CN115803433A

CN115803433A - 序列偏倚降低的热稳定连接酶

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Publication number: CN115803433A
Application number: CN202180049533.7A
Authority: CN
Inventors: 瑞安·查尔斯·赫勒; 托马斯·威廉·肖恩费尔德; 帕特里克·巴查德
Original assignee: Kaijie Beverly Co ltd
Current assignee: Kaijie Beverly Co ltd
Priority date: 2020-07-17
Filing date: 2021-06-17
Publication date: 2023-03-14
Also published as: EP4182448A1; US20230340449A1; WO2022015461A1

Abstract

本发明涉及DNA和/或RNA连接酶、其氨基酸序列、其核酸序列和由这些核酸序列编码的DNA和/或RNA连接酶蛋白质，以及包含所述DNA和/或RNA连接酶的核酸或氨基酸序列的部分的核酸或氨基酸构建体。本发明还涉及将所述DNA和/或RNA连接酶用于分子生物学测定法和分子诊断应用的方法以及包含所述DNA和/或RNA连接酶的试剂盒。

Description

序列偏倚降低的热稳定连接酶

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是酶领域，更特别是连接酶领域。本发明也属于单链核酸环化领域。

背景技术

本发明涉及连接酶，特别是能够进行模板非依赖性分子间和/或分子内核酸分子连接的热稳定连接酶。本发明还包括使用热稳定连接酶的方法，特别是在单链核酸分子环化中。

例如聚合酶和连接酶的酶是现代分子生物学和分子诊断学的主力军。由于分子生物学和分子诊断学领域取得的巨大进步，例如通过下一代测序(NGS)、聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)和数字PCR(dPCR)的发展和改进，迫切需要高效的酶来进一步改进现有的方法和测定法，并为这些技术领域开发新方法。

连接酶是可以催化两个分子(例如核酸分子)接合的酶。核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)连接酶在噬菌体T4感染细胞中很丰富并且催化5'-磷酰基末端核酸供体(RNA或DNA)与3'-羟基末端核酸受体的连接(Silber等人,1972.PNAS,第69卷,第10期,doi:10.1073/pnas.69.10.3009)。

RNA连接酶1(Rnl1)酶家族，其中T4 Rnl1是创始成员，是一类负责修复体内tRNA程序性断裂从而对抗宿主防御机制的酶。T4 Rnl1能够通过催化单链RNA或DNA的5'-磷酸和3'-羟基末端之间形成磷酸二酯键，在体外连接单链核酸(Omari等人,2006.The Journalof Biological Chemistry,第283卷,第3期,doi:10.1074/jbc.M509658200)。这包括两个不同的单链DNA和/或RNA分子的分子间连接或单个核酸分子的分子内连接(环化)，而不需要桥接或夹板核酸分子。T4 Rnl1对于许多分子生物学方法至关重要，包括但不限于RNA的3'端标记、寡核苷酸合成、cDNA接头连接、cDNA末端快速扩增(RLM-RACE)、用于PCR的单链引物产物的连接(例如Kaluz等人,1995.Biotechniques,第19卷,第2期,186；Tessier等人,1986.Analytical Biochemistry,第158卷,第1期,doi:10.1016/0003-2697(86)90606-8；Middleton等人,1985.Analytical Biochemistry,第144卷,第1期,doi:10.1016/0003-2697(85)90091-0；Heckler等人,1984.Biochemistry,第23卷,第7期,doi:10.1021/bi00302a020；Brennan等人,1983.Methods in Enzymology,第100卷,doi:10.1016/0076-6879(83)00044-0；Edwards等人,1991.Nucleic Acids Research,第19卷,第19期,doi:10.1093/nar/19.19.5227；Liu和Gorovsky,1993.Nucleic Acids research,第21卷,第21期,doi:10.1093/nar/21.21.4954)。虽然能够环化DNA和RNA，但T4 Rnl1的反应效率不高，通常需要分子拥挤试剂和长的孵育时间(Harrison和Zimmerman,1984.Nucleic AcidsResearch,第12卷,第21期,doi:10.1093/nar/12.21.8235)。此外，由于T4 Rnl1是一种嗜温酶，反应必须在低温下进行(Silber等人,1972.PNAS,第69卷,第10期,doi:10.1073/pnas.69.10.3009)，此时模板单链核酸可能形成不需要的二级结构，这对反应效率产生不利影响。

先前已经表征的嗜热Rnl1酶的一些实例包括来自感染真细菌海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)的嗜热噬菌体的RM378 Rnl1连接酶和感染嗜热真细菌水管致黑栖热菌(Thermus scotoductus)的TS2126Rnl1连接酶(Blondal等人,2003.Nucleic AcidsResearch,第31卷,第24期,doi:10.1093/nar/gkg914；Blondal等人,2005.Nucleic AcidResearch,第33卷,第1期,doi:10.1093/nar/gki149)。这两种酶都具有适度的热稳定性，最佳温度大约在60-70℃的范围内，预计所述条件会松弛单链模板二级结构。TS2126 Rnl1连接酶显示出更高水平的单链连接效率，有利于分子内环化反应。所述酶由Epicentre商业化为CircLigase ssDNA连接酶，它以ATP依赖性方式催化单链环化，其中端到端线性或环状多联体形成率低。随后，以允许分离主要腺苷酸化形式的方式从细胞中纯化TS2126 Rnl1连接酶。这允许在以ATP非依赖性方式进行的反应中提高活性和提高环化效率。所述酶的主要腺苷酸化形式可作为CircLigase II从Epicentre购得。TS2126 Rnl1连接酶的热稳定性模板非依赖性连接活性已被用于生产单链环状模板，从而用于滚环扩增(例如Gyanchandani等人,2018.Scientific Reports,第8卷,第1期,doi:10.1038/s41598-018-35470-9)和滚环转录、等温核酸扩增方法(Murakami等人,2008.Nucleic Acids Research,第37卷,第3期,doi:10.1093/nar/gkn1014)、用于法医应用的低拷贝片段化DNA扩增(Tate等人,2012.FSIGenetics,第6卷,第2期,doi:10.1016/j.fsigen.2011.04.011)，以及若干测序文库制备工作流程(例如Lamm等人,2011.Genome Research,第21卷,doi:10.1101/gr.108845.110；Lou等人,2013.PNAS,第110卷,第49期,doi:10.1073/pnas.1319590110；Heyer等人,2015.Nucleic Acids Research,第43卷,第1期,doi:10.1093/nar/gku1235)，包括全基因组亚硫酸氢盐测序(Miura等人,2019.Nucleic Acids Research,第47卷,第15期,Doi:10.1093/nar/gkz435)。Polidoros等人(2006.BioTechniques第41卷,第1期,doi:10.2144/000112205)描述了使用模板非依赖性TS2126 Rnl1连接酶作为cDNA末端随机扩增(RACE)的cDNA末端扩增方法中的一个步骤。

US20040058330A1描述了使用RM378 Rnl1连接酶或TS2126 Rnl1连接酶的方法，例如用于核苷酸或核酸的连接、寡核苷酸聚合物或重组基因产物的合成、探针与核酸的连接、核酸的扩增、3'标记与mRNA的连接、核酸文库的形成以及寡核苷酸的测序反应。

US20040259123A1公开了一种耐热DNA连接酶，其通过克隆原始极端嗜热菌敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)K1菌株的DNA连接酶基因获得。所述连接酶的活性在100℃热处理1小时不降低。

US20090061481A1描述了一种显示高耐热性和高DNA结合能力的DNA连接酶。所述耐热DNA连接酶来源于嗜热细菌如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus Stearothermophilus)、超嗜热细菌如海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；嗜热古细菌如火山热原体(Thermoplasmavolcanium)；和超嗜热古细菌如敏捷气热菌。

WO2000026381A2公开了一种热稳定连接酶，当密封一对与靶序列杂交的寡核苷酸探针之间的连接点时(其中与寡核苷酸探针存在不匹配，其3'端在紧邻连接点的碱基处邻接连接点)，其保真度比T4连接酶高100倍并且保真度比野生型嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)连接酶高6倍。

WO1994002615A1描述了一种来自超嗜热古细菌的热稳定DNA连接酶，它在约30℃至约80℃的温度下催化模板依赖性连接。

US20110053147A1公开了一种修饰的热稳定DNA连接酶，其与野生型相比具有更高的DNA结合活性，它可以通过用非负电荷的氨基酸取代来自嗜热细菌、超嗜热细菌、嗜热古细菌或超嗜热古细菌的热稳定DNA连接酶的C末端螺旋部分的N末端侧存在的带负电荷的氨基酸来获得。

WO2004027054A1描述了热稳定的TS2126 Rnl1连接酶的酶活性表征及其在RACE方案中的用途。

WO2010094040A1描述了线性单链DNA的模板非依赖性分子内连接，其通过使用高度腺苷酸化的TS2126 Rnl1连接酶并向连接反应混合物任选添加甜菜碱来进行。

