CN114317363A - 链霉菌及其在促进香蕉植株生长及抑制香蕉枯萎病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了链霉菌及其在促进香蕉植株生长及抑制香蕉枯萎病中的应用，链霉菌为分离自茶树叶片的内生链霉菌，其来源于大自然，对环境友好；其能有效的促进植株生长，提高植株抗性；对Foc TR4侵染香蕉引起的香蕉枯萎病防治效果显著；本方案利用链霉菌开发出杀菌制剂用于防治尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病，另外，链霉菌XY006分离于植物的内生环境，植物内生细菌因其独特的生态位，在为植物提供所需营养和激素、促进植物生长和增强植物抗性上发挥着多种生物学作用，其能够产生植物生长素IAA，具有溶磷和ACC脱氨酶活性，对香蕉苗表现出显著促生作用；使用链霉菌XY006防控香蕉枯萎病相较于传统防控方法更绿色、高效、安全，在高效生物菌肥的应用上有良好前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及链霉菌及其在促进香蕉植株生长及抑制香蕉枯萎病中的应用。
背景技术
枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种土传维管束病害，能危害多种作物，造成巨大的经济损失。尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)侵染香蕉根部导致香蕉枯萎病，也叫巴拿马枯萎病，是制约香蕉产业发展的重要病害之一，尤以FocTR4生理小种危害最为严重。尖孢镰刀菌在极低的剂量即可侵染，且其厚垣孢子或菌丝能长期潜伏于土壤或宿主体内却不显示病症，因此防控起来非常困难。传统的防治香蕉枯萎病的方法如选育抗病品种、农药灌根等，虽然见效快，但存在成本高、周期长、对环境不友好等弊端。相较之下，生物防治的优势就显而易见，但登记在册的生防菌剂有限且防治效果差异大。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种实施可靠、对环境友好且能够用于促进香蕉植株生长和抑制香蕉枯萎病的链霉菌及其在促进香蕉植株生长及抑制香蕉枯萎病中的应用。
为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：
一种链霉菌XY006，其被命名为链霉菌Streptomyces sp.，已于2021年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24090。
基于上述的链霉菌方案，本发明还提供一种链霉菌XY006发酵液，其由权利要求1所述的链霉菌XY006在MS培养基上划板活化后，于28～32℃环境下培养2～4天；然后挑取单菌落于MYG培养基，并在28～32℃和190～210rpm的条件下培养1～3天，然后按0.8％～1.2％量转接到MS培养基进行培养，使其在28～32℃、190～210rpm条件下培养6～8天，制得链霉菌XY006发酵液。
作为一种优选的实施方案，优选的，所述链霉菌XY006发酵液由链霉菌XY006在MS培养基上划板活化后，于30℃环境下培养3天；然后挑取单菌落于MYG培养基，并在30℃和200rpm的条件下培养2天，然后按1.0％量转接到MS培养基进行培养，使其在30℃、200rpm条件下培养7天，制得链霉菌XY006发酵液。
基于上述发酵液方案，本发明提供该链霉菌XY006发酵液在促进香蕉植株生长中的应用。
具体的，所述应用方法为：以7～10天为一次浇灌频率对香蕉苗进行浇灌，每次每株香蕉苗浇灌10ml链霉菌XY006发酵液。
基于上述发酵液方案，本发明提供该链霉菌XY006发酵液在抑制香蕉枯萎病中的应用。
具体的，所述应用方法为：以7～10天为一次浇灌频率对染有枯萎病的香蕉苗进行浇灌，每次每株香蕉苗浇灌15ml链霉菌XY006发酵液。
与此同时，本发明还提供一种杀菌剂，其包括上述所述的链霉菌XY006发酵液。
采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方案链霉菌为分离自茶树叶片的内生链霉菌(Streptomyces sp.XY006)，其来源于大自然，对环境友好；其能有效的促进植株生长，提高植株抗性；对Foc TR4侵染香蕉引起的香蕉枯萎病防治效果显著；在链霉菌菌株的基础上，本方案利用链霉菌开发出杀菌制剂用于防治尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病，这是目前未见大规模商品化应用的。另外，链霉菌XY006分离于植物的内生环境，应当知晓的是，植物内生细菌因其独特的生态位，在为植物提供所需营养和激素、参与植物防御、促进植物生长和增强植物抗性上发挥着多种生物学作用。因此，本方案链霉菌XY006能够产生植物生长素IAA，且具有溶磷和ACC脱氨酶活性，对香蕉苗表现出显著的促生作用；发明人通过在盆栽实验中对香蕉枯萎病的防效达到82.37％。且使用链霉菌XY006防控香蕉枯萎病相较于传统的防控方法绿色、高效、安全、成本低，在高效生物菌肥的开发应用上具有良好的前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明基于茶树内生放线菌16S rRNA序列构建的有根***进化树；
图2是本发明Streptomyces sp.XY006菌落形态示意图；
图3是本发明链霉菌XY006促进香蕉生长的植株形态示意图；
图4是本发明链霉菌XY006促进香蕉生长的相关指标表征图；
图5是本发明链霉菌XY006产植物激素IAA活性分析的IAA浓度标准曲线图；
图6是本发明链霉菌XY006溶磷能力活性的Ca-P固体平板测定表征图；
图7是本发明链霉菌XY006解氨能力固体平板测试表征图；
图8是本发明Foc TR4侵染香蕉苗外部症状示意图；
图9是本发明Foc TR4侵染香蕉苗后叶部症状统计示意图；
图10是本发明Foc TR4侵染香蕉苗球茎症状的示意图；
图11是本发明Foc TR4侵染香蕉苗后发病指数统计示意图；
图12是本发明Foc TR4侵染香蕉苗后发病率和病情指数统计示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明作进一步的详细描述。特别指出的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不对本发明的范围进行限定。同样的，以下实施例仅为本发明的部分实施例而非全部实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
链霉菌的分离和鉴定
1.1、菌株来源
福建农林大学茶园中铁观音茶树的叶片
1.2、分离方法
1.2.1样品的清洗与表面消毒
将采集的茶树样品在自来水下冲洗干净，再超声清洗一次，室温晾干。表面消毒过程为：70％乙醇3min，5％～8％次氯酸钠溶液4～5min，2.5％无菌硫代硫酸钠溶液10min，70％乙醇1min，无菌水漂洗5次。吸取100μL最后一次漂洗的无菌水，涂布于NB固体培养基，30℃培养观察，确保表面消毒可行且无表面微生物污染。
1.2.2样品研磨与均一化
样品表面消毒结束在超净台干燥后，转移至无菌的研钵，分次加入10mL0.9％氯化钠溶液研磨至浆状。样品梯度稀释(10-1、10-2和10-3)，吸取100μL这三个梯度的稀释液涂布分离培养基SGN、TWYE、TWYEPE、HVA、CPA、XAA和SAA上，30℃培养观察。
1.2.3分离纯化与保存
挑选具有放线菌特征(干燥、不透明、难以挑取、表面有孢子覆盖，表现粉末状或颗粒状)的菌落，在ISP4培养基上划线，长出的菌落在ISP2培养基上多次划线纯化，直至获得单菌落。
1.3、菌株鉴定
将分离所得的菌株经16S rRNA序列比对，结合图1所示茶树内生放线菌16S rRNA序列构建的有根***进化树和图2所示的菌落形态示意图，其被鉴定为Streptomyces sp.；将其命名为链霉菌XY006，已于2021年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24090。
如下用链霉菌XY006发酵液浇灌香蕉苗，通过一系列生长指标监测，产植物激素以及解氨、解磷能力评估，研究其在促进香蕉苗生长中的应用。
实施例2
2.1链霉菌XY006对香蕉的促生作用
链霉菌XY006发酵液的制备：链霉菌XY006在MS培养基上划板活化，于30℃培养三天；挑取单菌落于MYG(3mL)培养基，30℃、200rpm培养两天，按1％量转接到MS培养基大体积培养，30℃、200rpm培养七天，得链霉菌XY006发酵液。
实验设两组，每组三个重复，每个重复5株苗，如图3所示，CK组的苗整个培养期均浇灌纯水，T组的苗整个培养期每7～10天浇灌一次XY006发酵液，每株苗浇灌10mL发酵液。从图3A图可以看出，CK组香蕉苗叶片整体偏黄，呈现黄绿色，底部枯萎叶较多，T组香蕉苗叶色呈现深绿色，几乎没有明显枯萎的叶片。T组香蕉苗长势明显优于CK组。图3B图展示了两组香蕉苗单株形态，T组香蕉苗明显大于CK组，且根系发达，主根与侧根茂盛，而CK组根系稀疏。如图3C图所示，T组香蕉苗根明显多于CK组。
从图4可以看出，T组的叶绿素含量、含氮量和根重与CK组差异极显著(p<0.0001)，T组球茎的直径与CK组差异显著(p<0.001)，T组的根长、地上部分干重这两个指标与CK组也差异明显(p<0.01和p<0.05)。
因此，经过XY006处理的香蕉苗在根、茎和叶的长势上都明显优于CK，说明XY006对香蕉的生长具有明显的促进作用。
2.2链霉菌XY006产植物激素IAA活性分析
植物激素是植物体内合成，调控组织、细胞生长发育及响应外源胁迫的内源因子，在防卫反应中发挥重要作用。植物激素IAA对营养器官的纵向生长有明显的促进作用。参考Gordon等的方法测定IAA产量，利用分光光度计测定混合液在530nm的吸收值，根据标准曲线(如图5)计算链霉菌XY006产植物激素IAA的量。可知链霉菌XY006产IAA的量为12.7±0.5μg/mL。
2.3链霉菌XY006溶磷活性分析
磷是微生物生长的必需元素之一，土壤中绝大多数的磷与金属离子结合而降低了其利用率，而施用的磷肥，因土壤吸附，利用率也不高；具有解磷能力的微生物能够利用这些结合态的磷，促进磷的释放，不仅改善了土壤的营养组成，而且也间接促进了磷肥的利用，促进苗的生长。如图6所示，链霉菌XY006在不含游离态磷的培养基上能够正常生长，说明其具有溶磷的能力。
2.4链霉菌XY006的ACC脱氨酶活性分析
在植物体内不存在ACC解氨酶，病虫害胁迫会导致杨氏循环中乙烯的积累，促进营养器官老化、衰败；细菌体内存在的ACC解氨酶能分解乙烯的前体物质ACC，减缓或者抑制乙烯的积累而达到促进植物生长的作用。如图7所示，实验设三组，A组为阴性对照，不含氮源；B组为阳性对照，氮源为硫酸胺；C组为处理组，所用的氮源为ACC，所用培养基为DF基本培养基。处理组与阴性对照和阳性对照对比后发现，链霉菌XY006在以ACC为唯一氮源的平板上和在阳性对照平板上的长势明显优于阴性对照。以上结果说明链霉菌XY006能够分解平板中的ACC，证明XY006是具有解氨能力的。
如下将链霉菌XY006的发酵液施用于受到Foc TR4侵染的香蕉苗，通过发病率、叶部症状、球茎症状、病情指数及生防效果各指标评估XY006对香蕉枯萎病的生防效果。
实施例3
3.1 Foc TR4侵染香蕉苗外部症状
实验设三组，每组三个重复，每个重复10株苗，A组未接病原菌和生防菌，只浇纯水；B组为对照组，只接病原真菌Foc TR4；C组为处理组，侵染Foc TR4后立即用链霉菌XY006的发酵液灌溉，每株15mL。此后每7～10天处理组灌溉链霉菌XY006的发酵液10mL，A组和B组浇等量的纯水。培养观察至有明显叶片症状与球茎症状出现即收苗统计病情，本实施例中的链霉菌XY006发酵液的制备方法参考实施例2中2.1中的链霉菌XY006发酵液的制备。
