CN114317290B - 一种能够降解敌草隆的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够降解敌草隆的菌株及其应用。该菌株为链格孢属(Alternaria sp.)菌株QHSH‑5，其保藏号为CGMCC No.23258。该菌株可用于农药敌草隆的降解，有助于解决农业敌草隆残留问题，提高农产品质量安全。

Description

一种能够降解敌草隆的菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种能够降解敌草隆的菌株及其应用。

背景技术

敌草隆(Diuron)是一种选择性除草剂，难溶于水、也不易溶于大多数有机溶剂，在空气中化学性质稳定，遇强酸强碱可被分解，不燃烧，无腐蚀性，分子量为：233.0945，分子式为：C₉H₁₀Cl₂N₂O，化学结构式如下：

随着我国成为农药生产大国，敌草隆在国内的生产和使用也迅速增长，敌草隆应用于棉花、玉米、花生、甘蔗、果树；防除马塘、旱稗、狗尾草、莎草、蓼、藜等一年生杂草，对多年生杂草，如狗牙根，香附子等也有很好的防治效果。目前我国甘蔗用敌草隆的需求量在1500吨左右。由于敌草隆的大量使用，地下水和土壤都存在敌草隆残留，它虽是低毒性除草剂，但误服仍会出现中毒症状，并对上呼吸道有刺激性作用，人经口最小致死量为500mg/kg。已有研究表明敌草隆是一种内分泌干扰物，接触后会对人体产生为不利影响。

在农药的使用中，绝大多数农药都进入空气、水体、土壤中，由于只有少部分挥发，因此在水体、土壤中造成大量的农药残留。而在当前的农药残留降解方法中，微生物的降解作用相较于传统的降解方法具有独特的优势，它可以将农药进行生物修复和分解，使其转化为简单无机物，并且具有安全、高效、快速、廉价、无二次污染的特点。而分离筛选出具有降解作用的菌株将有利于解决农药残留问题，提高农产品质量，促进农业发展。

发明内容

为解决上述问题，本发明目的在于提供一种对敌草隆具有降解作用的菌株。该菌株能有效降解农药敌草隆，为敌草隆残留问题的解决奠定基础，能够改善土壤和水等的环境。

为实现上述目的，本发明提供了链格孢属(Alternaria sp.)菌株QHSH-5，其保藏号为CGMCC No.23258。

菌株QHSH-5的培养特征为，商用马丁真菌培养基28℃，培养3d，菌落形态呈圆形，干燥易挑，不透明，绒毛状，表面有白色菌丝。

本发明的链格孢菌(Alternaria sp.)菌株QHSH-5是按如下方法筛选到的，

1.菌株的分离纯化与筛选

自敌草隆污染土壤中，通过梯度稀释、平板划线等方法，分离纯化出单一微生物菌株，用于后续实验。

将单一微生物菌株分别接种至培养基中，28℃，180r/min摇床内振荡培养，此为实验组，并设置自身对照组和标准对照组。待菌株生长至对数生长期，向实验组以及标准对照组加入敌草隆，浓度为50mg/L，28℃，180r/min分别取样进行薄层分析观察其对农药的降解效果，选取具有降解效果的菌株编号为QHSH-5，作为下一步研究对象。

2.QHSH-5的鉴定

(1)形态学鉴定

将菌株QHSH-5接种到商用马丁固体平板上28℃培养3d，观察其菌落形态。菌落形态呈圆形，干燥，不透明，绒毛状表面有白色菌丝(见图1)。

(2)分子生物学鉴定

提取菌株基因组DNA，以提取的基因组为模板进行PCR扩增、测序。将菌株测得的ITS序列在NCBI数据库中利用BLAST进行比对分析，并选择同源性较高的相关序列利用MAGE7.0软件构建***发育树及分析进化关系(见图2)。

