CN114317346B

CN114317346B - 一株自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌及其应用

Info

Publication number: CN114317346B
Application number: CN202111628837.7A
Authority: CN
Inventors: 孙蕾; 王岩; 万顺刚; 袁丹; 王旭; 耿伟政; 苏沁华
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114317346A

Abstract

本发明公开了一株自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌及其应用。该菌种名称为克雷伯氏菌Klebsiella sp.HN02，保藏在广东微生物研究所菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为GDMCC No：62011，保藏日期为2021年11月4日。该菌种为克雷伯氏菌属细菌，呈革兰氏阴性，短杆状，部分近似球形。在NA平板上培养2天，菌落圆形，凸起，表面光滑，边缘整齐。本发明的克雷伯氏菌HN02可用于环境修复，菌种能够以对二甲苯为碳源自产糖脂类生物表面活性剂，提高体系内气液两相传质速率，降解环境污染物对二甲苯且降解效率很高，在72h内对21mg/L的对二甲苯实现100％的降解，在120h内对26mg/L的对二甲苯实现100％的降解。

Description

一株自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域和环境修复技术领域，具体涉及一株自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌及其应用。

背景技术

对二甲苯(PX)是典型的挥发性有机物(VOC)。它是二甲苯的异构体。主要用于生产对苯二甲酸(TPA)和作为生产聚对苯二甲酸乙二醇酯的主要前体，广泛用于塑料、薄膜和合成纤维的生产。以中国为例，即使每年生产大量的对二甲苯，仍然需要进口数千万吨的对二甲苯以满足工业生产需要。对二甲苯容易蒸发，因此经常进入空气中，很少在地表水或表土中以高浓度存在，这也在一定程度上造成了空气污染问题。对二甲苯有毒，易挥发，不溶于水，人体容易与其直接接触，从而对皮肤、眼睛、呼吸***和身体各器官造成伤害。另外二甲苯的嗅阈值极低，在较低浓度时就具有强烈的臭味，对人的生理及心理健康也会产生不利影响。因此，有效地去除大气中的对二甲苯成为了人们非常感兴趣的话题。但是对二甲苯难溶于水，因此其利用率也普遍偏低，所以提高对二甲苯的溶解度并从环境中有效去除对二甲苯是非常必要和紧迫的。表面活性剂具有两亲性，因而其可以提高某些不溶或难溶于水的物质在水中的溶解度，常常被用于提高难溶物质的溶解度来辅助使用，但传统的化学表面活性剂结构复杂且具有一定二次毒性，而利用微生物来降解环境中的有机污染物的方法是一种环境非常友好的方法并且某些微生物还可以自产环境友好、可生物降解的天然生物表面活性剂，所以分离筛选出可以降解对二甲苯并同时产生生物表面活性剂的细菌是一个非常好的解决对二甲苯降解问题的办法，因此筛选出低成本、高效率的二甲苯降解同时自产生物表面活性剂的细菌在恶臭有机废气的净化方面具有非常重要的意义。

克雷伯氏菌属(Klebsiella)为革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界，水、土壤、食物、动物呼吸道及肠道内均可检出该菌。李涛等(2009)在“生物表面活性剂菌株的筛选及发酵条件初步优化”中指出：从海南大学(儋州校区)职工食堂排污地采集的土样中分离到一株产生生物表面活性剂的菌株，命名为S423。采用16S rDNA***发育学分析确定该菌株属于Klebsiella属，通过定性分析、薄层层析色谱(TLC)和红外分光光度法(IR)分析，活性物质初步鉴定为糖脂。可见已有研究人员分离得到自产生物表面活性剂的克雷伯氏菌。但是，迄今为止，还未见有相关报道克雷伯氏菌可降解气态对二甲苯同时自产生物表面活性剂来再次提高对气态疏水性对二甲苯降解效率的相关研究或报道。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的之一为提供一株自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌。该克雷伯氏菌HN02属于克雷伯氏菌属的一个新变种，具有优异的对二甲苯降解能力同时自产生物表面活性剂，能降解环境中的较高浓度的对二甲苯且降解率很高。

