CN114317723B - 用于评估实体器官移植状况的snp标志物、引物、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种评估实体器官移植状况的SNP标志物、引物、试剂盒及其使用方法，所述SNP标志物由供者和受者均是纯合子，但基因型不同的SNP位点组成；通过对移植后受体总游离DNA的特定SNP位点进行检测，直接获得受体游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA百分比，根据GcfDNA百分比快速而准确地判断移植排斥的程度，使得该试剂盒能够灵敏、特异、准确、评估实体器官移植情况，无需进行创伤检测，适用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及用于评估实体器官移植状况的SNP标志物、引物、试剂盒及其使用方法。
背景技术
目前器官移植术后移植物的健康监测常采用抽血进行功能检查，或穿刺针采集组织进行病理学检查。
对于常规抽血功能检查，其各项指标如肌酐、ALT、AST、胆红素等等灵敏度和特异性均不高，无法准确的反应移植物的健康状况。
对于目前金标准的组织活检，其虽可直接的反应移植物的健康状况。但存在以下重大缺点：
1)侵入式检测，对病人造成较大痛苦，同时对移植物造成损伤；
2)检出异常时，移植物实质性损伤已经发生，并且损伤往往已经较为严重，这时对于临床医生来说拯救移植物往往已经太晚；
3)若穿刺针未采集到移植物的病灶组织部分，会对结果准确性造成较大影响，因此准确性和灵敏度不高。
发明内容
有鉴于此，本申请提供用于评估实体器官移植状况的SNP标志物、引物、试剂盒及其使用方法，通过对移植后受体总游离DNA的24个特定SNP位点进行检测，直接获得供者游离DNA浓度与供者和受者游离DNA总浓度的比值，即GcfDNA百分比，根据GcfDNA百分比快速而准确地判断移植排斥的程度，使得该试剂盒能够灵敏、特异、准确、评估实体器官移植情况，无需进行创伤检测，适用范围广。
为解决以上技术问题，本申请提供的技术方案是一种评估实体器官移植状况的SNP标记物，所述SNP标记物选自SNP位点rs2074000、rs179785、rs1254968、rs3736669、rs470117、rs3736729、rs2326719、rs3736861、rs2147105、rs3736908、rs1887763、rs3737035、rs1984748、rs856946、rs1559803、rs2114912、rs857932、rs284649、rs947101、rs615942、rs2788888、rs2004380、rs2197076、rs503821中的一种或多种。
优选地，所述SNP标记物由SNP位点rs2074000、rs179785、rs1254968、rs3736669、rs470117、rs3736729、rs2326719、rs3736861、rs2147105、rs3736908、rs1887763、rs3737035、rs1984748、rs856946、rs1559803、rs2114912、rs857932、rs284649、rs947101、rs615942、rs2788888、rs2004380、rs2197076、rs503821组成。
优选地，所述实体器官移植状况为评估实体器官移植损伤和/或排斥风险。
优选地，所述实体器官选自肝、肾、心脏、肺、胰腺中的一种或多种。
本发明还提供了一种评估实体器官移植状况的有效SNP位点的筛选方法，所述方法包括：
(1)收集实体器官移植供者和受者的基因组DNA；
(2)使用SNP筛选用孔板，供者样品孔加入qPCR反应液、供者DNA、水配置好的mix，受者样品孔加入qPCR反应液、受者DNA、水配置好的mix，阳性对照孔加入qPCR反应液、阳性对照DNA、水配置好的mix，阴性对照孔加入qPCR反应液、水配置好的mix；
(3)获取SNP标记物单个SNP位点基因分型结果；
(4)选择供者和受者均是纯合子的，但基因型不同的SNP位点作为评估实体器官移植状况的有效SNP位点。
优选地，所述有效SNP位点由供者和受者均是纯合子，但基因型不同的SNP位点组成。
优选地，所述有效SNP位点由SNP位点rs179785、rs470117、rs2147105、rs1984748、rs856946、rs2004380组成。
本发明还提供了上述SNP位点在制备评估实体器官移植状况的产品中的应用。
优选的，所述产品通过检测待测样品中的供者和受者游离DNA中供体游离DNA含量来评估实体器官移植状况。
