CN114317625B - 借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法 - Google Patents
借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114317625B CN114317625B CN202011056971.XA CN202011056971A CN114317625B CN 114317625 B CN114317625 B CN 114317625B CN 202011056971 A CN202011056971 A CN 202011056971A CN 114317625 B CN114317625 B CN 114317625B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- oil
- candida rugosa
- rugosa lipase
- unsaturated fatty
- recombinant candida
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000222175 Diutina rugosa Species 0.000 title claims abstract description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 title claims description 31
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims description 31
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 title claims description 31
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 title claims description 31
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 68
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims abstract description 45
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 36
- 235000019476 oil-water mixture Nutrition 0.000 claims abstract description 30
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims abstract description 23
- 239000004519 grease Substances 0.000 claims abstract description 22
- 101710084373 Lipase 1 Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 14
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 43
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims description 16
- 239000003760 tallow Substances 0.000 claims description 15
- 235000019482 Palm oil Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000002540 palm oil Substances 0.000 claims description 14
- 239000003925 fat Substances 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 8
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 claims description 5
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000010495 camellia oil Substances 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 239000003346 palm kernel oil Substances 0.000 claims description 4
- 235000019865 palm kernel oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 claims description 4
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 claims description 4
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 claims description 4
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 claims description 3
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 claims description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 41
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 6
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 5
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 5
