CN114317642A - 制备壳寡糖的方法、壳聚糖酶及其基因、酶制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备壳寡糖的方法、壳聚糖酶及其基因、酶制剂与应用，属于水解酶技术领域。本发明的制备壳寡糖的方法为：采用SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶酶解壳聚糖或胶质甲壳素生产壳寡糖，酶解条件为：pH 4.0～8.0，温度50～80℃。本发明的壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该壳聚糖酶的基因如SEQ ID NO.2所示。本发明的酶制剂，含有该壳聚糖酶。所述壳聚糖酶、酶制剂在降解壳聚糖或胶质甲壳素中的应用，在制备壳寡糖中的应用。本发明采用特定的壳聚糖酶制备壳寡糖，催化活性高，可在高温条件下进行。本发明的壳聚糖酶可以在高温条件下酶解壳聚糖，高效酶解壳聚糖制备壳寡糖。

Description

制备壳寡糖的方法、壳聚糖酶及其基因、酶制剂与应用

技术领域

本发明涉及一种制备壳寡糖的方法、壳聚糖酶及其基因、酶制剂与应用，属于水解酶技术领域。

背景技术

我国拥有丰富的虾蟹类资源，甲壳素是从虾蟹类资源中的一种动物多糖，在化工、医药、材料领域有着广泛的应用。但由于其分子量大、水溶性差的特性，其难以被人体吸收利用，限制了其在功能食品领域的使用。

将甲壳素脱乙酰后，可制得壳聚糖，其在酸溶液中具有一定的溶解性，将其进一步降解后，可制得分子量小、水溶性好、可被吸收利用并具有降血糖、降血压、降血脂等功能活性的壳寡糖。

目前使用壳聚糖制备壳寡糖的方法有物理降解法、化学降解法和生物酶降解法。物理降解法是使用微波、射线等方式断裂壳聚糖中的糖苷键，但过程对设备要求高、且得到的壳寡糖产物聚合度不确定，工业上难以应用；化学降解法是使用氧化剂或酸溶液在高温高压条件下断裂糖苷键，但过程中需要使用大量的酸碱试剂，容易造成环境污染，且产物有部分在反应中被破坏；生物酶降解法是使用生物酶的催化作用断裂糖苷键，具有反应过程环保、产物聚合度可控、产品生物安全性高的优点，是壳寡糖生产的首选方法。但其中关键的工具是具有高效催化活性和稳定性的壳聚糖酶，且在反应过程中为保障底物的充分溶解于反应过程控制微生物生长，需要控制一定的高温环境，因此筛选出可在高温下保持活性和稳定性的酶是实现壳寡糖高效生产的关键因素。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种制备壳寡糖的方法，本发明采用特定的壳聚糖酶酶解壳聚糖或胶质甲壳素生产壳寡糖，催化活性高且稳定性好，可在高温条件（70～80℃）下进行，在高温条件（70～80℃）下酶解可持续12小时以上，酶解得到的壳寡糖的聚合度范围可控。本发明还提供了该壳聚糖酶、表达该壳聚糖酶的基因，含有该壳聚糖酶的酶制剂，以及该壳聚糖酶、酶制剂在降解壳聚糖或胶质甲壳素中的应用，在制备壳寡糖中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种制备壳寡糖的方法：采用SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶酶解壳聚糖或胶质甲壳素生产壳寡糖，酶解条件为：pH 4.0～8.0，温度50～80℃；所得壳寡糖的聚合度为2～3。

进一步地，在温度70～80℃下酶解壳聚糖或胶质甲壳素。

进一步地，在pH 4.0～6.0的条件下酶解壳聚糖或胶质甲壳素。

进一步地，酶解时间在12小时以上。

进一步地，酶解时加入可溶性二价锰盐（锰离子的化合价为+2），以促进酶解；所述可溶性二价锰盐的浓度为0.5～2.0 mM，优选1.0 mM。

一种壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其来源于甲烷丝菌（Methanothrixsp.）。

