CN114276939A - 一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品防腐技术领域，公开了一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法，本发明通过分子生物学的方法，构建基因敲除株△FoGtr2和基因回补株△FoGtr2‑C，经向野生株、以及构建的基因敲除株△FoGtr2和基因回补株△FoGtr2‑C中添加不同种类的氨基酸，发现含硫氨基酸可以显著抑制尖孢镰孢菌的生长，从而可用于未来食品的防腐保鲜。

Description

一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法

技术领域

本发明涉及食品防腐技术领域，更具体地，涉及一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法。

背景技术

真菌细胞中，TORC1可感知环境中的营养物质、生长因子、压力等信号，来参与调节蛋白质翻译、核糖体合成、基因转录等信号通路，进而调节真菌的生长及代谢。上游响应元件Gtr1与Gtr2结合为异源二聚体，可介导上游多个信号通路，进而通过下游效应器调控细胞的生理过程，而下游支路中，Sch9与Tap42作为代谢效应元件，可响应上级通路传导的信号因子并通过下游调控镰孢菌的生长代谢。但Gtr1、Gtr2、Sch9与Tap42单一元件由TORC1通路介导对菌丝生长及次生代谢物生成的调控作用，目前还未有报道。

氨基酸作为TORC1信号通路的激活因子，具有显著调控细胞功能的作用。氨基酸根据性质的不同，可分为酸性氨基酸、碱性氨基酸、支链氨基酸、含硫氨基酸等。在不同种类的氨基酸激活下，可通过真菌TORC1元件传达不同的响应信号，对特定氨基酸进行响应，并通过下游支路的协同作用吸收有利于生长代谢。但目前对不同种类的氨基酸如何调控镰孢菌的生长与代谢，还没有深入研究。

发明内容

本发明为了克服现有技术中存在的上述缺陷，首先提供了氨基酸在抑制尖孢镰孢菌生长中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制镰孢菌生长的方法。

本发明的第三个目的是提供上述方法在食品防腐的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

氨基酸在抑制尖孢镰孢菌生长中的应用，所述氨基酸自酸性氨基酸和含硫氨基酸。

优选的，所述氨基酸选自L-Asp、L-Cys、L-Glu、L-Met中的至少一种。

本发明还提供一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制尖孢镰孢菌生长的方法，包括以下步骤：

S1、分别构建尖孢镰孢菌基因敲除株△FoGtr2和尖孢镰孢菌基因回补株△FoGtr2-C；

S2、分别向尖孢镰孢菌野生株、基因敲除株△FoGtr2和基因回补株△FoGtr2-C中添加氨基酸，所述氨基酸选自L-Asp、L-Cys、L-Glu、L-Met中的至少一种。

优选的，S1所述尖孢镰孢菌基因敲除株△FoGtr2的构建方法包括以下步骤：

(1)、以质粒pBluescript KS(+-)(pBS)-HPH1为模板，PCR扩增HYG抗性基因，将PCR产物纯化后连接T载体，得到重组质粒HYG-T，并测序验证；

(5)、以HYG为目标基因设计正向引物和反向引物，以重组质粒HYG-T为模板，扩增得到HYG的融合片段，扩增Gtr2基因的左右同源臂，通过重叠PCR连接T载体；

(6)、按照Split-marker重组技术成功构建Gtr2的敲除结构；

(7)、通过原生质体转化，将Gtr2的敲除结构转化尖孢镰孢菌的原生质体细胞，转化后原生质体通过潮霉素HYG平板筛选，25℃条件下培养至转化子长出。

优选的，S1所述尖孢镰孢菌基因回补株△FoGtr2-C的构建方法包括以下步骤：

(1)、以连接Gtr2基因的重组T载体为模板，利用构建回补载体的引物扩增Gtr2基因；PCR产物经过纯化后，连接到相应的经过双酶切的双元载体pCAMBIA1300-neo上，并测序进行验证；