WO2011123749A1描述了一种在ATP依赖性反应中生成腺苷酸化寡核苷酸制剂的方法，其通过使用与从热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、深海热球菌(Pyrococcus abyssii)、噬菌体KVP40、耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)、Autographica California、海洋红嗜热盐菌和噬菌体TS2126获得的连接酶具有90％序列同一性的连接酶来进行。

US20060240451A1描述了使用TS2126 Rnl1连接酶连接线性第一链cDNA分子以及通过滚环复制(RCR)或滚环转录(RCT)扩增环状cDNA分子的方法。

US9217167B2描述了使用TS2126 Rnl1连接酶对有限量的片段化染色体DNA进行磷酸化和分子内连接，接着使用滚环DNA合成来扩增DNA的方法。优化的反应条件允许多步过程在单个反应管中发挥作用，而无需干预纯化步骤。

尽管TS2126 Rnl1连接酶的模板非依赖性连接效率有所提高，但仍有一些特征并不理想。这些包括模板偏倚，因为单链分子末端的末端核苷酸强烈影响反应效率，例如具有5'-G和3'-T的底物环化效率最高，而具有末端胞嘧啶碱基的底物的连接效率非常低(Nunez等人,2008.应用环状连接酶为少量片段化DNA的滚环扩增提供模板(Application ofCircular Ligase to Provide Template for Rolling Circle Amplification of LowAmounts of Fragmented DNA),第十九届人类鉴定国际研讨会,2008,7页)。这些还包括缓慢的反应速率，因为有效的连接需要相对较长的孵育时间和相比于底物过量的酶，并且难以处理的底物可能需要很长的孵育时间和/或添加添加剂如甜菜碱(Heyer等人,2015.Nucleic Acids Research,第43卷,第1期,doi:10.1093/nar/gku1235)。虽然当从混合物中省略ATP时，连接酶的高度腺苷酸化形式比低腺苷酸化形式表现出高得多的单链DNA环化效率，但有效的反应需要酶的摩尔浓度大于底物的摩尔浓度。此外，两种形式的连接酶在使用大小相同或非常相似但序列组成差异很小的底物时显示出分子内连接效率的显著差异(WO2010094040A1)。

由于连接酶和连接反应在现代分子生物学和分子诊断方法和测定法中的重要性，因此非常需要改进的连接酶来克服这些缺陷。

发明内容

为了在足够高以松弛单链核酸二级结构的温度下进行的模板非依赖性分子内连接反应中提高效率并减少模板偏倚，本发明人分析了宏基因组测序研究并分离了先前未表征的与RNA连接酶1具有蛋白质家族同源性的基因产物。与本领域已知的连接酶相比，所鉴定的热稳定连接酶候选物显示出优异的性能，并且所述连接酶在众多分子生物学方法和测定法(例如滚环扩增和核酸测序文库制备)中得到充分确立。

本发明涉及腺苷酸化或未腺苷酸化的热稳定连接酶，其由以下组成或包含以下：根据SEQ ID NO.2的氨基酸序列或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％氨基酸序列同一性的多肽或其具有连接酶活性的衍生物或片段。

本发明进一步涉及编码热稳定连接酶的核酸分子，其由以下组成或包含以下：根据SEQ ID NO 1的核酸序列或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的核酸序列。

本发明还涉及热稳定连接酶在滚环扩增、滚环转录、等温核酸扩增、低拷贝片段化核酸扩增、测序文库制备、将RNA和/或DNA接头序列连接到核酸分子等的用途。

此外，本发明涉及一种试剂盒，其包含根据SEQ ID NO 2的连接酶或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％氨基酸序列同一性的多肽或其具有连接酶活性的衍生物或片段。

具体实施方式

本发明涉及热稳定DNA和/或RNA连接酶、其氨基酸序列、其核酸序列和由该核酸序列编码的模板DNA和/或RNA连接酶蛋白，以及包含所述DNA和/或RNA连接酶的核酸或氨基酸序列的部分的核酸或氨基酸构建体。根据本发明的热稳定DNA和/或RNA连接酶允许单链核酸的改进且更有效的模板非依赖性分子内连接。根据本发明的热稳定DNA和/或RNA连接酶进一步允许单链核酸的分子间连接。

与本领域已知的Rnl1连接酶不同，根据本发明的连接酶是通过使用不同的程序分离的。本发明人不是基于已知生物体的遗传分析或DNA测序来鉴定编码基因，而是通过来自环境宏基因组样本的非常弱的同源性意外地鉴定了这些连接酶，所述样本含有来自不同生物体和生物体类型的基因和基因片段的复杂混合物。因为这些基因的来源是未知的并且不知道所述基因是否在体内表达或活跃，所以没有期望在体外分离具有所需活性的连接酶。事实上，在缺乏模板偏倚和改进环化单链DNA的反应动力学方面，根据此处描述的方法分离的连接酶显示出优于本领域已知连接酶的几个优点(参见实施例3和4)。这些改进的特性是影响已知RNA连接酶在为各种分析方法提供完整、高效的单链DNA环状材料方面的效率的常见限制(WO2010094040A1；Nunez等人,2008.应用环状连接酶为少量片段化DNA的滚环扩增提供模板)。这种不存在可检测模板偏倚和单链DNA与GBS-3074连接酶的快速连接动力学的独特组合允许从少量随机剪切的基因组DNA中产生更高产量的环状DNA，用于滚环扩增和测序分析(参见实施例5)。

此外，GBS-3074酶具有独特的特性，即在单链环化反应中具有高活性并且与广泛范围的ATP浓度相容(参见实施例2)。已知过量的ATP会在反应中与腺苷酸化底物竞争，从而导致中间反应产物(包括腺苷酸化模板和腺苷酸化酶)的“死端”累积，然后与DNA末端接合环化步骤不相容(Zhelkovsky,A.和McReynolds,L.,Nucleic Acids Research,2011(39)；e117；参见WO2010094040A1)。为避免这种情况，TS2126酶先前以高度腺苷酸化形式分离，并在ATP不存在的情况下进行环化反应(参见WO2010094040A1)。不同的是，由于GBS-3074酶对ATP的耐受性很强，因此本发明人能够使用疏水相互作用色谱法以未腺苷酸化形式分离所述酶，然后在高浓度ATP存在下进行环化反应。与过量ATP的相容性和利用酶的未腺苷酸化形式的能力很重要，因为它允许与来自先前酶促反应的残留ATP相容，并允许所述酶在ATP存在下进行多轮的自腺苷酸化和催化，这导致更高效和完全的环化反应。

在随后被鉴定为执行相似细胞功能的酶之间显示出非常高水平的序列差异，这种情况并不少见，尤其是对于病毒衍生的基因产物。例如，在两个先前描述的源自RM378病毒和TS2126病毒的热稳定RNA连接酶1家族成员的情况下(Blondal等人,2003.Nucleic AcidsResearch,第31卷,第24期,doi:10.1093/nar/gkg914；Blondal等人,2005.Nucleic AcidResearch,第33卷,第1期,doi:10.1093/nar/gki149)，彼此的序列同一性仅为29.3％，并且与T4 Rnl1连接酶仅显示24.4％至29.3％的序列同一性。此外，对于本发明人从宏基因组序列中分离出的先前未表征的基因产物，尽管彼此之间以及与RNA连接酶1家族成员的序列同一性远低于60％，但这些连接酶被证明显示单链环化连接活性(参见表3)。

根据本发明的热稳定DNA和/或RNA连接酶显示出优于本领域已知的和市售的DNA和/或RNA连接酶的若干改进。与TS2126 Rnl1连接酶(迄今为止改进最多并且经常用于众多分子生物学和诊断应用中的T4 Rnl1连接酶)相比，它显示出显著提高的反应速率，因此可以缩短孵育时间并降低反应混合物中的连接酶浓度。缩短孵育时间并因此缩短周转时间是分子诊断应用的发展和改进中的关键方面之一，尤其是在护理点检测(例如病毒检测)中。除此之外，降低试剂浓度并因此降低成本是现代分子生物学或分子诊断测定法的发展和改进中的另一个关键方面。

与TS2126 Rnl1连接酶相比，对于根据本发明的DNA和/或RNA连接酶，没有观察到模板偏倚，例如对于具有末端胞嘧啶碱基的底物。因此，即使对于如此难以处理的底物，也不需要反应添加剂如甜菜碱、牛血清白蛋白(BSA)、T4基因32蛋白(gp32)等。这些添加剂通常需要针对任何特定的测定法和样本类型进行调整，并且还可能对检测方法产生其他负面副作用，例如由于定量PCR循环仪或下一代测序装置的荧光通道受到干扰。此外，这些添加剂是具有残留DNA(来自用于重组蛋白的表达宿主或来自可能存在于动物来源材料如BSA中的病毒)的分子检测试剂无意污染的潜在来源(Doelger等人,2020.BioProcessInternational,第18卷,第4期)。