该壳聚糖酶的氨基酸序列如下所示（如SEQ ID NO.1所示）：

MTITKKNLVF VFALLIVGLM VLASAQEDQA QKMAFDITGS FEGGKPNSLQ TYDAGIISYGMHQATLASGS LYNVLERYTE LSKTSNSEGI TKYLLRVQSR DITLRNDVEF LNLLRDAASE SAMVQAQNEIFSKDYYEPAK NKAATDGVTS PLGIAIYYDT NIQGGLEYIR RATNENFIQS TPTEQEWLST FLDERRNYLLAVADNKRKKG LETDAKYLEN SASSKGRLGV LENLVDAGNL NLDKGDSNQQ ISLGIFGKIY TIDSEFRANNYGREQYKEED TKIEEPPQST KESVAKSPTS YKSTIPIPSG PAADALKAQG KYEEYLQNAL QEAEERIAKDPHDEDAWRAK SLALYYLNRG AESETALAKA NELSHGYVSE DNRITPDPKA AMIDVTDISQ DMQQVKFPLAISEGLKPITQ AIQPTNYIEE SNIRESSSVP TLYPTTSPPP DESIIGESSS IPTLYPTTSP PPYESETWEGSGIPTLYPTT SPPPDESNRK DGKPFGAGDT SFGATSSSSD VESSGFGTSS DESDLGGINF TSIRLNYVSVSPDDSGGVNF DLGLKAKKAE GTSPGIDVIN STLIGATAFM TGLAVPSDKF WVNLNPWEPD RIIDEQLSRSDVGRIMLEAD LQMKKDTCNY ENPCTNEAGM TLSNLLDEKR NILVRQCMNK FPGEIDDVNN VVFRAGTRYWIVPDSVYAYS NGTQIYIINA TLAIQSEPVP DRTSFRVDNQ DVKKLSKGCL EELNKSSKEY GEYYEEMSEQIILPFVVADV NHGEKYEDLR EVFVALALAQ WYKSNINSHK DIFRDSLDSS DSPLNAIRPW NPNEIWENYVYSYENGEYEC YMNTTTKTAE GAEAVNIFIK SSGGVAFHNI NDKLVVLEST PPEIQETISQ AITDGFIDKGTDVFFGIRMH GEMGREKATP GSDSLKNVDR RDPSLAITWI NKGNKLNDQG KYDDAIEAYE EAIRLDPSSSVARSNLAITW NNKGNKLNDQ GKYDDAIEAY EEAIRLDPEN RVAWHNKGNA LSSQGKYSEA IQAYDEAIRLDPENPWAWYA KGVTLGEQGI HNEALLCFEE AIRLDADFAS AWNNKGVALE SLGRSLEADA AYFRARELS。

编码上述壳聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该核苷酸序列已经进行了密码子优化，以适合在在大肠杆菌宿主中异源表达。

所述壳聚糖酶在降解壳聚糖或胶质甲壳素中的应用；在制备壳寡糖中的应用。

一种含有壳聚糖酶的酶制剂，其含有上述壳聚糖酶。

所述含有壳聚糖酶的酶制剂在降解壳聚糖或胶质甲壳素中的应用；在制备壳寡糖中的应用。

本发明的壳聚糖酶，在pH 4.0～8.0之间时，酶活可保持最高酶活的60%以上，在pH4.0～6.0之间时，100 h内酶活可保持最高酶活的80%以上。在50～80℃之间，该酶的酶活均可保持在最高酶活的60%以上，且在50～70℃范围内具有较好的温度稳定性，在此温度范围内保温12 h，仍然能保留80%以上的酶活。可溶性二价锰盐（比如MnCl₂）可促进该酶的酶活，在使用该酶酶解壳聚糖时可加入适当浓度的MnCl₂。可溶性三价铁盐（比如FeCl₃）和可溶性二价钴盐（比如CoCl₂）显著抑制该酶活性，使酶活降低至60%～70%，同时试剂SDS和Na₂EDTA也可降低该酶的酶活至60%～70%，在反应体系中应避免此类物质的污染。

本发明的壳聚糖酶，可以在高温条件下酶解壳聚糖，酶活性高，且具有较好的温度稳定性，同时其对于甲壳素底物也具有较好的酶解效果，相较于已报道的壳聚糖酶，可在底物溶解性较好和具有较高生物安全性的高温下进行反应，可高效酶解壳聚糖制备壳寡糖。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：壳聚糖酶纯化后的纯酶SDS-PAGE电泳图，M为标准蛋白Marker；1为纯化后的壳聚糖酶。