优选的，所述产品通过检测供者和受者游离DNA中供体游离DNA含量来评估实体器官移植术后移植物损伤、排斥风险。
优选的，所述实体器官选自肾、肝、心脏、肺中的一种或多种；
评估肾移植损伤或排斥风险参考值为1％；GcfDNA百分比>1％为高风险，肾移植损伤或排斥风险高；肾移植损伤GcfDNA百分比<1％为低风险，肾移植损伤或排斥风险低；
评估肝移植损伤或排斥风险参考值为10％；GcfDNA百分比>10％为高风险，存在肝移植损伤或排斥风险高；肝移植损伤GcfDNA百分比<10％为低风险，肝移植损伤或排斥风险低；
评估心脏移植损伤或排斥风险参考值为0.5％；GcfDNA百分比>0.5％为高风险，存在心脏移植损伤或排斥风险高；心脏移植损伤GcfDNA百分比<0.5％为低风险，心脏移植损伤或排斥风险低；
评估肺移植损伤或排斥风险参考值为8％；GcfDNA百分比>8％为高风险，存在肺移植损伤或排斥风险高；肾移植损伤GcfDNA百分比<8％为低风险，肺移植损伤或排斥风险低。
本发明将上述24个SNP位点作为检测靶点，计算得到的供者和受者游离DNA中供体游离DNA的含量(GcfDNA百分比)能够准确反映出实体器官移植损伤或排斥风险的程度，为临床检测器官移植术后移植物损伤或排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
本发明还提供了一种用于评估实体器官移植状况的引物和探针，
所述引物选自用于检测SNP位点的引物中的一种或多种，所述用于检测SNP位点的引物为：
用于检测rs2074000的引物，其序列为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
用于检测rs179785的引物，其序列为SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
用于检测rs1254968的引物，其序列为SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
用于检测rs3736669的引物，其序列为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
用于检测rs470117的引物，其序列为SEQ ID No：9和SEQ ID No：10；
用于检测rs3736729的引物，其序列为SEQ ID No：11和SEQ ID No：12；
用于检测rs2326719的引物，其序列为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14；
用于检测rs3736861的引物，其序列为SEQ ID No：15和SEQ ID No：16；
用于检测rs2147105的引物，其序列为SEQ ID No：17和SEQ ID No：18；
用于检测rs3736908的引物，其序列为SEQ ID No：19和SEQ ID No：20；
用于检测rs1887763的引物，其序列为SEQ ID No：21和SEQ ID No：22；
用于检测rs3737035的引物，其序列为SEQ ID No：23和SEQ ID No：24；
用于检测rs1984748的引物，其序列为SEQ ID No：25和SEQ ID No：26；
用于检测rs856946的引物，其序列为SEQ ID No：27和SEQ ID No：28；
用于检测rs1559803的引物，其序列为SEQ ID No：29和SEQ ID No：30；
用于检测rs2114912的引物，其序列为SEQ ID No：31和SEQ ID No：32；
用于检测rs857932的引物，其序列为SEQ ID No：33和SEQ ID No：34；
用于检测rs284649的引物，其序列为SEQ ID No：35和SEQ ID No：36；
用于检测rs947101的引物，其序列为SEQ ID No：37和SEQ ID No：38；
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用于检测rs2197076的引物，其序列为SEQ ID No：45和SEQ ID No：46；
用于检测rs503821的引物，其序列为SEQ ID No：47和SEQ ID No：48；
所述探针选自用于检测SNP位点的探针中的一种或多种，所述用于检测SNP位点的探针为：
用于检测rs2074000的探针，其序列为SEQ ID No：49和SEQ ID No：50；