最终根据形态学特征，同源性远近以及***发育树，并结合文献报道，确定QHSH-5为链格孢属(Alternaria sp.)。

3.QHSH-5的降解测定

(1)生长曲线测定

接种纯化的菌株QHSH-5于商用马丁真菌培养基中，3组平行，分别于培养2、4、6、8、10d取样后通过干重法测量生长曲线(见图3)。

(2)转化产物的分离

通过对菌株QHSH-5的批量发酵，并于对数生长期投入敌草隆，至第10天过滤去除菌丝体，将上清液过大孔树脂柱后浓缩，再经过柱层析进行分离，选取样品再进一步通过核磁共振氢谱和碳谱确定QHSH-5对敌草隆的降解产物结构(见图4、5)。

(3)降解测定

通过在菌株QHSH-5中添加敌草隆，并且定时取样，然后进行HPLC-DAD测定，通过敌草隆以及降解产物的含量测定来确定敌草隆降解菌QHSH-5对敌草隆的降解效率(见图6、7、8)。

本发明还提供了上述的菌株或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在降解敌草隆中的应用。

本发明还提供了上述的菌株或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在制备降解敌草隆产品中的应用。

本发明还提供了上述的菌株或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂在降低敌草隆使用后的残留量中的应用。

本发明还提供了降解敌草隆的产品，包括上述的菌株或其培养液或其发酵液或含有其的菌剂。

本发明筛选出具有敌草隆降解作用的链格孢菌Alternaria sp.QHSH-5，可用于农药敌草隆的降解，有助于解决农业敌草隆残留问题，提高农产品质量安全。

保藏说明

菌种名称：链格孢

拉丁名：Alternaria sp.

菌株编号：QHSH-5

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年9月24日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.23258

附图说明

图1为QHSH-5的单个菌落形态特征图。

图2为QHSH-5的ITS***发育树。

图3为QHSH-5的生长曲线图。

图4为敌草隆降解产物核磁氢谱图。

图5为敌草隆降解产物核磁碳谱图。

图6为QHSH-5对敌草隆的降解实验结果。

图7为QHSH-5对敌草隆的降解实验中敌草隆的液相图。

图8为QHSH-5对敌草隆的降解实验中敌草隆降解产物的液相图。

图9为不同菌株对敌草隆的降解活性筛选的阴性结果薄层色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的培养基配方如下：

商用马丁培养基：蛋白胨5.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁0.5g，酵母浸出粉2.0g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌20min。固体培养基：每1L加入15.0g琼脂粉。

实施例1、菌株QHSH-5的分离、纯化与筛选

1.菌株的分离与纯化

于2020年7月自宁夏石嘴山市平罗县采集敌草隆污染土壤，取2g于50mL无菌水中充分混匀，待溶液静置澄清后，取上清采用梯度稀释法分别稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5等梯度，均匀涂布于商用马丁固体培养基中，28℃培养，通过平板划线分离法进行纯化，得到多个单一纯化微生物菌株。

2.敌草隆降解菌的筛选

配置商用马丁液体培养基(不添加琼脂)，250mL三角瓶中含150mL培养基，将单一纯化的多个菌株接种至培养基中，28℃，180r/min摇床振荡培养。待菌株生长至对数生长期，加入底物敌草隆，浓度为50mg/L，同条件继续培养至5天、7天、9天，分别取样并进行薄层检测，分析结果。

设立标准对照组：向等量液体培养基中加入敌草隆(浓度为50mg/L)；

设立自身对照组：将上述多个菌株接种至等量液体培养基，培养方法与上述培养方法相同，但不加入敌草隆。

通过自身对照组排除菌的自身次级代谢干扰而影响薄层分析结果；标准对照组排出培养基对化合物敌草隆的干扰。根据薄层信息，观察不同菌对农药敌草隆的降解，选取降解效果明显的菌株作为下一步研究对象。获得一株对敌草隆具有降解效果的菌株，编号为QHSH-5。

在QHSH-5获得过程中进行了大量的实验，供筛选的菌株近200株(部分筛选薄层分析结果见图9)，也包括同为链格孢的其他菌株，如本实验室前期获得的链格孢CGMCCNo.15984，然而也仅筛出一株活性菌株，说明敌草隆难降解，这也是土壤中敌草隆农药残留较为严重的原因。

