CN114324884A - 一种不依赖于抗体类型的抗体检测方法及其应用 - Google Patents
一种不依赖于抗体类型的抗体检测方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于免疫生物学检测领域,涉及一种不依赖于抗体类型的抗体检测方法及其应用,具体涉及一种免疫血清学病原微生物和自身免疫性疾病总抗体检测及其应用方法。本发明是利用一种能同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体分析病原微生物和自身免疫性疾病特异性总抗体水平。
Description
技术领域
本发明属于免疫生物学检测领域,涉及一种病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体检测诊断及其应用。
背景技术
抗体是免疫***产生的抵御病毒、细菌等外来物质的免疫球蛋白。脊椎动物体内的抗体是由重链和轻链组成,抗体重链可分为μ、δ、γ、ε和α五种重链亚型,对应的免疫球蛋白名称分别为:免疫球蛋白M(IgM),免疫球蛋白D(IgD),免疫球蛋白G(IgG),免疫球蛋白A(IgA),免疫球蛋白E(IgE)。抗体轻链可分为κ链和λ链两种亚型。
当病原微生物感染人或其它动物后,被感染人或动物体液中会产生针对病原微生物特异性IgM和/或IgG抗体。初次感染后,IgM型抗体10-14天产生,然后逐渐降低,IgG抗体14-20天产生,然后逐渐降低。再次感染同一种病原体后,IgM持续时间较短,IgG持续时间较长。
病原微生物免疫血清型检测包括抗病原微生物抗原的IgG抗体、IgM抗体和总抗体检测等。其中,IgG抗体检测是用于检测人血清、血浆或全血中的抗病原微生物的IgG抗体。当出现可疑感染时,该检测可用于明确病原微生物感染或被测者的免疫状态。IgM抗体检测可通过捕获法测人血清、血浆或全血中的抗病原微生物的IgM抗体,在微孔中预包被鼠抗人IgM(μ链)抗体,待检标本的IgM抗体都可被捕获,未结合的其他成分(包括特异的IgG抗体)将被洗涤除去。接着,加入辣根过氧化物酶标记的病原微生物抗原,被捕获的抗病原微生物的IgM会与辣根过氧化物酶标记的病原微生物抗原特异性的结合,洗去其他未结合物。最后,用TMB底物显色产生信号,从而判定样品中的抗病原微生物的IgM抗体的存在与否。总抗体检测一般采用双抗原夹心法检测血液样本中的病原微生物总抗体(包括IgM、IgG和IgA等各种抗体类型)。
检测IgM抗体可用于确认近期感染,检测IgG抗体可用于确认是否既往感染过这种病原体。总抗体则包括了IgM和IgG在内的全部特异性抗体。检测总抗体,既包括了IgM抗体检测早期诊断的优势,又有检测IgG抗体既往感染的特点,可以显著提高感染者的发现率,有效防止漏检的发生。
双抗原夹心法检测包括抗病原微生物的IgA、IgG、IgM、IgD和IgE总抗体时存在缺陷。双抗原夹心法需要对抗原进行标记,一些生物大分子如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)标记会造成抗原位点的屏蔽和破坏,造成检测结果假阴性的产生。有些标记后的抗原稳定性差,容易造成聚集和沉淀,对抗病原微生物的总抗体检测产品的工艺开发产生不利影响。
发明内容
本发明提供了一种检测分析样本中抗病原微生物总抗体的方法。总抗体检测抗体可以识别所有抗体类型(IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)的抗体。该方法通过将N-RBD(SARS-CoV-2NP连接的S-RBD)抗原固定在固相载体上,样本中的抗病原微生物特异性总抗体(IgA、IgG、IgM、IgD和IgE抗体)与抗原结合后,最后加入HRP标记的总抗体检测抗体。与传统的抗病原微生物总抗体检测比较,本发明总抗体检测不涉及抗原的标记,制备的总抗体检测试剂具有稳定性好、灵敏度高等优点。SARS-CoV-2NP连接的S-RBD是一个融合蛋白,它是通过基因重组技术将编码SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白(N蛋白)基因与编码SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白RBD结构域的基因片段融合在一起,构建重组质粒。通过哺乳动物表达***表达SARS-CoV-2NP连接的S-RBD蛋白。NP连接的S-RBD蛋白包含核衣壳蛋白和刺突糖蛋白RBD结构域。SARS-CoV-2NP连接的S-RBD蛋白可以检测样本中的针对SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白RBD抗体和针对SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白(N蛋白)抗体。
本发明是使用一种同时识别抗体kappa(κ)轻链和抗体lambda(λ)轻链的抗体检测样本中的病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体水平。总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和IgE各种抗体类型。
一方面,本发明提供病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体检测方法,包括:用总抗体检测抗体检测样本中的病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE抗体类型,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。在一些实施方式中,所述方法包括:使样本与固定在固相载体上的病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原接触,并用信号分子标记的总抗体检测抗体检测样本中是否存在针对所述抗原的总抗体或者确定针对所述抗原的总抗体的水平。在一些实施方式中,所述方法包括:1)使样本与固定在固相载体上的病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原接触;2)使步骤1)中与抗原接触后的样本与信号分子标记的总抗体检测抗体接触;3)测定信号分子的信号水平,并根据信号水平确定所述样本中是否存在针对所述抗原的总抗体或者确定针对所述抗原的总抗体的水平。