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 5
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091007045 Cullin Ring E3 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 102000036364 Cullin Ring E3 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 3
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 3
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 3
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000010516 ayurvedic herbal oil Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000010773 plant oil Substances 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 101000822667 Mus musculus Something about silencing protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 102000036366 SCF complex Human genes 0.000 description 1
- 108091007047 SCF complex Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000012209 assay specification Methods 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 101150077696 lip-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000020238 sunflower seed Nutrition 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019871 vegetable fat Nutrition 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Fats And Perfumes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
生产顺式不饱和脂肪酸的方法包含以下操作。(i)提供油水混合液，其中油水混合液包含1～10重量份的油脂以及1重量份的水。(ii)添加0.002～0.5重量份的重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(rCRL1)于油水混合液中。(iii)乳化油水混合液。(iv)使乳化后的油水混合液进行水解反应，以产生脂肪酸。(v)于55℃至65℃的温度下进行油水分离并提取油相层。(vi)对油相层进行降温过滤步骤，以获得顺式不饱和脂肪酸。
Description
技术领域
本揭露是有关于一种借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法。
背景技术
一般工业上从天然油脂制造食用油，或是从水解天然油脂生产脂肪酸，这些过程通常都会经过高温高压处理(温度210～265oC，压力2～7MPa)，进而导致天然油脂中的顺式不饱和脂肪酸转变成反式不饱和脂肪酸，以至于产品中皆含有大量的反式不饱和脂肪酸。经研究显示，相较于反式不饱和脂肪酸，顺式不饱和脂肪酸较不易引起人体的心血管疾病。使用酵素低温水解可避免反式不饱和脂肪酸的产生，保留天然油脂中的营养成分，并有节省设备费用及能源等优点。
皱褶假丝酵母菌脂肪酶(Candida rugosa lipase，CRL)是一种用途极为广泛的商业化脂肪酶，但目前此酵素在水解油脂生产脂肪酸的应用实例方面，多以混合型同功酶酵素(CRL1～5)、固定化酵素或是添加有机溶剂帮助油脂溶解后再进行油脂水解反应。因为不同的同功酶会有不同的催化性质，因此经常会有酵素质量不稳定的问题。另外，使用的酵素型态多为固定化，且酵素反应条件常添加有机溶剂帮助油脂溶解，因此会有价格昂贵、生产制程复杂、以及不符合环保等缺点。目前已知CRL1为所有同功酶中水解效率最佳的脂肪酶。
发明内容
有鉴于此，本发明使用的脂肪酶为单一型态的重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(rCRL1)进行低温水解反应，使用单一型态的酵素具有质量稳定的优势。因先前研究(JAgric Food Chem.2006Feb 8；54(3):815-22.)并未量产且实际应用在油脂水解，本发明则针对此酵素进行发酵量产且直接使用发酵液进行水解反应，进一步降低生产成本。
本发明提供一种借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法。此方法包括以下操作：(i)提供油水混合液，其中油水混合液包含1～10重量份的油脂以及1重量份的水；(ii)添加0.002～0.5重量份的重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(rCRL1)于油水混合液中；(iii)在操作(ii)之后，乳化油水混合液(iv)在操作(iii)之后，使乳化后的油水混合液进行水解反应，以产生脂肪酸；(v)在操作(iv)之后，于55℃至65℃的温度下进行油水分离并提取油相层；以及(vi)在操作(v)之后，对油相层进行降温过滤步骤，以获得顺式不饱和脂肪酸。
在某些实施方式中，油脂包含天然木本植物性油脂、天然草本植物油、天然动物性油脂及其组合。
在某些实施方式中，天然木本植物油包含棕榈油、棕榈仁油、橄榄油及山茶油。
在某些实施方式中，天然草本植物油包含大豆油、油菜籽油、花生油、芝麻油及葵花籽油。
