CN114304190A

CN114304190A - 一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法

Info

Publication number: CN114304190A
Application number: CN202111153103.8A
Authority: CN
Inventors: 刘铜; 张�成
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明提供一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：S1分生孢子悬浮液的制备、S2发酵基质的制备、S3分生孢子粉的制备、S4可湿性粉剂的制备，本发明确定了可湿性粉剂的组成比例为孢子粉20％、AB‑3 1％、分散剂NNO5％、抗坏血酸1％，经测定其润湿时间、质量悬浮率等方面均符合农药可湿性粉剂的相关标准，对T.brev T069产品的开发及工厂化生产具有重要意义，确定该菌株可湿性粉剂的组成，为生防T.brev T069的生产开发及田间应用与预评价奠定基础。

Description

一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，特别涉及一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法。

背景技术

在我国传统的农业中，连作现象非常普遍，这会导致严重的连作障碍，即土壤养分降低，病原菌大量积累，发病率和病害严重程度逐年升高，严重的影响了作物的产量与品质。为了更好的控制病害，人们往往大量的使用农药化肥，但效果并不明显。而且长期大量的使用化学药剂会严重的影响生态环境和人类的健康^[1]，且易使病原菌产生抗药性，增加了对病害的防治难度。生物防治是一种可替代化学农药的环境友好型病害防治方法，筛选出高效的生防菌株并将其制成高效的生防制剂对推进农业绿色发展的有着重要作用。

木霉菌(Trichoderma spp.)是一种应用较为广泛的生防真菌，可通过竞争作用、拮抗作用、重寄生作用等多种机制不同程度的抑制葡萄孢属(Botrytis spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)和丝核菌属(Rhizoctonia spp.)等18个属的29种植物病原真菌[3-4]。此外，木霉菌还可通过释放效应因子或分泌水解酶类诱导植物的抗性，被广泛应用于种子包衣处理、土壤改良、叶面喷施等方面[5-6]。目前，如何快速生产出大量的繁殖体并制成稳定可靠的制剂，是木霉菌生物防治进一步推广应用的研究重点。

21世纪前，菌丝体、分生孢子、厚垣孢子这三种木霉菌繁殖体在生防制剂的应用中早已开始研究。菌丝体抗逆性较差，存活率较低，厚垣孢子虽然储存能力强，但培养条件苛刻，生长周期长。相比较之下，分生孢子生产快速简单，同时对环境有较好的抗逆性，是目前商品化木霉制剂的主要类型。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，来解决上述问题。

本发明的技术方案是这样实现的：一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、分生孢子悬浮液的制备：将菌株T.brev T069转接于PDA培养基上活化培养，于20～30℃恒温培养7～11d出现大量绿色孢子，用无菌水冲洗孢子，并稀释为0.8～1.2×10⁸CFU/mL的种子液备用；

S2、发酵基质的制备：收集木薯环剥后的皮，将其切成小片烘干，粉碎，过10～100目的木薯皮渣，并混合均匀，称取木薯皮渣溶于水中，并装入组培瓶中灭菌得到发酵基质；

S3、分生孢子粉的制备：将T.brev T069孢子悬浮液按照发酵基质的体积百分比为0.3～1.2％的接种量加入到上述组培瓶中摇匀，于25～30℃恒温培养箱中静置培养2～4d，其中第1～2d时将其取出摇匀以打断菌丝一次，之后将经过T.brev T069发酵后的木薯皮渣晾干后，用粉碎机粉碎3～8s，共粉碎1～3次，粉碎间隔为3～7min，之后将其过300～400目筛，得到T.brev T069分生孢子粉；

S4、可湿性粉剂的制备：将上述孢子粉与湿润剂、分散剂、紫外保护剂、载体混合制得可湿性粉剂，所述可湿性粉剂中包括以下质量百分比原料：孢子粉12～25％、湿润剂0.9～1.3％、分散剂3～8％、紫外保护剂0.8～1.2％，余量为载体。

进一步的，所述S1分生孢子悬浮液的制备：将菌株T.brev T069转接于PDA 培养基上活化培养，于28℃恒温培养9d可见大量绿色孢子，用无菌水冲洗孢子，并稀释为1×10⁸CFU/mL的种子液备用。

进一步的，所述S2发酵基质的制备：木薯皮渣和水的质量体积比g/mL为 5～9：10。

进一步的，所述S3分生孢子粉的制备是将T.brev T069孢子悬浮液按照1％的接种量加入到组培瓶中摇匀，于28℃恒温培养箱中静置培养3d，其中第2d 时将其取出摇匀以打断菌丝一次，之后将经过T.brev T069发酵后的木薯皮渣晾干后，用粉碎机粉碎5s，共粉碎2次，粉碎间隔为5min，之后将其过325目筛，得到T.brev T069分生孢子粉。