用于检测rs179785的探针，其序列为SEQ ID No：51和SEQ ID No：52；
用于检测rs1254968的探针，其序列为SEQ ID No：53和SEQ ID No：54；
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用于检测rs2197076的探针，其序列为SEQ ID No：93和SEQ ID No：94；
用于检测rs503821的探针，其序列为SEQ ID No：95和SEQ ID No：96。
优选地，所述引物为用于检测SNP位点的引物。
优选地，所述探针为用于检测SNP位点的探针。
本发明还提供了所述引物和探针在制备评估实体器官移植状况的产品中的应用。
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：评估实体器官移植状况的引物和探针；所述引物和探针检测用于评估实体器官移植状况的SNP标志物，所述SNP标记物选自SNP位点rs2074000、rs179785、rs1254968、rs3736669、rs470117、
rs3736729、rs2326719、rs3736861、rs2147105、rs3736908、rs1887763、rs3737035、
rs1984748、rs856946、rs1559803、rs2114912、rs857932、rs284649、rs947101、
rs615942、rs2788888、rs2004380、rs2197076、rs503821中的一种或多种。
优选的，所述试剂盒为基于数字PCR平台的试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括上述序列如SEQ ID No.1～64所示的引物和序列如SEQID No.65～128所示的探针
优选的，所述探针分别用FAM和VIC标记。
优选的，用于检测1个SNP位点的一条探针5′端FAM作为荧光报告基团，另一条探针5′端选择VIC作为标记。
优选的，所述试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
优选的，所述试剂盒还包括：ddPCRTM ProbeSupermix和超纯水。
本发明还提供了上述的试剂盒非疾病治疗或诊断目的的使用方法，其特征在于，包括：
以待测样品的总游离DNA为模板，加入所述引物和探针，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
反应结束后，基于供者和受者SNP位点数据，计算供者游离DNA浓度与供者和受者游离DNA总浓度的比值，即GcfDNA百分比。
优选地，所述使用方法还包括：筛选评估实体器官移植状况的有效SNP位点。
优选地，所述使用方法还包括：基于评估实体器官移植状况的SNP标志物设计引物和探针
优选地，所述使用方法具体包括：
步骤1：
(1)收集实体器官移植供者和受者的基因组DNA；
(2)使用SNP筛选用孔板，供者样品孔加入qPCR反应液、供者DNA、水配置好的mix，受者样品孔加入qPCR反应液、受者DNA、水配置好的mix，阳性对照孔加入qPCR反应液、阳性对照DNA、水配置好的mix，阴性对照孔加入qPCR反应液、水配置好的mix；
(3)选择供者和受者均是纯合子，但基因型不同的SNP位点作为评估实体器官移植状况的SNP标志物；
(4)基于所述SNP标志物设计引物和探针；
步骤2：以待测样品的总游离DNA为模板，加入所述引物和探针，制备数字PCR反应微滴，进行数字PCR反应；
步骤3：获取SNP标记物单个SNP位点基因分型结果；
步骤4：选择供者和受者均是纯合子的，但基因型不同的SNP位点作为评估实体器官移植状况的有效SNP位点。
步骤5：基于供者和受者有效SNP位点数据，计算供者游离DNA/供者和受者游离DNA的比值，即GcfDNA百分比。
优选的，所述SNP筛选用孔板为SNP筛选用96孔板。
优选的，所述待测样品为口腔上皮细胞。
优选的，所述数字PCR反应的反应程序为：95℃、10min预变性；95℃、15s，57℃、1min，40个循环；95℃保持10min；10℃保存。
优选地，上述实体器官移植状况为实体器官移植术后移植物排斥风险。
本发明提供了SNP位点及其在评估实体器官移植状况中的应用。
现有技术肝、肾移植术后GcfDNA检测缺点在于需要根据检测结果数据用算法判定供者、受者来源DNA，移植供者来源DNA含量极低时，例如<0.2copy/ul时，仅仅通过该算法较难判定移植受者和移植供者在该位点上是纯合子还是杂合子状态，因此本发明直接以供者和受者均是纯合子，但基因型不同的SNP位点作为SNP标志物，基于此提供引物、探针、试剂盒，检测结果可作为直接证据评判实体器官移植状况。