图2：壳聚糖酶的最适反应pH测定结果示意图。

图3：壳聚糖酶的pH稳定性测定示意图。

图4：壳聚糖酶的最适反应温度测定示意图。

图5：壳聚糖酶的温度稳定性测定示意图。

图6：金属离子与化学试剂对壳聚糖酶酶活影响示意图。

图7：壳聚糖酶酶解壳聚糖产物质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1 酶的发掘及序列分析

为寻找壳聚糖酶基因，本发明的研究人员从甲烷丝菌（Methanothrixsp.）（据文献报道，该菌属于古细菌，多生活在极端的生态环境中，研究人员猜测该菌中所含有的潜在壳聚糖酶可能具有较为特殊的活性）编码蛋白中发掘到一段含有1109个氨基酸的潜在壳聚糖酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，将其命名为MS-1109。经蛋白序列比对分析，该蛋白与已报道的糖苷类水解酶最高序列相似性仅为34%，表明其为一个新型壳聚糖酶。

实施例2 酶基因的表达载体构建、表达与酶蛋白纯化

MS-1109酶经密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将序列人工合成后使用无缝连接技术连接至pET-21a(+)载体，获得重组载体pET-21a-MS-1109。将该重组载体使用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中。将热激处理后的细胞涂布至含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃过夜培养，挑选可在平板上生长的阳性克隆子进行菌落PCR验证，将PCR产物纯化后送样测序，经测序验证正确的克隆子即为含有重组成功质粒载体的菌株。挑取该菌株在LB液体培养基中37℃培养20 h，取菌液使用质粒提取试剂盒提取质粒，将提取后的质粒浓缩后热激转化入表达菌株大肠杆菌BL21感受态细胞中。使用含有氨苄青霉素抗性的LB平板挑选生长的阳性克隆子，并进行菌落PCR验证，验证成功的阳性克隆子即可进行培养表达。

将验证成功的大肠杆菌BL21重组菌接种至LB培养基中，37℃培养至菌液OD₆₀₀为0.6左右时，加入IPTG诱导，并将培养温度调整至16℃，诱导培养20 h左右，表达MS-1109酶。将表达后菌液在低温条件下离心收集菌体沉淀。将菌体沉淀使用50 mM pH 8.0 Tris-HCl缓冲液重悬后，在冰浴条件下超声破碎。破碎液在低温条件下离心，收集上清液。上清液过镍柱分离纯化，使用不同浓度的咪唑溶液洗脱镍柱，取100 mM咪唑溶液洗脱的组分，使用截留分子量5 kDa超滤膜脱盐并浓缩，获得MS-1109酶浓缩液，使用SDS-PAGE电泳检测酶液蛋白纯度，电泳图如图1所示，电泳中于125 kDa左右处出现一条较纯的蛋白条带，与根据氨基酸序列预测的分子量接近，表明MS-1109酶得到成功纯化。

实施例3 酶学性质研究

酶活测定方法：使用DNS显色法检测壳聚糖酶活性，取20 μL酶液与80 μL壳聚糖（2%）溶液混合，并加入200 μL缓冲溶液，组成300 μL反应体系。将反应体系置于50℃水浴锅中反应10 min，反应结束后迅速沸水浴处理10 min将酶灭活，再加入DNS显色液300 μL，混合液沸水浴5 min，显色完成后迅速冷却并加入1 mL去离子水，使用酶标仪于540 nm处检测其吸光值，根据吸光值计算酶活性。

最适反应pH测定：取20 μL酶液与80 μL壳聚糖（2%）溶液混合，分别加入200 μL pH4.0-9.0的不同体系缓冲液调节体系pH，将反应体系置于50℃水浴锅中反应10 min，反应结束后迅速沸水浴处理5 min将酶灭活，使用DNS显色法测定MS-1109酶在不同pH下的酶活力。

pH稳定性测定：将MS-1109酶分别存放在4℃条件下的pH 4.0～7.0缓冲液中，放置不同时间取样测定酶活力。

最适反应温度测定：取20 μL酶液与80 μL壳聚糖（2%）溶液混合，加入200 μL pH5.0的缓冲液调节体系pH，将反应体系分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴锅中反应10 min，反应结束后迅速沸水浴处理5 min将酶灭活，使用DNS显色法测定MS-1109酶在不同温度下的酶活力。

温度稳定性测定：将MS-1109酶缓冲液调节至pH5.0，将酶分别存放在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴环境中，放置不同时间取样测定酶活力。