(2)、基因回补载体向农杆菌的转化：向农杆菌中加入质粒DNA，进行涂布平板培养后挑取单克隆菌落，提取质粒，并通过PCR扩增鉴定；

(3)、将农杆菌溶液与真菌孢子按比例混匀，涂布于硝酸纤维素膜上培养3d；

(4)、将农杆菌和真菌孢子共培养物转移到真菌筛选培养基上，黑暗条件下培养3d，直至菌落出现，再转接并进行单孢培养；

(5)、培养的菌落进行测序验证。

优选的，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指抑制菌落生长和/或产孢能力和/或产毒能力。

更优选的，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指同时抑制菌落生长、产孢能力和产毒能力；所述氨基酸为L-Asp和/或L-Cys。

本发明还提供上述方法在食品防腐中的应用。本领域技术人员知道，尖孢镰孢菌在鱼干、虾干等水产干制品中广泛存在，对水产干制品造成了一定程度的危害，因此，可以使用上述方法用于防控水产干制品中尖孢镰孢菌的爆发。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过分子生物学的方法，构建基因敲除株△FoGtr2和基因回补株△FoGtr2-C，经向野生株、以及构建的基因敲除株△FoGtr2和基因回补株△FoGtr2-C中添加不同种类的氨基酸，发现含硫氨基酸可以显著抑制尖孢镰孢菌的生长，从而可用于未来食品的防腐保鲜。

附图说明

图1为Gtr2敲除转化子中HYG基因的PCR验证(a)和Gtr2敲除转化子25-6的PCR验证(b)；(a)：M:DNA分子标记，1.转化子25-5；2.转化子25-6；3.转化子25-7；4.转化子25-8；5转化子22-14；6.转化子22-15；7.转化子22-16；8.转化子22-17.(b)：M，DNA Markers；1.以Gtr2转化子25-6菌丝DNA为模板，扩增Gtr2-5’-HY；2.以Gtr2转化子25-6菌丝DNA为模板，扩增Gtr2-3’-YG；

图2为尖孢镰孢菌Gtr2基因扩增的PCR验证M：DNA分子标记；2：Gtr2基因的PCR验证；

图3为Gtr2基因敲除菌株基因回补的PCR验证；M：DNA分子标记；1-8：分别以Gtr2基因回补的尖孢镰孢菌1-8#菌落DNA为模板，PCR扩增NEO基因；9：NEO基因PCR阳性对照；10-17：分别以Gtr2基因回补的尖孢镰孢菌1-8#菌落DNA为模板，PCR扩增HYG基因；18：HYG基因PCR阳性对照；

图4为尖孢镰孢菌野生株Fo17、△FoGtr2和△FoGtr2-C在添加18种氨基酸的PDA培养基上的菌落形态；

图5为Fo17野生株和Gtr2基因缺失株及回补株在CDA液体培养基中的产孢量(注：以Fo17在CDA培养基的产孢量为基准，进行单因素方差分析，结果以p<0.05标为#，p<0.01标为##)；

图6为Fo17野生株、Gtr2基因敲除及回补株在分别添加特定氨基酸的CDA液体培养基中的产孢规律热图；

图7为野生株Fo17在分别添加18种氨基酸的GYM培养基中培养14d后T-2毒素产生量；

图8为△FoGtr2和△FoGtr2-C在分别添加18种氨基酸的GYM培养基中培养14d后T-2毒素的产生量(注：以△FoGtr2和△FoGtr2-C在GYM培养基中的产T-2毒素量为基准，进行显著性差异分析，p<0.05标为#)；

图9为Fo17野生株、Gtr2基因敲除及回补株在添加特定氨基酸的CDA液体培养基中的产T-2毒素规律热图；

图10为氨基酸对TORC1-Gtr2基因缺失尖孢镰孢菌的生长、产孢和产T-2毒素的调控。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

供试菌株：尖孢镰孢菌野生株Fo17(GDMCC 60824)、基因敲除株△FoGtr2和基因回补株△FoGtr2-C，上述基因敲除株和基因回补株的构建均属于常规基因工程和分子生物学技术。

实验数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示，通过SPSS 19.0对菌落生长直径、孢子产量和T-2产生量进行单因素方差分析，以p<0.05定义为具有显著性差异水平。