本发明采用SNP筛选用孔板，通过分别检测供者、受者DNA来筛选出可区分供受者的纯合子分型，然后再进行GcfDNA百分比检测，该方法结果更可靠。
通过对移植后受体总游离DNA的24个特定SNP位点进行检测，结合数字PCR技术以及特定的计算方法，最终获得供者和受者游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA百分比，根据GcfDNA百分比判断实体器官移植状况，为临床检测器官移植术后状况提供了一种简单而有效的辅助手段。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：
本发明提供了SNP位点在评估实体器官移植术后移植物损伤或排斥风险中的应用，通过对移植后受体总游离DNA的24个特定SNP位点进行检测，直接获得供者和受者游离DNA中供体游离DNA的含量，即GcfDNA百分比，根据GcfDNA百分比判断实体器官移植术后移植物损伤或排斥风险，为临床检测器官移植术后移植物损伤和排斥风险提供了一种简单而有效的辅助手段。
(1)结果可靠，采用本发明标志物引物、探针、试剂盒，不再根据检测结果数据用算法判定供者、受者来源DNA，检测结果可作为直接证据评判实体器官移植状况，结果可靠；
(2)适用范围广，适用于多种实体器官移植状况评判，包括肝、肾、心、肺、胰腺移植；
(3)方便，相比该领域其它技术或检测，例如测序、DSA检测等需要移植受者和移植供者双方的样本相比，该方法无需移植供者样本，仅需受者血液或尿液样本即可完成；本发明采用的是数字PCR进行检测，样本需求量低。
(4)灵敏，采用本发明引物、探针、试剂盒，检测灵敏度高；且选择现有PCR技术中精准度最高的数字PCR设备作为检测平台；
(5)早期，选用核酸分子作为检测靶点，这些靶点的变化发生在器官病变或损伤的最早期；
(6)特异，用本发明引物、探针、试剂盒，检测特异性高，可特异性的反映出肺移植物的健康状况。
附图说明
图1为本发明SNP筛选用96孔板；
图2为效果例1ROC曲线图；
图3为效果例2ROC曲线图；
图4为效果例3ROC曲线图；
图5为效果例4ROC曲线图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
一种用于评估实体器官移植情况的试剂盒，包括表1中序列如SEQ ID No.1～48所示的引物和序列如SEQ ID No.49～96所示的探针，ddPCRTM ProbeSupermix和超纯水；
表1
实施例1
采用本发明提供的试剂盒评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险
以肾移植检测为例：
1、分别采集肾移植受者和供者口腔上皮细胞，提取DNA，调整浓度为10～40ng/ul
2、分别配置SNP筛选反应体系，进行PCR反应；反应配制如下：
表2
3、将配置好的反应体系按要求加入到SNP筛选用96孔板中，见图1，(96孔板包括：从左向右依次设置的供者样品孔、受者样品孔、阴性对照孔、阳性对照孔；供者样品孔、受者样品孔、阴性对照孔、阳性对照孔均为3列8行)
4、然后用铝制封膜配合封膜机器热封好后进行PCR反应，反应程序设置如下：
表3
5、根据分型结果进行靶点筛选，
SNP位点，检测SNP位点的引物和探针见表1；
筛选结果见表4：
表4
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6、根据上述结果，符合供者和受者均是纯合子，但基因型不同的位点有7个，因此出2、5、9、13、14、18、22号SNP位点均可用于下一步的GcfDNA百分比检测。
7、检测受者血浆中GcfDNA百分比：首先使用EDTA采血管收集移植受者静脉血10ml，分离出大于4ml的血浆。
8、取4ml血浆，使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit进行总游离DNA的提取，提取完后测定浓度，调整浓度为10～40ng/ul。
9、配置数字PCR反应体系，共计7管(2、5、9、13、14、18、22)，如下：
表5
引物和探针序列如表1所示。
1、将配置好的反应体系加入到DropDx-2044数字PCR***通用芯片的样品槽中，同时在发生油槽中加入芯片填充液，最后用芯片密封盖封好，置于DropDx-2044数字PCR仪***的PCR扩增仪中，进行反应微滴的制备和PCR反应，反应条件如下：