金属离子及化学试剂对酶活性的影响：分别在反应体系中加入终浓度为1 mM的各种金属离子及化学试剂，置于pH 5.0，60℃条件下反应，取样测定酶活力。

测定结果如图2～图6所示，由图2可知，该酶的最适反应pH为5.0，在pH 4.0～8.0之间时，酶活可保持最高酶活的60%以上，说明该酶具有较为广泛的pH适应性，由图3可知，该酶在pH 4.0～6.0之间均具有良好的pH稳定性，在100 h内均可保持80%以上酶活。考虑到该酶的最适反应pH和pH稳定性，使用其催化壳聚糖的反应pH设定在5.0。由图4可知，该酶的最适反应温度为70℃，在50～80℃之间，该酶的酶活均可保持在最高酶活的60%以上。由图5可知，该酶在50～70℃下具有较好的温度稳定性，在此温度范围内保温12 h，仍然可以保留80%以上的酶活，综合考虑该酶的最适温度和温度稳定性，使用其催化壳聚糖的反应温度设定在70℃。由图6可知，所进行实验的各种金属离子和化学试剂中，可溶性二价锰盐（MnCl₂）可促进该酶的酶活，可使其酶活性提升50%左右，可溶性三价铁盐（FeCl₃）和可溶性二价钴盐（CoCl₂）显著抑制该酶活性，使酶活降低至60%～70%。同时试剂SDS和Na₂EDTA也可降低该酶的酶活至60%～70%。其余使用的金属离子对该酶的活性影响不大。综合考虑金属离子与化学试剂的影响，实用其催化壳聚糖时，在体系中加入1 mM的MnCl₂以提高催化效率。同时在反应体系中避免三价铁盐（FeCl₃）、二价钴盐（CoCl₂）、SDS和Na₂EDTA等物质的污染。

使用壳聚糖酶酶解壳聚糖是一种绿色高效的壳寡糖生产方法，由于体系条件温和，容易微生物等污染，同时常温条件下也不利于底物的溶解以及酶与底物的充分接触。因此使用高温反应可以提高酶解过程和产品的生物安全性。但目前大多数已报道的壳聚糖酶最适反应温度都在60℃以下。如发明专利“一种壳聚糖酶及其在壳寡糖制备中的应用（CN108330119B）”中报道的壳聚糖酶的最适温度为50℃，“一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用（CN109652437B）”中报道的壳聚糖酶的最适温度为55℃，“一种壳聚糖酶CsnQ及其应用（CN110144340B）”中报道的壳聚糖酶的最适温度为60℃，“一种深海来源的壳聚糖酶CSN5及其编码基因和应用（CN111187764B）”中报道的壳聚糖酶的最适温度为30℃。“一种壳聚糖酶及其应用（CN113493781A）”中报道的壳聚糖酶的最适温度为70℃，但其温度稳定性较差，在80℃条件下保温1 h仅能保持30%的酶活性。本发明的壳聚糖酶MS-1109最适反应温度为70℃，且在该温度下保温12 h仍可保持80%以上的酶活性，具有较好的稳定性，可保障在高温条件下的酶催化反应，具有作为生产壳寡糖的工具酶的工业应用潜力。

实施例4 酶解制备壳寡糖应用

利用实施例2制备得到的MS-1109酶酶解壳聚糖制备壳寡糖。配制5%浓度的壳聚糖溶液，在95 mL溶液中加入稀释后的5 mL MS-1109酶酶液（100 U/mL），与pH 5.0、70℃条件下反应2 h，反应结束后将反应液离心，取离心上清液冷冻干燥处理，将产物进行质谱鉴定。质谱鉴定结果如图7所示，可以看出该酶的产物主要为壳二糖和壳三糖，产物纯度较高。可以用来进行低聚合度壳寡糖的生产。

实施例5 酶的底物特异性分析

使用pH 5.0的柠檬酸盐缓冲液配制2.0%浓度的胶质甲壳素、粉质甲壳素和壳聚糖，分别取80 μL底物样品，加入20 μL MS-1109酶酶液（100 U/mL），在pH 5.0、70℃条件下反应10 min，用DNS法测定反应生成还原糖含量计算酶活，以该酶酶解壳聚糖酶活性为100%，计算其酶解胶质甲壳素和粉质甲壳素的相对酶活性，测定结果如表1所示。由实验结果可以看出，该酶在可高效酶解壳聚糖的同时，对于胶质甲壳素也有较高的酶解活性，可达到酶解壳聚糖的57.3%，表明其对于带有乙酰氨基的底物也具有较好的识别和降解作用，为探讨甲壳素酶和壳聚糖酶的特异性酶解机制和底物识别机制研究提供了较好的研究对象。

表1 MS-1109酶的底物特异性

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 制备壳寡糖的方法、壳聚糖酶及其基因、酶制剂与应用

<141> 2022-03-03

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1109

<212> PRT

<213> Methanothrix sp.

