CN114317638B - 一种多酶协同表面活性剂循环酶解糖化木质纤维素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多酶协同表面活性剂循环酶解糖化木质纤维素的方法，主要通过预处理、二次预处理、预酶解以及酶解四个步骤糖化杨木，并简易回收酶解液进行循环酶解。本发明主要通过氢氧化钠对杨木进行预处理，利用漆酶对碱处理的杨木进行二次预处理。利用木聚糖酶以及表面活性剂对两步预处理的杨木进行预酶解。最后利用纤维素酶协同表面活性剂对预酶解的杨木进行酶解糖化。其中，对二次预处理后滤液中的漆酶、预酶解后的木聚糖酶以及酶解后的纤维素酶以及表面活性剂进行抽滤回收重复利用，以达到降低成本的目的。

Description

一种多酶协同表面活性剂循环酶解糖化木质纤维素的方法

技术领域

本发明涉及生物转化领域，尤其涉及一种分步预处理以及多酶协同表面活性剂循环酶解糖化杨木的方法。

背景技术：

木质纤维生物质大量存在于自然界，是地球上最丰富、最廉价，且符合可持续发展要求的可再生资源。然而，由于木质纤维素中包含的纤维素、半纤维素和木质素相互之间缠绕，形成致密的三维网状空间结构，酶解效率低。木质素形成非晶态、非线性且不均匀的立体聚合结构，半纤维素贯穿于纤维素和木质素之间，限制木质纤维素降解催化因子的可及性。因此，在木质纤维素的转化过程中，在酶解前必须进行预处理以破坏其致密结构，使酶更容易接触到底物。酸处理可使原料中80-90％的半纤维素溶解，但是木质素未能得到有效脱除。木质素的屏障作用，以及对纤维素酶有显著的无效吸附，造成纤维素酶用量高，后续的酶解糖化成本高等问题。因此，去除木质素，降低纤维素酶酶解抗性和提高纤维素酶利用率对可持续发展至关重要。

碱处理能引起纤维素溶胀，增加原料的比表面积降低原料聚合度和结晶度，提高纤维素和半纤维素的可降解性，降低酶水解过程中酶在木质素上的无效结合，提高转化率。但是碱处理只能去除部分木质素，而漆酶可以进一步去除木质素并且不产生抑制物，是一种绿色的去除木质素的方法。木聚糖酶是专一降解木聚糖的酶，木聚糖是半纤维素的主要成分包裹在纤维素的表面，去除木聚糖可提高纤维素酶对纤维素的可及性。在酶解过程中，酶在底物上的吸附与脱附是同时存在的，表面活性剂可以与酶竞争性地吸附到木质素上，减少木质素的无效吸附。

尽管添加表面活性剂和多种酶协同作用可以提高酶促水解产率，但是酶成本高的问题仍然未能解决。目前木质纤维素酶解糖化存在成本过高的问题，这主要是因为酶用量较高。因此，降低酶的使用量是推进纤维素乙醇工业化的关键。在木质纤维素的降解过程中，酶首先吸附到底物上，然后进行酶解，酶解完成后脱附，再重新吸附到新底物上，进行下一轮水解。表面活性剂的加入，使酶竞争性吸附到木质素上，减少木质素对酶的吸附，促进酶的脱附和循环利用。利用这一特性，在酶解反应结束后，将酶回收进行循环利用，可以降低酶用量和使用成本。

