CN114324888A

CN114324888A - 一种微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法

Info

Publication number: CN114324888A
Application number: CN202111336311.1A
Authority: CN
Inventors: 雷震; 斯志娟
Original assignee: Nanchang No9 Hospital
Current assignee: Nanchang No9 Hospital
Priority date: 2021-11-12
Filing date: 2021-11-12
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明提供了一种微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，包括：将红细胞与第一抗体加入试管内进行红细胞致敏反应，所述红细胞为配血试验的献/受者红细胞或试剂红细胞，所述第一抗体为配血试验的受/献者血清、或待测同种抗体、或自身抗体；红细胞致敏反应完成后，将反应后的产物加入到抗人球蛋白卡的微柱凝胶管中进行凝集反应。根据本发明提供的方法，红细胞致敏反应在试管内完成，第一抗体未与第二抗体接触，不被中和，混匀容易并可在实验中增加混匀次数以增加抗原抗体接触、反应，因此红细胞致敏反应更加充分，反应灵敏度提高；在红细胞致敏反应完成后加入微柱试剂进行凝集反应，无需担心第一抗体被中和，操作难度大大降低。

Description

一种微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，特别是涉及一种微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法。

背景技术

间接抗人球蛋白试验广泛应用于输血相容性检测(同种抗体筛查、交叉配血实验)及血清或血浆游离自身抗体检测等实验检测，对于保障输血安全及自身免疫性溶血性贫血的诊断具有十分重要的意义，目前主要采用微柱凝集法进行间接抗人球蛋白试验。

微柱凝集法抗人球蛋白试验是采用一个集成的试剂卡(抗人球蛋白)用于检测临床标本。试剂卡由上部的反应腔和与之相连的微柱组成，反应腔用于红细胞致敏反应，微柱装有抗人球蛋白试剂(内含第二抗体)。实验分两部分，首先试剂红细胞(或配血试验的献、受者红细胞)与待检血清(第一抗体，或配血试验的受、献者血清)在反应腔内反应(红细胞致敏反应)，其次是凝集反应，红细胞致敏反应完成后离心，在低离心力的作用下红细胞缓慢通过凝胶微柱，如果红细胞被第一抗体致敏就会与第二抗体凝集而被滞留于微柱上端或微柱中间，未被致敏的红细胞沉于微柱底部。

由于致敏反应在反应腔内进行时，液相试剂中的第二抗体会中和被检的游离第一抗体而阻止其与红细胞结合，从而降低反应灵敏度。为减少中和反应，检测人员在加入试剂红细胞时会尽量使液相试剂与红细胞试剂之间形成一层分隔“膜”，操作技术难度高；为保护这层“膜”，加入待检血清后混匀手法相对轻柔混匀不充分，反应腔狭小也加大了混匀难度。因此，操作难度大、第一抗体被中和、致敏反应不充分、灵敏度降低。

发明内容

鉴于上述状况，本发明提供一种微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，以解决现有技术操作难度大、第一抗体被中和、致敏反应不充分、灵敏度降低的问题。

本发明的技术方案为：

一种微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，包括：

将红细胞与第一抗体加入试管内进行红细胞致敏反应，所述红细胞为配血试验的献/受者红细胞或试剂红细胞，所述第一抗体为配血试验的受/献者血清、或待测同种抗体、或自身抗体；

红细胞致敏反应完成后，将反应后的产物加入到抗人球蛋白微柱凝胶管中进行凝集反应。

根据本发明提供的微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，红细胞致敏反应在试管内完成，未与第二抗体接触，不被中和，混匀容易并可在实验中增加混匀次数以增加抗原抗体接触、反应，因此红细胞致敏反应更加充分，反应灵敏度提高；在红细胞致敏反应完成后加入微柱试剂进行凝集反应，无需担心第一抗体被中和，操作难度大大降低。

附图说明

图1为临床待测样本1实验结果照片；

图2为临床待测样本2实验结果照片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照各实施例对本发明进行更全面的描述，但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供一种微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，包括：

下面以具体实施例对上述方法进行说明。

1.材料与方法

1.1仪器BS-C12低速离心机及BS-I24试剂卡孵育器，珠海贝索生物技术有限公司。CU-600电热恒温水槽，上海一恒科学仪器有限公司。仪器由工程师按说明书设置。