在某些实施方式中，天然动物性油脂包含牛脂、猪脂及鱼油。
在某些实施方式中，乳化和水解反应是在25℃～40℃的温度下进行。
在某些实施方式中，乳化持续约1～6小时。
在某些实施方式中，水解反应持续约10～40小时。
在某些实施方式中，上述降温过滤步骤为多次连续降温过滤步骤，其包含第一次降温过滤步骤、第二次降温过滤步骤、第三次降温过滤步骤、第四次降温过滤步骤。第一次降温温度由55℃～65℃降至45℃～48℃。第二次降温温度由45℃～48℃降至34℃～37℃。第三次降温温度由34℃～37℃降至23℃～27℃。第四次降温温度由23℃～27℃降至16℃～19℃。
在某些实施方式中，其中所述降温过滤步骤为单次降温过滤步骤，且降温温度由55℃～65℃降至16℃～19℃。
附图说明
本发明内容上述和其他态样、特征及其他优点参照说明书内容并配合附加图式得到更清楚的了解，其中：
图1绘示根据本发明某些实施方式的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法的流程图。
图2绘示根据本发明某些实施方式的水解粗棕榈油在不同温度下进行乳化及水解反应后的水解率关系图。
图3绘示根据本发明某些实施方式的水解牛脂在不同温度下以油水比2:1的条件进行乳化及水解反应的水解率关系图。
图4绘示根据本发明某些实施方式的水解牛脂在不同温度下以油水比1:1的条件进行乳化及水解反应的水解率关系图。
图5绘示根据本发明某些实施方式的水解牛脂在30℃及不同油水比例下进行乳化及水解反应的水解率关系图。
图6绘示根据本发明某些实施方式的水解粗大豆油在不同的脂肪酶浓度下进行乳化及水解反应的水解率关系图。
图7绘示根据本发明某些实施方式的粗棕榈油水解物经过滤后的滤液及滤饼的脂肪酸含量。
图8绘示根据本发明某些实施方式的粗棕榈油水解物经过滤后的滤液中的不饱和脂肪酸及饱和脂肪酸的含量。
具体实施方式
为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。以下所揭露的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。
当以“约”、“大致”或类似用语来描述数值或数值范围时，此用语涵盖包括所述数值在内的合理范围内的数值，例如，在所述数值的±10％或本领域技术人员所理解的其他数值范围之内。举例而言，术语“约5μm”涵盖从4.5μm至5.5μm的尺寸范围。
如本文所使用，“脂肪酶”(lipase，亦称为甘油酯水解酶)为一种羧基酯水解酶类。脂肪酶能够将脂肪(三酸甘油酯)于自然情况下水解成甘油及脂肪酸。
“皱褶假丝酵母菌脂肪酶”(Candida rugose lipase，CRL)是指皱褶假丝酵母菌脂肪酶同功酶，其包含天然的皱褶假丝酵母菌脂肪酶或其变体(下文也称作重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶)，举例来说，重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶至少有五种多样性脂肪酶的产生，而且这五种脂肪酶胺基酸序列具有高度的相似性，但却有不同的基质专一性。“同功酶”是指性质不同但催化反应相同的酶，其可以以不同的量出现在一种生物的不同组织或器官中，彼等的差异可以是在蛋白质的一级结构上，也可以是在四级结构或转译后修饰上，其存在可被细胞用来根据细胞内特定的生理状况而对酶活性进行调节。
本发明提供一种借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法。图1绘示根据本发明某些实施方式的生产顺式不饱和脂肪酸的方法10的流程图。如图1所示，生产顺式不饱和脂肪酸的方法10至少包括操作110、操作120、操作130、操作140、操作150及操作160。
在操作110中，提供油水混合液。具体的说，油水混合液包含1～10重量份的油脂以及1重量份的水。在多个实施例中，上述油脂包含天然木本植物性油脂、天然草本植物油、天然动物性油脂及其组合。在一些实例中，天然木本植物油包含棕榈油(palm oil)、棕榈仁油(palm kernel oil)、橄榄油(olive oil)及山茶油(camellia oil)等。在一些实例中，天然草本植物油包含大豆油(soybean oil)、油菜籽油(rape-seed oil)、花生油(groundnutoil)、芝麻油(sesame oil)和葵花籽油(sunflower-seed oil)等。在一些实例中，天然动物性油脂包含牛脂(beef tallow)、猪脂(lard)和鱼油等。于本实施例中，油品的选择较佳为天然木本植物性油脂、天然草本植物油以及天然动物性油脂。
在某些实施例中，油水混合液可以包含1重量份的油脂以及1重量份的水。在某些实施例中，油水混合液可以包含2重量份的油脂以及1重量份的水。在某些实施例中，油水混合液可以包含3重量份的油脂以及1重量份的水。在某些实施例中，油水混合液可以包含4重量份的油脂以及1重量份的水。在某些实施例中，油水混合液可以包含5重量份的油脂以及1重量份的水。在某些实施例中，油水混合液可以包含6重量份的油脂以及1重量份的水。在某些实施例中，油水混合液可以包含7重量份的油脂以及1重量份的水。在某些实施例中，油水混合液可以包含8重量份的油脂以及1重量份的水。在某些实施例中，油水混合液可以包含9重量份的油脂以及1重量份的水。在某些实施例中，油水混合液可以包含10重量份的油脂以及1重量份的水。
在操作120中，添加0.002～0.5重量份的重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(rCRL1)于上述的油水混合液中。在某些实施例中，可添加0.003重量份的脂肪酶、0.005重量份的脂肪酶、0.007重量份的脂肪酶、0.009重量份的脂肪酶、0.01重量份的脂肪酶、0.03重量份的脂肪酶、0.05重量份的脂肪酶、0.07重量份的脂肪酶、0.09重量份的脂肪酶、0.1重量份的脂肪酶、0.15重量份的脂肪酶、0.2重量份的脂肪酶、0.25重量份的脂肪酶、0.3重量份的脂肪酶、0.35重量份的脂肪酶、0.4重量份的脂肪酶或0.45重量份的脂肪酶于上述的油水混合液中。