表6
11、将反应完后的数字PCR***通用芯片，DropDx-2044数字PCR仪***的生物芯片阅读仪中，进行结果的读取。
12、结果计算：两种碱基的拷贝数浓度分别代表供者和受者游离DNA浓度，GcfDNA百分比计算为然后计算平均值，作为GcfDNA百分比的计算结果。如下：
表7
13、计算GcfDNA百分比的平均值为2.7％，高于1％参考值，因此评估为移植排斥或损伤高风险。后受检者经活检穿刺病理检测，诊断为抗体介导的免疫排斥反应(ABMR)，和本实施例结果想吻合。
实施例2
效果数据：
纳入742例肾移植术后受者，按照实施例1方式收集他们的血浆，提取血浆中总游离DNA，进行数字PCR反应，反应结束后，分析每个SNP位点，得到GcfDNA百分比，设定1％为参考值区分移植损伤或排斥和正常(移植损伤或排斥(GcfDNA百分比＞1％)和移植物正常组(GcfDNA百分比＜1％))。
使用MedCalc软件进行分析，得到检测对照的ROC曲线(图2)，AUC＝0.87，灵敏度＝81.82％，特异度＝79.59％。
本发明试剂盒能够及时、准确并特异地反肾移植物的健康状况，评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险。
实施例3
纳入416例肝移植术后受者，按照实施例1收集他们的血浆，提取血浆中总游离DNA，进行数字PCR反应，反应结束后，分析每个SNP位点，得到GcfDNA百分比，设定10％为参考值区分移植损伤或排斥和正常(移植损伤或排斥(GcfDNA百分比＞10％)和移植物正常组(GcfDNA百分比＜10％))。
效果数据：使用MedCalc软件进行分析，得到检测对照的ROC曲线(图3)，AUC＝0.85，灵敏度＝83.64％，特异度＝71.43％。
本发明试剂盒能够及时、准确并特异地反肝移植物的健康状况，评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险。
实施例4
纳入102例心脏移植术后受者，按照实施例1收集他们的血浆，提取血浆中总游离DNA，进行数字PCR反应，反应结束后，分析每个SNP位点，得到GcfDNA百分比，设定0.5％为参考值区分移植损伤或排斥和正常(移植损伤或排斥(GcfDNA百分比＞0.5％)和移植物正常组(GcfDNA百分比＜0.5％))。
效果数据：使用MedCalc软件进行分析，得到检测对照的ROC曲线(图4)，AUC＝0.78，灵敏度＝74.55％，特异度＝75.51％。
本发明试剂盒能够及时、准确并特异地反心脏移植物的健康状况，评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险。
实施例5
纳入254例肺移植术后受者，按照实施例1收集他们的血浆，提取血浆中总游离DNA，进行数字PCR反应，反应结束后，分析每个SNP位点，得到GcfDNA百分比，设定8％为参考值区分移植损伤或排斥和正常(移植损伤或排斥(GcfDNA百分比＞8％)和移植物正常组(GcfDNA百分比＜8％))。
效果数据：使用MedCalc软件进行分析，得到检测对照的ROC曲线(图5)，AUC＝0.79，灵敏度＝80.7％，特异度＝70.21％。
本发明试剂盒能够及时、准确并特异地反肺移植物的健康状况，评估肝移植术后移植物损伤及排斥风险。
实施例2-5中，对于不同的人根据分型结果进行针对24个SNP位点进行靶点筛选，筛选出的可用位点不一定一样。这是根据不同人的供受者基因组的差异而定的,第一步筛选的目的就是找出有差异的SNP位点,第二步检测的目的就是利用这些有差异的SNP位点来实现GcfDNA的检测,筛选的目的就是找出有差异的SNP位点,后续检测的目的就是利用这些有差异的SNP位点来实现GcfDNA的检测,得到评估肾、肝、心脏、肺移植损伤或排斥风险参考值。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 成都仕康美生物科技有限公司
<120> 用于评估实体器官移植状况的SNP标志物、引物、试剂盒及其使用方法
<140> 2022100852773
<141> 2022-01-25
<160> 96
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Claims (4)