1.2临床样本来源两份不规则抗体筛选阳性临床样本(某医院惠赠)，临床样本1：男76岁A型不规则抗体筛选阳性，临床样本2：女72岁O型不规则抗体筛选阳性。新鲜A型、O型RHD阳性不规则抗体筛查阴性血清各一份(以下称“A型血清”、“O型血清”)(本院送检样本剩余血清)。

1.3试剂抗D(IgG)(单克隆抗体)试剂(批号：20210401)，上海血液生物医药有限责任公司；人ABO血型反定型用红细胞试剂盒(批号：20215319)，上海血液生物医药有限责任公司；抗体筛选红细胞试剂盒(批号：20217042)，上海血液生物医药有限责任公司；抗人球蛋白卡(批号A210201)，珠海贝索生物技术有限公司。

1.4实验方法

1.4.1以抗D(IgG)试剂为标准待测抗体。用生理盐水将抗D(IgG)试剂稀释成1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512的梯度标准待测样本(以下称“梯度标准待测样本”)；用生理盐水将人ABO血型反定型用红细胞试剂盒中的O红细胞稀释至1％的浓度作为抗原细胞(以下称“抗原细胞”)；用生理盐水将抗体筛选红细胞试剂Ι、Ⅱ稀释至1％的浓度作为筛选细胞(以下称“筛选细胞Ι”、“筛选细胞Ⅱ”)。

1.4.2微柱凝集法抗人球蛋白试验采用两种红细胞致敏反应场景(分别称为：方法一、方法二)以微柱凝集法分别检测上述梯度标准待测样本。

方法一：严格按说明书操作(即传统方法)，抗人球蛋白卡每孔加入抗原细胞50ul、待测样本25ul，混匀后置孵育器37℃孵育15分钟，离心判读结果。

方法二：红细胞致敏反应在试管内完成(即本发明的方法)，即①取5支试管，每管按抗原细胞/待测样本为2/1的比例加样为反应液，混匀置水浴箱37℃水浴孵育15分钟，期间每间隔5分钟混匀1次；②每管吸取75ul反应液加入抗人球蛋白卡，立即离心判读结果。

各梯度标准待测样本均用上述两种方法平行检测5批。

1.4.3临床样本检测上述临床样本1用A型血清倍比稀释、临床样本2用O型血清倍比稀释，形成原倍、1：2、1：4的递度临床待测样本。

以上述筛选细胞Ι、筛选细胞Ⅱ为筛选细胞，用方法一、方法二对照检测上述递度临床待测样本。

1.4.4红细胞沉降试验取一张抗人球蛋白卡，每孔加抗原细胞50ul、O型血清25ul，混匀后置水浴箱37℃空气浴孵育15分钟，分别于0、5、10、15分钟图片记录并比较分析微柱反应腔内红细胞沉降情况。

1.5结果判读

依试剂说明书方法判读结果，并记录各孔反应强度。

2.结果

2.1标准待测样本各孔凝集强度见表1，在1∶32和1∶64两个稀释度，两种方法凝集强度均为5，1∶128、1∶256二个稀释度方法一的凝集强度弱于方法二，1∶512该稀释度方法一阴性，方法二凝集强度为2。

表1标准待测样本各孔凝集强度

注：1～5号为方法一，6～10号为方法二；4+记录为5，3+记录为4，2+记录为3，1+记录为2，±记录为1，-记录为0。

2.2临床待测样本1各孔凝集强度见表2、实验结果照片见图1。方法一阳性孔凝集强度均弱于方法二，原倍样本筛选细胞Ι方法一阴性、方法二凝胶柱上端有一条较弱的凝集带。

表2临床待测样本1各孔凝集强度

注：3+/2+记录为4/3，2+记录为3，2+/1+记录为3/2，1+记录为2，±记录为1，-记录为0。

2.3临床待测样本2各孔凝集强度见表3、实验结果照片见图2。方法一阳性孔凝集强度均弱于方法二。

表3临床待测样本2各孔凝集强度

注：4+记录为5，4+/3+记录为5/4，3+记录为4，2+记录为3，2+/1+记录为3/2，1+记录为2，±记录为1，-记录为0。

2.4 10分钟末肉眼可见红细胞明显的沉降，15分钟末红细胞沉降更明显。

3.结论

输血前血型复检、红细胞不规则抗体筛查及交叉配血试验，是相容性输血的重要技术手段，对输血安全有十分重要的意义。研究发现，红细胞无效输注与低效价不规则抗体密切相关。因此，提高低效价不规则抗体的检出率、减少漏检的发生对提高红细胞输注疗效及保障输血安全具有重要意义。有研究采用多种方法同时检测，可减少低效价不规则抗体漏检的发生率。