进一步的，所述S3所述可湿性粉剂中包括以下质量百分比原料：孢子粉 20％、湿润剂1％、分散剂5％、紫外保护剂1％，余量为载体。

进一步的，所述载体为白炭黑、硅藻土、高岭土、滑石粉、木薯皮粉中的一种，载体浓度为1000～5000μg/ml。

进一步的，所述湿润剂为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、拉开粉BX、 AB-3中的一种。

进一步的，所述分散剂为羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钠、亚甲基二萘磺酸钠中的一种。

进一步的，所述紫外保护剂为糊精、抗坏血酸、荧光素钠中的一种，其浓度为100～1000μg/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明前期筛选出一株抑菌强，生长速度快和产孢多的生防T.brev T069，以木薯皮渣为发酵基质，采用固体发酵技术生产T.brev T069的分生孢子粉，通过测定不同种类及配比的助剂的性能指标及与T.brev T069之间的生物相容性本发明确定了可湿性粉剂的组成比例为孢子粉20％、AB-3 1％、分散剂NNO5％、抗坏血酸1％，经测定其润湿时间、质量悬浮率等方面均符合农药可湿性粉剂的相关标准。

本发明提供了一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法和新的可湿性粉剂配方，对T.brev T069产品的开发及工厂化生产具有重要意义，确定该菌株可湿性粉剂的组成，为生防T.brev T069的生产开发及田间应用与预评价奠定基础。

附图说明

图1为T.brev T069利用木薯皮渣发酵过程，图中A：干燥后的木薯皮，B：粉碎后的木薯皮，C：灭菌后的木薯皮，D：发酵第2d，E：发酵第3d；

图2为不同载体对T.brev T069菌丝生长的影响(36h)；

图3为不同浓度的湿润剂对T.brev T069菌丝生长的影响(36h)；

图4为不同浓度的分散剂对T.brev T069菌丝生长的影响(36h)；

图5为不同浓度的紫外保护剂对T.brev T069菌丝生长的影响(24h)。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

供试菌株T.brev T069，海南省绿色农用生物制剂创制工程研究中心(海南大学植保学院)提供。

实施例1

一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、分生孢子悬浮液的制备：将菌株T.brev T069转接于PDA培养基上活化培养，于20℃恒温培养7d可见大量绿色孢子，用无菌水冲洗孢子，并稀释为 0.8×10⁸CFU/mL的种子液备用；

S2、发酵基质的制备：收集木薯环剥后的皮，将其切成小片烘干，粉碎，过10目的木薯皮渣，并混合均匀，称取木薯皮渣溶于水中，并装入组培瓶中灭菌得到发酵基质；

S3、分生孢子粉的制备：将T.brev T069孢子悬浮液按照发酵基质的体积百分比为0.3％的接种量加入到上述组培瓶中摇匀，于25℃恒温培养箱中静置培养 2d，其中第1d时将其取出摇匀以打断菌丝一次，之后将经过T.brev T069发酵后的木薯皮渣晾干后，用粉碎机粉碎3s，共粉碎1次，粉碎间隔为3min，之后将其过300目筛，得到T.brev T069分生孢子粉；

S4、可湿性粉剂的制备：将上述孢子粉与湿润剂、分散剂、紫外保护剂、载体混合制得可湿性粉剂，所述可湿性粉剂中包括以下质量百分比原料：孢子粉12％、湿润剂AB-30.9％、分散剂NNO3％、紫外保护剂抗坏血酸0.8％，余量为硅藻土，硅藻土浓度为1000μg/ml，紫外保护剂抗坏血酸浓度为100μg/ml。

实施例2

一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、分生孢子悬浮液的制备：将菌株T.brev T069转接于PDA培养基上活化培养，于30℃恒温培养11d可见大量绿色孢子，用无菌水冲洗孢子，并稀释为1.2×10⁸CFU/mL的种子液备用；

S3、分生孢子粉的制备：将T.brev T069孢子悬浮液按照发酵基质的体积百分比为1.2％的接种量加入到上述组培瓶中摇匀，于30℃恒温培养箱中静置培养 4d，其中第2d时将其取出摇匀以打断菌丝一次，之后将经过T.brev T069发酵后的木薯皮渣晾干后，用粉碎机粉碎8s，共粉碎3次，粉碎间隔为7min，之后将其过400目筛，得到T.brev T069分生孢子粉；

S4、可湿性粉剂的制备：将上述孢子粉与湿润剂、分散剂、紫外保护剂、载体混合制得可湿性粉剂，所述可湿性粉剂中包括以下质量百分比原料：孢子粉25％、湿润剂AB-31.3％、分散剂NNO 8％、紫外保护剂抗坏血酸1.2％，余量为硅藻土，硅藻土浓度为5000μg/ml，紫外保护剂抗坏血酸浓度为1000μg/ml。