本揭露所使用的重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1为rCRL1。具体有关于rCRL1的胺基酸序列及其性质亦可参酌文献“Codon optimization of Candida rugosa lip1gene forimproving expression in Pichia pastoris and biochemical characterization ofthe purified recombinant LIP1 lipase”(J Agric Food Chem.2006Feb8；54(3):815-22.)。更详细的说，重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(rCRL1)为酵母菌发酵培养液，未浓缩的发酵培养液酵素活性为1600U/ml。举例来说，是使用聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)为基质乳化的橄榄油进行活性分析。其中，单位1U对应在37℃下每分钟释放1μmol脂肪酸的酵素量(或酶量)。
在操作130中，于操作120之后，乳化油水混合液。在多个实施例中，可以借由搅拌的方式使油水混合液乳化。举例来说，搅拌的转速可以为约250rpm～500rpm，例如可为300rpm。在多个实施例中，上述乳化是在25℃～40℃的温度下进行。在多个实例中，可以在27℃、29℃、30℃、31℃、33℃、35℃、37℃或39℃下进行乳化。
在操作140中，于操作130之后，使乳化后的油水混合液进行水解反应，以产生脂肪酸。在多个实施例中，上述水解反应是在25℃～40℃的温度下进行。在多个实例中，可以在27℃、29℃、30℃、31℃、33℃、35℃、37℃或39℃下进行水解反应。在某些实施例中，上述水解反应持续约10～40小时，例如，可为12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时或40小时。此水解反应时间可视油水混合液的量而定。在某些实施例中，在操作130后，只需将乳化后的油水混合液静置即可，无须再搅拌，如此，可以具有较高的水解反应速率。
在操作150中，于操作140之后，于55℃～65℃的温度下油水分离并提取油相层。具体的说，可在55℃～65℃的温度下对所述脂肪酸进行油水分离，并提取油相层。在多个实例中，可以在约57℃、约59℃、约60℃、约61℃或约63℃的温度下进行油水分离。
在操作160中，于操作150之后，对油相层进行降温过滤步骤。在多个实例中，操作160可以为对油相层进行多次连续降温过滤步骤，其包含四次连续的降温过滤步骤。举例来说，第一次降温过滤步骤的温度是由约55℃～65℃降至约48℃～45℃，第二次降温过滤步骤的温度是由约48℃～45℃降至约34℃～37℃，第三次降温过滤步骤的温度是由约34℃～37℃降至约27℃～23℃，且第四次降温过滤步骤的温度是由约27℃～23℃降至约19℃～16℃。
在另一实施例中，操作160可以为对油相层进行单次降温过滤步骤，且降温温度由55℃～65℃降至19℃～16℃。
本发明的生产顺式不饱和脂肪酸的方法是利用单一型CRL同功酶(亦即rCRL1)来水解油脂，在不添加有机溶剂的油水乳化两相***中乳化后，静置抑或搅拌，水相中的rCRL1可持续水解油脂，并获得游离脂肪酸。另外，水解后油相经过缓慢降温过滤后，滤液中的顺式不饱和脂肪酸含量可达约75％以上。此外，由于静置及过滤的操作温度均未超过100℃，因此，滤液中的顺式不饱和脂肪酸并不会转变成反式不饱和脂肪酸，进而保留了大部分原存在于油品中质量稳定的顺式脂肪酸。
以下的实施例用以详述本发明的特定态样，并使本发明所属技术领域中具有本领域技术人员得以实施本发明。然而，以下的实施例不应用以限制本发明。以下，将列举多个比较例与实施例以验证本发明的功效。
如下文所使用，“酸价(AV)”的测定是采用中国台湾的标准(CNS)总号3647，类号N6082的食用油脂检验法-酸价的测定的规范而测得。“皂化价(SV)”的测定是采用中国台湾的标准(CNS)总号3468，类号N6083的食用油脂检验法-皂化价的测定的规范而测得。“碘价(IV)”的测定是采用中国台湾的标准(CNS)总号15060，类号K61136的生质柴油(脂肪酸甲酯)-碘价测定法的规范而测得。
实验例1:水解粗棕榈油(Crude palm oil)
在本实验例中，使用油水比例相同的粗棕榈油与水混合的油水混合液，并使溶于水的rCRL1的浓度不变的条件下，分别在不同的温度(30℃及37℃)下搅拌乳化并进行水解反应2-4小时。接着，当样品产生固化脂肪酸结晶后静置，并定时取样分析其油层中的酸价(acid value，AV)及水解率(Hydrolysis,％)。结果如下表一所示。
表一
由上表一可知，在实施例1的油相层中所测得的AV为约193.6且水解率为约97.2％；而在实施例2的油相层中所测得的AV为约196.8且水解率为约98.8％。这意味着，实施例2的水解率较实施例1的水解率更高。在此须说明的是，水解率是根据油相层中的AV除以皂化价(SV)的计算而得。
2绘示根据本发明某些实施方式的水解粗棕榈油在不同温度下进行乳化及水解反应的水解率关系图。请参照图2，将实施例1及实施例2的结果整合于图2，以便于比较在不同反应条件下的水解率。
实验例2:水解牛脂
在本实验例中，使用不同油水比例的牛脂与水混合的油水混合液，并使溶于水的rCRL1的浓度不变的条件下，分别在不同的温度(30℃及37℃)下搅拌乳化并进行水解反应。此反应初期即产生固化脂肪酸结晶后静置，并定时取样分析其油层中的AV及水解率，其结果如下表二所示。
表二
由上表二可知，由于牛脂是属于高熔点油脂，因此，在水解后产生的高熔点游离脂肪酸，可于较低温度下立即产生固化脂肪酸结晶，进而有利于水解反应持续进行。在油水比为2:1的实施例中，实施例4(水解反应温度为约30℃)的水解率更优于实施例3(水解反应温度为约37℃)。在油水比为1:1的实施例中，实施例6(水解反应温度为约30℃)的水解率更优于实施例5(水解反应温度为约37℃)。
相较于实施例4，于水解反应时间40小时左右，在实施例6的油相层中所测得的AV可达189.2，且水解率为约95.6％。这意味着，当油水混合液中的油水比例由2:1变成1:1时，可以显著地提升水解率与反应速率。