通过16S:rDNA序列比对分析，发现本发明的菌株16SrDNA序列与Klebsiellapneumoniae strain MGH83同源性达99.93％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定本发明克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02属于克雷伯氏菌属的一个新变种。

该克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02目前保藏在广东微生物研究所菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，命名为Klebsiellasp.HN02，保藏号为GDMCC No：62011，保藏日期为2021年11月4日。

进一步的，所述的克雷伯氏菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，所述苯系物包括对二甲苯。

进一步的，所述苯系物包括气态对二甲苯。

进一步的，所述生物表面活性剂包括糖脂类生物表面活性剂。

本发明的第二目的是在于提出特定的方法筛选鉴别具有自产生物表面活性剂同时提高气态有机污染物降解能力的克雷伯氏菌属细菌。

进一步的，所述筛选方法包括以下步骤：

将造纸污水处理厂的好氧池污泥注入装有无机盐培养水溶液的容器中进行培养，并加入对二甲苯，密封容器；培养过程中测定容器中的对二甲苯浓度，当对二甲苯浓度下降到0时，获得初步筛选的细菌菌液；将初步筛选的细菌菌液在血琼脂平板上进行划线分离，培养，再从血琼脂平板上挑取菌落接种在亚甲基蓝平板上，可以产生变色反应的菌种视为具有对二甲苯降解能力并可以自产表面活性剂的细菌；最后，将筛选得到的菌种重复上述过程得到具有对二甲苯降解能力并可以自产表面活性剂的细菌。

其中，所述好氧池污泥为将好氧池排出的污泥与造纸黑液混合，培养至少3d后所得。

本发明中，所述造纸黑液是指造纸厂的碱法(烧碱法和硫酸盐法)制浆工艺产生的废水。本发明实施例中使用的是硫酸盐法制浆工艺产生的废水(黑液)。

进一步的，造纸黑液的添加量可以为污泥体积的1～3倍，pH可以控制在8～9之间，培养时间可以控制在3～5d左右。

进一步的，每1000mL无机盐培养水溶液中含有：1.2g K₂HPO₄·3H₂O，1.2g KH₂PO₄，0.2g MgSO₄·7H₂O，0.4g NH₄Cl，0.01g FeSO₄·7H₂O和1mL微量元素水溶液。其中，每1000mL微量元素水溶液中含有：0.2g CaCl₂，0.2g MnSO₄·4H₂O，0.1g CuSO₄·5H₂O，0.2g ZnSO₄·7H₂O，0.09g CoCl₂·6H₂O，0.12g Na₂MoO₄·2H₂O和0.006g H₃BO₃。

本发明的目的之三是提供上述自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌在环境修复中的应用。

进一步的，所述环境包括大气、水体或者土壤。

本发明所取得的效果：

1.本发明的克雷伯氏菌HN02菌株是首次从海南省某污水处理厂的好氧池活性污泥中筛选得到，其具有降解对二甲苯的能力并能自产生物表面活性剂。

2.本发明的克雷伯氏菌HN02具有降解对二甲苯的能力，且其以对二甲苯为碳源培养所得产物中生物表面活性剂的乳化效果更好。

3.本发明的克雷伯氏菌HN02对于浓度5.2～26.0mg/L的对二甲苯均达到100％降解，且对于高浓度(15.5～26.0mg/L)对二甲苯溶解的降解效率更高。

4.本发明的克雷伯氏菌HN02在20-40℃范围内对底物浓度为26mg/L的降解效率都达到了100％。

5.本发明的克雷伯氏菌HN02在pH为3-9范围内对底物浓度为26mg/L的降解效率都达到了100％。

6.造纸废水经处理后产生大量活性污泥，这些活性污泥含有多种微生物形成的菌胶团以及有机物、无机物。目前未发现有关从造纸污水处理厂好氧池中筛选分离出既能自产生物表面活性剂又能降解苯系物的菌株的相关报道。因此，本方案的提出可填补领域中的技术空白。

7.本发明为环境中对二甲苯的处理提供了绿色环保的候选方案。

附图说明

图1是本发明的克雷伯氏菌HN02在电子显微镜下的形态图。

图2是本发明的克雷伯氏菌HN02自产表面活性剂的乳化作用效果图。

图3是本发明的克雷伯氏菌HN02自产表面活性剂的种类鉴定图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，本发明中所用到的相关筛选方法为特定方法，只有用本发明中所叙述的方法才可筛选出兼具对二甲苯降解和自产生物表面活性剂能力的细菌，本发明中包含的血琼脂平板以及亚甲基蓝平板为必需品。

实施例1克雷伯氏菌HN02的分离筛选

所用的无机盐培养水溶液：每1000mL无机盐培养水溶液中含有1.2g K₂HPO₄·3H₂O，1.2g KH₂PO₄，0.2g MgSO₄·7H₂O，0.4g NH₄Cl，0.01g FeSO₄·7H₂O和1mL微量元素水溶液。其中，每1000mL微量元素水溶液中含有0.2g CaCl₂，0.2g MnSO₄·4H₂O,0.1g CuSO₄·5H₂O，0.2g ZnSO₄·7H₂O，0.09g CoCl₂·6H₂O，0.12g Na₂MoO₄·2H₂O和0.006g H₃BO₃。

本实施例的克雷伯氏菌HN02分离筛选自海南省某造纸污水处理厂的好氧池活性污泥。取造纸污水处理厂的好氧池排出的污泥，置于500mL瓶中，在污泥中加入2倍体积的造纸黑液，调节pH为8.3，密封瓶子，在温度37℃、200rpm摇床培养3d，沥去黑液，得好氧池污泥；将10mL好氧池污泥注入装有90mL无机盐培养水溶液的500mL顶空瓶中，并以200rpm培养。用10μL注射器加入过滤除菌的对二甲苯(1μL)，并用塞子密封瓶子。将培养物在37℃培养数天，每24小时用气相色谱法测定顶空瓶中的对二甲苯浓度，直到对二甲苯浓度为0。当对二甲苯浓度下降到0，对二甲苯降解菌即可认为被初步筛选出来。关于表面活性剂的筛选则是依据能够自产表面活性剂的细菌普遍具有溶血性这一特性进行筛选，并配合了亚甲基蓝平板指示的变色效果来进一步筛选。具体做法是，将初步筛选的可以降解对二甲苯的细菌菌液在血琼脂平板上进行划线分离，在37℃恒温培养箱内培养，再从血平板上挑取菌落接种在亚甲基蓝平板上，可以产生变色反应的菌种可初步视为具有对二甲苯降解能力并可以自产表面活性剂的细菌。最后，将得到的菌种重复上述过程3次得到具有对二甲苯降解能力并可以自产表面活性剂的细菌。

降解率的测定：在对二甲苯生物降解的过程中定时取样通过气相色谱法测定降解率。降解率＝(初始浓度-终浓度)/初始浓度。

气相色谱法测定对二甲苯的浓度：采用福立9790ii气相色谱仪-氢火焰(GC-FID)，气相色谱的进样口温设定为度180℃，色谱柱柱温设定为90℃，检测器温度设定为220℃。使用500μL顶空气密针吸取顶空瓶中的体积为200μL气相进行采样测定。记录初始时刻的峰面积作为初始浓度，终了时刻的峰面积为终浓度。

将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：

(1)菌体的形态特性：

a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的克雷伯氏菌的细胞染色为革兰氏阴性；在电子显微镜下观察，其形态为短杆状，菌体大小为1-3μm，如图1所示。

b.菌落的形态特性:NA(营养琼脂)平板上培养2天，菌落圆形，凸起，边缘整齐，表面光滑。

c.克雷伯氏菌主要的生理生化特征如表1所示：

表1克雷伯氏菌HN02的各项生理生化特征

注：+：阳性；－：阴性

上述结果表明本发明所筛选的细菌与克雷伯氏菌属的生理生化特性很相似。

(2)提取细菌基因组DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物：

上游引物：V4-515 F(5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3’)，SEQ ID NO：1