实施例1基因敲除株△FoGtr2和基因回补株△FoGtr2-C的构建

一、尖孢镰孢菌Gtr2基因敲除株的构建

1、钢珠法小量提取基因组DNA：在平板上挑取新鲜菌丝约0.1g，置于2mL离心管中，在装有菌丝的离心管中加入600μL细胞裂解液，加研磨钢珠2颗，将2mL的离心管放入样品研磨器中，以60Hz的频率振荡1min。研磨好的样品静置10min后，4℃，13,200rpm离心10min。吸取上清到新的离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min。弃去上清，用70％的乙醇洗涤沉淀。沉淀干燥后用100μL ddH₂O溶解。

2、CTAB法提取尖孢镰孢菌DNA

将新鲜培养的尖孢镰孢菌菌块接种于200mL PDB培养液中，25℃，180rpm/min培养24h。培养结束后用纱布过滤菌丝，用灭菌蒸馏水洗涤菌丝3次，用吸水纸擦干菌丝水分后加入液氮研磨成细粉状。随后加入65℃预热后的10mL CTAB抽提液，轻微振荡摇匀，并在65℃水浴锅中加热1h，结束后在4℃条件下9,000rpm离心10min，取上清液于离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(v:v:v＝25:24:1)，振荡混匀后12,000rpm离心10min，取上清液加入2倍体积的-20℃预冷无水乙醇，混匀后静置2h，再4℃、1,000rpm离心10min，去掉上清液，同时使用10mL 70％乙醇洗涤5次，洗涤后在1,000rpm下离心5min，保留沉淀并干燥。干燥后加入400μL双蒸水溶液DNA并于37℃培养下中加入1μL的10mg/mL RNase温育2h。

3、PCR扩增

PCR反应体系：

PCR反应条件：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸5s/kb，35个循环；72℃延伸5min，产物于4℃保存。

4、DNA电泳、PCR产物纯化、DNA酶切：采用常规手段。

5、DNA片段与载体连接

采用T4 DNA Ligase连接DNA片段与载体。

连接体系如下：

10×ligation buffe 2μL；

载体DNA 50ng；

***DNA片段(与载体DNA的摩尔比约为3)；

T4 DNA Ligase(350U/μL) 1μL；

ddH₂O add to 50μL；

连接条件：16℃，2h。

6、质粒DNA转化大肠杆菌(E.coil DH 5α)感受态细胞、质粒DNA的提取均采用常规手段；分生孢子的制备、原生质体的制备均采用常规手段；

7、尖孢镰孢菌转化：在放置于冰上预冷的1.5mL离心管中加入200μL待转化的原生质体细胞，加入100μL DNA样品，10μL 5mg/mL肝素钠以及250μL SPTC溶液后充分吸打混匀，冰上避光放置30min。然后向混合液中逐滴加入400μL SPTC溶液并充分混匀，避光室温放置20min。将混合液加入装有25mL TB3液体培养基的三角瓶中，缓慢混匀，并置于暗处30min。然后将三角瓶置于25℃摇床，100rpm过夜培养。次日将菌丝加入到PDA培养基中，再加入100μg/mL潮霉素，25°培养至转化子长出。

8、Gtr2基因编码区核苷酸序列的测定：首先从网站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi下载Gtr2(P53290)基因的核苷酸序列，并进行比对，根据比对结果设计扩增基因的引物Gtr2_5F和Gtr2_3R。以尖孢镰孢菌提取基因组DNA为模板，PCR扩增基因的编码框区域。PCR产物经过电泳后切胶纯化，并连接T载体测序。将测序结果与相关序列进行比对并作为设计后续用于基因敲除引物时的参照序列。

9、按照Split-marker重组技术成功构建Gtr2的敲除结构Gtr2-5’-HY(Gtr2左同源臂与HY的融合结构)和Gtr2-3’-YG(Gtr2右同源臂与YG的融合结构)；根据原生质体转化方法，将Gtr2的敲除结构Gtr2-5’-HY和Gtr2-3’-YG同时转化尖孢镰孢菌的原生质体细胞。转化后原生质体铺含有潮霉素HYG的平板进行筛选，25℃条件下培养至转化子长出。