在一些实施方式中,步骤1)包括使样本与固定在固相载体上的病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原孵育,洗涤;步骤2)包括将信号分子标记的总抗体检测抗体加入步骤1)处理后的固相载体上,孵育,洗涤。在一些实施方式中,步骤1)中的孵育时间为约30分钟,步骤2)中的孵育时间为约15分钟。在一些实施方式中,其中所述样本为血清、血浆或全血。在一些实施方式中,所述样本包含抗病原微生物特异性和/或自身免疫性疾病的特异性抗体IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE抗体中的任一种抗体或任何抗体的组合。在一些实施方式中,所述样本来源于人或动物。在一些实施方式中,其中所述总抗体检测抗体是小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、人源化单克隆抗体、羊驼单克隆抗体、scFv单链抗体、Fab抗原结合片段、F(ab’)2抗原结合片段、重组抗体和/或基因工程改造的嵌合抗体。在一些实施方式中,所述总抗体检测抗体由一种抗κ轻链抗体和一种抗λ轻链抗体组成,或者由多种抗κ轻链抗体和多种抗λ轻链抗体组成。在一些实施方式中,所述总抗体检测抗体为抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体形成的抗体混合物。在一些实施方式中,所述抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人κ轻链小鼠单克隆抗体混合质量比范围(抗人κ轻链小鼠单克隆抗体:抗人κ轻链小鼠单克隆抗体)是0.1-10,优选的为0.2-5,更优选的为0.2-3,更优选的为0.5-3,更优选的为0.5-2.5,更优选的为0.5-2,更优选的为1:1。在一些实施方式中,所述抗原为病毒抗原。在一些实施方式中,所述病毒抗原为SARS-CoV-2病毒抗原,所述方法用于确定人血清、血浆或全血中是否存在针对SARS-CoV-2病毒抗原的总抗体或者确定针对所述抗原的总抗体水平,针对SARS-CoV-2病毒抗原的总抗体包括SARS-CoV-2IgG、SARS-CoV-2IgM和SARS-CoV-2IgA中的两种或三种。在一些实施方式中,所述病毒抗原为SARS-CoV-2融合蛋白。在一些实施方式中,SARS-CoV-2融合蛋白为核衣壳蛋白(N蛋白)与刺突糖蛋白的融合蛋白,在一些实施方式中,SARS-CoV-2融合蛋白为核衣壳蛋白(N蛋白)与刺突糖蛋白RBD结构域的融合蛋白,例如N-RBD,融合蛋白之间可含有或不含有用于连接被融合的蛋白的序列。在一些实施方式中,用总抗体检测抗体通过化学发光分析、免疫层析分析、免疫比浊分析、酶联免疫吸附测定法、免疫印迹分析检测样本中的病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体。
另一方面,本发明提供总抗体检测抗体在制备用于检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体的试剂中的用途,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。另一方面,本发明提供了病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原在制备用于检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体的试剂中的用途,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。另一方面,本发明提供总抗体检测抗体和病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原的组合在制备用于检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体的试剂中的用途,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。另一方面,本发明提供总抗体检测抗体,和病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原在制备用于检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体的试剂盒中的用途,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。在一些实施方式中,所述病原微生物特异性总抗体为针对SARS-CoV-2病毒抗原的总抗体。在一些实施方式中,所述病原微生物抗原为病毒抗原。在一些实施方式中,所述病毒抗原为SARS-CoV-2病毒抗原。在一些实施方式中,所述病毒抗原为SARS-CoV-2融合蛋白。在一些实施方式中,SARS-CoV-2融合蛋白为核衣壳蛋白(N蛋白)与刺突糖蛋白的融合蛋白,在一些实施方式中,SARS-CoV-2融合蛋白为核衣壳蛋白(N蛋白)与刺突糖蛋白RBD结构域的融合蛋白,例如N-RBD,融合蛋白之间可含有或不含有用于连接被融合的蛋白的序列。在一些实施方式中,所述总抗体检测抗体是小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、人源化单克隆抗体、羊驼单克隆抗体、scFv单链抗体、Fab抗原结合片段、F(ab’)2抗原结合片段、重组抗体和/或基因工程改造的嵌合抗体。在一些实施方式中,所述总抗体检测抗体由一种抗κ轻链抗体和一种抗λ轻链抗体组成,或者由多种抗κ轻链抗体和多种抗λ轻链抗体组成。在一些实施方式中,所述总抗体检测抗体为抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体形成的抗体混合物。在一些实施方式中,所述抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人κ轻链小鼠单克隆抗体混合质量比范围(抗人κ轻链小鼠单克隆抗体:抗人κ轻链小鼠单克隆抗体)是0.1-10,优选的为0.2-5,更优选的为0.2-3,更优选的为0.5-3,更优选的为0.5-2.5,更优选的为0.5-2,更优选的为1:1。在一些实施方式中,所述试剂用于通过化学发光分析、免疫层析分析、免疫比浊分析、ELISA法、免疫印迹分析检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体。