<400> 1

Met Thr Ile Thr Lys Lys Asn Leu Val Phe Val Phe Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Val Gly Leu Met Val Leu Ala Ser Ala Gln Glu Asp Gln Ala Gln Lys

20 25 30

Met Ala Phe Asp Ile Thr Gly Ser Phe Glu Gly Gly Lys Pro Asn Ser

35 40 45

Leu Gln Thr Tyr Asp Ala Gly Ile Ile Ser Tyr Gly Met His Gln Ala

50 55 60

Thr Leu Ala Ser Gly Ser Leu Tyr Asn Val Leu Glu Arg Tyr Thr Glu

65 70 75 80

Leu Ser Lys Thr Ser Asn Ser Glu Gly Ile Thr Lys Tyr Leu Leu Arg

85 90 95

Val Gln Ser Arg Asp Ile Thr Leu Arg Asn Asp Val Glu Phe Leu Asn

100 105 110

Leu Leu Arg Asp Ala Ala Ser Glu Ser Ala Met Val Gln Ala Gln Asn

115 120 125

Glu Ile Phe Ser Lys Asp Tyr Tyr Glu Pro Ala Lys Asn Lys Ala Ala

130 135 140

Thr Asp Gly Val Thr Ser Pro Leu Gly Ile Ala Ile Tyr Tyr Asp Thr

145 150 155 160

Asn Ile Gln Gly Gly Leu Glu Tyr Ile Arg Arg Ala Thr Asn Glu Asn

165 170 175

Phe Ile Gln Ser Thr Pro Thr Glu Gln Glu Trp Leu Ser Thr Phe Leu

180 185 190

Asp Glu Arg Arg Asn Tyr Leu Leu Ala Val Ala Asp Asn Lys Arg Lys

195 200 205

Lys Gly Leu Glu Thr Asp Ala Lys Tyr Leu Glu Asn Ser Ala Ser Ser

210 215 220

Lys Gly Arg Leu Gly Val Leu Glu Asn Leu Val Asp Ala Gly Asn Leu

225 230 235 240

Asn Leu Asp Lys Gly Asp Ser Asn Gln Gln Ile Ser Leu Gly Ile Phe

245 250 255

Gly Lys Ile Tyr Thr Ile Asp Ser Glu Phe Arg Ala Asn Asn Tyr Gly

260 265 270

Arg Glu Gln Tyr Lys Glu Glu Asp Thr Lys Ile Glu Glu Pro Pro Gln

275 280 285

Ser Thr Lys Glu Ser Val Ala Lys Ser Pro Thr Ser Tyr Lys Ser Thr

290 295 300

Ile Pro Ile Pro Ser Gly Pro Ala Ala Asp Ala Leu Lys Ala Gln Gly

305 310 315 320

Lys Tyr Glu Glu Tyr Leu Gln Asn Ala Leu Gln Glu Ala Glu Glu Arg

325 330 335

Ile Ala Lys Asp Pro His Asp Glu Asp Ala Trp Arg Ala Lys Ser Leu

340 345 350

Ala Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Gly Ala Glu Ser Glu Thr Ala Leu Ala