10、Gtr2基因敲除转化子的验证

从同时转化Gtr2左右同源臂Gtr2-5’-HY和Gtr2-3’-YG的筛选平板上长出的菌落上挑取菌丝，提取菌丝DNA并扩增潮霉素抗性基因HYG。扩增结果：从25-6号转化子中扩增到了与预期大小一致的条带。以25-6号转化子DNA为模板，分别用引物Gtr2-A1和HY、Gtr2-A4和YG扩增Gtr2-5’-HY和Gtr2-3’-YG，扩增出的条带大小与预期一致。将PCR产物切胶纯化，并测序。结果表明Gtr2基因被成功敲除(图1)。

二、尖孢镰孢菌Gtr2基因敲除株的回补

1、回补基因序列的扩增

扩增待回补基因的全长序列(包括基因5’端的启动子区域和3’端的终止子区域)，基因扩增的参考序列通过同源查找尖孢镰孢菌Fusarium oxysporium的基因(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group/MultiHome.htmL)获得。基因扩增所需要的引物序列见表1。以野生型尖孢镰孢菌基因组DNA为模板，使用相应的引物扩增Gtr2基因的全长序列。PCR产物经过纯化后连接到T载体上进行测序。

表1

PCR扩增结果如图2所示，可以看出Gtr2基因的全长序列在5000bp左右。

2、基因回补载体的构建：

分别以连接有上述全长基因的重组T载体为模板，利用构建回补载体的引物扩增基因。PCR产物经过纯化后，利用In-

HD Cloning Kit连接到相应的经过双酶切的双元载体pCAMBIA1300-neo上。

构建回补载体的引物利用在线软件(http://www.takarabio.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Selection_Guides/Online_In-Fusion_Tools)完成。连接的正确性经过测序进行验证。

3、基因回补载体向农杆菌的转化，包括以下步骤：

(1)取一管农杆菌感受态细胞(200μL)，放置于冰上融化后，加入1μg质粒DNA，轻轻混匀后冰上放置30min。

(2)然后于液氮中速冻l min，37℃水浴5min。

(3)加入400μL LB液体培养基(不含抗生素)，28℃振荡培养2d直至长出单菌落。挑取单克隆菌落，提取质粒，并通过PCR扩增鉴定。

4、农杆菌介导的尖孢镰孢菌的转化

(1)真菌孢子的制备：挑取新鲜培养的禾谷镰孢菌边缘菌块，加入到150mLCMC孢子培养液中，25℃摇床中180rpm培养6d，培养后菌液通过2层纱布过滤，并用少量无菌水冲洗纱布，收集滤液，4℃，2,500×g离心10min，收集孢子。用IM液体培养基悬浮孢子，使孢子浓度达到1×10⁷CFU/mL。

(2)农杆菌的准备：

a、将带有双元载体的农杆菌在LB平板(含Kan 50μg/mL，rif 50μg/mL)上划线，28℃培养3天，以得到农杆菌单克隆；b、挑取一个农杆菌单克隆接种到液体10mL LB培养基(含Kan 50μg/mL，rif 50μg/mL)，28℃，250rpm培养24h；c、取1.5mL农杆菌菌液，室温下2，400g离心10min。弃去上清，用250μL液体IM培养基缓慢悬浮沉淀，室温下2,400g离心10min，弃去上清；d、将沉淀悬浮于5mL液体IM培养基(含200μM AS)，再将菌液转入100mL锥形瓶，28℃，100rpm培养5h，将菌液的OD 600nm调节为0.8。

5、农杆菌-真菌共培养

取100μL上述农杆菌溶液与100μL真菌孢子(浓度约为1×10⁷CFU/mL)以1:1的比例混匀。用灭菌镊子将0.45μM硝酸纤维素膜放入15cm直径的IM平板(含有200μM的AS)上，吸取200μL农杆菌与真菌孢子的混合液，加到平板上的硝酸纤维素膜上，用玻璃涂布器涂匀。将平板放置在25℃条件下培养3d。

