CN114277136A - 一种基于ecDNA上的肺癌基因标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域，具体涉及一种基于ecDNA上的肺癌基因标志物及其应用。本发明通过大量研究发现，MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2的痰液或肺泡灌洗液ecDNA生物标志物在肺癌患者与对照样本(健康人样本)中的表达值具有统计学上的显著差异，采用上述六个基因同时用于肺癌的诊断，其诊断准确率可达到90％以上，有望用于肺癌的早期分期诊断和预后判断，提高治疗的有效性和患者的生存率。

Description

一种基于ecDNA上的肺癌基因标志物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和肿瘤标志物医学技术领域，具体涉及一种基于ecDNA上的肺癌基因标志物及其应用。

背景技术

在全世界范围内，肺癌的发病率和死亡率均位居恶性肿瘤首位。肺癌早期病情隐匿，通常无任何症状，大部分患者在发现时已处于中晚期，其5年生存率不足20％，尤其对于晚期肺癌患者，其预后更差，总体5年生存率低于5％。而早期肺癌患者通过手术治疗，其5年生存率能提高20％～30％，A期患者生存率超过90％。因此，早发现早诊断出有症状的肺癌患者和及时从高危人群中筛选出无症状患者，是对患者获得长期生存和提高生存质量的重要途径。

目前肺癌早期诊断的方法主要是低剂量CT，但此方法具有较高的假阳性率，为后续的诊疗造成较大的困难。此外，血清学的肿瘤标志物作为辅助诊断也是常用的临床手段，如癌胚抗原(CEA)，细胞角蛋白19片段21-1(CYFRA 21-1)以及鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)等，但这些传统肿瘤标志物诊断肺癌的准确性和灵敏性十分有限，尤其小结节型的肺癌检出率更低。因此，急需寻找一种简单、灵敏度高的方法进行肺癌的早期筛查。

染色体外DNA(extrachromosomal DNA，ecDNA)是近年来肿瘤学研究领域的新热点，它是一种从染色体上脱落存在于染色体外，高度开放、高表达癌基因的环状DNA颗粒。研究发现，ecDNA几乎不存在于人类正常细胞，而在大多数癌症细胞中大量存在。且由于ecDNA携带大量的癌基因，可自我复制，促使肿瘤达到高基因拷贝数，同时通过其非染色质遗传机制维持肿瘤内的遗传异质性，加速肿瘤进化。因此，ecDNA可以作为一种潜在的生物标记物进行肿瘤的预测。

随着分子生物学的发展，已经发现大量与肺癌早期筛查、预后判断和复发预测相关的分子标志物，如基因突变、基因表达、基因甲基化和非编码RNA等。但ecDNA上相关基因还未有研究，因此，基于ecDNA的特性选择合适的基因进行肺癌的早期筛查、预后判断将具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基于ecDNA上的肺癌基因标志组合物，包括MDM2基因、TERT基因、TRIP13基因、PTPRB基因、CAND1基因和CCT2基因。将上述六个基因作为生物标志物进行肺癌辅助诊断，能够显著提高肺癌诊断的准确性和灵敏性。

鼠双微体基因2(Mouse double-minute-2，MDM2)是一种凋亡抑制蛋白的癌基因，其生物作用是增强细胞活力，使细胞生存期延长，促进细胞增生及肿瘤的生长。MDM2基因在大多数人类肿瘤组织中表达且与多种类型的恶性肿瘤转移相关。研究发现，MDM2在肺癌中表达上调，且MDM2的上调促进肿瘤的恶性增殖和转移。对非小细胞肺癌标本检测发现，MDM2阳性率为68％，且进展期肺癌MDM2阳性率较早期更高，表明MDM2基因的过度表达可能是肺癌发生的一个重要标志。

端粒酶逆转录酶基因(Telomerase reverse ranscriptase，TERT)是端粒酶的限速酶和蛋白亚单位，在肿瘤的发生、诊断、治疗预后等研究中发挥重要作用。研究者使用原位杂交技术在细胞水平研究正常细胞和不同发展阶段肿瘤细胞中TERT的表达情况，发现在肺和结肠肿瘤发生的早期TERT的表达开始升高，在癌变过程中表达逐渐增加，抑制肿瘤细胞的TERT会抑制肿瘤细胞的增殖生长。临床研究表明，80％～85％的肺癌组织TERT基因表达阳性，而在癌旁正常组织几乎均为阴性，表明端粒酶表达在肺癌的发生发展中起重要作用。