实施例2、菌株QHSH-5的鉴定

(1)菌落形态

将QHSH-5接种于商用马丁培养基平板上，菌落形态呈圆形，干燥，不透明，绒毛状，表面有白色菌丝。初期萌发灰白色菌丝后随即向培养基呈圆形扩散，成圆后中间颜色为灰白色周围逐渐变深。(见图1)

(2)菌株鉴定

将QHSH-5接入液体商用马丁培养基中，28℃，180r/min，摇床培养3d，离心后取少量菌体。采用《真菌基因组DNA提取试剂盒》(无锡百泰克生物技术有限公司，货号：B004009020)提取QHSH-5基因组DNA，提取步骤参照真菌基因组DNA提取试剂盒说明书。以QHSH-5基因组DNA为模板，采用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。

选用真菌引物序列如下：

ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)

ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)

PCR扩增反应体系(50μL)包括：5×buffer 10μL；dNTP 4μL；正向引物(10μM)1μL；反向引物(10μM)1μL；Prime STAR 0.5μL；模板(1μM)1μL；ddH₂O 32.5μL。

PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min。

扩增产物(即QHSH-5的ITS)送交北京优吉科技有限公司进行测序。

QHSH-5的ITS序列如SEQ ID No.1所示，将所得序列与NCBI核酸数据库用BLAST进行同源性比对分析，挑选部分相似性高的菌株与QHSH-5菌株进行***发育分析，用MEGA7.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining)构建***发育树。***发育树如图2所示。

最终根据形态学特征，同源性远近以及***发育树，并结合文献报道，确定QHSH-5为链格孢属(Alternaria sp.)。

实施例3、降解菌QHSH-5的降解测定

(1)生长曲线测定

取保存降解菌QHSH-5的斜面保存试管，加入3mL液体商用马丁培养基，反复吹吸，洗下菌苔，即为菌丝体洗脱液，随后用吸管将其转移至另一无菌试管，无菌水稀释10倍，制成菌悬液10mL。配置15瓶液体商用马丁培养基，每250mL锥形瓶含150mL液体商用马丁培养基，每瓶接种QHSH-5菌悬液0.5mL，28℃、180r/min恒温振荡培养。设3组平行，于2、3、4、5、6、7、8、9天取样，保留菌丝体，烘干至恒重后称量，通过干重法测量生长曲线(见图3)。生长曲线如图3所示，前6天为对数生长期，第6天达到最大值，6天以后为衰亡期，故QHSH-5的最适培养时间为6天。

(2)降解产物的分离

对敌草隆降解菌QHSH-5进行批量发酵，配置34瓶液体商用马丁培养基，每锥形瓶中含150mL培养基，共5.1L，28℃、180r/min恒温振荡培养降解菌QHSH-5。将500mg敌草隆溶解于6.8ml DMSO中，每瓶培养基加入200μL，即对数生长期共投入敌草隆500mg，至第10天过滤去除菌丝体获得发酵液。将发酵液通过D101大孔吸附树脂色谱柱(Φ75mm×150cm)，水洗后95％乙醇冲下样品，浓缩，将浓缩后样品进行硅胶拌样后，过硅胶柱层析(Φ26mm×457mm)进行分离(二氯甲烷/甲醇梯度洗脱)，根据薄层分析获得含敌草隆降解产物的粗样品，再将此粗样品通过Sephadex LH-20凝胶柱(Φ17mm×457mm)(石油醚/二氯甲烷/甲醇5∶4∶1洗脱)获得QHSH-5对敌草隆的降解产物，通过核磁共振氢谱和碳谱(见图4、图5)确定QHSH-5对敌草隆的降解产物结构式如下所示，为敌草隆去甲基产物。

敌草隆去甲基产物波谱数据归属如下：

¹H-NMR(MeOH-d₄，400MH)：7.72(d，J＝2.8Hz，H-2)，7.35(d，J＝8.8Hz，H-5)