间接抗人球蛋白试验广泛用于免疫性溶血性疾病的诊断、输血相容性检测(包括不规则抗体筛选和交叉配血试验)。该实验由两部分组成，分别是第一步的同种抗体致敏红细胞反应(红细胞致敏反应)和第二步的第二抗体(抗人球蛋白抗体)与致敏红细胞的凝集反应(凝集反应)。其中，红细胞致敏反应充分与否，是影响实验灵敏度的重要因素。研究表明，防止致敏反应混合物与凝胶柱试剂接触、保证充分的反应时间、增加待测血清量能提高间接抗人球蛋白试验的灵敏度。

上述方法一采用的是《全国临床检验操作规程》及试剂说明书推荐的方法，红细胞致敏反应在微柱上部的柱反应腔内混匀、反应，其灵敏度低于方法二的原因有：一是方法二的红细胞致敏反应在试管内完成，反应过程中待测抗体未被抗人球蛋白抗体(第二抗体)中和；方法一的红细胞致敏反应在微柱反应腔内进行时，反应过程中凝胶试剂中的抗人球蛋白抗体(第二抗体)中和了部分游离的待测抗体，待测抗体高浓度时影响不明显，低浓度时凝集强度下降甚或出现假阴性。二是微柱反应腔体积狭小，反应液很难充分混匀，而方法二在试管中充分混匀。另外，反应液中红细胞在重力的作用下缓慢沉降，方法一反应腔内的抗原抗体因红细胞沉降导致充分接触反应的时间相对缩短，反应不够充分；而方法二在红细胞致敏反应过程中增加了混匀次数，使得抗原抗体充分接触反应的时间相对较长，反应更加充分。因此，在临床检测中，红细胞不规则抗体筛选及交叉配血试验等实验可以采用方法二，即红细胞致敏反应在试管内完成，并在反应过程中增加混匀次数可提高同种抗体的检出率，保障输血安全。

本申请中，临床样本1原倍样本筛选细胞I方法二凝胶柱上端有一条较弱的凝集带，在光线较弱时不易观察，易被遗漏，应养成在强光下读卡的习惯。

本申请在临床样本检测中，采用同型血清稀释样本，使其更接近于临床弱阳性样本特性，呈现更真实的临床检测结果。

总之，红细胞致敏反应在试管内完成，实验易于充分混匀，还可以有效的避免抗人球蛋白抗体中和游离的待测抗体，同时增加混匀次数可使致敏反应更加充分，可提高微柱凝集法间接抗人球蛋白试验的灵敏度。

综上，根据本发明提供的微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，红细胞致敏反应在试管内完成，未与第二抗体接触，不被中和，混匀容易并可在实验中增加混匀次数以增加抗原抗体接触、反应，因此红细胞致敏反应更加充分，反应灵敏度提高；在红细胞致敏反应完成后加入微柱试剂进行凝集反应，无需担心第一抗体被中和，操作难度大大降低。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，其特征在于，所述微柱凝胶管内装有抗人球蛋白试剂。

3.根据权利要求2所述的微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，其特征在于，所述抗人球蛋白试剂包括固相的凝胶分子筛和液相的第二抗体，所述第二抗体为抗人球蛋白抗体。

4.根据权利要求3所述的微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，其特征在于，所述第二抗体充满分子筛微孔并高出微柱预设距离。

5.根据权利要求3所述的微柱凝集法间接抗人球蛋白试验方法，其特征在于，所述方法具体包括：

取5支试管，每管按抗原细胞/待测样本为2/1的比例加样为反应液，混匀置水浴箱37℃水浴孵育15分钟，期间每间隔5分钟混匀1次；

每管吸取75ul反应液加入抗人球蛋白卡的微柱凝胶管中，立即离心判读结果。