发明内容：

本发明的目的是提供一种多酶协同表面活性剂循环酶解糖化木质纤维素的方法。该方法酶解效率高，酶可以循环利用，成本低，具有很好的应用前景。

上述方法依次包括以下步骤：

(1)木材的碱处理：使用氢氧化钠对粉碎至80目干燥后的木屑混匀处理，之后水洗至中性后干燥；

(2)漆酶二次预处理：缓冲液重悬木屑，加入双氧水和漆酶二次处理，抽滤回收滤液，滤渣待用；

(3)木聚糖酶的预酶解：缓冲液重悬步骤(2)获得的滤渣，添加木聚糖酶和表面活性剂进行预酶解，抽滤回收滤液，滤渣待用；

(4)纤维素酶的酶解糖化：缓冲液重悬步骤(3)获得的滤渣，添加纤维素酶和表面活性剂酶解糖化，抽滤收集滤液，即为糖化产物。

所用的木屑清洗后使用粉碎机粉碎，过80目筛后将木屑放至于60℃烘箱中，烘至恒重；之后水洗碱处理后的木屑，洗至pH呈中性，60℃烘至绝干。；

所述的方法，步骤(1)所用的氢氧化钠浓度为1％～4％，优选：氢氧化钠是在115℃～125℃下进行处理，处理时间为60min～150min。

所述的方法，步骤(2)、(3)、(4)使用后的酶液过滤后循环利用，优选可重复利用5～8次。

所述的方法，步骤(2)所用的双氧水浓度为8％～20％，所用的漆酶用量为10U/g～100U/g木屑。

所述的方法，双氧水和漆酶是在37～60℃条件下进行预处理，处理时间为6～24h。

所述的方法，步骤(3)所用的木聚糖酶用量为10U/g～150U/g木屑，所用的表面活性剂为聚乙二醇和吐温-80中的一种或两种，用量为0.01g/g～0.1g/g木屑。

所述的方法，木聚糖酶和表面活性剂是在37℃～60℃条件下进行预酶解，处理时间为0.5～6h。

所述的方法，步骤(4)所用的纤维素酶用量为4U/g～60U/g木屑，所用的表面活性剂为聚乙二醇和吐温-80中的一种或两种，聚乙二醇用量为0.01g/g～0.1g/g木屑。

所述的方法，纤维素酶和表面活性剂是在37℃～60℃条件下进行酶解，处理时间为24～84h。

所述的方法，所用的缓冲液为乙酸乙酸钠缓冲液，其pH为4.8，木屑或者滤渣与缓冲液比例为1:5～1:20(g:mL)。

本发明所回收的滤液是使用真空泵进行抽滤，保存于-20℃，便于再次利用。

与现有技术相比，本发明具有如下优势：

(1)与单一预处理相比，两步预处理进一步去除了木质素，利用木聚糖酶进行预酶解，去除了部分半纤维素，增加了纤维素酶与纤维素的接触面积，添加表面活性剂，减少了木质素对纤维素酶的无效吸附，进一步提高了酶解效率。

(2)预处理以及酶解过程中的酶及表面活性剂可回收再利用，操作简单，降低了酶解成本。

具体实施方式：

以下实施例，可以帮助更好地理解本发明。此外，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：木材的预处理