再根据文献Hydrolysis of Animal Fats By Lipase at Temperature BelowThere Melting Points(Biotechnology Letters,1992Aug.14；(8):683-688)指出，使用商业化混合型皱褶假丝酵母菌脂肪酶(Meito Sangyo)水解牛脂，油水比例为1:1，酵素用量180U/g牛脂，于30℃水解24小时可达到93.7％的水解率，此结果与实施例6相似，而实施例6的rCRL1酵素用量为80U/g牛脂，比商业化酵素用量少，具有降低酵素成本的优点。
图3绘示根据本发明某些实施方式的牛脂在不同温度下以油水比2:1的条件进行乳化及水解反应的水解率关系图。图4绘示根据本发明某些实施方式的牛脂在不同温度下以油水比1:1的条件进行乳化及水解反应的水解率关系图。请同时参照图3及图3，将实施例3至实施例6的结果整合于图3及图4，以便于比较在不同反应条件下的水解率。
图5绘示根据本发明某些实施方式的水解牛脂在30℃及不同油水比例下进行乳化及水解反应的水解率关系图。将实施例4及实施例6的结果整合于图5，以便于比较在不同油水比的反应条件下的水解率关系。
实验例3:水解粗大豆油
在本实验例中，使用200公克的粗大豆油混合100公克的水，并添加不同含量的rCRL1(6公克以及12公克)，并于37℃下持续搅拌乳化并进行水解反应。接着，定时取样分析其油层中的AV及水解率，其结果如下表三所示。
表三
由上表三可知，在固定油水比例的情况下，rCRL1的浓度增加会加快反应速率，相反地，会使水解效率略为降低。
图6绘示根据本发明某些实施方式的水解粗大豆油在不同的脂肪酶浓度下进行乳化水解反应的水解率关系图。将实施例7及实施例8的结果整合于图6，以便于比较在不同rCRL1浓度的反应条件下的水解率。
实验例4:从粗棕榈油水解物中分离饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸
图7绘示根据本发明某些实施方式的粗棕榈油水解物经过滤后的滤液及滤饼的脂肪酸组成。图8绘示根据本发明某些实施方式的粗棕榈油水解物经过滤后的滤液中的不饱和脂肪酸及饱和脂肪酸的含量。请同时参照图7及图8，将以下两个分离实验例的结果整合于图7及图8，以便于比较在不同分离操作下的碘价值及游离脂肪酸的含量。
在分离实验例中，将前述以水解完成的实施例2于温度约60℃下静置后，分离油层及水层，取约430g的油层于约45℃进行真空过滤(Vacuum filtration)。须说明的是，本实验例的过滤时间为约30分钟至1小时，但不以此为限，过滤时间是依样品而异。所得滤液经降温而结晶后再次进行真空过滤，直至温度降至约17℃为止。每一次过滤的滤液及滤饼皆会取样分析其碘价(IV)。可以理解的是，当检测所得的碘价值越高代表不饱和脂肪酸的含量越多。如图7所示，每次过滤的滤液中IV由62.8逐步提升至96.2。相对地，滤饼中的IV则由22.9提升至49.5。如图8所示，最终所得滤液中含有约88.6％的不饱和脂肪酸以及约10.0％的饱和脂肪酸。由于分离过程的操作温度均未超过100℃，因此，最终所得滤液主要含有顺式不饱和脂肪酸。
在另一分离实验例中，将前述以水解完成的实施例2于温度约60℃下静置后，分离油层及水层，取约200g的油层进行缓慢降温结晶后，再于18℃进行真空过滤。举例来说，上述的缓慢降温是由60℃经30分钟降温至45℃，经30分钟降温至35℃，经30分钟降温至25℃，再经120分钟降温至18℃后再进行真空过滤。接着，取样分析滤液及滤饼的IV。如图7所示，最终所得滤液中的IV为94.6，而滤饼中的IV则为30.3。如图8所示，最终所得滤液中含有约84.7％的不饱和脂肪酸以及约13.7％的饱和脂肪酸。由于分离过程的操作温度均未超过100℃，因此，最终所得滤液主要含有顺式不饱和脂肪酸。
虽然本发明的实施方式及实验例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当权利要求书所界定者为准。
【符号说明】
10:方法
110:操作
120:操作
130:操作
140:操作
150:操作
160:操作。
Claims (10)
1.一种借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candida rugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，包含以下操作：
(i)提供油水混合液，其中该油水混合液包含1～10重量份的油脂以及1重量份的水；
(ii)添加0.002～0.5重量份的重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(rCRL1)于该油水混合液中；
(iii)在操作(ii)之后，乳化该油水混合液，其中该乳化在不添加有机溶剂的油水乳化两相***中进行；
(iv)在操作(iii)之后，使乳化后的该油水混合液进行水解反应，以产生脂肪酸；
(v)在操作(iv)之后，于55℃至65℃的温度下进行油水分离并提取油相层；以及
(vi)在操作(v)之后，对该油相层进行降温过滤步骤，以获得该顺式不饱和脂肪酸。
2.如权利要求1所述的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candidarugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，其中所述油脂包含天然木本植物性油脂、天然草本植物油、天然动物性油脂及其组合。
3.如权利要求2所述的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candidarugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，其中该天然木本植物性油脂包含棕榈油、棕榈仁油、橄榄油及山茶油。
4.如权利要求2所述的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candidarugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，其中该天然草本植物油包含大豆油、油菜籽油、花生油、芝麻油及葵花籽油。
