CN114317527A - 用于从样本中提取核酸的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于从样本中提取核酸的方法，包括以下步骤：(a)使裂解组合物、样本以及固相载体混合，以使所述固相载体结合从所述样本中释放的核酸，得到经结合的固相载体；(b)清洗所述经结合的固相载体，以得到经清洗的固相载体；和(c)对所述经清洗的固相载体进行洗脱，以释放核酸；其中，所述方法中不使用有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。本公开的方法可有效避免使用有机溶剂、缩短提取时间并降低成本。

Description

用于从样本中提取核酸的方法和试剂盒

技术领域

本公开涉及核酸提取技术领域，更具体涉及用于从样本中提取核酸的方法和试剂盒。

背景技术

核酸提取是分子生物学常用的技术，是从复杂样本得到高纯度核酸的过程。核酸提取的通常流程包括1.细胞裂解，即将核酸从细胞或其他生物体(比如病毒)中释放出来；2.核酸分离和纯化。核酸分离和纯化的方法常用的包括：抽提与沉淀法、柱提取和磁珠法提取。抽提与沉淀法指的是采用有机溶剂(如酚氯仿，Tizol)反复抽提，离心后分层，核酸位于上层水相，而变性的蛋白大多在中间层，下层有机相含有脂类等杂质。小心吸取水相后，加入乙醇沉淀核酸，70％乙醇清洗后可得到较纯的核酸，加入TE或无核酸酶水溶解即得到核酸。柱提取法利用的是硅胶膜在高盐低pH时选择性吸附核酸，而在低盐高pH时释放核酸的特征进行核酸分离，而杂质的清洗需要用到含乙醇的漂洗液。磁珠法提取是利用磁珠作为固相载体吸附核酸，通常结合过程会使用异丙醇或则聚乙二醇，而清洗磁珠杂质需要用到高比例的乙醇(常用70％-80％)。

然而，核酸提取现有的技术，无论是上述哪种方法，都需要使用到有机溶剂，如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇等。然而，有机溶剂大多有毒性或者运输储存受限，这对日常实验人员带来风险和不便。并且，核酸清洗使用有机溶剂后需要时间挥发以免影响核酸纯度，这个等待挥发的时间通常需要5分钟，这个时间看起来不长，但在大量样本需要处理时(比如新冠检测每天需要提取大量样本)也会浪费时间。

因此，非常需要开发一种新的用于从样本中提取核酸的方法，以避免使用有机溶剂、缩短提取时间并降低成本。

发明内容

通过核酸提取方法中组分、试剂使用浓度和体积、反应体系、反应程序、操作流程的优化，可以解决上述问题。

根据本公开的第一方面，其提供用于裂解样本的组合物，其包含：

离液盐；

去垢剂；

缓冲液；和

水；

其中，所述离液盐在所述组合物中的浓度为接近其饱和浓度，例如为4M-7M；

所述去垢剂在所述组合物中的浓度为0.1％-10％(v/v)，优选0.5％-8％，更优选1％-5％；

所述缓冲液在所述组合物中的浓度为10mM-100mM；并且

其中所述组合物不包含有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。

在一种实施方案中，所述离液盐选自下组中的至少一种：盐酸胍、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍盐、盐酸胍和尿素。

在一种实施方案中，所述离液盐为4M盐酸胍和3M异硫氰酸胍；或

所述离液盐为4M盐酸胍和5M异硫氰酸胍盐；或

所述离液盐为7M盐酸胍；或

所述离液盐为4M-5M盐酸胍和5M-6M尿素；或

所述离液盐为3M-4M异硫氰酸胍和5M-6M尿素；或

所述离液盐为5M异硫氰酸胍。

在一种实施方案中，所述去垢剂选自下组中的至少一种：吐温-20、NP40和TritonX-100，优选吐温-20。

在一种实施方案中，所述缓冲液选自下组中的至少一种：三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液和苯磺酸缓冲液，优选三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