355 360 365

Lys Ala Asn Glu Leu Ser His Gly Tyr Val Ser Glu Asp Asn Arg Ile

370 375 380

Thr Pro Asp Pro Lys Ala Ala Met Ile Asp Val Thr Asp Ile Ser Gln

385 390 395 400

Asp Met Gln Gln Val Lys Phe Pro Leu Ala Ile Ser Glu Gly Leu Lys

405 410 415

Pro Ile Thr Gln Ala Ile Gln Pro Thr Asn Tyr Ile Glu Glu Ser Asn

420 425 430

Ile Arg Glu Ser Ser Ser Val Pro Thr Leu Tyr Pro Thr Thr Ser Pro

435 440 445

Pro Pro Asp Glu Ser Ile Ile Gly Glu Ser Ser Ser Ile Pro Thr Leu

450 455 460

Tyr Pro Thr Thr Ser Pro Pro Pro Tyr Glu Ser Glu Thr Trp Glu Gly

465 470 475 480

Ser Gly Ile Pro Thr Leu Tyr Pro Thr Thr Ser Pro Pro Pro Asp Glu

485 490 495

Ser Asn Arg Lys Asp Gly Lys Pro Phe Gly Ala Gly Asp Thr Ser Phe

500 505 510

Gly Ala Thr Ser Ser Ser Ser Asp Val Glu Ser Ser Gly Phe Gly Thr

515 520 525

Ser Ser Asp Glu Ser Asp Leu Gly Gly Ile Asn Phe Thr Ser Ile Arg

530 535 540

Leu Asn Tyr Val Ser Val Ser Pro Asp Asp Ser Gly Gly Val Asn Phe

545 550 555 560

Asp Leu Gly Leu Lys Ala Lys Lys Ala Glu Gly Thr Ser Pro Gly Ile

565 570 575

Asp Val Ile Asn Ser Thr Leu Ile Gly Ala Thr Ala Phe Met Thr Gly

580 585 590

Leu Ala Val Pro Ser Asp Lys Phe Trp Val Asn Leu Asn Pro Trp Glu

595 600 605

Pro Asp Arg Ile Ile Asp Glu Gln Leu Ser Arg Ser Asp Val Gly Arg

610 615 620

Ile Met Leu Glu Ala Asp Leu Gln Met Lys Lys Asp Thr Cys Asn Tyr

625 630 635 640

Glu Asn Pro Cys Thr Asn Glu Ala Gly Met Thr Leu Ser Asn Leu Leu

645 650 655

Asp Glu Lys Arg Asn Ile Leu Val Arg Gln Cys Met Asn Lys Phe Pro

660 665 670

Gly Glu Ile Asp Asp Val Asn Asn Val Val Phe Arg Ala Gly Thr Arg

675 680 685

Tyr Trp Ile Val Pro Asp Ser Val Tyr Ala Tyr Ser Asn Gly Thr Gln

690 695 700

Ile Tyr Ile Ile Asn Ala Thr Leu Ala Ile Gln Ser Glu Pro Val Pro

705 710 715 720

Asp Arg Thr Ser Phe Arg Val Asp Asn Gln Asp Val Lys Lys Leu Ser

725 730 735

Lys Gly Cys Leu Glu Glu Leu Asn Lys Ser Ser Lys Glu Tyr Gly Glu

740 745 750

Tyr Tyr Glu Glu Met Ser Glu Gln Ile Ile Leu Pro Phe Val Val Ala

755 760 765

Asp Val Asn His Gly Glu Lys Tyr Glu Asp Leu Arg Glu Val Phe Val

770 775 780

Ala Leu Ala Leu Ala Gln Trp Tyr Lys Ser Asn Ile Asn Ser His Lys

785 790 795 800

Asp Ile Phe Arg Asp Ser Leu Asp Ser Ser Asp Ser Pro Leu Asn Ala

805 810 815

Ile Arg Pro Trp Asn Pro Asn Glu Ile Trp Glu Asn Tyr Val Tyr Ser

820 825 830

Tyr Glu Asn Gly Glu Tyr Glu Cys Tyr Met Asn Thr Thr Thr Lys Thr

835 840 845

Ala Glu Gly Ala Glu Ala Val Asn Ile Phe Ile Lys Ser Ser Gly Gly

850 855 860

Val Ala Phe His Asn Ile Asn Asp Lys Leu Val Val Leu Glu Ser Thr

865 870 875 880

Pro Pro Glu Ile Gln Glu Thr Ile Ser Gln Ala Ile Thr Asp Gly Phe

885 890 895

Ile Asp Lys Gly Thr Asp Val Phe Phe Gly Ile Arg Met His Gly Glu

900 905 910

Met Gly Arg Glu Lys Ala Thr Pro Gly Ser Asp Ser Leu Lys Asn Val

915 920 925

Asp Arg Arg Asp Pro Ser Leu Ala Ile Thr Trp Ile Asn Lys Gly Asn

930 935 940

Lys Leu Asn Asp Gln Gly Lys Tyr Asp Asp Ala Ile Glu Ala Tyr Glu

945 950 955 960

Glu Ala Ile Arg Leu Asp Pro Ser Ser Ser Val Ala Arg Ser Asn Leu

965 970 975

Ala Ile Thr Trp Asn Asn Lys Gly Asn Lys Leu Asn Asp Gln Gly Lys

980 985 990

Tyr Asp Asp Ala Ile Glu Ala Tyr Glu Glu Ala Ile Arg Leu Asp Pro

995 1000 1005

Glu Asn Arg Val Ala Trp His Asn Lys Gly Asn Ala Leu Ser Ser Gln

1010 1015 1020

Gly Lys Tyr Ser Glu Ala Ile Gln Ala Tyr Asp Glu Ala Ile Arg Leu

1025 1030 1035 1040

Asp Pro Glu Asn Pro Trp Ala Trp Tyr Ala Lys Gly Val Thr Leu Gly

1045 1050 1055

Glu Gln Gly Ile His Asn Glu Ala Leu Leu Cys Phe Glu Glu Ala Ile

1060 1065 1070

Arg Leu Asp Ala Asp Phe Ala Ser Ala Trp Asn Asn Lys Gly Val Ala

1075 1080 1085

Leu Glu Ser Leu Gly Arg Ser Leu Glu Ala Asp Ala Ala Tyr Phe Arg

1090 1095 1100

Ala Arg Glu Leu Ser

1105

<210> 2

<211> 3327

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgaccatca ctaaaaaaaa cctggtgttc gtttttgctc tgctgatcgt aggtctgatg 60