5.如权利要求2所述的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candidarugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，其中该天然动物性油脂包含牛脂、猪脂及鱼油。
6.如权利要求1所述的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candidarugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，其中该乳化和该水解反应是在25℃～40℃的温度下进行。
7.如权利要求1所述的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candidarugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，其中该乳化持续1～6小时。
8.如权利要求1所述的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candidarugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，其中该水解反应持续10～40小时。
9.如权利要求1所述的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candidarugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，其中所述降温过滤步骤为多次连续降温过滤步骤，包含:
第一次降温过滤步骤，其中第一次降温温度由55℃～65℃降至45℃～48℃；
第二次降温过滤步骤，其中第二次降温温度由45℃～48℃降至34℃～37℃；
第三次降温过滤步骤，其中第三次降温温度由34℃～37℃降至23℃～27℃；以及
第四次降温过滤步骤，其中第四次降温温度由23℃～27℃降至16℃～19℃。
10.如权利要求1所述的借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶1(recombinant Candidarugosa lipase 1，rCRL1)生产顺式不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，其中所述降温过滤步骤为单次降温过滤步骤，且降温温度由55℃～65℃降至16℃～19℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011056971.XA CN114317625B (zh) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | 借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011056971.XA CN114317625B (zh) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | 借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114317625A CN114317625A (zh) | 2022-04-12 |
| CN114317625B true CN114317625B (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=81010592
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011056971.XA Active CN114317625B (zh) | 2020-09-30 | 2020-09-30 | 借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114317625B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1131697A (zh) * | 1994-11-28 | 1996-09-25 | 雀巢制品公司 | 水解多不饱和脂肪酸甘油三酯的方法 |
| TWI233450B (en) * | 2001-08-31 | 2005-06-01 | Academia Sinica | Recombinant Candida rugosa lipases |
| CN102959083A (zh) * | 2010-05-28 | 2013-03-06 | 日本水产株式会社 | 利用脂肪酶的含高度不饱和脂肪酸的油脂的制造方法 |
| TWI542694B (zh) * | 2015-11-17 | 2016-07-21 | 國立臺灣師範大學 | 藉由重組脂肪酶生產生質柴油的方法 |
| TWI757901B (zh) * | 2020-09-30 | 2022-03-11 | 承德油脂股份有限公司 | 藉由重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶生產順式不飽和脂肪酸的方法 |
-
2020
- 2020-09-30 CN CN202011056971.XA patent/CN114317625B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1131697A (zh) * | 1994-11-28 | 1996-09-25 | 雀巢制品公司 | 水解多不饱和脂肪酸甘油三酯的方法 |
| TWI233450B (en) * | 2001-08-31 | 2005-06-01 | Academia Sinica | Recombinant Candida rugosa lipases |
| CN102959083A (zh) * | 2010-05-28 | 2013-03-06 | 日本水产株式会社 | 利用脂肪酶的含高度不饱和脂肪酸的油脂的制造方法 |
| TWI542694B (zh) * | 2015-11-17 | 2016-07-21 | 國立臺灣師範大學 | 藉由重組脂肪酶生產生質柴油的方法 |