根据本公开的第二方面，其提供用于提取样本中核酸的试剂盒，其包含：

根据上述第一方面所述的组合物；

清洗液；

洗脱液；和

固相载体；并且

其中，所述试剂盒不包含有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。

在一种实施方案中，所述清洗液的pH小于7，优选为4-6，更优选为4-5；和/或所述洗脱液的pH大于8，优选为8-9，更优选为9。

在一种实施方案中，所述清洗液和/或所述洗脱液由选自下组的至少一种物质配制得到：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸、醋酸和苯磺酸。

在一种实施方案中，所述清洗液是pH为4-5的由三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制得到的缓冲液或pH为6的柠檬酸钠缓冲液；和/或所述洗脱液是pH为9的三羟甲基氨基甲烷。

在一种实施方案中，所述固相载体为磁珠。

根据本公开的第三方面，其提供用于从样本中提取核酸的方法，包括以下步骤：

(a)使根据上述第一方面所述的组合物、样本以及固相载体混合，以使所述固相载体结合从所述样本中释放的核酸，得到经结合的固相载体；

(b)清洗所述经结合的固相载体，以得到经清洗的固相载体；和

(c)对所述经清洗的固相载体进行洗脱，以释放核酸；

其中，所述方法中不使用有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。

在一种实施方案中，所述步骤(a)包括：

(a1)将根据上述第一方面所述的组合物添加到样本中；和

(a2)向上述步骤(a1)获得的混合物中添加固相载体，然后在5-40℃下，优选室温下，充分混匀至少1分钟，优选1-10分钟，更优选5分钟，然后使所述固相载体与液体分离，以获得所述经结合的固相载体。

在一种实施方案中，所述步骤(b)包括：

(b1)向所述经结合的固相载体中添加清洗液进行清洗；和

(b2)使所述经历清洗的固相载体与液体分离，以获得所述经清洗的固相载体。

在一种实施方案中，所述清洗液的pH小于7，优选为4-6，更优选为4-5。

在一种实施方案中，所述清洗液由选自下组的至少一种物质配制得到：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸、醋酸和苯磺酸，优选地所述清洗液是pH为4-5的由三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制得到的缓冲液或pH为6的柠檬酸钠缓冲液。

在一种实施方案中，所述步骤(c)包括：

(c1)向所述经清洗的固相载体中添加洗脱液进行洗脱；和

(c2)使所述经历洗脱的固相载体与液体分离，以获得上清液，即核酸。

在一种实施方案中，所述洗脱液的pH大于8，优选为8-9，更优选为9。

在一种实施方案中，所述洗脱液由选自下组的至少一种物质配制得到：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠、硼酸钠；优选地，所述洗脱液是pH为9的三羟甲基氨基甲烷。

在一种实施方案中，所述固相载体为磁珠。

在一种实施方案中，在根据第一方面所述的组合物、根据第二方面所述的试剂盒或根据第三方面所述的方法中，所述样本选自细胞；组织；细菌；或液体，诸如环境水样、血清、脑脊液、肺泡灌洗液、培养液。

应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本公开的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本公开的范围。本公开的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。

具体实施方式

下面将更详细地描述本公开的实施例。然而应当理解的是，本公开可以通过各种形式来实现，而且不应该被解释为限于这里阐述的实施例，相反提供这些实施例是为了更加透彻和完整地理解本公开。应当理解的是，本公开的实施例仅用于示例性作用，并非用于限制本公开的保护范围。