本领域已知的连接酶对三磷酸腺苷(ATP)非常敏感，如WO2010094040A1中关于TS2126 Rnl1连接酶所示。与此相反，根据本发明的未腺苷酸化形式的DNA和/或RNA连接酶与宽范围的ATP浓度相容，并且在高达80uM ATP下显示几乎完全连接。与即使如此高的ATP浓度相容也是一个重要的改进，因为它允许在含有ATP的反应混合物中进行多轮自腺苷酸化和催化。此外，它还允许与先前酶促反应中残留的ATP相容。例如，虽然含有5'-羟基的DNA或RNA分子不能在分子间或分子内连接，但这些末端可以在需要ATP的反应中被激酶磷酸化，将它们转化为5'-磷酸末端，然后能够被连接。因此，与来自激酶反应的这种残留ATP相容是有益的，因为它允许后续连接而无需从残留ATP中纯化核酸。

此外，根据本发明的DNA和/或RNA连接酶显示比使用TS2126Rnl1连接酶更有效地将稀释的片段化DNA连接成可扩增的环状DNA。这允许对具有少量DNA或较少起始细胞数的样本进行更完整、更高质量的遗传分析。

在本文中，“连接”被定义为通过酶的作用接合两个或更多个核酸片段，所述核酸片段为脱氧核糖核酸(DNA)分子和/或核糖核酸(RNA)分子。这种酶可以是根据本发明的连接酶。

术语“DNA和/或RNA连接酶”是指连接酶能够连接单链DNA(ssDNA)片段和单链RNA(ssRNA)片段或其组合。

在本文中，“热稳定”被定义为酶具有催化活性的宽温度范围和/或高限定的解折叠或转变温度或解链温度或者在选定的宽温度范围内观察到长半衰期。

在本文中，术语“模板非依赖性连接”被定义为在不存在连接模板(例如靶核酸、桥接或夹板核酸分子，其中希望连接的线性ssDNA和/或ssRNA的末端可以退火，使其末端相邻)的情况下线性ssDNA和/或ssRNA的分子间和/或分子内连接。

在本文中，术语“桥接或夹板核酸分子”被定义为在连接之前与应连接的ssDNA和/或ssRNA分子杂交；例如以便将它们栓系在正确方向上的核酸分子，特别是DNA和/或RNA寡核苷酸。

在本文中，术语“分子内连接”是指接合ssDNA和/或ssRNA分子的两端，导致这种分子环化，而术语“分子间连接”是指接合两个或更多个ssDNA和/或ssRNA分子。通过分子间连接来接合两个或更多个ssDNA和/或ssRNA分子而产生的ssDNA和/或ssRNA分子可以通过分子内连接进行环化。

在本文中术语“环化的ssDNA和/或ssRNA”或“ssDNA和/或ssRNA分子的环化”是指此分子已经形成共价闭环结构。环化的ssDNA和/或ssRNA分子尤其表现出更高的核酸外切酶降解抗性、更好的热力学稳定性和通过DNA聚合酶以滚环方式复制的能力。

在本文中术语“反应速率”是指连接酶将ssDNA和/或ssRNA底物转化为分子内和/或分子间连接产物的速度。通常，反应速率高度依赖于连接酶浓度和孵育时间。

本发明涉及一种新颖的热稳定连接酶，其由以下组成或包含以下：根据SEQ ID NO2的氨基酸序列，称为GBS-3074连接酶，发现其催化ssDNA和/或ssRNA的模板非依赖性分子内和/或分子间连接。

出乎意料地，本发明人在实验中发现，GBS-3074连接酶也显示出分子间连接活性。虽然分子内连接活性(环化)是本发明人的主要关注点，但在适当反应条件下的分子间连接能力是GBS-3074连接酶的另一个重要特征。

GBS-3074连接酶在高达75℃时是热稳定的，并且在高达该温度时显示出连接活性。这种广泛范围的热稳定性可用于本领域技术人员已知的和本文所述的各种核酸技术。

根据本发明的热稳定的单链DNA和/或RNA连接酶，称为GBS-3074连接酶，可以在45℃至75℃的范围内，优选在55℃至70℃的范围内的温度下，更优选在60至65℃下使用。

根据本发明的热稳定的单链DNA和/或RNA连接酶，称为GBS-3074连接酶，可以在pH6.5至pH 8.0的范围内，优选在pH 7.0至pH 8.0的范围内的pH下，更优选在pH 7.5下使用。

本发明涉及由以下组成或包含以下的热稳定DNA和/或RNA连接酶：根据SEQ ID NO2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的氨基酸序列或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％氨基酸序列同一性的多肽或其具有连接酶活性的衍生物或片段。

本发明进一步涉及由以下组成或包含以下的热稳定DNA和/或RNA连接酶：根据SEQID NO 2、SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6的氨基酸序列或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％氨基酸序列同一性的多肽或其具有连接酶活性的衍生物或片段，其中所述连接酶能够分子间连接两个或更多个RNA和/或DNA分子或者分子内连接RNA或DNA分子，其中所述RNA或DNA分子可以是单链的。

US20040259123A1、US20090061481A1、WO2000026381A2、WO1994002615A1和US20110053147A1中公开的连接酶源自古细菌物种(特别是，US20040259123A1的Crenarchaea敏捷气热菌，以及US20090061481A1、WO1994002615A1和US20110053147A1的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus))并且被鉴定为ATP依赖性DNA连接酶。WO2000026381A2中描述的连接酶来自栖热菌属(Thermus sp.)。AK16D与Taq连接酶非常相似，Taq连接酶是一种热稳定的NAD依赖性DNA连接酶。关于这些连接酶所述的活性也与其他DNA连接酶一致：它们催化双链DNA分子的粘性末端接合和双链DNA上的缺口密封。这些连接酶使用桥接或夹板DNA分子以模板依赖性方式起作用。因此，这些连接酶可能仅能够使用桥接或夹板DNA分子以模板依赖性方式对双链DNA进行分子内连接。

不同的是，根据本发明的连接酶允许在模板非依赖性程序中环化单链DNA或RNA分子。

本发明进一步涉及热稳定的DNA和/或RNA连接酶，其中所述连接酶不需要桥接或夹板核酸分子用于连接。

本发明还涉及一种编码如本文所述的热稳定DNA和/或RNA连接酶的核酸分子，所述核酸分子由以下组成或包含以下：根据SEQ ID NO1、SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5的核酸序列或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的核酸序列。

本发明还涉及包含如上所述的核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码如本文所述的热稳定DNA和/或RNA连接酶或其活性衍生物或片段，可操作地连接到至少一个调控序列。许多表达载体是可商购的，并且技术人员可以容易地制备其他合适的载体。调控序列是本领域已知的并且被选择以产生多肽或其活性衍生物或片段。

在本文中，术语“可操作地连接”被定义为核苷酸序列以允许核酸序列表达的方式连接到调控序列。

在本文中，术语“调控序列”是指启动子、增强子和文献中描述的其他表达控制元件(例如Goeddel(1990),Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,第185卷,Academic Press,San Diego,CA)。

与TS2126 Rnl1连接酶相比，GBS-3074连接酶的序列同一性约为30％。

令人惊讶的是，本发明人发现GBS-3074连接酶没有显示出模板偏倚(参见实施例2)，并且连接效率相比于TS2126 Rnl1连接酶高度改进(参见实施例3和4)。

在本文中，术语“模板偏倚”是指当环化具有不同末端核苷酸的底物时环化效率不同，例如当连接酶对某些底物(例如含有5'-G和3'-T的底物)表现出偏好，而某些底物(例如含有末端胞嘧啶碱基的底物)连接效率低下。

在本文中术语“连接效率”定义为连接产物相对于初始连接底物的量随时间变化的百分比，例如如果80％的底物在30分钟反应时间后通过分子内连接环化，则连接效率高于在相同时间内仅25％的底物环化或者需要例如75分钟反应时间才能达到相对于初始连接底物的量为80％的环状产物。

本发明人发现可以使用疏水相互作用色谱法分离两种形式的GBS-3074连接酶，这两种形式被鉴定为主要的自腺苷酸化形式和未腺苷酸化形式。在众所周知的连接酶催化三步机制(Pascal,2008.Current Opinion in Structural Biology,第18卷,第1期,doi:10.1016/j.sbi.2007.12.008)的第一步中，连接酶与三磷酸腺苷(ATP)反应后形成酶-腺苷酸中间体。两种形式的GBS-3074连接酶的活性测试表明，虽然腺苷酸化形式不需要反应缓冲液中的ATP并被ATP抑制，但未腺苷酸化形式绝对需要ATP才能发挥活性(图1)。酶的未腺苷酸化形式被选为优选形式，因为反应混合物中存在ATP允许进行多轮的自腺苷酸化和催化。