gtgctggcca gcgcccagga agatcaagcc cagaaaatgg ctttcgatat caccggctct 120

tttgaaggcg gcaaaccgaa ctccctgcaa acgtacgacg ctggtatcat ctcttacggt 180

atgcaccagg caactctggc gtctggtagc ctgtataacg tcctggaacg ctacaccgaa 240

ctgagcaaaa cttctaacag cgaaggcatc accaaatacc tgctgcgcgt acagtctcgt 300

gatatcaccc tgcgcaacga tgtagaattc ctgaacctgc tgcgtgacgc ggcgtctgaa 360

agcgcgatgg ttcaggctca gaacgaaatc ttcagcaaag attattatga gccagcgaaa 420

aacaaagcag ccaccgatgg tgtcacctct ccgctgggta ttgccatcta ttacgacacc 480

aacatccagg gtggtctgga gtatattcgc cgtgccacca atgaaaactt catccagagc 540

actccgacgg agcaggaatg gctgagcacc tttctggacg agcgccgcaa ctatctgctg 600

gctgttgctg acaacaaacg taaaaaaggt ctggaaacgg atgcgaaata tctggagaac 660

tctgcttcct ccaaaggccg cctgggtgta ctggaaaacc tggtggacgc cggcaacctg 720

aacctggata aaggtgatag caaccagcag attagcctgg gtatcttcgg taaaatttat 780

accatcgaca gcgaattccg tgccaacaat tacggccgtg aacagtataa agaagaagac 840

accaaaattg aagagccgcc gcagtccact aaagaaagcg tggccaagtc cccgacctct 900

tacaagtcca ccatcccgat tccatccggc ccggctgccg atgctctgaa agcgcagggt 960

aaatatgaag agtacctgca gaacgcactg caggaagcag aggaacgtat tgccaaagat 1020

ccgcacgacg aagacgcgtg gcgtgcgaaa tctctggcgc tgtattatct gaatcgtggc 1080

gcagaaagcg agaccgcgct ggcaaaagct aacgaactgt ctcacggtta tgtcagcgaa 1140

gacaatcgta tcactccgga cccgaaagct gccatgatcg acgtgaccga tatctctcaa 1200

gacatgcaac aagttaaatt tccgctggca atctctgaag gtctgaaacc gatcactcag 1260

gcaatccaac cgaccaacta tatcgaagaa agcaacatcc gcgaaagctc ttccgttccg 1320

accctgtacc cgaccaccag cccgccgccg gacgagtcca ttattggtga atctagcagc 1380

atcccgaccc tgtacccgac cacttctcca cctccgtacg aatccgaaac ctgggaaggt 1440

tccggcattc ctaccctgta cccgaccacc tctccgccgc cggacgagtc caaccgtaaa 1500

gacggtaaac cgttcggcgc gggcgacacc agctttggcg caacctcttc cagctccgat 1560

gtggaatctt ccggttttgg tacctcttct gatgaatctg atctgggcgg tattaatttc 1620

acctctattc gcctgaacta cgtttccgta agcccggatg atagcggtgg tgtgaacttt 1680

gacctgggtc tgaaagcgaa aaaagcagag ggcacctctc ctggtatcga cgtgatcaat 1740

agcaccctga tcggtgcaac cgctttcatg actggtctgg cggtgccatc tgataaattt 1800

tgggttaatc tgaacccgtg ggagccagac cgcattatcg atgaacagct gtctcgtagc 1860

gatgttggcc gtattatgct ggaggcggac ctgcagatga aaaaggatac ctgcaattac 1920

gaaaacccat gtaccaacga agcaggcatg acgctgtcta acctgctgga cgaaaaacgc 1980

aacattctgg ttcgccagtg tatgaacaaa ttccctggtg aaatcgatga tgtgaacaac 2040