另一方面,本发明提供检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体的试剂盒,所述试剂盒包括总抗体检测抗体和病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原,其中,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。在一些实施方式中,所述总抗体检测抗体包括信号分子标记。在一些实施方式中,所述的试剂盒进一步包括固相载体,所述病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原能够固定在所述固相载体上。在一些实施方式中,所述总抗体检测抗体由一种抗κ轻链抗体和一种抗λ轻链抗体组成,或者由多种抗κ轻链抗体和多种抗λ轻链抗体组成。在一些实施方式中,所述总抗体检测抗体为抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体形成的抗体混合物。在一些实施方式中,所述抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人κ轻链小鼠单克隆抗体混合质量比范围(抗人κ轻链小鼠单克隆抗体:抗人κ轻链小鼠单克隆抗体)是0.1-10,优选的为0.2-5,更优选的为0.2-3,更优选的为0.5-3,更优选的为0.5-2.5,更优选的为0.5-2,更优选的为1:1。在一些实施方式中,所述病毒抗原为SARS-CoV-2病毒抗原,所述试剂盒用于确定人血清、血浆或全血中是否存在针对SARS-CoV-2病毒抗原的总抗体或者确定针对所述抗原的总抗体水平,针对SARS-CoV-2病毒抗原的总抗体包括SARS-CoV-2IgG、SARS-CoV-2IgM和SARS-CoV-2IgA中的两种或三种。在一些实施方式中,所述病毒抗原为SARS-CoV-2融合蛋白。在一些实施方式中,SARS-CoV-2融合蛋白为核衣壳蛋白(N蛋白)与刺突糖蛋白的融合蛋白,在一些实施方式中,SARS-CoV-2融合蛋白为核衣壳蛋白(N蛋白)与刺突糖蛋白RBD结构域的融合蛋白,例如N-RBD,融合蛋白之间可含有或不含有用于连接被融合的蛋白的序列。在一些实施方式中,所述试剂盒包扩化学发光检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、免疫比浊检测试剂盒或ELISA检测试剂盒,优选的为ELISA检测试剂盒。在一些实施方式中,本发明的试剂盒用于本发明的检测方法中。
附图说明
图1:总抗体检测抗体组分1分析轻链抗体,结果表明总抗体检测抗体组分1能够识别重组人IgG1(κ轻链抗体),与重组人IgG1(λ轻链抗体)不反应。
图2:总抗体检测抗体组分1分析轻链抗体,结果表明总抗体检测抗体组分2能够识别重组人IgG1(λ轻链抗体),与重组人IgG1(κ轻链抗体)不反应。
图3:总抗体检测抗体分析血清IgG抗体,结果表明总抗体检测抗体、总抗体检测抗体组分1、总抗体检测抗体组分2和阳性对照均能检测到人血清IgG抗体。
图4:总抗体检测抗体分析血清IgM抗体,结果表明总抗体检测抗体、总抗体检测抗体组分1、总抗体检测抗体组分2和阳性对照均能检测到人血清IgM抗体。
图5:总抗体检测抗体分析血清IgA抗体,结果表明总抗体检测抗体、总抗体检测抗体组分1、总抗体检测抗体组分2和阳性对照均能检测到人血清IgA抗体。
图6:总抗体检测抗体分析血清IgE抗体,结果表明总抗体检测抗体、总抗体检测抗体组分1、总抗体检测抗体组分2和阳性对照均能检测到人血清IgE抗体。
图7:SARS-CoV-2总抗体检测试剂盒分析,结果表明SARS-CoV-2总抗体检测试剂盒可以检测重组人抗SARS-CoV-2IgG抗体、重组人抗SARS-CoV-2IgM抗体、重组人抗SARS-CoV-2IgA抗体。
具体实施方式
除非另有说明,本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。
术语解释
本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子,其通常为由2个相同重链和2个相同轻链通过二硫键相互连接组成的四聚体。术语“轻链(L)”是指由大约211-217个氨基酸残基组成的肽链,可分为kappa(κ)与lambda(λ)两种亚型,同一个天然免疫球蛋白分子上L链的型总是相同的。术语“抗体重链”是指由大约450-550个氨基酸残基组成的肽链,根据其恒定区氨基酸组成的不同分为μ、γ、α、δ和ε五类,相应的免疫球蛋白分别为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。
术语“IgA型抗体”是指一种免疫球蛋白,可分为血清型和分泌型两种。血清型IgA以单体形式主要存在于血清中,仅占血清Ig总量的10%~15%。分泌型IgA以二聚体形式,主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液。分泌型IgA是外分泌液中主要的抗体类别,参与黏膜局部免疫。术语“IgD型抗体”是指一种免疫球蛋白,可分为血清型IgD和膜结合型IgD。正常人血清lgD浓度很低,占血清Ig总量的0.2%。血清型IgD的生物学功能尚不清楚;膜结合型IgD构成BCR,是B细胞分化发育成熟的标志。术语“IgE型抗体”是指一种免疫球蛋白,是正常人血清中含量最少的Ig,血清浓度极低。IgE主要由黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌。其重要特征为糖含量较高。IgE与机体的抗寄生虫免疫相关。术语“lgM型抗体”是指分子量最大的免疫球蛋白,以五聚体的形式存在。lgM有IgMl和IgM2两个亚型。主要分布于血清中,占血清总Ig的5%~10%。IgM具有强大的杀菌、激活补体、免疫调理和凝集作用。术语“总抗体”是指包括IgM、IgG、IgA、IgD和IgE在内的全部病原微生物特异性抗体。