本发明涉及主要未腺苷酸化的热稳定DNA和/或RNA连接酶。

本发明进一步涉及主要未腺苷酸化并且需要ATP来发挥活性的热稳定DNA和/或RNA连接酶。

本发明还涉及主要腺苷酸化的热稳定DNA和/或RNA连接酶。

本发明进一步涉及主要腺苷酸化并在ATP存在下被抑制的热稳定DNA和/或RNA连接酶。

大多数市售连接酶都显示出模板偏倚，这在分子生物学和分子诊断测定法中可能是一个严重的问题。为了确定GBS-3074连接酶是否显示模板偏倚，即对单链分子末端的特定末端核苷酸的偏好，测试了10种不同底物的连接效率(图2)。出乎意料的是，发现所有底物在60分钟或更短时间内几乎完成了环化。相反，与以前的报告(Nunez等人,2008.应用环状连接酶为少量片段化DNA的滚环扩增提供模板,第十九届人类鉴定国际研讨会,2008,7页)一致，发现TS2126 Rnl1连接酶对某些底物(例如含有5'-G和3'-T的底物)显示出明显的偏好，而某些底物连接效率低下，例如那些含有末端胞嘧啶碱基的底物(图3)。

因此，本发明还涉及能够催化主要没有任何模板偏倚的连接反应的热稳定的DNA和/或RNA连接酶。

在本文中，“主要没有任何模板偏倚”是指具有特定末端核苷酸的底物不优先于其他底物连接。

ssDNA和/或ssRNA底物浓度降低以及ssDNA和/或ssRNA片段长度增加都会对分子内环化速率产生负面影响，因为可用于连接酶催化的ssDNA和/或ssRNA末端的有效浓度降低(参见Shore等人,1981.PNAS,第78卷,第8期,doi:doi.org/10.1073/pnas.78.8.4833)。本发明人发现，GBS-3074连接酶在分子内连接活性方面显示出超过现有市售连接酶的显著改进，片段长度增加为约200bp并且连接底物浓度降低。

因此，本发明涉及一种热稳定的单链DNA和/或RNA连接酶，其能够分子内连接长度为约200bp的随机底物，底物存在量为1ng或更多至小于100fg(参见实施例5)。

本发明还涉及一种热稳定的单链DNA和/或RNA连接酶，它能够以模板非依赖性方式分子内连接长度为约50个核苷酸或更少的底物至长度为200个核苷酸或更多的底物。

此外，本发明人出乎意料地发现，与TS2126 Rnl1连接酶相比，GBS-3074连接酶在此类底物上的连接动力学要快得多(图4和图5a)，表明可以使用更短的反应时间来实现所有底物类型的有效连接。

根据本发明的热稳定DNA和/或RNA连接酶可以用于以下方法，例如但不限于：滚环扩增、数字核酸分析(例如数字PCR或数字微滴PCR)、滚环转录、等温核酸扩增方法、用于法医应用的低拷贝片段化DNA扩增、测序和下一代测序文库制备工作流程、全基因组测序、全基因组亚硫酸氢盐测序、扩增cDNA末端以随机扩增cDNA末端(RACE)、RNA的3'端标记、寡核苷酸合成、cDNA接头连接、cDNA末端快速扩增(RLM-RACE)、用于PCR的单链引物产物的连接以及本领域技术人员已知的许多技术。

此外，本发明涉及包含如本文所述的热稳定的模板非依赖性DNA和/或RNA连接酶的试剂盒，或涉及包含如本文所述的热稳定的模板非依赖性DNA和/或RNA连接酶以及任选地缓冲液和/或寡核苷酸的试剂盒。

本文引用的参考文献通过引用整体并入。已经参考其优选实施方式显示和描述了本发明。本领域的技术人员将理解本发明：在不脱离由权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以在其中进行形式和细节的各种改变。

实施例

实施例1：高活性热稳定性单链连接酶的鉴定

为了鉴定能够进行模板非依赖性DNA和RNA环化的高活性和热稳定性连接酶，在包含宏基因组采样研究序列的数据库、联合基因组研究所综合微生物基因组和微生物组***(https://img.jgi.doe.gov/；Chen等人,2019.Nucleic Acid Research,第47卷,第D1期,doi:10.1093/nar/gky901)中对于以前未表征的与T4 Rnl1具有蛋白质家族同源性的基因产物进行了搜索。在将结果限制于那些在嗜热生物体预期生长的地理位置进行采样的研究之后，生成了13种病毒基因产物的列表(表1)。这些DNA序列中的每一者都针对在大肠杆菌(E.coli)中的表达进行了密码子优化，并且构建了相应的合成基因片段并将其组装到表达载体中。序列验证后，连接酶在BL21细胞中过表达。在最初的14种候选物中，8种显示出可检测的蛋白质表达并且其中6种产生可溶性蛋白质，然后通过亲和色谱法和离子交换色谱法的迭代循环进行纯化。为了测量模板非依赖性高温连接活性，使根据SEQ ID NO 7(5'-/5phos/gtctggttggtcagccgttgtgggatgttagccgtagcagcactggtaatctggttgaatgg tt)的单链64核苷酸5'-磷酸化寡核苷酸底物与每种连接酶反应并使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定线性形式到环状形式的转化程度。将含有33mM HEPES-KOH(pH 7.5)、66mM KOAc、0.5mMDTT、2.5mM MnCl₂、50μM ATP、0.5μM寡核苷酸底物和2μM酶的反应物(20μl)在55℃下孵育1小时。使用含有7M尿素(TBE-尿素)的15％聚丙烯酰胺Tris-硼酸盐-EDTA凝胶通过电泳分离线性和环状DNA产物，然后用2X SYBR Gold(Invitrogen)对凝胶进行染色并量化条带强度。发现其中3个候选物显示出可检测的活性，并且其中一个被称为GBS-3074连接酶(基因座标签Ga0072500_1423074，SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2)显示出高水平的活性，几乎可以将所有底物转化为环状形式。与更好表征的DNA连接酶不同，由于GBS-3074连接酶基因是作为大型宏基因组研究的一部分进行测序的，该研究包含来自环境中许多生物体和生物体类型的基因和基因片段的复杂混合物，因此未知连接酶基因是否在体内表达，该基因起源于哪种病毒，以及起源病毒感染的细胞种类或类型。

下表1描绘了来自宏基因组Rnl1基因的假定嗜热Rnl1酶，这些酶被合成、表达和筛选用于模板非依赖性分子内DNA连接。显示了相对于TS2126 Rnl1连接酶的同一性百分比。覆盖率百分比指示在BLAST比对中用于测量同一性和相似性的候选蛋白质的部分。粗体候选物(基因座标签Ga0072500_1423074；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO 2)对应于最活跃的连接酶，称为GBS-3074连接酶。斜体候选物(基因座标签Ga0209741_10051251，SEQ ID NO.5，SEQID NO.6；基因座标签Ga0105160_10035846；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4)也确实显示了一些单链环化活性。

表1：从宏基因组Rnl1基因中获得的嗜热Rnl1酶列表

实施例2：GBS-3074连接酶的腺苷酸化和未腺苷酸化形式的分离和表征。

在从大肠杆菌裂解物中纯化GBS-3074连接酶期间，注意到两种形式的蛋白质可以通过使用HiTrap Phenyl HP柱(Cytiva Life Sciences)的苯基琼脂糖疏水相互作用色谱法分离，随后被鉴定为主要的自腺苷酸化形式和未腺苷酸化形式。在众所周知的连接酶催化三步机制的第一步中，连接酶与ATP反应后形成酶-腺苷酸中间体。两种形式的GBS-3074连接酶的活性测试表明，虽然腺苷酸化形式不需要反应缓冲液中的ATP并被ATP抑制(图1a)，但未腺苷酸化形式绝对需要ATP才能发挥活性(图1b)。GBS-3074连接酶在0.63μM至80μM的宽ATP浓度范围的存在下显示出高环化活性，而TS2126 Rnl1连接酶环化活性在12.5μMATP存在下受到抑制，并且在50μM ATP的存在下显示显著抑制。这些反应(20μl)包含33mMHEPES-KOH(pH 7.5)、0.5mM DTT、2.5mM MnCl₂、0.5μM单链底物、0.5μM连接酶、指示量的ATP，并在55℃下孵育1小时。寡核苷酸底物是根据SEQ ID NO 8的5'-磷酸化64nt寡核苷酸，具有5'和3'末端腺苷碱基(5'-/5phos/atctggttggtcagccgttgtgggatgttagccgtagcagcactggtaatctggttgaatgg ta)。使用15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶通过电泳分离线性和环状DNA产物，然后用2X SYBR Gold(Invitrogen)染色。所述酶的未腺苷酸化形式被选为优选形式用于进一步表征，因为它能够催化更完整的底物环化，对更高ATP浓度的耐受范围更广，以及在含有ATP的反应混合物中使用未腺苷酸化的连接酶进行多轮自腺苷酸化和催化的潜力。此外，对ATP的耐受性允许与来自先前酶促反应的残留ATP相容。例如，DNA或RNA分子的末端可以在需要ATP的反应中被激酶磷酸化，将它们转化为5'-磷酸末端，然后能够进行连接。因此，与来自激酶反应的这种残留ATP的相容性将是有益的，因为它允许后续连接而无需从残留ATP中纯化核酸。

