CN114317684B - 一种基于tna分子的细胞内镁离子成像的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法。属于金属离子成像技术领域，具体步骤：体外筛选镁离子依赖的具有RNA切割活性的TNA分子；对筛选获得的TNA分子序列进行活性测试及截短分析；选择其中活性最高的TNA分子进行生物化学表征；将TNA分子切割体系构建为镁离子荧光传感器；在体外缓冲液中验证该荧光传感器的性能；将该传感器转染至细胞中进行体内镁离子的成像。本发明可以有效地在体外对不同浓度的镁离子进行荧光响应，检测限达到0.35mM，并且可在活细胞内对镁离子进行荧光成像，比利用天然核酸进行检测的方法更稳定，更耐核酸酶的降解，为分子生物学提供了新的工具。
Description
技术领域
本发明属于金属离子成像技术领域，涉及一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，特别是涉及一种体外筛选可切割RNA的TNA分子用于细胞内镁离子成像的方法。
背景技术
镁离子是哺乳动物体内含量最丰富的二价阳离子，具有广泛的生物学作用。镁离子通过与细胞内的蛋白质，核酸或膜结构相互作用来发挥如功能代谢，信号传导及结构组成等重要的生物学作用，因此对细胞内镁离子的成像和检测是非常重要的。由于天然核酸在金属配体领域得到了广泛研究，目前已有研究通过体外筛选的方法获得了可以在金属离子的激活下，特异型切割RNA的DNA酶，由于筛选获得的8-17脱氧核酶在锌离子和铅离子的激活下比镁离子更活跃，因此8-17用于检测环境中的铅离子以及细胞内的锌离子。由于天然核酸在细胞内容易受到核酸酶的降解，因此目前尚未有天然核酶直接用于细胞内镁离子的检测。苏糖核酸(TNA)是一种RNA类似物，它可与DNA或RNA形成稳定的双螺旋结构，同时能够储存和传递遗传信息。由于其化学结构简单，与天然核酸不同的单体连接方式，使其更耐核酸酶的降解，在细胞环境中更能稳定的发挥作用。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供了一种基于苏糖核酸(TNA)分子的细胞内镁离子成像的方法，特别是一种体外筛选可切割RNA的TNA酶用于细胞内镁离子成像的方法。
技术方案：本发明所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法：
(1)、体外筛选镁离子依赖的具有RNA切割活性的TNA分子；
具体操作方法是：
首先，合成初始DNA分子随机文库和引物，然后进行循环筛选；在每一轮筛选里，采用引物延伸的方法获得TNA文库；
然后，通过链霉亲和素分离得到包含RNA底物和TNA分子的单链文库，该文库在含有镁离子的缓冲液中进行孵育，在TNA分子的催化下，具有切割活性的TNA分子会催化底物发生断裂，使TNA分子从磁珠上被洗脱下来；
最后，被洗脱的TNA分子经过逆转录和PCR扩增后，获得富集的DNA分子文库，应用于下一轮筛选；如此重复筛选多轮，逐渐加大筛选压力，镁离子浓度由20mM降低到1mM，孵育时间由18h降低到1h，以获得高活性的TNA分子(对富集的DNA分子进行测序，并根据测序结果推断得到TNA分子的序列信息。最后制备单链TNA分子，测试其在镁离子存在时的催化活性，具有RNA切割活性的TNA分即为苏糖核酶)；
选择其中活性最高的TNA分子进行生物化学表征；
其具体的内容如下：首先，在缓冲液中加入不同的二价金属离子，测试TNA分子对金属离子的选择性；然后，在缓冲液中加入不同浓度的镁离子，测试TNA分子的催化活性随镁离子浓度的变化；然后测试不同的pH对反应动力学参数的影响；最后，测试了TNA分子的一级反应动力学常数，和米氏常数；
其中，所述活性最高的TNA分子具体是指：通过截短实验和蛇毒磷酸二酯酶处理后，从而获得的活性最高的TNA分子，其序列如下所示：
5’-GTAGGAGAGGTTATCGTTGGAGGGAGATGAGTGTAG-2’；
作为本发明一种方案，所述TNA酶的序列T17-22如SEQ ID NO：1所示：
5’-GTAGGAGAGGTTATCGTTGGAGGGAGATGAGTGTAG-2’
(SEQ ID NO：1)
优选，所述重复筛选多轮为重复筛选16轮，总共进行17轮筛选。