术语“总抗体检测”是指同时检测包括IgM和IgG在内的全部病原微生物特异性抗体。该方法具有早期检测的优势,又有检测IgG抗体既往感染的特点,可以更好的防止漏检,缩短诊断窗口期,具有更高的特异性和灵敏度。
术语“总抗体检测抗体”是指能够同时识别抗体κ轻链和λ轻链的抗体,该抗体可以用来检测样本中总抗体水平,总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE各种抗体类型。针对某抗原的总抗体并不必然的包括所有的这五种抗体类型。本发明的总抗体是针对某抗原的所有抗体,根据抗原的不同,生物体内可能只产生IgA、IgG、IgM、IgD和IgE中的一种、两种、三种、四种、或全部五种抗体类型的针对该抗原的抗体,本发明的总抗体根据抗原的不同因而可以包括IgA、IgG、IgM、IgD和IgE中的任何一种、两种、三种、四种或全部五种抗体。进一步,每一种类型的抗体可能包含一种或多种的亚型,比如IgG又可以分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。
“能够同时识别抗体κ轻链和λ轻链的抗体”可以为小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、人源化单克隆抗体、羊驼单克隆抗体、scFv单链抗体、Fab抗原结合片段、F(ab’)2抗原结合片段、重组抗体和/或基因工程改造的嵌合抗体,可以由一种抗κ轻链抗体和一种抗λ轻链抗体组成,或者由多种抗κ轻链抗体和多种抗λ轻链抗体组成。在一些实施方式中,能够同时识别抗体κ轻链和λ轻链的抗体为抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体形成的抗体混合物。抗κ轻链抗体和抗λ轻链抗体均是本领域技术人员所熟知的,可以通过商购获得。
术语“抗原”是指能引起免疫***产生针对其的抗体的任何物质,包扩大分子化学物质、小分子化学物质、有机物质、无机物质、病毒、细菌、花粉、蛋白质、RNA、DNA等。
术语“病原微生物”(又称“病原体”)是指可以侵犯人或动物,引起感染甚至传染病的微生物,其包括病毒、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、朊毒体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)等。
术语“SARS-CoV-2”(又称严重急性呼吸***综合症冠状病毒2)是导致冠状病毒病2019(COVID-19)的冠状病毒,其为巴尔的摩IV类正链单链RNA病毒。本文中所使用的SARS-CoV-2应该被理解为包括所有SARS-CoV-2亚型、突变体或毒株。
术语“自身免疫性疾病”是指自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病,其包括的疾病是本领域技术人员熟知的,例如:器官特异性自身免疫疾病和***性自身免疫疾病(***性红斑狼疮、类风湿关节炎、***性血管炎、硬皮病、自身免疫性溶血性贫血等等)。
术语“信号分子”是指能直接发出或间接发出能被检测到的信号的分子,所述信号包括光学的(发光、荧光、染色)、电化学的、热量的、质量改变等。能直接发出信号的分子包括荧光标记(荧光蛋白、量子点、小分子荧光探针)、胶体金等。能间接发出信号的分子包括使发光底物发光的酶(例如,辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等);与发光启动剂或其他反应物(在存在或不存在催化剂条件下)反应后发光的化学发光剂(例如,吖啶酯、异鲁米诺等)、电化学发光剂;以及能与能直接发出信号的分子、能使底物发光的分子、化学发光剂或电化学发光剂特异性结合(例如抗原抗体结合、链霉亲和素与生物素结合等)的分子,例如生物素为能间接发出信号的分子,其可以通过与连接有链霉亲和素的能使底物发光的酶特异性结合,或能与连接有链霉亲和素的能直接发出信号的分子特异性结合,间接产生信号。在一些实施方式中,“信号分子”包括氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、胶体金、吖啶酯、异鲁米诺等。
术语“化学发光分析”指利用化学发光进行化学分析的方法,化学反应能产生某种处于电子激发态的产物,当这种产物分子发生辐射跃迁或将能量转移给其他会发光的分子使该分子再发生辐射跃迁时,便产生发光现象。化学发光分析的方法和设备是本领域技术人员所熟知的。
术语“免疫层析分析”指以固定有检测线和质控线的条状纤维层析材料为固定相,测试液为流动相,荧光标记抗体或抗原固定于连接垫,通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等),通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法,即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合,当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。免疫层析分析的方法和设备是本领域技术人员所熟知的。
术语“免疫比浊分析”是抗原抗体结合动态测定方法。其基本原理是:当抗原与抗体在特殊稀释***中反应而且比例合适(一般规定抗体过量)时,形成的可溶性免疫复合物在稀释***中的促聚剂(聚乙二醇等)的作用下,自液相析出,形成微粒,使反应液出现浊度。当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加。通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出检样中抗原的含量。免疫比浊分析的方法和设备是本领域技术人员所熟知的。
术语“酶联免疫吸附测定法”(又称ELISA)是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上,利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。酶联免疫吸附测定法的方法和设备是本领域技术人员所熟知的。
术语“免疫印迹分析”是指根据抗原抗体的特异性结合检测某种蛋白的方法,是将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹分析的方法和设备是本领域技术人员所熟知的。