6、转化体的筛选

将带有农杆菌和真菌孢子共培养物的硝酸纤维素膜用灭菌的镊子转移到真菌筛选培养基上(PDA培养基，含有Kan 50μM，cef 200μM，Geneticin 100μM)。黑暗条件下30℃培养3d，直至菌落出现。将转化体再转接到筛选培养基上，进行单孢培养。

7、回补菌株的验证

用AxyPrep基因组DNA小量提取试剂盒提取待验证菌株的基因组DNA。以引物NEO-F和NEO-R进行PCR扩增。

PCR验证体系如下：

利用引物Gtr2-C1和Gtr2-C2，以野生型的尖孢镰孢菌扩增基因组进行PCR测序，经重组得到基因回补引物Gtr2-infu-5F和Gtr2-infu-3R扩增Gtr2基因全长序列，并将Gtr2基因连接到经过Bam HI和SalI双酶切的双元载体pCAMBIA1300-NEO上，得到回补载体pCA-FoGtr2-C，并转入农杆菌感受态细胞中，再将pCA-FoGtr2-C转入Gtr2基因敲除的尖孢镰孢菌中。回补株经抗性培养基筛选和PCR验证，得到Gtr2基因回补的尖孢镰孢菌(图3)。

实施例2氨基酸添加对镰孢菌菌落生长的影响

配制含5mg/mL特定氨基酸(sAA)的PDA培养基，回补株培养基中添加10μg/mL潮霉素。以PDA培养基作为对照组，PDA培养基中添加0.5mmol/L雷帕霉素设置为阳性对照组。培养基121℃灭菌冷却后，使用Fo17野生株、Gtr2基因敲除株及回补株平板各打5mm菌饼，接种于sAA-PDA培养基，28℃培养7d，菌落拍照观察。

一、不同氨基酸对△FoGtr2和△FoGtr2-C菌落生长的影响

由图4可得，与野生株Fo17相比，△FoGtr2和△FoGtr2-C在PDA培养基中的菌落生长显著较小，气生菌丝生长减弱。在大部分氨基酸添加下，△FoGtr2生长均显著受到抑制，菌丝体与PDA中菌落相比较小，且无明显气生菌丝。在Gly、L-Leu和L-Thr添加下，△FoGtr2-C回补株菌落生长率略有增加，但无法恢复成野生菌株形态，结果表明Gtr2基因敲除对镰孢菌响应营养物质具有重要影响，基因缺失后，生长显著下降。在L-Cys、L-Met、L-Asp和L-Glu添加下，△FoGtr2和△FoGtr2-C菌落生长均显著抑制，菌丝体较小。

二、氨基酸对镰孢菌菌落生长率分析

以Fo17野生株及TORC1基因缺失株及回补株在PDA培养基为基准(100％)，计算在添加不同氨基酸PDA培养基的菌落生长率，结果表明：Fo17在L-Arg、L-Cys、L-Glu及L-Iso添加的培养基中的生长率分别为80.0％、44.3％、49.3％、72.8％，表明其生长显著受到抑制。△FoGtr2在Gly的培养基中生长率为95.6％，而回补后仅为82.7％，与野生株相近，表明在Gtr2基因敲除后，对Gly的吸收增加。

Fo17及Gtr2基因突变体和回补株在L-Met培养基中的生长率均低于80％，表明L-Met显著抑制尖孢镰孢菌生长，且不受目标基因调控。△FoGtr2在L-Lys和L-Pro添加的培养基中生长率为仅为52.2％和63.0％，基因回补后分别达到69.3％和101.4％。

实施例3TORC1关键基因介导氨基酸对镰孢菌孢子产生的影响

一、对CDA液体培养基中孢子产生量及孢子形态的影响

配制sAA-CDA培养基，每个培养基含10mg/mL特定氨基酸，将基因缺失株及回补株分别接种于特定的10mL sAA-CDA培养基内，28℃摇床培养7d。培养结束后用磁力搅拌器500rpm/min转速将孢子混匀打碎，三层纱布过滤。取50μL滤液在显微镜下用血细胞计数板测定孢子数量。