实施例3

一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、分生孢子悬浮液的制备：将菌株T.brev T069转接于PDA培养基上活化培养，于28℃恒温培养9d可见大量绿色孢子，用无菌水冲洗孢子，并稀释为1.0×10⁸CFU/mL的种子液备用；

S3、分生孢子粉的制备：将T.brev T069孢子悬浮液按照发酵基质的体积百分比为1％的接种量加入到上述组培瓶中摇匀，于28℃恒温培养箱中静置培养 3d，其中第2d时将其取出摇匀以打断菌丝一次，之后将经过T.brev T069发酵后的木薯皮渣晾干后，用粉碎机粉碎5s，共粉碎2次，粉碎间隔为5min，之后将其过325目筛，得到T.brev T069分生孢子粉；

S4、可湿性粉剂的制备：将上述孢子粉与湿润剂、分散剂、紫外保护剂、载体混合制得可湿性粉剂，所述可湿性粉剂中包括以下质量百分比原料：孢子粉20％、湿润剂AB-31％、分散剂NNO 5％、紫外保护剂抗坏血酸1％，余量为硅藻土，硅藻土浓度为5000μg/ml，紫外保护剂抗坏血酸浓度为100μg/ml。

一、不同载体的生物相容性测定

将硅藻土、高岭土、滑石粉、白炭黑、木薯皮粉过325目筛后分别按1000、 2500、5000μg/mL的浓度加入到100mLPDA中，用无菌打孔器打取5mm菌饼接到含有载体的PDA平板中心，验证载体对T.brev T069菌落直径的影响。配制孢子萌发液(蔗糖20g，大豆蛋白胨5g，磷酸二氢钾5g，水1000mL)，取 45mL分装到容量为250mL的锥形瓶中，并将几种载体按照上述浓度加入其中， 121℃高温灭菌20min，冷却后备用。吸取5mL浓度为1×10⁷CFU/mL的T.brev 孢子悬浮液，加入到含有不同载体的孢子萌发液中，120r/min，28℃恒温培养 12h，在显微镜下用血球计数板测量其萌发数(孢子萌发的标准为可见芽管长度等于或者大于孢子直径)，重复5次。不同浓度的载体对T.brev T069的孢子萌发及菌丝生长的影响如表1所示，

表1不同载体与T.brev T069的生物相容性测定(P<0.05)

不同字母表示差异显著(P<0.05)

由上表1和图2中可知，不同浓度白炭黑的培养基中，T.brev T069的孢子萌发率为和菌丝菌落直径显著低于对照(P<0.05)。在不同浓度的硅藻土培养基中，T.brev T069的孢子萌发率均低于对照，在浓度为2500μg/mL时差异不显著； 24和36h时对菌丝生长的影响也有所不同，其中当浓度为5000μg/mL时菌落直径最大，显著高于对照。在不同浓度的高岭土培养基中，T.brev T069的孢子萌发率均低于对照；在1000和5000μg/mL的浓度下，菌落直径显著高于对照。在不同浓度滑石粉的培养基中，T.brev T069的孢子萌发率均低于对照；在5000 μg/mL浓度下36h的菌落直径显著低于对照。在不同浓度的木薯皮粉培养基中，孢子萌发率与对照间差异不显著；36h时的菌落直径均显著低于对照。综合比较下，硅藻土对菌丝生长的影响最优。

二、湿润剂的筛选及生物相容性测定

湿润性能的测定参考GB/T5451-2001，将拉开粉BX、十二烷基硫酸钠 (SDS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、AB-3四种湿润剂分别按照1％、3％、 5％(w/w)的比例，孢子粉20％的比例加入硅藻土，混合均匀。之后称取5.0g 样品，加入盛有100ml标准水的150mL烧杯液面上，并记录样品全部润湿所需时间，重复3次，以不加湿润剂的样品作为对照，结果如表2。

表2不同湿润剂的湿润性能及生物相容性测定

由表2可知，1％、3％、5％三种不同浓度的四种湿润剂的湿润性能存在较为明显的差异。其中，湿润性能最好的为5％十二烷基硫酸钠(SDS)，湿润时间为3.83±0.22s，但对T.brev T069的生物相容性较差(图3)。此外，不同浓度的十二烷基苯磺酸钠(SDBS)为湿润剂时，湿润时间较长；不同浓度BX为湿润剂时孢子均不萌发。因此，上述三种物质均不能作为湿润剂AB-3在三种浓度下的湿润时间为6.52-10.08s，仅次于SDS，同时在1％浓度下，T.brev T069 的孢子萌发率超过80％，36h时菌落直径为6.80cm，综合评价选择1％的AB-3作为湿润剂。