gtcgtttttc gcgctggtac ccgttattgg attgtgccgg actctgttta cgcgtactcc 2100

aacggtactc agatctacat catcaacgct accctggcaa ttcagagcga accggtacca 2160

gaccgtacct ctttccgtgt ggacaaccag gatgtcaaaa aactgtctaa aggttgcctg 2220

gaagaactga acaaatcctc caaggaatac ggcgaatact atgaagaaat gtctgaacaa 2280

atcattctgc cgtttgtggt tgcagatgtt aaccacggtg aaaaatatga agatctgcgt 2340

gaggtgtttg tggcgctggc gctggcgcag tggtacaaga gcaacatcaa cagccacaaa 2400

gatatctttc gtgattccct ggactcttcc gattctccgc tgaatgcaat tcgcccgtgg 2460

aatccgaacg aaatttggga aaactacgtg tactcctatg aaaacggcga atacgaatgt 2520

tacatgaaca ctactacgaa gactgcagaa ggtgcggaag cagtgaacat cttcatcaaa 2580

tctagcggtg gtgttgcatt ccacaacatc aacgacaaac tggttgtact ggaatctact 2640

ccgcctgaga tccaagaaac catctctcag gctattaccg atggtttcat cgataaaggc 2700

actgacgttt ttttcggtat tcgtatgcac ggtgaaatgg gtcgtgaaaa agcgactcct 2760

ggtagcgaca gcctgaagaa tgtcgaccgt cgtgatccga gcctggcaat cacttggatc 2820

aacaaaggca acaaactgaa cgaccagggt aaatatgatg acgcgattga agcatatgaa 2880

gaagcgattc gtctggaccc gtcttctagc gtggcgcgtt ctaacctggc tattacctgg 2940

aataacaaag gcaacaaact gaacgaccag ggcaaatacg acgacgctat cgaagcgtac 3000

gaagaggcga ttcgtctgga tccggaaaac cgtgttgctt ggcacaataa aggtaacgct 3060

ctgtcttctc agggcaagta tagcgaggca atccaggctt acgacgaagc catccgtctg 3120

gacccggaaa acccatgggc ctggtacgcg aaaggtgtca ctctgggtga acagggcatc 3180

cacaacgaag cactgctgtg cttcgaagaa gcgatccgtc tggatgcgga tttcgcttct 3240

gcctggaaca acaaaggtgt agcgctggaa tctctgggtc gtagcctgga agcggacgcc 3300

gcgtacttcc gtgctcgtga actgtct 3327

Claims (10)

1.一种制备壳寡糖的方法，其特征在于：采用SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶酶解壳聚糖或胶质甲壳素生产壳寡糖，酶解条件为：pH 4.0～8.0，温度50～80℃。

2.根据权利要求1所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：在温度70～80℃下酶解壳聚糖或胶质甲壳素。

3.根据权利要求1所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：在pH 4.0～6.0的条件下酶解壳聚糖或胶质甲壳素。

4.根据权利要求1所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：所述酶解的时间在12小时以上。

5.根据权利要求1所述的制备壳寡糖的方法，其特征在于：酶解时加入可溶性二价锰盐，所述可溶性二价锰盐的浓度为0.5～2.0 mM。

6.一种壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.编码权利要求6所述的壳聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.权利要求5所述的壳聚糖酶在降解壳聚糖或胶质甲壳素中的应用；权利要求5所述的壳聚糖酶在制备壳寡糖中的应用。

9.一种含有壳聚糖酶的酶制剂，其含有权利要求5所述的壳聚糖酶。

10.权利要求9所述的含有壳聚糖酶的酶制剂在降解壳聚糖或胶质甲壳素中的应用；权利要求9所述的含有壳聚糖酶的酶制剂在制备壳寡糖中的应用。

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