除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。

当量、浓度、或其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

此外，本文中要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨在限定单数形式。

进一步地，在以下说明书中将提及大量的表述，这些表述被定义为具有下列含义。

浓度单位“M”是指mol/L或摩尔/升。

浓度单位“mM”是指mmol/L或毫摩尔/升。

浓度单位“(v/v)”是指(体积/体积)。

如前文所描述，现有技术中缺乏新的用于从样本中提取核酸的方法，以避免使用有机溶剂、缩短提取时间并降低成本。

用于裂解样本的组合物

为了至少部分地解决上述问题以及其他潜在问题中的一个或者多个，本公开的第一示例实施方案提出了用于裂解样本的组合物，其包含：

离液盐；

去垢剂；

缓冲液；和

水；

其中，所述离液盐在所述组合物中的浓度为接近其饱和浓度，例如为4M-7M；

所述去垢剂在所述组合物中的浓度为0.1％-10％(v/v)，优选0.5％-8％，更优选1％-5％；

所述缓冲液在所述组合物中的浓度为10mM-100mM；并且

其中所述组合物不包含有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。

关于样本，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，例如所述样本可选自细胞；组织；细菌；或液体，诸如环境水样、血清、脑脊液、肺泡灌洗液、培养液，优选为细胞培养收集物、脑脊液或肺泡灌洗液。

关于离液盐，其在所述组合物中的浓度为接近其饱和浓度，例如为4M-7M，具体可以采用4M、5M、6M、7M或这些数值之间的任何数值。关于“接近其饱和浓度”是指浓度为其饱和浓度的至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％。关于离液盐的种类，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，例如选自下组中的至少一种：盐酸胍、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍盐、盐酸胍和尿素。优选地，离液盐可以为4M盐酸胍和3M异硫氰酸胍；或所述离液盐为4M盐酸胍和5M异硫氰酸胍盐；或所述离液盐为7M盐酸胍；或所述离液盐为4M-5M盐酸胍和5M-6M尿素；或所述离液盐为3M-4M异硫氰酸胍和5M-6M尿素；或所述离液盐为5M异硫氰酸胍。

关于去垢剂，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些。例如，选自下组中的至少一种：吐温-20、NP40和Triton X-100，优选吐温-20。

关于所述去垢剂的浓度，其可以相对于所述组合物为0.1-10％(v/v)，例如可以具体采用0.1％(v/v)、0.2％(v/v)、0.3％(v/v)、0.4％(v/v)、0.5％(v/v)、0.6％(v/v)、0.7％(v/v)、0.8％(v/v)、0.9％(v/v)、1.0％(v/v)、1.1％(v/v)、1.2％(v/v)、1.3％(v/v)、1.4％(v/v)、1.5％(v/v)、1.6％(v/v)、1.7％(v/v)、1.8％(v/v)、1.9％(v/v)、2.0％(v/v)、2.1％(v/v)、2.2％(v/v)、2.3％(v/v)、2.4％(v/v)、2.5％(v/v)、2.6％(v/v)、2.7％(v/v)、2.8％(v/v)、2.9％(v/v)、3.0％(v/v)、3.1％(v/v)、3.2％(v/v)、3.3％(v/v)、3.4％(v/v)、3.5％(v/v)、3.6％(v/v)、3.7％(v/v)、3.8％(v/v)、3.9％(v/v)、4.0％(v/v)、4.1％(v/v)、4.2％(v/v)、4.3％(v/v)、4.4％(v/v)、4.5％(v/v)、4.6％(v/v)、4.7％(v/v)、4.8％(v/v)、4.9％(v/v)、5.0％(v/v)、5.1％(v/v)、5.2％(v/v)、5.3％(v/v)、5.4％(v/v)、5.5％(v/v)、5.6％(v/v)、5.7％(v/v)、5.8％(v/v)、5.9％(v/v)、6.0％(v/v)、6.1％(v/v)、6.2％(v/v)、6.3％(v/v)、6.4％(v/v)、6.5％(v/v)、6.6％(v/v)、6.7％(v/v)、6.8％(v/v)、6.9％(v/v)、7.0％(v/v)、7.1％(v/v)、7.2％(v/v)、7.3％(v/v)、7.4％(v/v)、7.5％(v/v)、7.6％(v/v)、7.7％(v/v)、7.8％(v/v)、7.9％(v/v)、8.0％(v/v)、8.1％(v/v)、8.2％(v/v)、8.3％(v/v)、8.4％(v/v)、8.5％(v/v)、8.6％(v/v)、8.7％(v/v)、8.8％(v/v)、8.9％(v/v)、9.0％(v/v)、9.1％(v/v)、9.2％(v/v)、9.3％(v/v)、9.4％(v/v)、9.5％(v/v)、9.6％(v/v)、9.7％(v/v)、9.8％(v/v)、9.9％(v/v)、10.0％(v/v)或这些数值之间的任何数值。

关于缓冲液，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些。例如，选自下组中的至少一种：三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液和苯磺酸缓冲液，优选三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

关于所述缓冲液的浓度，其可以相对于所述组合物为10mM-100mM，例如可以具体采用10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、31mM、32mM、33mM、34mM、35mM、36mM、37mM、38mM、39mM、40mM、41mM、42mM、43mM、44mM、45mM、46mM、47mM、48mM、49mM、50mM、51mM、52mM、53mM、54mM、55mM、56mM、57mM、58mM、59mM、60mM、61mM、62mM、63mM、64mM、65mM、66mM、67mM、68mM、69mM、70mM、71mM、72mM、73mM、74mM、75mM、76mM、77mM、78mM、79mM、80mM、81mM、82mM、83mM、84mM、85mM、86mM、87mM、88mM、89mM、90mM、91mM、92mM、93mM、94mM、95mM、96mM、97mM、98mM、99mM、100mM、或这些数值之间的任何数值，优选为50mM。

用于提取样本中核酸的试剂盒

本公开的第二示例实施方案还提出了用于提取样本中核酸的试剂盒，其包含：

根据上述第一示例实施方案所述的组合物；

清洗液；

洗脱液；和

固相载体；并且

其中，所述试剂盒不包含有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。

关于样本，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，例如所述样本可选自细胞；组织；细菌；或液体，诸如环境水样、血清、脑脊液、肺泡灌洗液、培养液，优选为细胞培养收集物、脑脊液或肺泡灌洗液。

关于清洗液和洗脱液，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，例如由选自下组的至少一种物质配制得到：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸、醋酸和苯磺酸。但优选地，所述清洗液的pH小于7，优选为4-6，更优选为4-5；和/或所述洗脱液的pH大于8，优选为8-9，更优选为9。进一步优选地，所述清洗液是pH为4-5的由三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制得到的缓冲液或pH为6的柠檬酸钠缓冲液；和/或所述洗脱液是pH为9的三羟甲基氨基甲烷。

关于固相载体，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，例如二氧化硅基质、玻璃颗粒、硅藻土、磁珠、硝化纤维素、尼龙和阴离子交换材料。固相载体可以是疏松颗粒、过滤器、膜、纤维或织物或格栅的形式。但优选地，所述固相载体是磁珠。

用于从样本中提取核酸的方法

本公开的第三示例实施方案还提出了用于从样本中提取核酸的方法，包括以下步骤：

(a)使根据本公开的第一示例实施方案所述的组合物、样本以及固相载体混合，以使所述固相载体结合从所述样本中释放的核酸，得到经结合的固相载体；

(b)清洗所述经结合的固相载体，以得到经清洗的固相载体；和

(c)对所述经清洗的固相载体进行洗脱，以释放核酸；

其中，所述方法中不使用有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。

关于样本，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，例如所述样本可选自细胞；组织；细菌；或液体，诸如环境水样、血清、脑脊液、肺泡灌洗液、培养液，优选为细胞培养收集物、脑脊液或肺泡灌洗液。

关于固相载体，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些，例如二氧化硅基质、玻璃颗粒、硅藻土、磁珠、硝化纤维素、尼龙和阴离子交换材料。固相载体可以是疏松颗粒、过滤器、膜、纤维或织物或格栅的形式。但优选地，所述固相载体是磁珠。

关于上述步骤(a)，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些方法。但为了取得更好的效果，步骤(a)优选包括：

(a1)将根据本公开的第一示例实施方案所述的组合物添加到样本中；和

(a2)向上述步骤(a1)获得的混合物中添加固相载体，优选磁珠，然后在5-40℃下，优选室温下，充分混匀(例如通过颠倒)至少1分钟，优选1-10分钟，更优选5分钟，然后使所述固相载体与液体分离，以获得所述经结合的固相载体。

关于步骤(a2)中的温度可以具体采用5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃。

关于步骤(a2)中的充分混匀时间，可以具体采用1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。

当固相载体为磁珠时，关于使所述磁珠与液体分离的方式，可以采用磁铁(磁力架)吸住磁珠，然后去掉澄清液体。

关于上述步骤(b)，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些方法。但为了取得更好的效果，步骤(b)优选包括：

(b1)向所述经结合的固相载体(优选磁珠)中添加清洗液进行清洗；和

(b2)使所述经历清洗的固相载体(优选磁珠)与液体分离，以获得所述经清洗的固相载体。

关于清洗液的pH，其优选小于7，更优选为4-6，最优选为4-5。关于清洗液的类型，其可以由选自下组的至少一种物质配制得到：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸、醋酸和苯磺酸，优选地所述清洗液是pH为4-5的由三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制得到的缓冲液或pH为6的柠檬酸钠缓冲液。

当固相载体为磁珠时，关于使所述经历清洗的磁珠与液体分离的方式，可以采用磁铁(磁力架)吸住磁珠，然后去掉澄清液体。

关于上述步骤(c)，并无特别限制，可以采用本领域常规采用的那些方法。但为了取得更好的效果，步骤(c)优选包括：

(c1)向所述经清洗的固相载体(优选磁珠)中添加洗脱液进行洗脱；和

(c2)使所述经历洗脱的固相载体(优选磁珠)与液体分离，以获得上清液，即核酸。

关于洗脱液的pH，其优选大于8，更优选为8-9，最优选为9。关于洗脱液的类型，其可以由选自下组的至少一种物质配制得到：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸、醋酸和苯磺酸，优选地，所述洗脱液是pH为9的三羟甲基氨基甲烷。

当固相载体为磁珠时，关于使所述经历洗脱的磁珠与液体分离的方式，可以采用磁铁(磁力架)吸住磁珠，转移上清液体得到核酸。

优选实施例

下面进一步对本公开的优选实施例进行详细描述，以下的描述为示例性的，并非对本公开的限制，任何的其他类似情形也都落入本公开的保护范围之中。

材料和设备

实施下述实施例1-4所采用的材料和设备如下：

异硫氰酸胍，购自上海生工有限公司(A610244)；

盐酸胍，购自上海生工有限公司(A100287)；

三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(1M Tris-HCl)，购自北京索莱宝科技有限公司(T1160)；Triton X-100，购自北京索莱宝科技有限公司(T8200)；

冰醋酸/乙酸，购自上海生工有限公司(A501931)；

蛋白酶K，购自北京索莱宝科技有限公司(P1121).

实施例1.灭活单纯疱疹病毒II型(HSV2)核酸提取

样本为细胞培养收集物，掺入1000拷贝的灭活的单纯疱疹病毒II型(HSV2)。分别用本公开的方法(无需有机溶剂)与商业化试剂盒(需要有机溶剂)提取并检测。

本公开的方法：加入裂解液(其组成为：5M异硫氰酸胍、50mM三羟甲基氨基甲烷、1％Triton X-100，制备方法为：取1M Tris-HCl 1ml加无核酶水19ml稀释20倍得到50mMTris-HCl，称取5.9g(5M*10ml*分子量118.16g/mole)异硫氰酸胍，加入Triton X-100 100μl(1％v/v)，加入50mM Tris-HCl溶解定容至10ml得到裂解液)充分混匀裂解细胞和病毒；加入20微升二氧化硅羧基磁珠(苏州海狸生物医学工程有限公司)，室温颠倒充分混匀5分钟；用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体；加入清洗液10mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液(pH＝5)清洗，再次用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体。重复该清洗步骤1次。加洗脱液10mM三羟甲基氨基甲烷(pH＝9.0)。56度加热混匀5分钟，再用磁铁(磁力架)吸住磁珠，转移上清液体得到核酸。

商业化试剂盒(Promega MagaZorb提取试剂盒)为对比方法，洗脱液使用试剂盒带的，洗脱体积与本公开方法相同。

分别取5微升洗脱液进行探针法qPCR检测HSV2提取的CT值如下：

	样本1	样本2
			本公开方法-重复1	34.06	33.23
本公开方法-重复2	34.25	33.56
			商业试剂盒-重复1	34.28	33.69
商业试剂盒-重复2	33.93	33.59

从结果看出，本公开的方法无需使用有机溶剂能实现与商品化试剂盒近似的效果。

实施例2.灭活柯萨奇病毒A16提取核酸

样本为2例阴性脑脊液，分别掺入1000拷贝的灭活的柯萨奇病毒A16。分别用三个方法比较核酸提取效果。

方法1：加入用5倍体积的裂解液(其组成为：4M盐酸胍、3M异硫氰酸胍、50mM三羟甲基氨基甲烷、2％吐温-20，制备方法为：取1M Tris-HCl 1ml加无核酶水19ml稀释20倍得到50mM Tris-HCl；称取3.82g(4M*10ml*分子量95.53g/mole)盐酸胍和3.54g(3M*10ml*分子量118.16g/mole)异硫氰酸胍，加入吐温-20 200μl(2％v/v)，加入50mM Tris-HCl溶解定容至10ml得到裂解液)；加入20微升磁珠(友康生物科技有限公司)，室温颠倒充分混匀5分钟；用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体；加入清洗液10mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液(pH＝4.3)清洗，再次用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体。重复该清洗步骤1次。加洗脱液10mM三羟甲基氨基甲烷(pH＝9.0)。56度加热混匀5分钟，再用磁铁(磁力架)吸住磁珠，转移上清液体得到核酸。

方法2：加入2倍体积的裂解液(其组成为：4M盐酸胍、3M异硫氰酸胍、50mM三羟甲基氨基甲烷、2％吐温-20，制备方法为：取1M Tris-HCl 1ml加无核酶水19ml稀释20倍得到50mM Tris-HCl；称取3.82g(4M*10ml*分子量95.53g/mole)盐酸胍和3.54g(3M*10ml*分子量118.16g/mole)异硫氰酸胍，加入吐温-20 200μl(2％v/v)，加入50mM Tris-HCl溶解定容至10ml得到裂解液)，再加入20微升蛋白酶K，混匀处理56度5分钟。加入20微升磁珠(友康生物科技有限公司)，室温颠倒充分混匀5分钟；用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体；加入清洗液10mM三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲液(pH＝4.3)清洗，再次用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体。重复该清洗步骤1次。加洗脱液10mM三羟甲基氨基甲烷(pH＝9.0)。56度加热混匀5分钟，再用磁铁(磁力架)吸住磁珠，转移上清液体得到核酸。

方法3：使用Promega公司商业化的病毒提取试剂盒(需要使用异丙醇和乙醇)。

上述三个方法得到的核酸用荧光定量PCR检测柯萨奇病毒A16的核酸含量，以下为CT值：

从CT值可以看出本公开无需用有机溶剂的方法1和方法2都可以成功提取含量很低的柯萨奇病毒A16的核酸；而方法1的效果更好一些。方法3是需要用到异丙醇以及乙醇的商业化试剂盒，这款试剂盒算是行业内认为效果非常好的试剂盒了，而本公开不使用有机溶剂的方法1能达到近似的效果。