实施例3：使用具有不同末端核苷酸的底物的环化效率

为了确定GBS-3074连接酶是否显示模板偏倚，即对单链分子末端的特定末端核苷酸的偏好，测试了10种不同底物的连接效率(图2)。这些底物都是根据SEQ ID NO 9(5'-/5phos/ntctggttggtcagccgttgtgggatgttagccgtagcagcactggtaatctggttgaatggtn)的5'-磷酸化寡核苷酸，其中n＝a、g、c或t。含有33mM HEPES-KOH(pH 7.5)、0.5mM DTT、2.5mMMnCl₂、50μM ATP、0.5μM寡核苷酸底物和1μM未腺苷酸化的GBS-3074连接酶的反应物(20μl)在55℃下孵育。含有CircLigase II(Lucigen)的反应在55℃下使用制造商推荐的条件与相同的底物反应。使用15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶通过电泳分离线性和环状DNA产物，然后用2X SYBR Gold(Invitrogen)染色并量化条带强度。发现所有底物都被未腺苷酸化的GBS-3074连接酶环化至接近完成(图2)。相比之下，发现TS2126 Rnl1连接酶对某些底物(例如含有5'-G和3'-T的底物)显示出明显的偏好，而某些底物的连接效率低下，例如含有末端胞嘧啶碱基的底物(图3)。

实施例4：单链DNA环化反应动力学的测量

为了确定GBS-3074连接酶催化的具有不同末端核苷酸的单链DNA底物环化的相对速度，使用荧光标记的底物寡核苷酸进行时程反应并通过变性毛细管电泳分析产物(图4)。GBS-3074连接酶反应(15μl)含有33mM HEPES-KOH(pH 7.5)、0.5mM DTT、2.5mM MnCl₂、25μMATP、0.5μM寡核苷酸底物和1μM未腺苷酸化的连接酶。CircLigase II反应(15μl)含有1μM连接酶、0.5μM寡核苷酸底物、2.5mM MnCl₂和制造商推荐的缓冲液。寡核苷酸底物在位置28上具有内部荧光素标记的胸腺嘧啶碱基，并且具有根据SEQ ID NO 10(5'-/5phos/gtctggttggtcagccgttgtgggatgntagccgtagcagcactggtaatctggttgaatggtg)(图4a)或SEQ ID NO11(5'-/5phos/ctctggttggtcagccgttgtgggatgntagccgtagcagcactggtaatctggttgaatggtc)(图4b)的序列，其中n＝位置28的内部荧光素标记的胸腺嘧啶。反应物在55℃下孵育指定时间，然后通过加入1μl 200mM EDTA和3.2mg/ml蛋白酶K溶液停止反应，接着在37℃下再孵育30分钟。在3730xlDNA分析仪(Applied Biosystems)上通过甲酰胺中的毛细管电泳分析产物。对应于线性寡核苷酸(底物)和环化单链DNA(连接产物)的峰被量化，并绘制了环状产物的百分比。实际上没有检测到串联的端到端连接产物。已发现，使用具有5'-G和3'-G核苷酸的底物，两种连接酶之间的环化连接动力学和连接程度相似(图4a)，除了CircLigaseII在早期时间点的滞后期稍长。然而，使用具有5'-C和3'-C核苷酸的底物，GBS-3074连接酶显示出比CircLigase II快得多的连接动力学(图4b)，其连接速率和连接程度类似于与5'-G/3'-G底物的反应。相比之下，由CircLigase II催化的反应在5'-C/3'-C底物上60分钟后仅完成了至多24％。GBS-3074连接酶的低模板偏倚表明可以使用更短的反应时间来实现多种底物类型的有效连接并提高反应均匀性。

实施例5：使用更大、随机片段化的基因组DNA片段的单链环化活性

DNA底物浓度降低和DNA片段长度增加都会对分子内环化速率产生负面影响，因为可用于DNA连接酶催化的DNA末端的有效浓度降低。为了证明GBS-3074连接酶环化具有一定长度范围的非常稀释的DNA片段的能力，通过使用聚焦超声(Covaris)将大肠杆菌基因组DNA随机剪切至平均大小200bp来制备底物。这些片段由具有所有可能的末端核苷酸组合的序列的随机混合物组成。对于GBS-3074连接酶，连接反应(10μl)含有33mM HEPES-KOH(pH7.5)、0.5mM DTT、2.5mM MnCl₂、25μM ATP、剪切大肠杆菌DNA和1μM未腺苷酸化的连接酶。CircLigase II反应(10μl)含有1μM连接酶、剪切的大肠杆菌DNA、2.5mM MnCl₂和制造商推荐的缓冲液。反应在没有连接酶的情况下组装，在95℃下加热3分钟以将片段化的大肠杆菌基因组DNA分离成单链，然后迅速转移到冰块上。对于GBS-3074连接酶反应和CircLigaseII反应两者，通过添加连接酶启动反应并在60℃下孵育1小时。环化DNA产物通过Phi29介导的滚环扩增进行扩增，其通过将2.3μl添加到含有50mM HEPES(pH 8.0)、20mM MgCl₂、0.01％ Tween-20、2mM DTT、20mM KCl、40μM硫代磷酸化随机六聚体、0.5X SYBR Green I(Invitrogen)、0.4mM dNTP和20μg/ml Phi29聚合酶的反应物(15μl)中来进行。在StepOnePlus***(Applied Biosystems)中在30℃下孵育4小时，每分钟读取一次荧光读数。对于每个反应，通过测量荧光读数达到60,000个相对荧光单位的时间来确定阈值时间，并在半对数标度上将结果与DNA输入量作图。由于多重置换扩增效率低下，因此没有连接酶的反应显示出非常长的阈值时间，通常为120分钟或更长，而用单链连接酶处理的反应显示出更快的阈值时间，表明转化为滚环扩增模式(图5a)。在1ng模板DNA输入时，GBS-3074连接酶连接反应的阈值时间仅比CircLigase^TMII连接反应短一点，但在输入量小于此值时，GBS-3074连接酶反应显示出显著更短的阈值时间，表明将稀释的片段化DNA显著更有效地连接到可扩增的环状DNA中。

为了分析滚环扩增DNA的序列内容，将反应产物纯化并处理到Illumina测序文库中。Phi29聚合酶在65℃下热灭活10分钟后，DNA经乙醇沉淀、洗涤并重悬于10mM Tris(pH8.0)中。DNA产量通常在4-6μg范围内。为了生成测序文库，使用sparQ DNA Frag&LibraryPrep试剂盒(Quantabio)将500ng扩增的DNA片段化、末端抛光并连接到接头，无需额外的PCR扩增。然后使用MiSeq 2X150配对末端方案(Illumina)对文库进行汇集和测序，然后通过对每个样本随机抽样175万个读段来对产生的读段数量进行归一化。映射到大肠杆菌参考基因组表明，GBS-3074连接酶连接反应足够有效，即使输入量为10pg，也可回收超过95％的基因组DNA序列(图5b)。相比之下，CircLigase II反应显示使用100pg片段化DNA输入的连接反应的基因组覆盖率仅为51％，而来自10pg连接输入反应的基因组覆盖率仅为13％。此外，在来自那些使用GBS-3074连接酶来环化片段化输入DNA的连接反应中，大肠杆菌参考DNA序列的中值基因组覆盖率水平显著更高(图5c)。

实施例6：单链DNA和RNA底物的环化

为了确定GBS-3074连接酶与单链RNA核酸模板的底物相容性，使用具有相同末端碱基组成的64nt DNA寡核苷酸和56nt RNA寡核苷酸进行环化反应(图6)。这些反应(20μl)含有33mM HEPES-KOH(pH7.5)、0.5mM DTT、2.5mM MnCl₂、0.5μM单链底物、1μM连接酶、1.25μM ATP，并在55℃下孵育1小时。DNA寡核苷酸底物是根据SEQ ID NO 12(5'-/5phos/ttctggttggtcagccgttgtgggatgttagccgtagcagcactggtaatctggttgaatggtc)的5'-磷酸化寡核苷酸，并且RNA底物是根据SEQ ID NO 13(5'-/5phos/uaggcgucgggugacaaacggccagcguuguugucucuccuguucuagcuuaucgguc)的5'-磷酸化RNA寡核苷酸。使用15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶通过电泳分离线性和环状DNA或RNA产物，然后用2X SYBR Gold(Invitrogen)染色。两种底物类型都接近完成环化，表明GBS-3074连接酶与DNA和RNA都相容。