下游引物：V4-806 R(5’-GGACTACCAGGGTATCTAA-3’)，SEQ ID NO：2

扩增其16S rDNA全部基因，测序结果如SEQ ID NO：3所示。

将SEQ ID NO：3中所示的长为1394bp的16SrRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌株与Klebsiella pneumoniae strain MGH83同源性均达99.93％。

综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的菌株应归属克雷伯氏菌属的一个新变种，命名为克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02。

该菌种名称为克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02，目前保藏在广东微生物研究所菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为62011，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年11月4日。

实施例2

本实施例为克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02在环境修复中的应用，可降解环境中的对二甲苯。其中环境包括大气、水体或者土壤。

对本发明筛选得到的克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02的对二甲苯降解能力进行试验：

根据降解实验需要，配置无机盐培养基：向500mL的顶空瓶中加入无机盐溶液100mL(每1000mL无机盐培养水溶液中含有：1.2g K₂HPO₄·3H₂O，1.2g KH₂PO₄，0.2g MgSO₄·7H₂O，0.4g NH₄Cl，0.01g FeSO₄·7H₂O和1mL微量元素水溶液。其中，每1000mL微量元素水溶液中含有：0.2g CaCl₂，0.2g MnSO₄·4H₂O，0.1g CuSO₄·5H₂O，0.2g ZnSO₄·7H₂O，0.09gCoCl₂·6H₂O，0.12g Na₂MoO₄·2H₂O和0.006g H₃BO₃)。于121℃高压灭菌15min。首先将筛选所得的具有对二甲苯降解能力的克雷伯氏菌HN02在LB培养基中(酵母提取物5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L)37℃、200rprn的摇床中活化菌体48h，菌液离心，收集菌体，并用无机盐培养水溶液洗涤三次，并用100mL无机盐溶液重悬，将100mL菌液(4×10⁸CFU/mL)用100mL针筒注射进提前加入了不同含量的对二甲苯的顶空瓶中，顶空瓶内对二甲苯的浓度分别为：5.2，10.3，15.5，21.0，26.0mg/L。其中无机盐水溶液的pH值为7，在37℃，200rpm的摇床反应，定时取样，通过气相色谱法测定降解率。降解率测定同实施例1，结果如表2所示。

表2

从表2中可以看出，本发明筛选得到克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02在该条件下对对二甲苯的降解能力在5.2～26.0mg/L内都可以实现100％降解。另外，根据单位时间降解浓度可知，克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02对于高浓度(15.5～26.0mg/L)对二甲苯溶解的降解效率更高。

经进一步的试验证明，克雷伯氏菌HN02在20-40℃范围内对底物浓度为26mg/L的降解效率都达到了100％。在pH为3-9范围内对底物浓度为26mg/L的降解效率都达到了100％。降解时间均在120h以内。

实施例3

本实施例为克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02在产生生物表面活性剂能力的一种佐证体现方法。

对本发明筛选得到的克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02产生的的生物表面活性剂能力进行试验：

将克雷伯氏菌在底物浓度为21mg/L的条件下进行培养，培养条件参照实施例2。待对二甲苯完全降解，取其菌液上清液进行乳化能力测定。具体方法是，在试管中加入3mL花生油，然后将等量的离心菌液后得到的无细胞上清液加入到同一试管中，剧烈震荡试管2min，随即静置24h，24h后观察其乳化层高度。乳化指数＝(乳化层高度/试管中液体的总高度)×100％。

经过测定，本发明筛选得到的克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02产生的生物表面活性剂的乳化指数为37.50％，这表明克雷伯氏菌自产生物表面活性剂的乳化作用明显，证明其产生了生物表面活性剂，如图2所示。