甲状腺激素受体因子(Thyroid hormone receptor interactor 13，TRIP13)是人类肿瘤中与染色体不稳定性相关的最重要的基因之一，TRIP13过表达可触发过早的有丝***检查点沉默，诱发非整倍性，从而促进癌症发生。研究发现，无论体内或体外实验中，TRIP13能促进多种癌细胞的增殖、转移及侵袭能力。在肺癌中，研究者发现与癌旁组织相比，TRIP13在肿瘤组织中表达明显增高，且TRIP13阳性表达率与肿瘤分化程度、有无***转移及TNM分期有显著相关性。

PTPRB(Protein tyrosine phosphatase，receptor type B)基因编码的蛋白是蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族的成员，能够调节多种细胞过程的信号分子，包括细胞生长、生化、有丝***周期和致癌转化。在NSCLC患者中，PTPRB可以通过调节磷酸化作用调节肿瘤生长，PTPRB基因下调与患者的OS密切相关，可以独立作为NSCLC患者预后的生物标记物。

CCT2基因(chaperonin containing TCP1 subunit 2)编码的蛋白质是一种分子伴侣。研究发现，在肺癌中，CCT2可通过与PDGFRα相互作用，促进NSCLC细胞的生长，且CCT2基因的表达与肺腺癌预后呈相关关系，其表达量越高则患者的预后越差。

CAND1基因(cullin associated and neddylation dissociated 1)编码泛素连接酶的调节因子。研究发现，与癌旁组织相比，NSCLC组织中CAND1的表达增加，且靶向CAND1治疗后能抑制肺癌细胞的增殖、细胞周期进程和细胞迁移。

本发明通过大量的前期研究筛选得到MDM2基因、TERT基因、TRIP13基因、PTPRB基因、CAND1基因和CCT2基因与肺癌的发生发展和预后密切相关，且上述六个基因彼此独立，不存在连锁不平衡，采用上述六个基因同时用于肺癌的诊断，其诊断准确率可达到90％以上。

本发明的目的之二在于提供上述基因标注组合物在制备肺癌检测试剂中的应用。

本发明的目的之三在于提供上述基因标注组合物的检测试剂在制备肺癌检测试剂中的应用。

本发明的目的之四在于提供一种用于检测肺癌的引物和探针，包括MDM2基因引物探针组、TERT基因引物探针组、TRIP13基因引物探针组、PTPRB基因引物探针组、CAND1基因引物探针组和CCT2基因引物探针组。

具体地，MDM2基因引物探针组：

上游引物为：CCTTCATCTTCACATTTGG，如SEQ ID NO:1所示，

下游引物为：GTCGTTCACCAGATAATTC，如SEQ ID NO:2所示，

探针序列为：TTCTGTCTCACTAATTGCTCTCCTT，如SEQ ID NO:3所示；

TERT基因引物探针组：

上游引物为：TGGAGAACAAGCTGTTTG，如SEQ ID NO:4所示；

下游引物为：GTCCTGAGGAAGGTTTTC，如SEQ ID NO:5所示；

探针序列为：TCACCAACAAGAAATCATCCAC，如SEQ ID NO:6所示；

TRIP13基因引物探针组：

上游引物为：CAGACAAGAACGTCAACA，如SEQ ID NO:7所示；

下游引物为：CCTGCTTGAAAGTCTAATTG，如SEQ ID NO:8所示；

探针序列为：CAACCTCATCACCTGGAACCG，如SEQ ID NO:9所示；

PTPRB基因引物探针组：

上游引物为：GGATGAGGTCTCTTGTAG，如SEQ ID NO:10所示；

下游引物为：CTGTGTTTCTTCCTTTCC，如SEQ ID NO:11所示；

探针序列为：AGCAGCACCACAGAATCATTGAAG，如SEQ ID NO:12所示；

CAND1基因引物探针组：

上游引物为：CCACATCTTTACAATGAAAC，如SEQ ID NO:13所示；

下游引物为：GTGTGTACATACACTCAAA，如SEQ ID NO:14所示；

探针序列为：ATCCAGACCATCATCAACCGTATGT，如SEQ ID NO:15所示；

CCT2基因引物探针组：

上游引物为：GGTTCAAGATGATGAAGTTG，如SEQ ID NO:16所示；

下游引物为：GATGGTCTGTGGATGAATC，如SEQ ID NO:17所示；

探针序列为：TGATGGCACTACCTCTGTTACCG，如SEQ ID NO:18所示。

其中，探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光猝灭基团。

本发明的目的之五在于提供上述引物和探针在制备肺癌检测试剂中的应用。

本发明的目的之六在于提供一种肺癌检测试剂盒，包括上述的检测引物和探针。

肺癌的始发部位是支气管粘膜上皮或肺泡上皮，癌变过程中的脱落细胞可随痰液或支气管肺泡灌洗液排出体外，上述检测试剂针对性检测的生物标志物即为痰液或肺泡灌洗液中的ecDNA生物标志物，检测方法为qPCR法，材料获取简单、创伤小，易被客户接受。

本发明利用人血液或体液ecDNA作为生物标志物区分早期肺癌患者时具有快速、无伤害、准确率高、特异性强等优点，可动态检测肺癌患者ecDNA上相关基因的变化，能够辅助肺癌早期诊断和预后，延长患者生存期。

本发明所提供的试剂盒是通过qPCR技术对痰液或肺泡灌洗液中的ecDNA上的相关基因进行检测的，所述方法包括以下步骤：

(1)疑似肺癌患者痰液或肺泡灌洗液的获取；

(2)痰液或肺泡灌洗液ecDNA的提取与纯化；

(3)ecDNA生物标志物MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2的组合进行表达检测和关联性分析；

该步骤中具体是采用荧光定量PCR法检测疑似肺癌患者样本与对照样本中ecDNA上MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2生物标志物(为受损的染色体上线性MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2基因，脱落下来的碎片随机地缝合在一起，组装形成的染色体外环状DNA)的表达量与正常样本的生物标记物表达量相比较进行关联分析；该步骤中qPCR扩增体系和扩增程序是大量的实验后最终确定的合适的体系和程序。

(4)受检者样本进行结果判读。

该步骤具体是将肺癌患者和对照样本表达量检测结果进行ROC曲线分析，获得对应每个基因的阈值，进而根据阈值进行意思肺癌患者样本的结果判读。

发明人通过大量研究发现，MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2的痰液或肺泡灌洗液ecDNA生物标志物在肺癌患者与对照样本(健康人样本)中的表达值具有统计学上的显著差异，采用上述六个基因同时用于肺癌的诊断，其诊断准确率可达到90％以上，有望用于肺癌的早期分期诊断和预后判断，提高治疗的有效性和患者的生存率。

附图说明

图1为实施例1中肺癌患者与健康人痰液样本检测结果；

图2为实施例1中MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2基因的ROC曲线；

图3为实施例2中标志物基因在阳性细胞检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。

以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。

实施例1肺癌患者痰液或肺泡灌洗液样本与健康人痰液样本检测

收集30例肺癌患者的痰液或肺泡灌洗液样本及40例健康人的痰液样本，提取ecDNA，采用qPCR方法进行MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2基因的检测和测定，具体方法如下：

(1)样本ecDNA的获取

a、将收集到的痰液样本取200μL至于干净的1.5mL离心管中，加入200μL细胞裂解液(10mM Tris-cl(PH8.0)，0.1mol/L EDTA，0.5％SDS、15mMNaCl)，轻轻上下颠倒混匀数次，室温静置1-5min，待细胞充***解，溶液应变清亮(但颜色偏黑色)；

b、加入350μL中和缓冲液(Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，轻轻上下颠倒混合数次，充分混匀，避免剧烈震荡，室温下12000g离心10min；

c、小心吸取上清转移到***收集管的离心吸附柱内，室温下12000g离心1min，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中；

d、加入500μL漂洗液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)，80％乙醇(Ethanol))于离心吸附柱中，室温下12000g离心30s，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中；

e、再次加入500μL漂洗液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)，80％乙醇(Ethanol))于离心吸附柱中，室温下12000g离心30s，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中，将离心吸附柱开盖再次离心2min，彻底除去残余漂洗液；

f、小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的1.5mL灭菌离心管中，向硅胶吸附膜的中央加入100μL洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 7.5)；1mM EDTA(pH7.5))，室温放置1min后，12000g离心1min收集所需要的DNA；

g、向(f)步骤中所得的收集液中加入5Units的外切酶(exoⅢ)和1mmol的ATP，涡旋震荡混匀，37℃孵育3h；

h、向(g)混合液中加入终浓度为0.5mol/L的EDTA，70℃加热30min灭活，即获取所需的ecDNA。所获取的ecDNA存放于2-8℃，如果要长期存放，可以放置在-20℃。

(2)qPCR检测

按照表1的引物及探针序列合成对应的序列，然后按照表2的体系进行扩增体系的配制，并按照表3的扩增程序在ABI 7500荧光定量PCR仪中进行程序扩增，获得每个样品的Ct值，并对结果进行分析。

表1各基因的引物及探针序列

表2 qPCR扩增体系

试剂	终浓度
		EPI HS taq	0.75U/20μL
Buffer	～
		MgCl<sub>2</sub>	3.5mM
dNTP	10mM
		MDM2-F	0.15μM
MDM2-R	0.15μM
		MDM2-Probe	0.1μM
TERT-F	0.2μM
		TERT-R	0.2μM
TERT-Probe	0.15μM
		TRIP13-F	0.15μM
TRIP13-R	0.15μM
		TRIP13-Probe	0.1μM
PTPRB-F	0.2μM
		PTPRB-R	0.2μM
PTPRB-P	0.2μM
		CAND1-F	0.15μM
CAND1-R	0.15μM
		CAND1-P	0.2μM
CCT2-F	0.3μM
		CCT2-R	0.3μM
CCT2-P	0.3μM
		模板DNA	10～100ng/20μL
dd H<sub>2</sub>O	～

表3扩增程序

(3)样品阈值的获得

受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic Curver，ROC曲线)分析目的基因的诊断价值：将肺癌患者痰液或肺泡灌洗液与健康人痰液样本ecDNA的ct值带入计算，获得多对灵敏度及1-特异性值，绘制ROC曲线，根据约登指数(敏感度+[1-(1-特异性))计算Cut-off值，由计算得到的Cut-off值判断样品的阳/阴性。

按照肺癌患者和健康志愿者的基因检测结果绘制ROC曲线，根据ROC曲线结果获得各基因的Cut-off值，为后续患者的诊断提供依据，其中肺癌患者和健康人痰液样本检测结果如图1所示，其中部分样本未检测到Ct值，则未在图中表示。各基因的ROC曲线如图2所示。

由数据分析可知，MDM2基因的Cut-off值为35，曲线下面积AUC为0.913，说明结果可信。TERT基因的Cut-off值为37，AUC为0.849，结果较为可信。TRIP13基因的Cut-off值为36，曲线下面积AUC为0.883，结果可信度较高。PTPRB基因的Cut-off值为37，曲线下面积为0.891，结果可信。CAND1基因的Cut-off值为38，曲线下面积为0.805，CCT2基因的Cut-off值为35，曲线下面积为0.832，结果均可信。

(4)结果判读

通过分析发现，30个肺癌患者样本中大多数样本均检测到2～5个基因成阳性，少数样本检测到1个基因呈阳性，没有样本6个基因呈全阴性状态。健康人样本中，少数几个样本检测到1个基因呈阳性，其余样本均呈现6个基因全阴性。因此，将检测到2个及以上基因为阳性时则判定该样本阳性，只检测到1个样本阳性或所有样本均阴性时则判定该样本为阴性。

实施例2细胞系样本进行检测体系的验证

选择人肺癌细胞系：A549、H1299、H1703、H460、H292等5个阳性细胞系和K562、MCF7共2个细胞系作为阴性对照(所有细胞系均从ATCC购买得到)，以H₂O为空白对照，进行MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2标志物基因的检测和鉴定。具体方法如下：

按照痰液提取方法提取各细胞系样本的ecDNA，按照表2、表3进行扩增体系的配制和最终的qPCR扩增，获得7个细胞系及对照样本的Ct值，按照阈值设定原则进行结果的判读。

不同细胞系中各标志物基因检测结果如图3所示。根据每个基因的cut-off对细胞系样本进行检测，发现5个阳性细胞系样本各标志物基因均呈阳性，对照组中阴性细胞系及H₂O均为阴性，进一步说明了本检测方法的准确性。

实施例3ecDNA的生物标志物在疑似肺癌样本的检测

收集疑似肺癌患者的痰液样本(20例)，按照实施例1所述方法检测MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2基因的表达情况，结果见下表4：

表4疑似肺癌患者样本检测

由表4可知，在20例疑似肺癌患者中，MDM2基因的阳性率为45％(9/20)，TERT基因的阳性率为35％(7/20)，TRIP13基因的阳性率为30％(6/20)，PTPRB基因的阳性率为30％(6/20)，CAND1基因的阳性率为25％(5/20)，CCT2基因的阳性率为35％(7/20)。