术语“固相载体”指适合于或可被改性以适合于附接蛋白质的任何材料,其涵盖的具体物质是本领域技术人员所知晓的,例如:玻璃和改性的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM等)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性的硅)、碳、金属、无机玻璃、塑料、光学纤维束、和很多其他聚合物。将蛋白质固定在固相载体上的方法是本领域技术人员熟知的。
“约”、“大约”在本文中的意思为所述数值的±20%、±18%、±15%、±12%、±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%、±1%或±0.5%的范围,所述范围包扩所述范围的端点及所述范围内的任一数值。
除非另有说明,下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解,下文描述的方法和材料,仅是示例性的,而不应视为限定本发明的范围。
实施例1:总抗体检测抗体组分1分析IgG1(λ轻链)抗体和IgG1(κ轻链)抗体
1)用PBS缓冲液分别将重组人IgG1(κ轻链抗体)和重组人IgG1(λ轻链抗体)稀释成5μg/ml。
2)向不同ELISA板(Costar:42592)孔中加入重组人IgG1(κ轻链抗体)和重组人IgG1(λ轻链抗体),37℃反应1.5小时。
3)用PBS-T缓冲液(包含0.05%吐温)洗板一次,弃去上清,每孔加入200μl的封闭液(PBS-T缓冲液100ml和牛血清白蛋白1g),37℃反应1小时,弃去封闭液。
4)向首孔加入100μl的1μg/ml的HRP标记的总抗体检测抗体组分1(抗人轻链Kappa抗体2F1C1,南京金斯瑞,V06801),用样本稀释液(1%BSA;2%蔗糖;用1*PBST溶解)3倍梯度稀释样品形成7个测试浓度梯度,第8个孔为样本稀释液作为空白对照,37℃反应30min,弃去反应液。
5)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
6)向每孔中加入100μl的TMB显色液(金斯瑞),在室温下避光反应15min。
7)向每孔中加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应,使用酶标仪在450nm下读板。总抗体检测抗体组分1检测结果如图1,结果表明总抗体检测抗体组分1能够识别重组人IgG1(κ轻链抗体),与重组人IgG1(λ轻链抗体)不反应。
实施例2:总抗体检测抗体组分2分析IgG1(λ轻链抗体)和IgG1(κ轻链抗体)
1)用PBS缓冲液将分别将重组人IgG1(κ轻链抗体)和重组人IgG1(λ轻链抗体)稀释成5μg/ml。
2)向不同ELISA板(Costar:42592)孔中加入重组人IgG1(κ轻链抗体)和重组人IgG1(λ轻链抗体),37℃反应1.5小时。
3)用PBS-T(包含0.05%吐温)洗板一次,弃去上清,向每孔中加入200μl的封闭液(PBST 100ml和牛血清白蛋白1g),37℃反应1小时,弃去封闭液。
4)弃去封闭液,分别向首孔加入100μl的10μg/ml的HRP标记的总抗体检测抗体组分2(抗人轻链lambda抗体2D54,南京金斯瑞,V06901),用样本稀释液(1%BSA;2%蔗糖;PBST溶解)3倍梯度稀释样品形成7个测试浓度梯度,第8个孔为样本稀释液作为空白对照,37℃反应30min,弃去反应液。
5)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
6)每孔加入100μl的TMB显色液(Surmodics,TMBC-1000-01),室温下避光反应15min。
7)向每孔中加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应,使用酶标仪在450nm下读板。总抗体检测抗体组分2检测结果如图2,结果表明总抗体检测抗体组分2能够识别重组人IgG1(λ轻链抗体),与重组人IgG1(κ轻链抗体)不反应。
实施例3:总抗体检测抗体分析人血清IgG抗体亚型
1)用CBS包被缓冲液(Na2CO3:1.59g;NaHCO3:2.93g;1L ddH2O)将小鼠抗人IgG抗体(南京金斯瑞,A01006)稀释成5μg/ml的工作液。
2)向ELISA板(Costar,42592)的板孔中加入100μl小鼠抗人IgG工作液,37℃反应1.5小时。
3)用PBS-T(包含0.05%吐温)洗板一次,弃去上清,向每孔中加入200μl的封闭液(PBST 100ml和牛血清白蛋白1g),37℃反应1小时,弃去封闭液。
4)用样本稀释液(1%BSA;2%蔗糖;PBST溶解)按1:100稀释健康人血清,向首孔加入稀释后的血清,再用样本稀释液对首孔样本进行3倍梯度稀释,形成7个测试浓度梯度,第8个孔为样本稀释液作为空白对照,37℃反应30min,弃去反应液。
5)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
6)向每孔中加入100μl的HRP标记的总抗体检测抗体组分1、HRP标记的总
抗体检测抗体组分2、HRP标记的总抗体检测抗体(由组分1和组分2按质量比1:1混
合)和HRP标记的小鼠抗人IgG(阳性对照)和抗体稀释液(阴性对照),37℃反应15min,弃去反应液。
7)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
8)每孔加入100μl的TMB显色液(SURMODICS,TMBC-1000-01),室温下避光
反应15min。
9)每孔加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应,酶标仪450nm读板。检测结果如图3,结果表明总抗体检测抗体、总抗体检测抗体组分1、总抗体检测抗体组分2和阳性对照均能检测到人血清IgG抗体。
实施例4:总抗体检测抗体分析人血清IgM抗体亚型
1)用CBS包被缓冲液(Na2CO3:1.59g;NaHCO3:2.93g;1L ddH2O)将小鼠抗人IgM抗体(洛阳百奥通,C010204)稀释成5μg/ml。
2)向ELISA板(Costar:42592)板孔中加入100μl的小鼠抗人IgM工作液,37℃反应1.5小时。
3)用PBS-T(0.05%吐温)洗板一次,弃去上清。每孔加入200μl的封闭液(PBST100ml;牛血清白蛋白1g)。37℃反应1小时,弃去封闭液。
4)用样本稀释液(1%BSA;2%蔗糖;PBST溶解)按1:100稀释健康人血清,向首孔加入稀释后的血清,再用样本稀释液对首孔样本进行3倍梯度稀释,形成7个测试浓度梯度,第8个孔为样本稀释液作为空白对照,37℃反应30min,弃去反应液。
5)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
6)每孔中加入100μl的HRP标记的总抗体检测抗体组分1、HRP标记的总抗体检测抗体组分2、HRP标记的总抗体检测抗体(由组分1和组分2按1:1混合)和HRP标记的小鼠抗人IgM(阳性对照)和抗体稀释液(阴性对照),37℃反应15min,弃上清。
7)每孔260μl加PBST洗液,洗板四次,弃上清。
8)每孔加入100μl的TMB显色液(SURMODICS,货号:TMBC-1000-01),室温下避光反应15min。
9)每孔加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应,酶标仪450nm读板。检测结果如图4,结果表明总抗体检测抗体、总抗体检测抗体组分1、总抗体检测抗体组分2和阳性对照均能检测到人血清IgM抗体。
实施例5:总抗体检测抗体分析人血清IgA抗体亚型
1)用CBS包被缓冲液(Na2CO3:1.59g;NaHCO3:2.93g;1L ddH2O)将小鼠抗人IgA抗体(洛阳百奥通,C010208)稀释成5μg/ml工作液。
2)向ELISA板(Costar:42592)板孔中加入100μl的小鼠抗人IgA工作液,37℃反应1.5小时。
3)用PBS-T(包含0.05%吐温)洗板一次,弃去上清,每孔中加入200μl的封闭液(PBST 100ml和牛血清白蛋白1g),37℃反应1小时,弃去封闭液。
4)用样本稀释液(1%BSA;2%蔗糖;PBST溶解)按1:100稀释健康人血清,向首孔加入稀释后的血清,再用样本稀释液对首孔样本进行3倍梯度稀释,形成7个测试浓度梯度,第8个孔为样本稀释液作为空白对照,37℃反应30min,弃去反应液。
5)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
6)每孔中加入100μl的HRP标记的总抗体检测抗体组分1、HRP标记的总抗体检测抗体组分2、HRP标记的总抗体检测抗体(由组分1和组分2按1:1混合)和Biotin标记的小鼠抗人IgA(阳性对照)和抗体稀释液(阴性对照),37℃反应15min。
7)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
8)向加入了Biotin标记的小鼠抗人IgA(阳性对照)的孔中加入100μl的链霉亲和素-HRP(Streptavidin-HRP,南京金斯瑞,货号:M00091),37℃反应15min,弃上清。
9)每孔260μl加PBST洗液,洗板四次,弃上清。
10)每孔中加入100μl的TMB显色液(SURMODICS,货号:TMBC-1000-01),室温下避光反应15min。
11)向每孔中加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应,酶标仪450nm读板。检测结果如图5,结果表明总抗体检测抗体、总抗体检测抗体组分1、总抗体检测抗体组分2和阳性对照均能检测到人血清IgA抗体。
实施例6:总抗体检测抗体分析人血清IgE抗体亚型
1)用CBS包被缓冲液(Na2CO3:1.59g;NaHCO3:2.93g;1L ddH2O)将小鼠抗人IgE抗体(南京金斯瑞,V05302)稀释成5μg/ml工作液。
2)向ELISA板(Costar:42592)板孔中加入100μl的小鼠抗人IgE工作液,37℃反应1.5小时。
3)用PBS-T(包含0.05%吐温)洗板一次,弃去上清,每孔中加入200μl的封闭液(PBST100ml和牛血清白蛋白1g),37℃反应1小时,弃去封闭液。
4)用样本稀释液(1%BSA;2%蔗糖;PBST溶解)按1:100稀释含IgE的人血清,向首孔加入稀释后的血清,再用样本稀释液对首孔样本进行3倍梯度稀释,形成7个测试浓度梯度,第8个孔为样本稀释液作为空白对照,37℃反应30min,弃去反应液。
5)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
6)向每孔中加入100μl的HRP标记的总抗体检测抗体组分1、HRP标记的总抗体检测抗体组分2、HRP标记的总抗体检测抗体(由组分1和组分2按1:1混合)和Biotin标记的小鼠抗人IgE抗体(阳性对照)和抗体稀释液(阴性对照),37℃反应15min。
7)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
8)向加入了Biotin标记的小鼠抗人IgE(阳性对照)的孔中加入100μl的链霉亲和素-HRP(南京金斯瑞,M00091),37℃反应15min,弃上清。
9)每孔260μl加PBST洗液,洗板四次,弃上清。
10)向每孔中加入100μl的TMB显色液(SURMODICS,TMBC-1000-01),在室温下避光反应15min。
11)每孔中加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应,酶标仪450nm读板。检测结果如图6,结果表明总抗体检测抗体、总抗体检测抗体组分1、总抗体检测抗体组分2和阳性对照均能检测到人血清IgE抗体。
实施例7:总抗体检测抗体在开发SARS-CoV-2总抗体检测试剂盒中的应用
1)用CBS包被缓冲液(Na2CO3:1.59g;NaHCO3:2.93g;ddH2O1L)将SARS-CoV-2N-RBD融合蛋白(南京金斯瑞,Z03498)稀释成1μg/ml。
2)向ELISA板(Costar:42592)板孔中加入100μl的SARS-CoV-2N-RBD融合蛋白工作液,37℃反应1.5小时。
3)用PBS-T(0.05%吐温)洗板一次,弃去上清。每孔中加入200μl的封闭液(PBST100ml;牛血清白蛋白1g)。37℃反应1小时,弃去封闭液。
4)分别向首孔加入100μl的1μg/ml的重组人抗SARS-CoV-2IgG抗体、重组人抗SARS-CoV-2IgM抗体、重组人抗SARS-CoV-2IgA抗体,抗体用样本稀释液(1%BSA;2%蔗糖;PBST溶解)3倍梯度稀释样品形成7个测试浓度梯度,第8个孔为样本稀释液作为空白对照。
5)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
6)向每孔中加入100μl的HRP标记的总抗体检测抗体(由组分1和组分2按1:1混合),37℃反应15min,弃上清。
7)每孔加260μl的PBST洗液,洗板四次,弃上清。
8)向每孔中加入100μl的TMB显色液(SURMODICS,TMBC-1000-01),在
室温下避光反应15min。
9)每孔中加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应,酶标仪450nm读板。检测结果如图7,结果表明SARS-CoV-2总抗体检测试剂盒可以检测重组人抗SARS-CoV-2IgG抗体、重组人抗SARS-CoV-2IgM抗体和重组人抗SARS-CoV-2IgA抗体。
Claims (37)
1.样本中病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体检测方法,包括:用总抗体检测抗体检测样本中的病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE抗体类型,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。
2.根据权利要求1所述的方法,包括:使样本与固定在固相载体上的病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原接触,并用信号分子标记的总抗体检测抗体检测样本中是否存在针对所述抗原的总抗体或者确定针对所述抗原的总抗体的水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法,包括:
1)使样本与固定在固相载体上的病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原接触;
2)使步骤1)中与抗原接触后的样本与信号分子标记的总抗体检测抗体接触;
3)测定信号分子的信号水平,并根据信号水平确定所述样本中是否存在针对所述抗原的总抗体或者确定针对所述抗原的总抗体的水平。
4.根据权利要求3所述的方法,其中:
步骤1)包括使样本与固定在固相载体上的病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原孵育,洗涤;
步骤2)包括将信号分子标记的总抗体检测抗体加入步骤1)处理后的固相载体上,孵育,洗涤。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述样本为血清、血浆或全血。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述样本包含抗病原微生物特异性和/或自身免疫性疾病的特异性抗体IgA、IgG、IgM、IgD和IgE抗体中的任一种抗体或任何抗体的组合。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述样本来源于人或动物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述总抗体检测抗体是小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、人源化单克隆抗体、羊驼单克隆抗体、scFv单链抗体、Fab抗原结合片段、F(ab’)2抗原结合片段、重组抗体和/或基因工程改造的嵌合抗体。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述总抗体检测抗体由一种抗κ轻链抗体和一种抗λ轻链抗体组成,或者由多种抗κ轻链抗体和多种抗λ轻链抗体组成。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其中所述总抗体检测抗体为抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体形成的抗体混合物。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体混合质量比范围是0.1-10,优选为1:1。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述抗原为病毒抗原。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述病毒抗原为SARS-CoV-2病毒抗原,所述方法用于确定人血清、血浆或全血中是否存在针对SARS-CoV-2病毒抗原的总抗体或者确定针对所述抗原的总抗体水平,针对SARS-CoV-2病毒抗原的总抗体包括SARS-CoV-2IgG、SARS-CoV-2IgM和SARS-CoV-2IgA中的两种或三种。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述SARS-CoV-2病毒抗原为SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白和SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白的融合蛋白,优选为SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白和SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白RBD结构域的融合蛋白。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法,其中用总抗体检测抗体通过化学发光分析、免疫层析分析、免疫比浊分析、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹分析检测样本中的病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体。