实施例7：GBS-3074连接酶最佳反应温度和pH的表征

为了确定GBS-3074连接酶的热相容性和最佳反应温度，用根据SEQ ID NO 14(5'-/5phos/ctctggttggtcagccgttgtgggatgttagccgtagcagcactggtaatctggttgaatggtc)的5'-磷酸化64nt DNA寡核苷酸底物进行环化反应，并且反应如所示在45℃至75℃的温度范围内孵育(图7a)。这些反应(15μl)含有33mM HEPES-KOH(pH 7.5)、0.5mM DTT、2.5mMMnCl₂、0.5μM单链底物、0.5μM连接酶、25μM ATP，并孵育15分钟。使用15％聚丙烯酰胺TBE-尿素凝胶通过电泳分离线性和环状DNA产物，用2X SYBR Gold(Invitrogen)染色，然后量化条带强度，并且计算环化底物的百分比并作图。虽然在45℃到75℃的整个温度范围内都观察到了显著的活性，但观察到GBS-3074连接酶的最佳环化反应温度为60℃至65℃。

GBS-3074连接酶的最佳反应pH通过进行DNA环化反应来确定，其中HEPES-KOH缓冲液的pH在7.0-8.0之间变化(图7b)。反应(20μl)含有33mM HEPES-KOH、0.5mM DTT、2.5mMMnCl₂、0.5μM单链底物(SEQ ID NO 13)、1μM连接酶、1.25μM ATP，并孵育30或60分钟。在两个时间点，在pH 7.5时观察到最大量的环化DNA产物，表明在该pH值下反应速度最快。

表2：氨基酸和核酸序列

表3：活性RNA连接酶1酶的成对序列同一性分析

附图说明

图1

在不存在或存在不同浓度ATP的情况下，两种形式的GBS-3074连接酶的单链DNA环化活性：

a)反应含有腺苷酸化形式的GBS-3074连接酶。

b)反应含有未腺苷酸化形式的GBS-3074连接酶或CircLigase ssDNA连接酶。

图2

在存在ATP的情况下，使用含有不同末端核苷酸的64种核苷酸底物，在60分钟的反应中，未腺苷酸化的GBS-3074连接酶的单链DNA环化效率相当。

图3

与CircLigase II相比，GBS-3074连接酶在45分钟的单链DNA环化反应中减少了末端核苷酸序列偏倚：

a)SYBR Gold染色的变性丙烯酰胺凝胶图像。

b)对对应于线性寡核苷酸和环化产物的条带进行量化，并确定每种条件下的环状产物百分比。

图4

与CircLigase II相比，GBS-3074连接酶的快速连接反应动力学：

a)底物是具有5'-G和3'-G核苷酸的64核苷酸5'-磷酸化寡核苷酸。

b)底物是具有5'-C和3'-C核苷酸的64核苷酸5'-磷酸化寡核苷酸。

图5

使用极少量随机片段化大肠杆菌基因组DNA底物的GBS-3074连接酶的单链DNA环化效率：

a)未连接的剪切DNA或由GBS-3074连接酶或CircLigase II使用指定输入量的剪切DNA生成的环化DNA产物的滚环扩增动力学。

b)使用Illumina MiSeq测序读段映射的大肠杆菌基因组的百分比，这些读段源自完整的未扩增基因组DNA或剪切的低输入环化滚环扩增反应的产物。

c)使用Illumina MiSeq测序读段映射的大肠杆菌基因组的中值覆盖率，这些读段源自完整的未扩增基因组DNA或剪切的低输入环化滚环扩增反应的产物。

图6

使用GBS-3074连接酶在ATP存在下使用64个核苷酸底物在60分钟的反应中DNA和RNA单链底物环化效率相当。

图7

GBS-3074连接酶最佳反应温度和pH的表征

a)描绘在45℃至75℃范围内的不同孵育温度下单链DNA环化程度的图表。

b)SYBR Gold染色的变性丙烯酰胺凝胶图像和说明单链DNA底物在不同反应pH值下环化程度的图表。

序列表

<110>

凯杰贝佛利有限公司

<120> 序列偏倚降低的热稳定连接酶

<130> 37578.0077P1

<160> 14

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 1155

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 称为GBS-3074连接酶的热稳定连接酶的DNA序列。基因座标签Ga0072500_1423074

<400> 1

atgacgttat atgagttacg taagggctta gaagcggtga aacattacat ccttaacaac 60

gacgcatcag cgtcggggta taacgacgac ttactggagc gtatggtatg ggtgaatcac 120

gaatatgatc tggtcctgtt aaactacaaa gatgccactg ctatgatcct gcataacgaa 180

gggttacagt ggacaccttt tttgcgtgtt tgtcgtgggg ttgtatttac gccttcaggc 240

gaactggtct cgttgccctt acacaaattc ttcaatgtaa aggagaacga agagacctcg 300

ttggctaata tcgctaattg gcctctgcgt agtgctaccg agaaggtaga cggggtcatg 360

attcaggtgt tcttccaccc actgcgcaag gaaattacct atgccagtcg ctggcgcatt 420

tggtccgacg cagccatcac tgcgtttaaa ttagcgaact cagcgctgac taacgcggta 480

atcccaaagc tgaatgcctc tttcggtgaa ggaaagtgga cgttaatttg tgaattaatc 540

catccagagc atcgtcagcc cggaatggtt agctatgggg acttacaagc gttggtgctt 600

ctgtacgtcc gcaaattaga cgatcttgag ttgattccag ccgtagaatt gtttaaggat 660

aacgaattgc cgcccccact tatgctgcca cagcaatatt taattgtgtc cgcactggaa 720

gcccttgaga aagtcaagca ggccaagcac gcgaattggg agggtattgt tgttcagggg 780

gcaatggagg gtgggaatcg tctggtgaag atgaaaaacc ctctgtactt agagggagta 840

aacgccgtga aaaacttgaa tcgcatttta aagatctatg aagcacaggg gcgcgaaggc 900

gtggaaaacc tgttcctgct gtacgcatcc tacttggacg atgtcccgca catcgtgggt 960

cttcgcgatt tgttgtacaa gaccgaggac gagattaaca actacgctaa gcagttgcgc 1020

gaatcgacac aggacgtgac taccttgcct cgtgaatggc gttgggtcaa atcttatgac 1080

gtcggcaatg acaaatggca gcgctgcgtc cgccgtatgg tactgcaaaa agtgaacgca 1140

ggcggtcgta agtaa 1155

<210> 2

<211> 384

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 称为GBS-3074连接酶的热稳定连接酶的蛋白质序列。基因座标签Ga0072500_1423074

<400> 2

Met Thr Leu Tyr Glu Leu Arg Lys Gly Leu Glu Ala Val Lys His Tyr

1 5 10 15

Ile Leu Asn Asn Asp Ala Ser Ala Ser Gly Tyr Asn Asp Asp Leu Leu

20 25 30

Glu Arg Met Val Trp Val Asn His Glu Tyr Asp Leu Val Leu Leu Asn

35 40 45

Tyr Lys Asp Ala Thr Ala Met Ile Leu His Asn Glu Gly Leu Gln Trp

50 55 60

Thr Pro Phe Leu Arg Val Cys Arg Gly Val Val Phe Thr Pro Ser Gly

65 70 75 80

Glu Leu Val Ser Leu Pro Leu His Lys Phe Phe Asn Val Lys Glu Asn

85 90 95

Glu Glu Thr Ser Leu Ala Asn Ile Ala Asn Trp Pro Leu Arg Ser Ala

100 105 110

Thr Glu Lys Val Asp Gly Val Met Ile Gln Val Phe Phe His Pro Leu

115 120 125

Arg Lys Glu Ile Thr Tyr Ala Ser Arg Trp Arg Ile Trp Ser Asp Ala

130 135 140

Ala Ile Thr Ala Phe Lys Leu Ala Asn Ser Ala Leu Thr Asn Ala Val

145 150 155 160

Ile Pro Lys Leu Asn Ala Ser Phe Gly Glu Gly Lys Trp Thr Leu Ile

165 170 175

Cys Glu Leu Ile His Pro Glu His Arg Gln Pro Gly Met Val Ser Tyr

180 185 190

Gly Asp Leu Gln Ala Leu Val Leu Leu Tyr Val Arg Lys Leu Asp Asp

195 200 205

Leu Glu Leu Ile Pro Ala Val Glu Leu Phe Lys Asp Asn Glu Leu Pro

210 215 220

Pro Pro Leu Met Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Ile Val Ser Ala Leu Glu

225 230 235 240

Ala Leu Glu Lys Val Lys Gln Ala Lys His Ala Asn Trp Glu Gly Ile

245 250 255

Val Val Gln Gly Ala Met Glu Gly Gly Asn Arg Leu Val Lys Met Lys

260 265 270

Asn Pro Leu Tyr Leu Glu Gly Val Asn Ala Val Lys Asn Leu Asn Arg

275 280 285

Ile Leu Lys Ile Tyr Glu Ala Gln Gly Arg Glu Gly Val Glu Asn Leu

290 295 300

Phe Leu Leu Tyr Ala Ser Tyr Leu Asp Asp Val Pro His Ile Val Gly

305 310 315 320

Leu Arg Asp Leu Leu Tyr Lys Thr Glu Asp Glu Ile Asn Asn Tyr Ala

325 330 335

Lys Gln Leu Arg Glu Ser Thr Gln Asp Val Thr Thr Leu Pro Arg Glu

340 345 350

Trp Arg Trp Val Lys Ser Tyr Asp Val Gly Asn Asp Lys Trp Gln Arg

355 360 365

Cys Val Arg Arg Met Val Leu Gln Lys Val Asn Ala Gly Gly Arg Lys

370 375 380

<210> 3

<211> 1272

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 热稳定连接酶的DNA序列。基因座标签Ga0105160_10035846

<400> 3

atggaagagc gggtccgtgt ttatcaagct ataccatccc tggaacgcgc gtttgacata 60

gctaaagacg ctaaggccat agcgtttcgt acctcggaag aaggacttgt attatttaac 120

tatttgtttt ctgaccaaca gctgtggaca caggtacccg agtcgcgtaa cttgagaggt 180

attgtctatg agcaaacgtc tggacgggtg gtctctctgc ccttccataa gttttttaac 240

ccgggggagc cagcttctcc ggacgtttca aaatacgatt ttggaaagtc acttgtctcc 300

aaaaagcacg atggatactt gctgcagacg tttgtgtacc gtgggaaagt ctacactatc 360

tccagacact cttttaaggc tccactggtt caaacagtct tacagggctt atgggacaag 420

cgccacgaac gttttgtatt acaggtctct gaggagtatc cgcagggaat tacactgttg 480

tgggaagtta tacatcccct ttatccagtc ctggaacttc cagaaaagcc ttcactggtc 540

ttattagctg ctcgcatgac cgacacaggg gattacttat tccccgtaat agagggagaa 600

tctgacccac cgtttgaggt taaaacgctg tcagtaccta gtagtttctt atcagatgga 660

atcacggagg tagcccgttg gcttcccgtg tctagtcttt tcgaaaatta ctcgtcctgg 720

aacgacataa aacagcaggt caagtcaatt caccgctctg aaggatatgt tatagcgttg 780

tttacacaag aggggtccga attcgttttt gacgatttcg taaaagctaa gactccttgg 840

gcgttcaaag cgtccttgtt attcgctaac cctggggata cgcttgtgcg ttcagtggtc 900

gaggataagg tggatgatct tgtgtacgag gtgttaaaag atgatccgcg tctgcaagca 960

tttagtaagg cccacagaac gttgttaaac cacatctatc ttgcctacga tttcggtctt 1020

ggtctgagtc aaaagcaggt cgaagcgaaa gatgcttacc aggccgccgt gtcatggtca 1080

cagccctacg gtaaatacca cccagagttg ccgagcgtat ttaccccgtt gataatgaag 1140

gcctaccgcg gtgcgtcctt tgaagaagtt tgggagaatt tcaaaaaatt aatggagaac 1200

aaaaaaaagt tggttgcagt ttctagctgg attgaactta cccatcaact tcactacgtg 1260

gagccagatg ga 1272

<210> 4

<211> 424

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 热稳定连接酶的蛋白质序列。基因座标签Ga0105160_10035846

<400> 4

Met Glu Glu Arg Val Arg Val Tyr Gln Ala Ile Pro Ser Leu Glu Arg

1 5 10 15

Ala Phe Asp Ile Ala Lys Asp Ala Lys Ala Ile Ala Phe Arg Thr Ser

20 25 30

Glu Glu Gly Leu Val Leu Phe Asn Tyr Leu Phe Ser Asp Gln Gln Leu

35 40 45

Trp Thr Gln Val Pro Glu Ser Arg Asn Leu Arg Gly Ile Val Tyr Glu

50 55 60

Gln Thr Ser Gly Arg Val Val Ser Leu Pro Phe His Lys Phe Phe Asn

65 70 75 80

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Pro Asp Val Ser Lys Tyr Asp Phe Gly Lys

85 90 95

Ser Leu Val Ser Lys Lys His Asp Gly Tyr Leu Leu Gln Thr Phe Val

100 105 110

Tyr Arg Gly Lys Val Tyr Thr Ile Ser Arg His Ser Phe Lys Ala Pro

115 120 125

Leu Val Gln Thr Val Leu Gln Gly Leu Trp Asp Lys Arg His Glu Arg

130 135 140

Phe Val Leu Gln Val Ser Glu Glu Tyr Pro Gln Gly Ile Thr Leu Leu

145 150 155 160

Trp Glu Val Ile His Pro Leu Tyr Pro Val Leu Glu Leu Pro Glu Lys

165 170 175

Pro Ser Leu Val Leu Leu Ala Ala Arg Met Thr Asp Thr Gly Asp Tyr

180 185 190

Leu Phe Pro Val Ile Glu Gly Glu Ser Asp Pro Pro Phe Glu Val Lys

195 200 205

Thr Leu Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Ser Asp Gly Ile Thr Glu Val

210 215 220

Ala Arg Trp Leu Pro Val Ser Ser Leu Phe Glu Asn Tyr Ser Ser Trp

225 230 235 240

Asn Asp Ile Lys Gln Gln Val Lys Ser Ile His Arg Ser Glu Gly Tyr

245 250 255

Val Ile Ala Leu Phe Thr Gln Glu Gly Ser Glu Phe Val Phe Asp Asp

260 265 270

Phe Val Lys Ala Lys Thr Pro Trp Ala Phe Lys Ala Ser Leu Leu Phe

275 280 285

Ala Asn Pro Gly Asp Thr Leu Val Arg Ser Val Val Glu Asp Lys Val

290 295 300

Asp Asp Leu Val Tyr Glu Val Leu Lys Asp Asp Pro Arg Leu Gln Ala

305 310 315 320

Phe Ser Lys Ala His Arg Thr Leu Leu Asn His Ile Tyr Leu Ala Tyr

325 330 335

Asp Phe Gly Leu Gly Leu Ser Gln Lys Gln Val Glu Ala Lys Asp Ala

340 345 350

Tyr Gln Ala Ala Val Ser Trp Ser Gln Pro Tyr Gly Lys Tyr His Pro

355 360 365

Glu Leu Pro Ser Val Phe Thr Pro Leu Ile Met Lys Ala Tyr Arg Gly

370 375 380

Ala Ser Phe Glu Glu Val Trp Glu Asn Phe Lys Lys Leu Met Glu Asn

385 390 395 400

Lys Lys Lys Leu Val Ala Val Ser Ser Trp Ile Glu Leu Thr His Gln

405 410 415

Leu His Tyr Val Glu Pro Asp Gly

420

<210> 5

<211> 1146

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 热稳定连接酶的DNA序列。基因座标签Ga0209741_10051251