以上实验过程，每种方法做了两个样本两个重复，即每种方法提取4个；三种方法分别统计的操作总时间为：

	提取4个所用时间
		方法1	15分钟
方法2	25分钟
		方法3	45分钟

本公开的方法1裂解液使用了极高浓度(几乎饱和)的胍盐，因此裂解时间所需很短；另外由于清洗液中不需要使用乙醇，因此清洗完成后不需要5分钟的晾干时间，即可直接进行后续的洗脱过程。所以时间上，本公开的方法都比商业化试剂盒需要的时间短。

实施例3.使用自动化提取仪进行核酸提取的程序

大部分自动化提取仪都是使用深孔板，将试剂加入深孔板固定孔位，编写程序控制磁棒在不同孔位移动即可完成核酸提取。

按以下方式在深刻板内加入对应物料：

放入内容	样本、裂解液	磁珠	清洗液	清洗液	洗脱液
						孔位	1	2	3	4	5

以下是13分钟内实现快速核酸提取的程序：

若自动化提取仪的磁棒磁力能更强、移动快速更快的话，整个流程可能再缩短2分钟。

实施例4.同时提取病毒、细菌核酸的效果

样本单纯疱疹病毒1型(HSV1)和肺炎链球菌混合感染的肺泡灌洗液样本，用本公开建立的方法(无有机溶剂)以及商业化提取试剂盒(需要使用异丙醇和乙醇)同时进行核酸提取，再用qPCR检测提取效果。本公开无有机溶剂的方法：加入用5倍体积的裂解液(7M盐酸胍、50mM三羟甲基氨基甲烷、1％NP-40)；加入20微升磁颗粒(北京全式金生物技术有限公司)，室温颠倒充分混匀5分钟；用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体；加入清洗液(柠檬酸钠缓冲液，pH＝6.0)清洗，再次用磁铁(磁力架)吸住磁珠，去掉澄清液体。重复该清洗步骤。加洗脱液10mM三羟甲基氨基甲烷(pH＝9.0)。50度加热混匀5分钟，再用磁铁(磁力架)吸住磁珠，转移上清液体得到核酸。

用本公开建立的方法(无有机溶剂)以及商业化提取试剂盒(需要使用异丙醇和乙醇)同时进行核酸提取，再用qPCR检测提取效果；其CT值如下：

可以看出本公开无有机溶剂的方法同时提取病毒和细菌的阳性样本，其效果与需要使用有机溶剂的商业化试剂盒相当。

综上，本公开的用于从样本中提取核酸的方法，兼具避免使用有机溶剂、缩短提取时间并降低成本的技术优势，取得了明显的有益效果。

前述的示例仅是说明性的，用于解释本公开的特征的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求并不被说明本申请的特征的示例的选择限制。如在权利要求中使用的，术语“包括”和其语意上的变体在逻辑上也包括不同和变化的用语，例如但不限于“基本组成为”或“组成为”。当需要时，提供了一些数值范围，而这些范围也包括了在其之间的子范围。这些范围中的变化也对于本领域技术人员也是自明的，且不应被认为被捐献给公众，而这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的权利要求覆盖。而且在科技上的进步将形成由于语言表达的不准确的原因而未被目前考虑的可能的等同物或子替换，且这些变化也应在可能的情况下被解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (20)

1.用于裂解样本的组合物，其包含：

离液盐；

去垢剂；

缓冲液；和

水；

其中，所述离液盐在所述组合物中的浓度为接近其饱和浓度，例如为4M-7M；

所述去垢剂在所述组合物中的浓度为0.1％-10％(v/v)，优选0.5％-8％，更优选1％-5％；

所述缓冲液在所述组合物中的浓度为10mM-100mM；并且

其中所述组合物不包含有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述离液盐选自下组中的至少一种：盐酸胍、异硫氰酸胍、异硫氰酸胍盐、盐酸胍和尿素。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述离液盐为4M盐酸胍和3M异硫氰酸胍；或