三、分散剂的悬浮特性及生物相容性测定

将亚甲基双萘磺酸钠NNO、木质素磺酸钠、羧甲基纤维素钠(CMC-Na) 三种分散剂分别按照1％、3％、5％(w/w)的比例，孢子粉20％，以硅藻土补充至100％。称取2.5g样品，根据GB/T 14825-2006的方法测定3种分散悬浮剂的悬浮特性，重复3次，结果如表3。

表3不同浓度分散剂的悬浮特性及生物相容性测定

由表3可知，添加3种不同浓度的分散剂后，其悬浮率相较于未加分散剂的对照(悬浮率42.45％)有显著性的提高，且在同一种分散剂中，随着浓度的提高，悬浮率均有提高。其中，悬浮特性最好为CMC-Na，在5％下悬浮率可达 82.03％，显著高于其他浓度的悬浮剂。但该试剂较为粘稠，在水中的溶解时间大于10min。不同浓度木质素磺酸钠作为悬浮剂时，36h时菌丝直径为7.00-7.33 cm，效果最好，但其悬浮率仅为55.81-60.44％，性能最差。当NNO在5％浓度下，悬浮率可达到73.04％，仅次于浓度为5％的CMC-Na；虽然36h时菌丝直径6.87cm，略小于对照，但差异不显著。因此，综合考虑下选择5％NNO作为分散剂。

四、紫外保护剂的保护特性及生物相容性测定

将荧光素钠、糊精、抗坏血酸分别按照100、500、1000μg/mL的浓度加入到10⁶CFU/mL的T.brev孢子悬浮液中混合均匀。吸取100μL混合液滴于凹玻片上，之后在紫外灯(30W)下40cm处照射10min，于28℃黑暗处培养12h 后测定孢子萌发率，重复5次。以加无菌水混合后不照射为对照1，以加无菌水混合后照射为对照2，结果如下表4。

表4不同浓度紫外保护剂特性及生物相容性测定

由表4可知，紫外照射前和紫外照射后孢子萌发率差异显著，照射后的萌发率仅为5.4％。三种紫外保护剂中，保护性能最好为100μg/mL的抗坏血酸，在紫外照射10min后，T.brev T069孢子萌发率为85.6％，显著高于其他浓度和其他类型的紫外保护剂。同时，该浓度的抗坏血酸在生物相容性的孢子萌发测定中，T069的孢子萌发率为93.4±1.82％，与CK没有显著性差异；菌丝直径为 5.0cm，显著高于对照，表明其对菌丝生长还具有一定的促进作用。因此，选择 100μg/mL的抗坏血酸作为紫外保护剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、分生孢子悬浮液的制备：将菌株T.brev T069转接于PDA培养基上活化培养，于20～30℃恒温培养7～11d出现绿色孢子，用无菌水冲洗孢子，并稀释为0.8～1.2×10⁸CFU/mL的种子液备用；

2.如权利要求1所述的一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述S1分生孢子悬浮液的制备：将菌株T.brevT069转接于PDA培养基上活化培养，于28℃恒温培养9d可见大量绿色孢子，用无菌水冲洗孢子，并稀释为1×10⁸CFU/mL的种子液备用。

3.如权利要求1所述的一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述S2发酵基质的制备：木薯皮渣和水的质量体积比g/mL为5～9：10。

4.如权利要求1所述的一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述S3分生孢子粉的制备是将T.brev T069孢子悬浮液按照1％的接种量加入到组培瓶中摇匀，于28℃恒温培养箱中静置培养3d，其中第2d时将其取出摇匀以打断菌丝一次，之后将经过T.brevT069发酵后的木薯皮渣晾干后，用粉碎机粉碎5s，共粉碎2次，粉碎间隔为5min，之后将其过325目筛，得到T.brevT069分生孢子粉。

5.如权利要求1所述的一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述S3所述可湿性粉剂中包括以下质量百分比原料：孢子粉20％、湿润剂1％、分散剂5％、紫外保护剂1％，余量为载体。

6.如权利要求1或5所述的一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述载体为白炭黑、硅藻土、高岭土、滑石粉、木薯皮粉中的一种，载体浓度为1000～5000μg/ml。

7.如权利要求1或5所述的一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述湿润剂为十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、拉开粉BX、AB-3中的一种。

8.如权利要求1或5所述的一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述分散剂为羧甲基纤维素钠、木质素磺酸钠、亚甲基二萘磺酸钠中的一种。

9.如权利要求1或5所述的一种木霉菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于：所述紫外保护剂为糊精、抗坏血酸、荧光素钠中的一种，其浓度为100～1000μg/ml。