| TWI757901B (zh) * | 2020-09-30 | 2022-03-11 | 承德油脂股份有限公司 | 藉由重組皺褶假絲酵母菌脂肪酶生產順式不飽和脂肪酸的方法 |
| US11685939B2 (en) * | 2020-09-30 | 2023-06-27 | Chant Oil Co., Ltd. | Method for producing cis-unsaturated fatty acid by recombinant Candida rugosa lipase 1 (rCRL1) |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Codon Optimization of Candida rugosa lip1 Gene for lmprovingExpression in Pichia pastoris and Biochemical Characterization of the PurifiedRecombinant LIP1 Lipase;Shu Wei Chang等;Journal of Agricultural and Food Chemistry;第54卷(第3期);第820页右栏最后一段至第821页左栏第1段 * |
| Hydrolysis of Animall Fats by Lipase at TemperaturesBelow Their Melting Points;DE RENOBALES, M.等;Biotechnology Letters;第14卷(第8期);683-688 * |
| Recombinant lipase from Candida rugosa for regioselective hydrolysis of peracetylated nucleosides. A comparison with commercial non-recombinant lipases;Teodora Bavaro等;Biocatalysis and Biotransformation;第28卷(第2期);108-116 * |
| 假丝酵母（Candida sp.）99-125胞外脂肪酶的基因克隆、重组表达以及N-糖基化对脂肪酶功能影响的研究;于明锐;中国优秀博士学位论文全文数据库基础科学辑;第2015卷(第3期);1-165 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114317625A (zh) | 2022-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6261812B1 (en) | Process for producing diglycerides | |
| RU2392263C2 (ru) | Способы получения сложных алкиловых эфиров | |
| Coteron et al. | Reactions of olive oil and glycerol over immobilized lipases | |
| Abdelmoez et al. | Utilization of oleochemical industry residues as substrates for lipase production for enzymatic sunflower oil hydrolysis | |
| JPH0439995B2 (zh) | ||
| CN101818179A (zh) | 一种制备富含多不饱和脂肪酸的磷脂酰丝氨酸的方法 | |
| CN106460018A (zh) | 采用碱处理进行脂肪酸烷基酯生产 | |
| US11685939B2 (en) | Method for producing cis-unsaturated fatty acid by recombinant Candida rugosa lipase 1 (rCRL1) | |
| CN114317625B (zh) | 借由重组皱褶假丝酵母菌脂肪酶生产顺式不饱和脂肪酸的方法 | |
| WO1991006661A1 (en) | Lipase-catalyzed in situ generation of mono- and di-glycerides | |
| JP3847445B2 (ja) | ジグリセリドの製造法 | |
| JPH0730352B2 (ja) | 酵素による油脂の精製法 | |
| KR102411079B1 (ko) | 미세조류 오일을 이용한 바이오 디젤 및 지방산의 제조방법 | |
| CN111892992A (zh) | 一种化学催化制备甘油二酯的方法 | |
| JP2006288404A (ja) | ジグリセリドの製造法 | |
| CN116445558B (zh) | 一种甘油二酯油的制备方法 | |
| US9296977B2 (en) | Method for producing fatty acid composition | |
| CN116042736B (zh) | 一种甘油二酯的酶法生产方法 | |
| CN115650943B (zh) | 一种从植物脱臭馏出物中富集多不饱和脂肪酸酯、角鲨烯、天然维生素e及植物甾醇的方法 | |
| JPH0665310B2 (ja) | ジグリセリドの製造法 | |
| EP1509613A1 (de) | Verfahren zur herstellung von konjugierter linolsäure | |
| US20210324432A1 (en) | Method of producing docosahexaenoic acid containing glyceride using a lipase hydrolysis reaction | |
| JP3853181B2 (ja) | ステリルエステルの分離方法 | |
| JPH01187089A (ja) | パルミトレイン酸及びそのグリセライドの製造方法 | |
| TW200411042A (en) | A method for producing a fatty acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |