实现小麦赤霉病的防治。
本发明的第一个目的是提供一种防治小麦赤霉病的混合剂，所述混合剂由仙人掌提取物和蜡状芽孢杆菌菌悬液混合制成；
所述仙人掌提取物和蜡状芽孢杆菌菌悬液用量比为3-5g:10mL；
所述蜡状芽孢杆菌菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2014445；
所述蜡状芽孢杆菌菌悬液的有效活菌数为5ⅹ106-5ⅹ107cfu/mL。
进一步地，所述仙人掌提取物制备过程为：取新鲜的仙人掌捣碎，按照料液比1g:20-26mL加入浓度为80％的乙醇，在超生功率450W,温度60-65℃，pH8.0的条件下，超声提取20-25min，然后离心取上清液，于60℃下减压浓缩，真空冷冻干燥，获得仙人掌提取物。
进一步地，离心条件为4000-4500rpm,离心10-15min。
本发明的第二个目的是提供了一种上述防治小麦赤霉病的混合剂的制备方法，包括如下步骤：
S1，仙人掌提取物制备：取新鲜的仙人掌捣碎，按照料液比1g:20-26mL加入浓度为80％的乙醇，在超生功率450W,温度60-65℃，pH8.0的条件下，超声提取20-25min，然后于4000-4500rpm，离心10-15min，取上清液，于60℃下减压浓缩，真空冷冻干燥，获得仙人掌提取物；
S2，蜡状芽孢杆菌菌悬液制备：首先平板划线法活化蜡状芽孢杆菌，然后挑取单菌落接种于新鲜的液体培养基中，于28-32℃、140-160r/min下培养20-26h获得种子液，将种子液按照接种量3-5％转接于新的液体培养基中，于28-32℃、140-160r/min下培养46-48h，获得蜡状芽孢杆菌菌悬液；
S3，将S1中制备的仙人掌提取物与S2中制备的蜡状芽孢杆菌菌悬液按照用量比为3-5g:10mL混合获得防治小麦赤霉病的混合剂。
进一步地，S1中，所述真空冷冻干燥的条件为-20--30℃，真空度为6-10Pa，时间为6-8h。
进一步地，S2中，活化所用培养基为LB固体培养基。
进一步地，S2中，所述液体培养基为肉汤培养基；
所述肉汤培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，去离子水1000mL，PH7.0。
进一步地，S3中，所述仙人掌提取物与蜡状芽孢杆菌菌悬液用量比为3g:10mL。
本发明的第三个目的是提供了一种所述的混合剂在防治小麦赤霉病中的应用。
进一步地，所述小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明通过超生提取获得仙人掌提取物，然后与蜡状芽孢杆菌制备得到的菌悬液混合获得能够防治小麦赤霉病的混合剂，所述混合剂能够抑制禾谷镰刀菌，因此，能够用于防治由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。
2、本发明制备的仙人掌提取物和蜡状芽孢杆菌菌悬液均能够对禾谷镰刀菌产生抑制作用，且二者混合后抑制能力更高(抑菌率90.8％)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一、一种防治小麦赤霉病的混合剂及其制备方法
实施例1
1、供试菌株
(1)小麦赤霉病菌(禾谷镰刀菌)购买自上海抚生实业有限公司；
(2)蜡状芽孢杆菌ML19，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014445。
(3)所用培养基：
LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂18g，去离子水1000mL。
肉汤培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，去离子水1000mL，PH7.0。
综合PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H2O1.5g，硫胺素微量，琼脂15g，蒸馏水1000mL。
2、防治小麦赤霉病的混合剂的制备
S1，仙人掌提取物制备：取新鲜的仙人掌捣碎，按照料液比1g:20mL加入浓度为80％的乙醇，在超生功率450W,温度60℃，pH8.0的条件下，超声提取20min，然后于4000rpm，离心10min，取上清液，于60℃下减压浓缩，于-25℃，8Pa，真空冷冻干燥7h，获得仙人掌提取物；
S2，蜡状芽孢杆菌菌悬液制备：首先在LB固体培养基平板上划线法活化蜡状芽孢杆菌ML19，然后挑取单菌落接种于新鲜的肉汤培养基中，于28℃、150r/min下培养24h获得种子液，将种子液按照接种量3％(3mL/100mL)转接于新的肉汤培养基中，于32℃、150r/min下培养48h，获得蜡状芽孢杆菌菌悬液；
S3，将S1中制备的仙人掌提取物与S2中制备的蜡状芽孢杆菌菌悬液按照用量比为3g:10mL混合获得防治小麦赤霉病的混合剂。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，区别在于：
2、防治小麦赤霉病的混合剂的制备过程中：
S1，仙人掌提取物制备：取新鲜的仙人掌捣碎，按照料液比1g:23mL加入浓度为80％的乙醇，在超生功率450W,温度60℃，pH8.0的条件下，超声提取25min，然后于4500rpm，离心10min，取上清液，于60℃下减压浓缩，于-20℃，10Pa，真空冷冻干燥8h，获得仙人掌提取物；
S2，蜡状芽孢杆菌菌悬液制备：首先在LB固体培养基平板上划线法活化蜡状芽孢杆菌ML19，然后挑取单菌落接种于新鲜的肉汤培养基中，于30℃、150r/min下培养24h获得种子液，将种子液按照接种量4％(4mL/100mL)转接于新的肉汤培养基中，于30℃、150r/min下培养48h，获得蜡状芽孢杆菌菌悬液；
S3，将S1中制备的仙人掌提取物与S2中制备的蜡状芽孢杆菌菌悬液按照用量比为4g:10mL混合获得防治小麦赤霉病的混合剂。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，区别在于：
2、防治小麦赤霉病的混合剂的制备过程中：
S1，仙人掌提取物制备：取新鲜的仙人掌捣碎，按照料液比1g:26mL加入浓度为80％的乙醇，在超生功率450W,温度65℃，pH8.0的条件下，超声提取25min，然后于4000rpm，离心15min，取上清液，于60℃下减压浓缩，于-30℃，6Pa，真空冷冻干燥6h，获得仙人掌提取物；
S2，蜡状芽孢杆菌菌悬液制备：首先在LB固体培养基平板上划线法活化蜡状芽孢杆菌ML19，然后挑取单菌落接种于新鲜的肉汤培养基中，于32℃、150r/min下培养24h获得种子液，将种子液按照接种量4％(4mL/100mL)转接于新的肉汤培养基中，于32℃、150r/min下培养48h，获得蜡状芽孢杆菌菌悬液；
S3，将S1中制备的仙人掌提取物与S2中制备的蜡状芽孢杆菌菌悬液按照用量比为5g:10mL混合获得防治小麦赤霉病的混合剂。
以实施例1为例，研究本发明制备得到的仙人掌提取物，蜡状芽孢杆菌菌悬液和混合剂分别对禾谷镰刀菌的抑制作用。
二、混合剂对禾谷镰刀菌的抑制作用
1、仙人掌提取物、蜡状芽孢杆菌菌悬液和混合剂对禾谷镰刀菌的相对抑制率
在综合PDA培养基(固体)上接种禾谷镰刀菌，在28℃下培养48h，用无菌的打孔器(直径＝6mm)从菌落边缘打出菌饼，接种在新鲜的空白综合PDA培养基平板中央位置，在距离菌饼2.5cm处的两边分别接种2μL的待检测物质，以无菌水为对照组，每个处理重复三次，待对照组综合PDA培养基平板中的菌丝长满全板时，测量病原菌菌落的生长半径，利用以下公式计算抑菌率。
相对抑菌率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径ⅹ100％
上述的待检测物质为仙人掌提取物稀释液，蜡状芽孢杆菌菌悬液和混合剂；
所述的仙人掌提取物稀释液由本发明中实施例1制备的仙人掌提取物与40℃的无菌水混合均匀而成，其中，仙人掌提取物与无菌水混合比例为3g:10mL；
2、不同稀释倍数的混合剂对禾谷镰刀菌的抑制作用
将所述混合剂用无菌水稀释0倍、10倍、50倍、100倍、200倍和500倍，分别用平板对峙培养法检测所得的各倍数稀释液对禾谷镰刀菌的相对抑菌率；
以上实验每个组分别做三个平行，计算平均数。
三、实验结果
1、仙人掌提取物、蜡状芽孢杆菌菌悬液和混合剂对禾谷镰刀菌的相对抑制率
表1本发明制备的各物质对禾谷镰刀菌的抑菌效果
待检测物质 相对抑菌率(％)
仙人掌提取物稀释液 61.3
蜡状芽孢杆菌菌悬液 68.4
混合剂 90.8
由表1可知，本发明实施例1制备的混合剂对禾谷镰刀菌的相对抑菌率达到90.8％，说明所述混合剂对禾谷镰刀菌具有高效的抑菌能力，且发现本发明制备的仙人掌提取物和蜡状芽孢杆菌菌悬液均对禾谷镰刀菌有一定的抑制效果，但是抑菌率不高，但是通过将二者按照特定比例混合后发现得到的混合剂抑菌率大大增加。
2、不同稀释倍数的混合剂对禾谷镰刀菌的抑制作用
表2本发明中不同稀释倍数的混合剂对禾谷镰刀菌的抑菌效果
不同稀释倍数的混合剂 相对抑菌率(％)
混合剂原液 90.8
混合剂10倍液 84.4
混合剂50倍液 80.3
混合剂100倍液 77.1
混合剂200倍液 70.5
混合剂500倍液 59.6
由表2可知，本发明实施例1制备得到的混合剂的10倍液、50倍液、100倍液、200倍液和500倍液均对禾谷镰刀菌具有抑菌效果，虽然随着稀释倍数增加抑菌率降低，但是在混合剂稀释至500倍时，其抑菌率仍然在50％以上，因此，本发明制备的混合剂能够有效的抑制禾谷镰刀菌，从而能够将其用于由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病防治中。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种防治小麦赤霉病的混合剂，其特征在于，所述混合剂由仙人掌提取物和蜡状芽孢杆菌菌悬液混合制成；
所述仙人掌提取物和蜡状芽孢杆菌菌悬液用量比为3-5g:10mL；
所述蜡状芽孢杆菌菌种保藏编号为CCTCC NO：M 2014445；
所述蜡状芽孢杆菌菌悬液的有效活菌数为5ⅹ106-5ⅹ107cfu/mL。
2.如权利要求1所述的防治小麦赤霉病的混合剂，其特征在于，所述仙人掌提取物制备过程为：取新鲜的仙人掌捣碎，按照料液比1g:20-26mL加入体积浓度为80％的乙醇，在超声功率450W、温度60-65℃、pH8.0的条件下，超声提取20-25min，然后离心取上清液，于60℃下减压浓缩，真空冷冻干燥，获得仙人掌提取物。
3.如权利要求2所述的防治小麦赤霉病的混合剂，其特征在于，离心条件为4000-4500rpm,离心10-15min。
4.一种权利要求1所述的防治小麦赤霉病的混合剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，仙人掌提取物制备：取新鲜的仙人掌捣碎，按照料液比1g:20-26mL加入浓度为80％的乙醇，在超生功率450W,温度60-65℃，pH8.0的条件下，超声提取20-25min，然后于4000-4500rpm，离心10-15min，取上清液，于60℃下减压浓缩，真空冷冻干燥，获得仙人掌提取物；
S2，蜡状芽孢杆菌菌悬液制备：活化蜡状芽孢杆菌，然后挑取单菌落接种于新鲜的液体培养基中，于28-32℃、140-160r/min下培养20-26h获得种子液，将种子液按照接种量3-5％转接于新的液体培养基中，于28-32℃、140-160r/min下培养46-48h，获得蜡状芽孢杆菌菌悬液；
S3，将S1中制备的仙人掌提取物与S2中制备的蜡状芽孢杆菌菌悬液按照用量比为3-5g:10mL混合获得防治小麦赤霉病的混合剂。
5.如权利要求4所述的防治小麦赤霉病的混合剂的制备方法，其特征在于，S1中，所述真空冷冻干燥的条件为-20--30℃，真空度为6-10Pa，时间为6-8h。
6.如权利要求4所述的防治小麦赤霉病的混合剂的制备方法，其特征在于，S2中，活化所用培养基为LB固体培养基。
7.如权利要求4所述的防治小麦赤霉病的混合剂的制备方法，其特征在于，S2中，所述液体培养基为肉汤培养基；
所述肉汤培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，去离子水1000mL，PH7.0。
8.如权利要求4所述的防治小麦赤霉病的混合剂的制备方法，其特征在于，S3中，所述仙人掌提取物与蜡状芽孢杆菌菌悬液用量比为3g:10mL。
9.一种权利要求1所述的混合剂在防治小麦赤霉病中的应用。
10.如权利要求9所述的混合剂在防治小麦赤霉病中的应用，其特征在于，所述小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌引起的。
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