所述离液盐为4M盐酸胍和5M异硫氰酸胍盐；或

所述离液盐为7M盐酸胍；或

所述离液盐为4M-5M盐酸胍和5M-6M尿素；或

所述离液盐为3M-4M异硫氰酸胍和5M-6M尿素；或

所述离液盐为5M异硫氰酸胍。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述去垢剂选自下组中的至少一种：吐温-20、NP40和Triton X-100，优选吐温-20。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述缓冲液选自下组中的至少一种：三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液和苯磺酸缓冲液，优选三羟甲基氨基甲烷缓冲液。

6.用于提取样本中核酸的试剂盒，其包含：

根据权利要求1-5中任一项所述的组合物；

清洗液；

洗脱液；和

固相载体；并且

其中，所述试剂盒不包含有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述清洗液的pH小于7，优选为4-6，更优选为4-5；和/或所述洗脱液的pH大于8，优选为8-9，更优选为9。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述清洗液和/或所述洗脱液由选自下组的至少一种物质配制得到：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸、醋酸和苯磺酸。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中所述清洗液是pH为4-5的由三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制得到的缓冲液或pH为6的柠檬酸钠缓冲液；和/或所述洗脱液是pH为9的三羟甲基氨基甲烷。

10.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述固相载体为磁珠。

11.用于从样本中提取核酸的方法，包括以下步骤：

(a)使根据权利要求1-5中任一项所述的组合物、样本以及固相载体混合，以使所述固相载体结合从所述样本中释放的核酸，得到经结合的固相载体；

(b)清洗所述经结合的固相载体，以得到经清洗的固相载体；和

(c)对所述经清洗的固相载体进行洗脱，以释放核酸；

其中，所述方法中不使用有机溶剂，诸如苯酚、氯仿、异丙醇、乙醇、聚乙二醇。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述步骤(a)包括：

(a1)将根据权利要求1-5中任一项所述的组合物添加到样本中；和

(a2)向上述步骤(a1)获得的混合物中添加固相载体，然后在5-40℃下，优选室温下，充分混匀至少1分钟，优选1-10分钟，更优选5分钟，然后使所述固相载体与液体分离，以获得所述经结合的固相载体。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述步骤(b)包括：

(b1)向所述经结合的固相载体中添加清洗液进行清洗；和

(b2)使所述经历清洗的固相载体与液体分离，以获得所述经清洗的固相载体。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述清洗液的pH小于7，优选为4-6，更优选为4-5。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述清洗液由选自下组的至少一种物质配制得到：三羟甲基氨基甲烷、柠檬酸钠、柠檬酸、磷酸、醋酸和苯磺酸，优选地所述清洗液是pH为4-5的由三羟甲基氨基甲烷和醋酸配制得到的缓冲液或pH为6的柠檬酸钠缓冲液。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述步骤(c)包括：

(c1)向所述经清洗的固相载体中添加洗脱液进行洗脱；和

(c2)使所述经历洗脱的固相载体与液体分离，以获得上清液，即核酸。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述洗脱液的pH大于8，优选为8-9，更优选为9。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述洗脱液由选自下组的至少一种物质配制得到：三羟甲基氨基甲烷、氢氧化钠、磷酸氢二钠、硼酸钠；优选地，所述洗脱液是pH为9的三羟甲基氨基甲烷。

19.根据权利要求11所述的方法，其中所述固相载体为磁珠。

20.根据权利要求1所述的组合物、根据权利要求6所述的试剂盒或根据权利要求11所述的方法，其中所述样本选自细胞；组织；细菌；或液体，诸如环境水样、血清、脑脊液、肺泡灌洗液、培养液。