<400> 5

atgactattc agcaactgcg cgatggatta gcccaagtaa tggagttcgt gcgcaagaac 60

cagtaccctt cggaaatcgg tcgttatttt atccgccgtc gctgggaaaa tttagtcctg 120

ttaaactacg ctgactcagc cgtttacaaa ttctcggcag acgagtggac gccgccgatg 180

cgtgtttgtc gcggagtgat cgtaacggat gacggatcac aagtggtcag ctttcctttc 240

cataaatttt ttaatgttgg ggaaggttct gaaacttcac ccaacgaggt cgcccgctgg 300

actgttaaag ccgtcaccga gaagattgat ggcgtaatga ttcaggtctt tcgttggaaa 360

ggtgagttaa tctgggcttc gcgccatggt atttggtcga atgccgcgac cgacgcattt 420

aaggtagcat catcagcggt agaaaagatc ttcccccgca aaggtaattg gacgctgatc 480

tgtgaattca tccacccaga ccatcgtaaa gccggtatga tcgattacgg cgatctggtg 540

ggccttggag tgctttattt gcgcgacttg gattctcttg aattgattcc cgcacgcgag 600

aagttcgacg acgacctgcc cagcccattg ttccttcctg cgttataccc cttcagccaa 660

ttttgggagg cgcgcgagtt cgtacagaac agtcagactc gctactttga aggcgtcgtc 720

ttacagggtg ctgaggaatt aggaaatcgt ttagtgaaga tcaagaaccc tttatatctt 780

gacgctcttg ccaccattcg cgcgatcaca ccaaatcgca ttattttcat ctacgaacgc 840

ctggggctga atggggtcaa ggacttattt agcctttaca aggacgtttt ggatgacatt 900

ccagaagcgc gtcagttggc tgcggaactg gaaaaggcgg aagcagagtt cgttgcacgt 960

tgtttggagc tgcgtgagaa agaaatggaa gaaatccccc cggagatgcg ttgggttaaa 1020

agttatgagg tgggtagtaa gaaatggaac caaaccgttt ggcgtttcgt cgcggggaaa 1080

gtcagttggc agctgaccga gccgaagccc aaaccgccca gtcgttatga gtacgacgaa 1140

atcgac 1146

<210> 6

<211> 424

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 热稳定连接酶的蛋白质序列。基因座标签Ga0209741_10051251

<400> 6

Met Glu Glu Arg Val Arg Val Tyr Gln Ala Ile Pro Ser Leu Glu Arg

1 5 10 15

Ala Phe Asp Ile Ala Lys Asp Ala Lys Ala Ile Ala Phe Arg Thr Ser

20 25 30

Glu Glu Gly Leu Val Leu Phe Asn Tyr Leu Phe Ser Asp Gln Gln Leu

35 40 45

Trp Thr Gln Val Pro Glu Ser Arg Asn Leu Arg Gly Ile Val Tyr Glu

50 55 60

Gln Thr Ser Gly Arg Val Val Ser Leu Pro Phe His Lys Phe Phe Asn

65 70 75 80

Pro Gly Glu Pro Ala Ser Pro Asp Val Ser Lys Tyr Asp Phe Gly Lys

85 90 95

Ser Leu Val Ser Lys Lys His Asp Gly Tyr Leu Leu Gln Thr Phe Val

100 105 110

Tyr Arg Gly Lys Val Tyr Thr Ile Ser Arg His Ser Phe Lys Ala Pro

115 120 125

Leu Val Gln Thr Val Leu Gln Gly Leu Trp Asp Lys Arg His Glu Arg

130 135 140

Phe Val Leu Gln Val Ser Glu Glu Tyr Pro Gln Gly Ile Thr Leu Leu

145 150 155 160

Trp Glu Val Ile His Pro Leu Tyr Pro Val Leu Glu Leu Pro Glu Lys

165 170 175

Pro Ser Leu Val Leu Leu Ala Ala Arg Met Thr Asp Thr Gly Asp Tyr

180 185 190

Leu Phe Pro Val Ile Glu Gly Glu Ser Asp Pro Pro Phe Glu Val Lys

195 200 205

Thr Leu Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Ser Asp Gly Ile Thr Glu Val

210 215 220

Ala Arg Trp Leu Pro Val Ser Ser Leu Phe Glu Asn Tyr Ser Ser Trp

225 230 235 240

Asn Asp Ile Lys Gln Gln Val Lys Ser Ile His Arg Ser Glu Gly Tyr

245 250 255

Val Ile Ala Leu Phe Thr Gln Glu Gly Ser Glu Phe Val Phe Asp Asp

260 265 270

Phe Val Lys Ala Lys Thr Pro Trp Ala Phe Lys Ala Ser Leu Leu Phe

275 280 285

Ala Asn Pro Gly Asp Thr Leu Val Arg Ser Val Val Glu Asp Lys Val

290 295 300

Asp Asp Leu Val Tyr Glu Val Leu Lys Asp Asp Pro Arg Leu Gln Ala

305 310 315 320

Phe Ser Lys Ala His Arg Thr Leu Leu Asn His Ile Tyr Leu Ala Tyr

325 330 335

Asp Phe Gly Leu Gly Leu Ser Gln Lys Gln Val Glu Ala Lys Asp Ala

340 345 350

Tyr Gln Ala Ala Val Ser Trp Ser Gln Pro Tyr Gly Lys Tyr His Pro

355 360 365

Glu Leu Pro Ser Val Phe Thr Pro Leu Ile Met Lys Ala Tyr Arg Gly

370 375 380

Ala Ser Phe Glu Glu Val Trp Glu Asn Phe Lys Lys Leu Met Glu Asn

385 390 395 400

Lys Lys Lys Leu Val Ala Val Ser Ser Trp Ile Glu Leu Thr His Gln

405 410 415

Leu His Tyr Val Glu Pro Asp Gly

420

<210> 7

<211> 64

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> DNA寡核苷酸底物

<400> 7

gtctggttgg tcagccgttg tgggatgtta gccgtagcag cactggtaat ctggttgaat 60

ggtt 64

<210> 8

<211> 64

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> DNA寡核苷酸底物

<400> 8

atctggttgg tcagccgttg tgggatgtta gccgtagcag cactggtaat ctggttgaat 60

ggta 64

<210> 9

<211> 64

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<221> 等位基因

<222> 1;64

<223> DNA寡核苷酸底物；n =位置1和64的a、g、c或t

<400> 9

ntctggttgg tcagccgttg tgggatgtta gccgtagcag cactggtaat ctggttgaat 60

ggtn 64

<210> 10

<211> 64

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> 28

<223> DNA寡核苷酸底物；n =位置28的内部荧光素标记的胸腺嘧啶

<400> 10

gtctggttgg tcagccgttg tgggatgnta gccgtagcag cactggtaat ctggttgaat 60

ggtg 64

<210> 11

<211> 64

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> 28

<400> 11

ctctggttgg tcagccgttg tgggatgnta gccgtagcag cactggtaat ctggttgaat 60

ggtc 64

<210> 12

<211> 64

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> DNA寡核苷酸底物

<400> 12

ttctggttgg tcagccgttg tgggatgtta gccgtagcag cactggtaat ctggttgaat 60

ggtc 64

<210> 13

<211> 56

<212> RNA

<213> 未知

<220>

<223> RNA寡核苷酸底物

<400> 13

uaggcgucgg ugacaaacgg ccagcguugu ugucucucug uucuagcuua ucgguc 56

<210> 14

<211> 64

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> DNA寡核苷酸底物

<400> 14

ctctggttgg tcagccgttg tgggatgtta gccgtagcag cactggtaat ctggttgaat 60

ggtc 64

Claims

1.一种热稳定连接酶，所述热稳定连接酶由以下组成或包含以下：SEQ ID NO.2的氨基酸序列或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％氨基酸序列同一性的多肽或其具有连接酶活性的衍生物或片段。

2.根据权利要求1所述的热稳定连接酶，其中所述连接酶能够进行RNA或DNA分子的分子内连接。

3.根据权利要求1所述的热稳定连接酶，其中所述连接酶能够进行两个或更多个RNA和/或DNA分子的分子间连接。

4.根据权利要求1至3所述的热稳定连接酶，其中所述RNA和/或DNA分子是单链的。

5.根据权利要求1至4所述的热稳定连接酶，其中所述连接酶不需要桥接或夹板核酸分子用于连接。

6.根据权利要求1至5所述的热稳定连接酶，其中所述连接酶是模板非依赖性的。

7.根据权利要求1至6所述的热稳定连接酶，其中所述连接酶是未腺苷酸化的并且需要ATP来发挥活性。

8.根据权利要求1至7所述的热稳定连接酶，其中未腺苷酸化的连接酶能够在ATP存在下进行多轮的自腺苷酸化和催化。

9.根据权利要求1至6所述的热稳定连接酶，其中所述连接酶是腺苷酸化的并在ATP存在下被抑制。

10.根据前述权利要求中任一项所述的热稳定连接酶，其中所述连接在45℃至75℃的范围内，优选在55℃至70℃的范围内，更优选在60至65℃的范围内的温度下进行。

11.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据前述权利要求中任一项所述的热稳定连接酶。

12.一种核酸分子，所述核酸分子由以下组成或包含以下：根据SEQ ID NO.1的核酸序列或与其具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的核酸序列。

13.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求11至12所述的核酸分子。

14.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至10所述的热稳定连接酶或根据权利要求13所述的表达载体。

15.根据权利要求1至10所述的热稳定连接酶用于滚环扩增、数字核酸分析、滚环转录、等温扩增、低拷贝片段化DNA扩增、测序和下一代测序文库制备、全基因组测序、全基因组亚硫酸氢盐测序、cDNA末端扩增、RNA 3'末端标记、寡核苷酸合成、cDNA接头连接、cDNA末端快速扩增、用于PCR的单链引物产物连接的用途。