7.21(dd，J＝8.8，2.8Hz，H-6)，2.76(s，H_CH3-10)；

¹³C-NMR(MeOH-d₄，100MH)：158.5(C-8)，141.5(C-1)，133.4(C-3)，131.5(C-4)，125.7(C-5)，121.2(C-6)，119.4(C-2)，26.9(C-10)。

选用D101大孔吸附树脂(北京索莱宝科技有限公司；M0041)，200-300目柱层层析硅胶(青岛海洋化工厂；M150107)，葡聚糖凝胶LH-20(GE Healthcare Life SciencesChina；17009002)。

(3)降解率测定

用无菌的生理盐水洗下保存降解菌QHSH-5的斜面保存试管内的菌苔，充分混匀后，用生理盐水稀释至10^-2倍，得到QHSH-5的菌悬液，浓度为10⁶CFU/mL。处理组以10％的接种量接种于液体商用马丁培养基中，设3组平行，28℃、180r/min恒温振荡培养，培养至对数生长期加入敌草隆150mg/L，在加入敌草隆后第2、4、6、8、10天取样，动态监测降解敌草隆过程中的降解量，采用HPLC-DAD检测培养液中敌草隆及降解产物，以相同条件下的液体商用马丁培养基不接入菌种作为对照组，用敌草隆标准品(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，D101260)和上述分离出的降解产物的出峰时间作为对照判断培养液中的敌草隆和降解产物(见图7、8)。图7为敌草隆的液相色谱图，图8为降解产物的液相色谱图。

敌草隆降解率及降解产物的产量测定：将培养液离心去除菌体后，取上清20mL过ODS C₁₈小柱，保留甲醇层，待挥干后，用色谱纯甲醇溶解，经0.45μm有机滤膜过滤后置于棕色色谱瓶中，获得待检测样品。

分析采用高效液相色谱仪：岛津LC2030C色谱仪，色谱柱为Megers C18色谱柱(250×4.6mm，10μm)，流动相为甲醇：水＝60：40，流速为1mL/min，柱温度30℃，进样量为10μL，检测波长为254nm。

降解实验结果如图6所示，敌草隆的降解率(％)＝(对照组中敌草隆浓度-处理组中敌草隆浓度)/对照组中敌草隆浓度×100％。

随着时间的推移，敌草隆的含量呈快速下降趋势，并且根据降解产物含量随培养时间持续增长，说明QHSH-5对敌草隆的降解率非常高，约为74％。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 宁夏医科大学

宁夏农林科学院植物保护研究所（宁夏植物病虫害防治重点实验室）

<120> 一种能够降解敌草隆的菌株及其应用

<130> GNCYZ220254

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> 链格孢属(Alternaria sp.)

<400> 1

gtggctgcca tgaggcgggc tggaaccctc cagccgggca ctgcttcacg gcgtgcgcgg 60

ctggagccgg ccctgctgaa ttattcaccc gtgtcttttg cgtacttctt gtttcctggg 120

tgggctcgcc cgccatcagg accaaccata aacctttttg taatagcaat cagcgtcagt 180

aacaacgtaa ttaattacaa ctttcaacaa cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga 240

acgcagcgaa atgcgatacg tagtgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg 300

aacgcacatt gcgccctttg gtattccaaa gggcatgcct gttcgagcgt catttgtacc 360

ctcaagcttt gcttggtgtt gggcgtcttt tgtctccagc tcgctggaga ctcgccttaa 420

agtcattggc agccggccta ctggtttcgg agcgcagcac aagtcgcgct cttgcccagc 480

caaggtcagc gtccagcaag ccttttttca acctttgacc tcggatcagg tagggatacc 540

cgctgaactt aagcatatca ataagcggag gaa 573

Claims (5)

1.链格孢属（Alternaria sp.）菌株QHSH-5，其保藏号为CGMCC No.23258。

2.权利要求1所述的菌株或其发酵液或含有其的菌剂在降解敌草隆中的应用。

3.权利要求1所述的菌株或其发酵液或含有其的菌剂在制备降解敌草隆产品中的应用。

4.权利要求1所述的菌株或其发酵液或含有其的菌剂在降低敌草隆使用后的残留量中的应用。

5.降解敌草隆的产品，其特征在于：包括权利要求1所述的菌株或其发酵液或含有其的菌剂。

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