16.总抗体检测抗体在制备用于检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体的试剂中的用途,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。
17.总抗体检测抗体和病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原的组合在制备用于检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体的试剂中的用途,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。
18.总抗体检测抗体和病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原在制备用于检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体的试剂盒中的用途,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的用途,其中所述病原微生物特异性总抗体为针对SARS-CoV-2病毒抗原的总抗体。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的用途,其中所述病原微生物抗原为病毒抗原。
21.根据权利要求20所述的用途,其中所述病毒抗原为SARS-CoV-2病毒抗原。
22.根据权利要求21所述的用途,其中所述SARS-CoV-2病毒抗原为SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白和SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白的融合蛋白,优选为SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白和SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白RBD结构域的融合蛋白。
23.根据权利要求16-22中任一项所述的用途,其中所述总抗体检测抗体是小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、人源化单克隆抗体、羊驼单克隆抗体、scFv单链抗体、Fab抗原结合片段、F(ab’)2抗原结合片段、重组抗体和/或基因工程改造的嵌合抗体。
24.根据权利要求16-23中任一项所述的用途,其中所述总抗体检测抗体由一种抗κ轻链抗体和一种抗λ轻链抗体组成,或者由多种抗κ轻链抗体和多种抗λ轻链抗体组成。
25.根据权利要求16-24中任一项所述的用途,其中所述总抗体检测抗体为抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体形成的抗体混合物。
26.根据权利要求25所述的用途,其中所述抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体混合比范围是0.1-10,优选的为1:1。
27.根据权利要求16-26中任一项所述的用途,所述试剂用于通过化学发光分析、免疫层析分析、免疫比浊分析、ELISA法、免疫印迹分析检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体。
28.检测病原微生物和/或自身免疫性疾病的特异性总抗体的试剂盒,所述试剂盒包括总抗体检测抗体和病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原,其中,所述总抗体包括IgA、IgG、IgM、IgD和/或IgE,所述总抗体检测抗体为同时识别抗体κ轻链和λ轻链的检测抗体。
29.根据权利要求28所述的试剂盒,其中所述总抗体检测抗体包括信号分子标记。
30.根据权利要求28或29所述的试剂盒,进一步包括固相载体,所述病原微生物和/或自身免疫性疾病抗原能够固定在所述固相载体上。
31.根据权利要求28-30中任一项所述的试剂盒,其中所述总抗体检测抗体由一种抗κ轻链抗体和一种抗λ轻链抗体组成,或者由多种抗κ轻链抗体和多种抗λ轻链抗体组成。
32.根据权利要求28-31中任一项所述的试剂盒,其中所述总抗体检测抗体为抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体形成的抗体混合物。
33.根据权利要求32所述的试剂盒,其中所述抗人κ轻链小鼠单克隆抗体和抗人λ轻链小鼠单克隆抗体混合质量比范围是0.1-10,优选的为1:1。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的试剂盒,其中所述病毒微生物抗原为SARS-CoV-2病毒抗原。
35.根据权利要求34所述的试剂盒,其中所述SARS-CoV-2病毒抗原为SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白和SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白的融合蛋白,优选的为SARS-CoV-2病毒的核衣壳蛋白和SARS-CoV-2病毒的刺突糖蛋白RBD结构域的融合蛋白。
36.根据权利要求34或35所述的试剂盒,其中所述总抗体为SARS-CoV-2病毒抗原的总抗体,包括SARS-CoV-2IgG、SARS-CoV-2IgM和SARS-CoV-2IgA中的两种或三种。
37.根据权利要求28-36中任一项所述的试剂盒,包括化学发光检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、免疫比浊检测试剂盒或ELISA检测试剂盒,优选的为ELISA检测试剂盒。
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PB01 | Publication | ||
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