由图5可得，Fo17野生株在CDA液体培养基中的产孢量为12.3×10⁵CFU/mL，△FoGtr2产孢量显著降低(p<0.01)，仅为3.2×10⁵CFU/mL，基因回补后△FoGtr2-C产孢量增加，但仍低于野生株对照组。

Fo17野生株在CDA液体培养基上的产孢量为12.3×10⁵CFU/mL，在培养基添加L-Asp、L-Cys、Gly、L-His和L-Leu后，Fo17产孢量明显减少至2.3-7.6×10⁵CFU/mL，表现为氨基酸负向抑制产孢效应。而在L-Arg和L-Iso添加后Fo17产孢量达18.5-18.7×10⁵CFU/mL。△FoGtr2在L-Glu添加下的培养基中产孢量升高，回补后降低至对照组水平。L-Lys、L-Met、L-Phe添加后Fo17野生株产孢量明显升高，对产孢能力表现为正向激活作用；而L-Thr、L-Val、L-Try添加后产孢量显著减少，表现为负向抑制作用。L-Thr激活△FoGtr2的产孢量。△FoGtr2和△FoGtr2-C在L-Pro、L-Ser、L-Try添加后，产孢量显著受到抑制。

二、镰孢菌在CDA液体培养基中的产孢规律

根据图6聚类分析热图可得，Fo17野生株和Gtr2基因敲除及回补株在L-Cys、L-Leu、L-Val、L-Try、L-Ala和Gly添加的CDA培养基中，产孢量显著较低，表明这6种氨基酸对镰孢菌的产孢能力具有抑制效应。而在L-Glu、L-Phe、L-Tyr、L-Met、L-Arg、L-Lys添加下，菌株产孢量呈现较高水平。

实施例4TORC1关键基因介导氨基酸对镰孢菌产T-2毒素的影响

配制含5mg/mL特定氨基酸的GYM培养基，取1mL sAA-GYM培养基溶液加入2mL离心管中，将不同种类的镰孢菌分别打2个5mm菌饼，接种于液体培养基中，28℃120r/min摇床培养15d，培养结束后将培养液5,000rpm离心15min，取上清液加入等量乙酸乙酯，涡旋震荡3min后收集上清液，重复操作3次，合并上清液，60℃氮气吹干后加入1mL的30％甲醇溶液复溶，涡旋震荡至底层沉淀溶解，0.22μm滤膜过滤，LC-MS/MS法测定T-2含量。

一、氨基酸添加对野生株Fo17产T-2产量的影响

由图7可得，野生株Fo17在GYM培养基中的产T-2为22.8ng/mL，添加L-Asp、L-Glu后产毒量显著降低，仅为14.8ng/mL和12.6ng/mL(p<0.05)。添加L-Cys、L-Phe和L-Pro后产T-2量显著升高，分别达33.6、30.5和31.0ng/mL。在其他氨基酸添加下的GYM培养基中镰孢菌产T-2量与对照组无明显差异(p>0.05)。

二、氨基酸添加对△FoGtr2和△FoGtr2-C产T-2毒素产量的影响

由图8可得，△FoGtr2在GYM培养基中产T-2量为30.9ng/mL，基因回补△FoGtr2-C在GYM培养基产毒下降为23.6ng/mL。表明Gtr2基因缺失将激活毒素调控基因，提高产毒水平。在L-Ala、L-Asp、L-Arg、L-Glu、L-Phe、L-Pro、L-Ser和L-Thr添加的GYM培养基中的产T-2量均显著减少(p<0.05)，产T-2量为11.1-23.3ng/mL，基因回补后略有升高，但L-Asp和L-Glu组仍低于对照组水平。△FoGtr2在L-Met添加的GYM培养基里与对照组无显著差异，而△FoGtr2-C则显著升高，产毒量达39.9ng/mL。△FoGtr2在L-Val添加下产毒素量显著升高(p<0.05)，达46.1ng/mL，基因回补后恢复正常水平。