1.检测SNP位点的引物和探针在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，所述SNP位点为rs2074000、rs179785、rs1254968、rs3736669、rs470117、rs3736729、rs2326719、rs3736861、rs2147105、rs3736908、rs1887763、rs3737035、rs1984748、rs856946、rs1559803、rs2114912、rs857932、rs284649、rs947101、rs615942、rs2788888、rs2004380、rs2197076、rs503821的组合；
所述产品通过检测待测样品中的供者和受者游离DNA中供体游离DNA含量来评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险；所述实体器官选自肾、肝、心脏、肺中的一种或多种；
评估肾移植损伤或排斥风险参考值为1％；GcfDNA百分比>1％为高风险，肾移植损伤或排斥风险高；肾移植损伤GcfDNA百分比<1％为低风险，肾移植损伤或排斥风险低；
评估肝移植损伤或排斥风险参考值为10％；GcfDNA百分比>10％为高风险，存在肝移植损伤或排斥风险高；肝移植损伤GcfDNA百分比<10％为低风险，肝移植损伤或排斥风险低；
评估心脏移植损伤或排斥风险参考值为0.5％；GcfDNA百分比>0.5％为高风险，存在心脏移植损伤或排斥风险高；心脏移植损伤GcfDNA百分比<0.5％为低风险，心脏移植损伤或排斥风险低；
评估肺移植损伤或排斥风险参考值为8％；GcfDNA百分比>8％为高风险，存在肺移植损伤或排斥风险高；肾移植损伤GcfDNA百分比<8％为低风险，肺移植损伤或排斥风险低。
2.一种用于评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的引物和探针的组合，其特征在于，所述引物为序列SEQ ID No:1-48所示引物的组合，所述引物为：
用于检测rs2074000的引物，其序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；
用于检测rs179785的引物，其序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4；用于检测rs1254968的引物，其序列为SEQ ID No:5和SEQ ID No:6；用于检测rs3736669的引物，其序列为SEQID No:7和SEQ ID No:8；用于检测rs470117的引物，其序列为SEQ ID No:9和SEQ ID No:10；用于检测rs3736729的引物，其序列为SEQ ID No:11和SEQ ID No:12；用于检测rs2326719的引物，其序列为SEQ ID No:13和SEQ ID No:14；用于检测rs3736861的引物，其序列为SEQ ID No:15和SEQ ID No:16；用于检测rs2147105的引物，其序列为SEQ ID No:17和SEQ ID No:18；用于检测rs3736908的引物，其序列为SEQ ID No:19和SEQ ID No:20；用于检测rs1887763的引物，其序列为SEQ ID No:21和SEQ ID No:22；用于检测rs3737035的引物，其序列为SEQ ID No:23和SEQ ID No:24；用于检测rs1984748的引物，其序列为SEQID No:25和SEQ ID No:26；用于检测rs856946的引物，其序列为SEQ ID No:27和SEQ IDNo:28；用于检测rs1559803的引物，其序列为SEQ ID No:29和SEQ ID No:30；用于检测rs2114912的引物，其序列为SEQ ID No:31和SEQ ID No:32；用于检测rs857932的引物，其序列为SEQ ID No:33和SEQ ID No:34；用于检测rs284649的引物，其序列为SEQ ID No:35和SEQ ID No:36；用于检测rs947101的引物，其序列为SEQ ID No:37和SEQ ID No:38；用于检测rs615942的引物，其序列为SEQ ID No:39和SEQ ID No:40；用于检测rs2788888的引物，其序列为SEQ ID No:41和SEQ ID No:42；用于检测rs2004380的引物，其序列为SEQ IDNo:43和SEQ ID No:44；用于检测rs2197076的引物，其序列为SEQ ID No:45和SEQ ID No:46；用于检测rs503821的引物，其序列为SEQ ID No:47和SEQ ID No:48；所述探针为序列SEQ ID No:49-96所示探针的组合，所述探针为：
用于检测rs2074000的探针，其序列为SEQ ID No:49和SEQ ID No:50；用于检测rs179785的探针，其序列为SEQ ID No:51和SEQ ID No:52；用于检测rs1254968的探针，其序列为SEQ ID No:53和SEQ ID No:54；
用于检测rs3736669的探针，其序列为SEQ ID No:55和SEQ ID No:56；
用于检测rs470117的探针，其序列为SEQ ID No:57和SEQ ID No:58；
用于检测rs3736729的探针，其序列为SEQ ID No:59和SEQ ID No:60；
用于检测rs2326719的探针，其序列为SEQ ID No:61和SEQ ID No:62；
用于检测rs3736861的探针，其序列为SEQ ID No:63和SEQ ID No:64；
用于检测rs2147105的探针，其序列为SEQ ID No:65和SEQ ID No:66；
用于检测rs3736908的探针，其序列为SEQ ID No:67和SEQ ID No:68；
用于检测rs1887763的探针，其序列为SEQ ID No:69和SEQ ID No:70；
用于检测rs3737035的探针，其序列为SEQ ID No:71和SEQ ID No:72；
用于检测rs1984748的探针，其序列为SEQ ID No:73和SEQ ID No:74；
用于检测rs856946的探针，其序列为SEQ ID No:75和SEQ ID No:76；
用于检测rs1559803的探针，其序列为SEQ ID No:77和SEQ ID No:78；
用于检测rs2114912的探针，其序列为SEQ ID No:79和SEQ ID No:80；
用于检测rs857932的探针，其序列为SEQ ID No:81和SEQ ID No:82；
用于检测rs284649的探针，其序列为SEQ ID No:83和SEQ ID No:84；
用于检测rs947101的探针，其序列为SEQ ID No:85和SEQ ID No:86；
用于检测rs615942的探针，其序列为SEQ ID No:87和SEQ ID No:88；
用于检测rs2788888的探针，其序列为SEQ ID No:89和SEQ ID No:90；
用于检测rs2004380的探针，其序列为SEQ ID No:91和SEQ ID No:92；
用于检测rs2197076的探针，其序列为SEQ ID No:93和SEQ ID No:94；
用于检测rs503821的探针，其序列为SEQ ID No:95和SEQ ID No:96。
3.权利要求2所述引物和探针的组合在制备评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的产品中的应用，所述产品通过检测待测样品中的供者和受者游离DNA中供体游离DNA含量来评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险；所述实体器官选自肾、肝、心脏、肺中的一种或多种；
评估肾移植损伤或排斥风险参考值为1％；GcfDNA百分比>1％为高风险，肾移植损伤或排斥风险高；肾移植损伤GcfDNA百分比<1％为低风险，肾移植损伤或排斥风险低；
评估肝移植损伤或排斥风险参考值为10％；GcfDNA百分比>10％为高风险，存在肝移植损伤或排斥风险高；肝移植损伤GcfDNA百分比<10％为低风险，肝移植损伤或排斥风险低；
评估心脏移植损伤或排斥风险参考值为0.5％；GcfDNA百分比>0.5％为高风险，存在心脏移植损伤或排斥风险高；心脏移植损伤GcfDNA百分比<0.5％为低风险，心脏移植损伤或排斥风险低；
评估肺移植损伤或排斥风险参考值为8％；GcfDNA百分比>8％为高风险，存在肺移植损伤或排斥风险高；肾移植损伤GcfDNA百分比<8％为低风险，肺移植损伤或排斥风险低。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括评估实体器官移植术后移植物损伤及排斥风险的引物和探针的组合，所述引物为权利要求2中所述序列为SEQ ID No:1-48所示引物的组合，所述探针为权利要求2中所述序列为SEQ ID No:49-96所示探针的组合。
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