对比例1

为了对比分析对二甲苯对克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02产生物表面活性剂能力的影响。本例采用土豆淀粉替换对二甲苯作为碳源，进行克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02培养，并测定乳化指数。

培养条件和实施例3相同。培养后，取其菌液上清液进行乳化能力测定。具体方法是，在试管中加入3mL花生油，然后将等量的离心菌液后得到的无细胞上清液加入到同一试管中，剧烈震荡试管2min，随即静置24h，24h后观察其乳化层高度。乳化指数＝(乳化层高度/试管中液体的总高度)×100％。

经过测定，产生的的生物表面活性剂的乳化指数为28.59％。对比实施例3和对比例1的结果，表明克雷伯氏菌HN02能够利用对二甲苯提高自身产生物表面活性剂的能力，所产生表面活性剂的乳化效果更好。

对比例2

本发明还对比了采用不同筛选方法所得菌株的应用效果。

筛选方法①：即实施例1所述的筛选方法。

筛选方法②：取造纸污水处理厂的好氧池排出的污泥，置于500mL瓶中，在污泥中加入2倍体积的无机盐培养水溶液，调节pH为8.3，密封瓶子，在温度37℃、200rpm摇床培养3d，沥去黑液，得好氧池污泥；将10mL好氧池污泥注入装有90mL无机盐培养水溶液的500mL顶空瓶中，并以200rpm培养。用10μL注射器加入过滤除菌的对二甲苯(1μL)，并用塞子密封瓶子。将培养物在37℃培养数天，每24小时用气相色谱法测定顶空瓶中的对二甲苯浓度，直到对二甲苯浓度为0。将初步筛选的可以降解对二甲苯的细菌菌液在血琼脂平板上进行划线分离，在37℃恒温培养箱内培养，再从血平板上挑取菌落接种在亚甲基蓝平板上，选出可以产生变色反应的菌种。将得到的菌种重复上述过程得到纯化的细菌。

参照实施例3的培养方法对不同筛选方法所得菌株进行培养，并进行乳化能力测定。

结果显示，方法②得到的菌株产生的生物表面活性剂的乳化指数为12.34％，表明采用方法①所得的菌株具有更高的产表面活性剂的能力。

实施例4

本实施例为克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02产生生物表面活性剂的种类相关鉴定。

对本发明筛选得到的克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02产生的生物表面活性剂能力进行核磁共振氢谱(¹HNMR)鉴定：

将实施例2所述100mL菌液(4×10⁸CFU/mL)与1mL液体对二甲苯混合，在37℃，200rpm条件下摇床培养，连续培养3d后，将菌液离心处理，去除菌体，用等量的乙酸乙酯反复萃取10分钟，分离得到有机相，将有机相在旋转蒸发仪中在50℃下蒸发得到棕色的固体，利用二甲基亚砜(DMSO)溶解，进行核磁共振氢谱(¹HNMR)鉴定。

经过测定，本发明筛选得到的克雷伯氏菌(Klebsiella)HN02产生的生物表面活性剂种类属于糖脂类生物表面活性剂，关键指示峰为存在着糖分子存在的糖苷键以及相关的脂肪族基团，相关鉴定结果如图3所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌，其特征在于，所述克雷伯氏菌保藏在广东微生物研究所菌种保藏中心，名称为Klebsiella sp. HN02，保藏号为GDMCC No：62011，保藏日期为2021年11月4日。

2.根据权利要求1所述自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌，其特征在于，所述的克雷伯氏菌的16S rRNA序列如SEQ ID NO:3 所示。

3.根据权利要求1所述自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌，其特征在于，所述苯系物包括对二甲苯。

4.根据权利要求1所述自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌，其特征在于，所述苯系物包括气态对二甲苯。

5.根据权利要求1所述自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌，其特征在于，所述生物表面活性剂包括糖脂类生物表面活性剂。

6.权利要求1~5任一项所述的自产生物表面活性剂及可降解苯系物的克雷伯氏菌在环境修复中的应用，所述苯系物为对二甲苯。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述环境包括大气、水体或者土壤。