图8显示了三个实验组苗的外部形态，A组香蕉苗除了底部叶片枯萎外，少数叶片有褪绿的症状，此外其他叶片没有褪绿变黄甚至更严重的症状；B组大多数苗呈现整株枯萎或者即将枯萎的趋势，每株香蕉苗有零星的正常叶片，呈现褪绿、变黄、坏死和枯萎的叶部症状；C组苗健壮且叶色浓绿，有零星的叶片表现褪绿的症状且都为底部叶片。C组苗长势明显优于A组，B组表现典型的香蕉枯萎病症状。
图9为Foc TR4侵染香蕉苗叶部症状统计，Foc TR4侵染香蕉苗的叶部症状表现为5级，分别为健康、褪绿、变黄、坏死和枯萎。CK组只接病原真菌Foc TR4，T组侵染Foc TR4后立即用XY006的发酵液灌溉。CK组叶片表现变黄、坏死和枯萎的病症，其中坏死和枯萎叶片占比接近75％；T组只有褪绿的病症，占比为30％，70％苗叶片正常。
因此，可获知链霉菌XY006的施用能有效的抑制Foc TR4的侵染，大大降低植株发病率。
3.2 Foc TR4侵染香蕉苗的球茎症状
图10显示了三个实验组香蕉苗球茎的纵剖面，A组为健康苗的球茎纵切面，切面乳白色，中心部位带浅黄色，球茎与根部结合部位没有变褐变黑症状。B组呈现三个病级，没有健康苗，最高级为4级，4级为整株枯萎苗的球茎，球茎中心区域全部变黑且假茎也已变黑枯萎。C组病情呈现一个病级，最高级为1级。说明XY006能有效地控制Foc TR4在香蕉苗内部的侵害。
图11为Foc TR4侵染香蕉苗的发病指数统计，从图中可以看出CK组没有健康苗，3级和4级病株占比超过85％且4级病株占比接近55％；T组只有1级病株，健康苗占比为40％，1级病苗占比60％。T组的球茎症状显著轻于CK组。这一结果说明，链霉菌XY006的施用极大地降低了发病指数。
3.3 Foc TR4侵染香蕉苗的发病率与病情指数统计
Foc TR4侵染香蕉苗的发病率和生防效果统计如图12所示，其中，CK组全部苗均发病，T组的发病率在60％左右。T组的病情指数极显著地低于CK组(p<0.0001)，相对防效为82.37％。以上结果说明利用链霉菌XY006生物防控Foc TR4的效果显著。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种链霉菌XY006，其特征在于，其被命名为链霉菌Streptomyces sp.，已于2021年12月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24090。
2.一种链霉菌XY006发酵液，其特征在于，其由权利要求1所述的链霉菌XY006在MS培养基上划板活化后，于28～32℃环境下培养2～4天；然后挑取单菌落于MYG培养基，并在28～32℃和190～210rpm的条件下培养1～3天，然后按0.8％～1.2％量转接到MS培养基进行培养，使其在28～32℃、190～210rpm条件下培养6～8天，制得链霉菌XY006发酵液。
3.如权利要求2所述的链霉菌XY006发酵液，其特征在于，其由链霉菌XY006在MS培养基上划板活化后，于30℃环境下培养3天；然后挑取单菌落于MYG培养基，并在30℃和200rpm的条件下培养2天，然后按1.0％量转接到MS培养基进行培养，使其在30℃、200rpm条件下培养7天，制得链霉菌XY006发酵液。
4.如权利要求2或3所述的链霉菌XY006发酵液在促进香蕉植株生长中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：以7～10天为一次浇灌频率对香蕉苗进行浇灌，每次每株香蕉苗浇灌10ml链霉菌XY006发酵液。
6.如权利要求2或3所述的链霉菌XY006发酵液在抑制香蕉枯萎病中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用方法为：以7～10天为一次浇灌频率对染有枯萎病的香蕉苗进行浇灌，每次每株香蕉苗浇灌15ml链霉菌XY006发酵液。
8.一种杀菌剂，其特征在于：其包括权利要求2或3所述的链霉菌XY006发酵液。
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