具体的，具体步骤如下所述：
(A)、合成初始DNA分子随机文库和上下游引物；
(B)、取DNA分子随机文库以tC、tT、tG和tA核苷三磷酸为底物进行引物延伸后链分离，获得非天然核酸文库；
(C)、将非天然核酸文库溶液在含有镁离子的缓冲液中，在pH 7.5,37℃的条件下进行孵育，收集洗脱液；
(D)、将洗脱液作为模板进行逆转录反应；
(E)、以逆转录产物为模板，PCR扩增19～25个循环后，分离单链，得到本轮筛选获得的富集文库，可用于下一轮筛选；
(F)、重复(B)-(E)步骤；
(G)、筛选17轮后，将最后一轮筛选获得的PCR扩增产物连接载体中，并对含成功连接载体的菌落进行测序；
(H)、根据测序结果推断得到TNA分子的序列信息，通过聚合酶延伸反应，链分离以及蛇毒磷酸二酯酶处理制备单链TNA分子；
(I)、利用电泳法测试TNA分子在镁离子的激活下对RNA底物的切割活性，得到多个具有催化活性TNA分子；
(J)、对其中亲和力较高的TNA分子进行二级结构预测和截短优化，得到所述TNA酶；
其中，步骤(B)中的聚合酶选自KOD-RI聚合酶；
其中，步骤(D)中的聚合酶选自Bst 2.0聚合酶；
其中，步骤(G)中的载体选自pEASY-T1；
(2)、将TNA分子切割体系构建为镁离子荧光传感器；
所述构建镁离子荧光传感器具体是：
首先，在RNA底物的5’端和3’端分别标记荧光基团FAM和猝灭基团BHQ-1的RNA底物；
然后，RNA底物与TNA分子进行退火形成复合物；在复合物中加入缓冲液进行孵育，当镁离子不存在时，荧光被猝灭；当镁离子存在时，TNA分子催化RNA底物断裂，荧光基团被释放，荧光信号恢复；
在体外缓冲液中验证该荧光传感器的性能；具体表现如下：
当镁离子浓度小于20mM时，体系的荧光信号强度与镁离子浓度呈现线性关系，检测限为0.35mM；
(3)、将该传感器转染至细胞中进行体内镁离子的成像；步骤如下：
首先，利用转染试剂Lipofectamine 3000将荧光传感器转染至细胞内；
然后，利用钙离子载体将培养基中的镁离子运输至细胞内；
最后，细胞孵育后利用共聚焦显微镜进行成像；
其性能表现如下：
该检测方法可在活细胞内对20mM浓度的镁离子进行荧光成像。
有益效果：本发明与现有技术相比，本发明通过体外筛选技术获得了具有RNA切割活性的TNA酶，该TNA酶对镁离子有较高的特异性。与以往筛选获得的脱氧核酶相比，具有结构简单，生物稳定性强的优势，同时在缓冲液中对镁离子有更高的特异性，在细胞内能够对镁离子的浓度变化有特异性的响应，将该TNA酶构建成镁离子响应的荧光传感器后，不仅能在体外实现不同镁离子浓度的检测，还可以进一步在细胞中实现镁离子的成像，是一种相比脱氧核酶更稳定的细胞内镁离子成像的工具。
附图说明
图1为本发明方法的筛选流程图；
图2为本发明延伸反应及逆转录反应的结果图；
图3为本发明的TNA分子活性检测结果；
图4为本发明获得的T17-22分子生物化学表征的结果
图5为本发明的镁离子荧光传感器设计图；
图6为本发明的基于TNA酶的荧光传感器在细胞内成像镁离子的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1本发明可以切割RNA的TNA酶的体外筛选流程：
1、合成初始DNA分子随机文库和引物：
DNA分子随机文库核酸序列，如下所示：
5’-TGTCTACACTGAAGCTTAC-N40-CGTACTGCATACGAGTGTC-3’；
N40代表随机核酸序列，四种脱氧核糖核苷酸单体比例如下所示：
A:T:G:C＝2:2:2:1；
TNA文库延伸反应引物核酸序列，如下所示：
5’-Biotin-AAAAA-CTCAT-r(CAUGC)-AGCTCGACACTCGTATGCAGTACG-3’；
PCR上游引物核酸序列，如下所示：
5’-Biotin-GACACTCGTATGCAGTACG-3’；
下游引物核酸序列，如下所示：
5’-TGTCTACACTGAAGCTTAC-3’。
2、体外筛选可以切割RNA的TNA酶的过程：
2.1、取初始DNA分子随机文库进行引物延伸，获得非天然核酸文库；如图2左图所示，具体步骤为：
取1nmol DNA分子随机文库加入到1×标准Taq酶反应缓冲液中，加入1μM下游引物进行梯度退火，再依次加入0.1mM tNTPs，1.5mg/mL的KOD-RI聚合酶(提前用1mM MnCl2在室温下预处理15分钟)，反应条件为55℃，4h；
2.2、分离获得TNA文库，并在筛选缓冲液中进行孵育，具体步骤为：
用500μL洗涤液(50mM Tris-HCl,200mM NaCl,1mM EDTA,pH 7.5)对1mL链霉亲和素包覆的磁珠进行3次洗涤；取引物延伸产物与链霉亲和素包被的磁珠在室温下孵育30min，然后去除上清液；磁珠在用洗涤液洗涤3次后，用含1mM EDTA的500μL冷NaOH(0.1M)洗涤5次(每次洗涤<30s)，以去除DNA模板；随后再用500μL中和缓冲液(50mM Tris-HCl,1mMEDTA,pH 6.0)立即中和挂在磁珠上的TNA文库；最后用500μL无酶水洗涤三次，使得延伸反应获得的TNA单链文库被固定在含有链霉亲和素的磁珠上；
在TNA文库中加入110μL筛选缓冲液(50mM Tris-HCl,154mM NaCl,20mM MgCl2,pH7.5)，使其在37℃中孵育；在第一轮筛选中，TNA文库在含有20mM MgCl2的筛选缓冲液中培养18h；随着筛选的进行，MgCl2浓度逐渐降低到1mM，培养时间逐渐缩短到1h；
2.3、孵育结束后，以上清液为模板逆转录为cDNA，如图3右图所示；反应包含0.1μM引物、1×ThermoPol缓冲液、0.5mM dNTPs和0.4U/mL Bst 2.0聚合酶，在55℃的条件下孵育4h；
2.4、利用PCR引物对，Taq DNA聚合酶以逆转录产物为模板进行PCR扩增：95℃，5min,N个循环(95℃,15s；49℃,15s；72℃，10s)，72℃，5min；采用小体系PCR梯度实验确定循环次数(N)；
2.5、将PCR产物进行链分离，具体步骤如下：
将载有链霉亲和素的树脂用PBS进行冲洗两次，加入延伸反应产物溶液孵育30min，用PBS冲洗一次，再用200mM NaOH洗脱3次，收集3次洗脱液，加入醋酸钠溶液调pH至中性，再用脱盐柱进行脱盐，收集到的DNA序列用于下一轮筛选的模板；
2.6、重复2.1-2.5步骤；
2.7、筛选17轮后，将最后一轮筛选结束获得的PCR扩增产物连接于pEASY-T1载体中，并对含成功连接载体的菌落进行测序；
2.8、根据测序结果推断得到TNA分子序列信息，合成引物延伸的模板，进行引物延伸反应，并分离单链，获得TNA分子；
2.9、将TNA分子与荧光标记的RNA底物在筛选缓冲液中进行孵育，通过电泳法测试TNA分子的催化活性；
2.10、对其中活性最高的TNA酶进行二级结构预测和截短优化，得到活性高、特异性强的TNA酶T17-22。T17-22的二级结构预测结果如图5所示；
所述TNA酶T17-22的序列如SEQ ID NO：1所示：
5’-GTAGGAGAGGTTATCGTTGGAGGGAGATGAGTGTAG-2’(SEQ ID NO：1)
其中，单体ATCG均为TNA单体；
进一步，所述步骤2.1中引物延伸所用的聚合酶为文献已有报道的KOD-RI；
进一步，所述步骤2.3中逆转录反应所用的聚合酶为文献已有报道的Bst 2.0；
进一步，所述步骤2.9中RNA底物5’端修饰的荧光标记物为Cy5.5；
实施例2本发明构建镁离子的荧光传感器用于细胞内镁离子成像的流程：
1、合成初始序列，如下所示：
生物素标记的T17-22的DNA模板序列，如下图所示：
5’-Biotin-AACTCATCTCCCTCCAACGATAACCTCTCCTACCGTACTGCATACGAGTGTC-3’；
2、制备TNA酶T17-22分子：
2.1、通过引物延伸反应获得TNA和DNA的杂交双链，具体步骤如下：
首先，将引物和生物素标记的模板在1×ThermoPol缓冲液中90℃加热5分钟，然后梯度冷却至4℃(10℃/min)进行退火；再加入1mM MnCl2预处理15min后的KOD-RI聚合酶(1mg/mL)，0.1mM tNTPs在55℃下反应4h；
2.2、引物延伸后，双链产物被固定在链霉亲和素树脂上，用200mM NaOH洗脱TNA单链；然后用除盐柱除盐；
2.3、将TNA酶单链的DNA引物部分去除，具体步骤如下：
该反应包含1μM的双链产物，1U/mL的蛇毒磷酸二酯酶I，在该酶的反应缓冲液中37℃下孵育16小时，酶解产物经变性PAGE胶纯化，再用脱盐柱脱盐后紫外定量；
3、构建镁离子依赖的荧光传感器：
3.1、合成荧光基团和猝灭基团标记的底物序列，如下所示：
5’-FAM-AACTCAT-r(CAUGC)-AGCTCGA-BHQ-1-3’；
3.2、T17-22分子和底物(E:S＝2:1(200nM))在水中90℃加热5分钟，再置于冰上10分钟进行退火形成荧光传感器复合物；
4、在复合物中加入不同镁离子浓度的的反应缓冲液在37℃反应1h；在460nm的激发下，利用酶标仪扫描采集荧光光谱，发射波长为505-650nm；
5、细胞内镁离子成像：
5.1、Hela细胞培养，步骤如下：
Hela细胞在添加10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2.5μg/mL四环素的DMEM培养基中培养，置于37℃，含有5％ CO2的湿化培养箱中培养；共聚焦成像前，细胞被铺在35毫米玻璃底培养皿中生长24小时，达到60-70％融合；
5.2、采用转染试剂进行荧光传感器的转染，步骤如下：
100pmol的传感器和4μL的Lipofectamine 3000在Opti-MEM培养基中分别在室温下孵育10分钟，然后混合孵育10分钟；将该混合物加入到培养基中与细胞共孵育12h；
5.3、共聚焦成像，步骤如下：
转染12h后，用包含2μM钙离子载体和20mM Mg2+的新鲜Opti-MEM替代转染所用的培养基，然后与细胞孵育12h；孵育结束后，用2.5ng/mL的Hoechst 33258细胞核染色剂37℃染色15分钟，并用PBS小心清洗，最后用4％多聚甲醛37℃固定细胞15分钟；共聚焦成像是在60×的分辨率下使用奥林巴斯激光扫描共聚焦显微镜拍摄的；在401nm激发下，在450-520nm范围内测量了Hoechst 33258的荧光发射；FAM在488nm处激发获得荧光，在493-563nm处收集。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，其具体操作步骤如下：
(1)、体外筛选镁离子依赖的具有RNA切割活性的TNA分子；将TNA分子切割体系构建为镁离子荧光传感器；
所述TNA分子具体是指：通过截短实验和蛇毒磷酸二酯酶处理后，从而获得的活性最高的TNA分子，其序列如下所示：
5’-GTAGGAGAGGTTATCGTTGGAGGGAGATGAGTGTAG-2’；
(2)、在体外缓冲液中验证该荧光传感器的性能；
(3)、将该传感器转染至细胞中进行体内镁离子的成像。
2.根据权利要求1所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，
在步骤(1)中，所述构建镁离子荧光传感器具体是：
在RNA底物的5’端和3’端分别标记荧光基团FAM和猝灭基团BHQ-1，当镁离子不存在时，荧光被猝灭；当镁离子存在时，TNA分子催化RNA底物断裂，荧光基团被释放，荧光信号恢复。
3.根据权利要求1所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，
在步骤(2)中，所述在体外缓冲液中验证该荧光传感器的性能具体表现如下：
当镁离子浓度小于20mM时，体系的荧光信号强度与镁离子浓度呈现线性关系，检测限为0.35mM。
4.根据权利要求1所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，
在步骤(3)中，所述将该传感器转染至细胞中进行体内镁离子的成像步骤如下：
首先，利用转染试剂Lipofectamine 3000将荧光传感器转染至细胞内；
然后，利用钙离子载体将培养基中的镁离子运输至细胞内；
最后，细胞孵育后利用共聚焦显微镜进行成像。
5.根据权利要求4所述的一种基于TNA分子的细胞内镁离子成像的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述该传感器体内镁离子的成像的性能表现如下：该方法在活细胞内对20mM浓度的镁离子进行荧光成像。
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