(1)将杨木清洗后使用粉碎机粉碎，过80目筛后将木屑放至于60℃烘箱中，烘至恒重；

(2)取50g木屑，使用4％的氢氧化钠按料液比1:10(g:mL)进行充分混匀，并置于121℃条件下处理90min；

(3)使用纯水将杨木屑洗至中性，之后放至于60℃烘箱中，烘至恒重，待用。

实施例2：双氧水和漆酶的二次预处理

(1)将实施例1中处理的木屑，用乙酸乙酸钠缓冲液按料液比1:10(g:mL)进行充分混匀；

(2)加入50mL浓度为10％的双氧水以及50U/g木屑的漆酶，50℃预处理12h；

(3)对二次预处理的木屑使用真空泵抽滤，以得到滤液以及滤渣，其中滤液回收，冷藏保存，便于再次利用，滤渣待用。

实施例3：木聚糖酶和表面活性剂的预酶解

(1)将实施例2中得到的杨木滤渣用乙酸乙酸钠缓冲液按料液比1:10(g:mL)进行充分混匀；

(2)加入60U/g木屑的木聚糖酶及0.05g/g木屑的非离子表面活性剂吐温-80进行预酶解，预酶解2h；

(3)对预酶解的木屑使用真空泵抽滤，以得到滤液以及滤渣，其中滤液回收，冷藏保存，便于再次利用，滤渣待用。

实施例4：纤维素酶酶解糖化

(1)将实施例3中得到的杨木滤渣用乙酸乙酸钠缓冲液按料液比1:10(g:mL)进行充分混匀；

(2)加入20U/g木屑的纤维素酶及0.05g/g木屑的非离子表面活性剂聚乙二醇进行酶解糖化，酶解48h；

(3)对酶解的木屑使用真空泵抽滤，得到滤渣以及滤液，其中滤液回收，冷藏保存，便于再次利用，弃滤渣。

实施例5：木屑的酶解糖化效果比较

为考察本发明对杨木的酶解糖化效果，为此设计以下处理：

处理1：按实施例1、实施例2、实施例3和实施例4依次进行处理木屑，其中所用木屑为50g；

处理2：按实施例2、实施例3和实施例4依次进行处理木屑，其中木屑换为烘至恒重的未处理木屑50g；

处理3：按实施例1、实施例3和实施例4依次进行处理木屑，其中所用木屑为50g；

处理4：按实施例1、实施例2和实施例4依次进行处理木屑，其中所用木屑为50g；

处理5：按实施例3和实施例4依次进行处理杨木，其中滤渣换为烘至恒重的未处理木屑50g；

处理6：按实施例2和实施例4依次进行处理木屑，其中木屑换为烘至恒重的未处理木屑50g；

处理7：按实施例1和实施例4依次进行处理木屑，其中所用木屑为50g；

处理8：按实施例4直接进行处理杨木，其中滤渣换为烘至恒重的未处理木屑50g；

处理9：按实施例1、实施例2和实施例3依次进行处理木屑，其中所用木屑为50g；

处理10：按实施例1处理后，将双氧水与漆酶、木聚糖酶与表面活性剂以及纤维素酶分别按照实施例2、3和4的添加量同时加入处理木屑，其中所用木屑为50g。

使用DNS法测定处理1～10中最终滤液中还原糖的含量，结果如下表1所示：

表1

从表中数据可以看出，不进行纤维素酶解(处理9)以及不进行任何预处理(处理8)，最终产糖量是极低的，而进行四步处理的处理1，滤液中的还原糖含量是最高的，达到20.26mg/mL，即20.26％的还原糖得率(对底物)，优于一步或者两步处理方法，比次优(处理4)的还原糖得率16.49％增加了3.77％，十分具有优越性。

实施例6：酶的循环利用

处理1：按实施例1、实施例2、实施例3和实施例4依次进行处理杨木；

处理2：按实施例1、实施例2、实施例3和实施例4依次进行处理杨木2次，其中，实施例2、实施例3和实施例4的酶为前一次回收的滤液。

处理3：按实施例1、实施例2、实施例3和实施例4依次进行处理杨木5次，其中，实施例2、实施例3和实施例4的酶为前一次回收的滤液。

处理4：按实施例1、实施例2、实施例3和实施例4依次进行处理杨木8次，其中，实施例2、实施例3和实施例4的酶为前一次回收的滤液。

使用DNS法测定实施例4中最后一次处理的滤液中还原糖的含量，回收效率＝最终滤液还原糖含量/(处理1中还原糖含量×处理次数)。结果如下表2所示：

表2

从表中数据可以看出，酶重复利用1次(即处理2)最终回收效率能有89.66％，当重复利用4次后(即处理3)回收效率仍能达到一半以上，这表明酶回收十分具有意义，可以极大的节约成本。当重复利用7次后，回收效率低于50％，为48.6％，此时酶解效率偏低，不宜在继续重复利用，因此，本方法所设计的回收方法，在重复利用4～6次后仍能有很好的酶解效果，可以极大的降低成本。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种多酶协同表面活性剂循环酶解糖化木质纤维素的方法，其特征在于，依次包括以下步骤： (1)木材的碱处理：使用氢氧化钠对粉碎至80目干燥后的木屑混匀处理，之后水洗至中 性后干燥； (2)漆酶二次预处理：缓冲液重悬木屑，加入双氧水和漆酶二次处理，抽滤回收滤液，滤 渣待用； (3)木聚糖酶的预酶解：缓冲液重悬步骤(2)获得的滤渣，添加木聚糖酶和表面活性剂 进行预酶解，抽滤回收滤液，滤渣待用； (4)纤维素酶的酶解糖化：缓冲液重悬步骤(3)获得的滤渣，添加纤维素酶和表面活性 剂酶解糖化，抽滤收集滤液，即为糖化产物；步骤(2)、(3)、(4)使用后的酶液过滤后循环利用4-6次；

步骤(1)所用的氢氧化钠浓度为1％～4％， 氢氧化钠是在115℃～125℃下进行处理，处理时间为60min～150min；

步骤(2)所用的双氧水浓度为8％～20％，所用的漆酶用量为10U/g～100U/g木屑；

双氧水和漆酶是在37～60℃条件下进行预处理，处理时间为6～24h；

步骤(3)所用的木聚糖酶用量为10U/g～ 150U/g木屑，所用的表面活性剂为聚乙二醇和吐温-80中的一种或两种，用量为0.01g/g～ 0.1g/g木屑；

木聚糖酶和表面活性剂是在37℃～60℃条件下进行预酶解，处理时间为0.5～6h；

步骤(4)所用的纤维素酶用量为4U/g～60U/g木屑，所用的表面活性剂为聚乙二醇和吐温-80中的一种或两种，用量为0.01g/g～0.1g/g木屑；

纤维素酶和表面活性剂是在37℃～60℃条件下进行酶解，处理时间为24～84h；

所用的缓冲液为乙酸乙酸钠缓冲液，其pH为4.8，木屑或者滤渣与缓冲液比例为1:5～1:20g:mL。