将有2个或2个以上基因检测阳性的样本定义为肺癌样本，则共有11个样本检测阳性。随后对此20例疑似患者进行随访，发现有10例病人诊断为肺癌患者(90.9％，10/11)，而此10例患者均含有2个及2个以上基因表达阳性。说明通过对疑似肺癌患者痰液ecDNA上MDM2、TERT、TRIP13、PTPRB、CAND1、CCT2标志物基因检测可以进行肺癌的辅助判断。

在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种基于ecDNA上的肺癌基因标志物及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 1

ccttcatctt cacatttgg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 2

gtcgttcacc agataattc 19

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 3

ttctgtctca ctaattgctc tcctt 25

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 4

tggagaacaa gctgtttg 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 5

gtcctgagga aggttttc 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 6

tcaccaacaa gaaatcatcc ac 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 7

cagacaagaa cgtcaaca 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 8

cctgcttgaa agtctaattg 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 9

caacctcatc acctggaacc g 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 10

ggatgaggtc tcttgtag 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 11

ctgtgtttct tcctttcc 18

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 12

agcagcacca cagaatcatt gaag 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 13

ccacatcttt acaatgaaac 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 14

gtgtgtacat acactcaaa 19

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 15

atccagacca tcatcaaccg tatgt 25

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 16

ggttcaagat gatgaagttg 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 17

gatggtctgt ggatgaatc 19

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Synthesis)

<400> 18

tgatggcact acctctgtta ccg 23

Claims (7)

1.一种基于ecDNA上的肺癌基因标志组合物，其特征在于，包括MDM2基因、TERT基因、TRIP13基因、PTPRB基因、CAND1基因和CCT2基因。

2.权利要求1所述的基因标志组合物在制备肺癌检测试剂中的应用。

3.权利要求1所述的基因标志组合物的检测试剂在制备肺癌检测试剂中的应用。

4.用于检测肺癌的引物和探针，其特征在于，包括MDM2基因引物探针组、TERT基因引物探针组、TRIP13基因引物探针组、PTPRB基因引物探针组、CAND1基因引物探针组和CCT2基因引物探针组。

5.根据权利要求4所述的用于检测肺癌的引物和探针，其特征在于，

MDM2基因引物探针组：

上游引物为：CCTTCATCTTCACATTTGG，如SEQ ID NO:1所示，

下游引物为：GTCGTTCACCAGATAATTC，如SEQ ID NO:2所示，

探针序列为：TTCTGTCTCACTAATTGCTCTCCTT，如SEQ ID NO:3所示；

TERT基因引物探针组：

上游引物为：TGGAGAACAAGCTGTTTG，如SEQ ID NO:4所示；

下游引物为：GTCCTGAGGAAGGTTTTC，如SEQ ID NO:5所示；

探针序列为：TCACCAACAAGAAATCATCCAC，如SEQ ID NO:6所示；

TRIP13基因引物探针组：

上游引物为：CAGACAAGAACGTCAACA，如SEQ ID NO:7所示；

下游引物为：CCTGCTTGAAAGTCTAATTG，如SEQ ID NO:8所示；

探针序列为：CAACCTCATCACCTGGAACCG，如SEQ ID NO:9所示；

PTPRB基因引物探针组：

上游引物为：GGATGAGGTCTCTTGTAG，如SEQ ID NO:10所示；

下游引物为：CTGTGTTTCTTCCTTTCC，如SEQ ID NO:11所示；

探针序列为：AGCAGCACCACAGAATCATTGAAG，如SEQ ID NO:12所示；

CAND1基因引物探针组：

上游引物为：CCACATCTTTACAATGAAAC，如SEQ ID NO:13所示；

下游引物为：GTGTGTACATACACTCAAA，如SEQ ID NO:14所示；

探针序列为：ATCCAGACCATCATCAACCGTATGT，如SEQ ID NO:15所示；

CCT2基因引物探针组：

上游引物为：GGTTCAAGATGATGAAGTTG，如SEQ ID NO:16所示；

下游引物为：GATGGTCTGTGGATGAATC，如SEQ ID NO:17所示；

探针序列为：TGATGGCACTACCTCTGTTACCG，如SEQ ID NO:18所示。

6.权利要求4～5所述的引物和探针在制备肺癌检测试剂中的应用。

7.一种肺癌检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求2或3所述的检测引物和探针。

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