三、氨基酸添加调控镰孢菌产毒规律

由图9可得，Fo17野生株、Gtr2基因敲除及回补株在L-Asp、L-Glu添加的GYM培养基中产毒量显著降低，表明这两种氨基酸可显著抑制镰孢菌的产毒能力。△FoGtr2在L-Val添加下T-2产生量显著上升，Gtr2基因回补后下降，表明在Gtr2基因缺失后，对镰孢菌产毒能力呈正调控作用。5株菌在L-His、L-Tyr添加中的培养基的产T-2量与GYM培养基最为相近。

实施例5TORC1关键基因介导氨基酸对镰孢菌生长及代谢规律

由图10可得，Gtr2基因缺失后，L-Met、L-Pro、L-Thr和L-Tyr添加后，△FoGtr2菌丝生长反向抑制效应明显。在调控孢子产生量方面，氨基酸添加对其的影响与菌丝生长调控方面具有显著差异。L-Pro显著抑制△FoGtr2菌丝生长能力，但显著增加孢子产生量，同时抑制T-2产毒量。L-Asp正向激活产孢能力，同时降低了产生T-2的能力。

雷帕霉素敏感的TORC1激酶是保守的信号转导级联途径的重要成分，该信号转导级联控制细胞对氨基酸的吸收和响应，调节真菌生长、代谢和毒力产生能力。氨基酸作为一类含碱性氨基和酸性氨基的有机化合物，组成和结构的差异性造成种类的多样性，对真菌通过TORC1响应的程度和利用率也具有显著不同。本研究中，发现Gly、L-His、L-Pro和L-Thr对镰孢菌野生株的生长具有激活作用，表明这四种氨基酸可在真菌氮合成和代谢中被迅速利用转换。

本研究还发现酸性氨基酸L-Asp、L-Glu和含硫氨基酸L-Cys、L-Met对镰孢菌野生株的生长具有显著抑制作用，且基因敲除株和回补株均呈现相同抑制表型，表明这两类外源氨基酸是在TOR通路介导外对镰孢菌生长产生负调控效应。

镰孢菌在碱性条件下生长较快，而酸性氨基酸L-Asp和L-Glu添加到培养基中，显著降低培养条件的pH值，因此，酸性氨基酸并不利于镰孢菌的生长。L-Asp常与其他金属元素结合，制备成抑真菌剂，应用于食品真菌防控。Bitu等通过对新型含L-Asp和胺基的Th(IV)和Zr(IV)离子过氧配合物进行。

在TORC1关键基因介导的氨基酸信号调控中，氨基酸对镰孢菌TORC1基因突变株的调控是各异的。在TORC1-Gtr2基因缺失后，镰孢菌菌丝生长显著受到抑制，氨基酸添加后菌落生长更加缓慢，产孢能力丧失。这可能是由于在真菌TOR***激活调控过程中，Gtr1功能依赖于与Gtr2的结合。

在真菌生长过程中，营养是生长的基础，生长是营养的表现形式。在本研究中，含硫氨基酸L-Cys、L-Met和酸性氨基酸L-Asp和L-Glu添加对镰孢菌菌落生长具有明显抑制作用，在Gtr2基因敲除后，菌丝体在氨基酸添加下也表现出相同菌丝形态。然而，在L-Pro、Gly和L-Thr添加下，菌落生长较好，菌丝呈顶端生长，气生菌丝较少，表明这三种氨基酸促进生长具有重要作用。

在产孢能力试验中，观察到镰孢菌野生株在MM、L-Ala和L-Arg添加的MM培养基中产孢量最多，并呈聚集状分布。

Claims (8)

1.氨基酸在抑制尖孢镰孢菌生长中的应用，其特征在于，所述氨基酸选自酸性氨基酸和含硫氨基酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氨基酸选自L-Asp、L-Cys、L-Glu、L-Met中的至少一种。

3.一种氨基酸协同Gtr2基因调控抑制尖孢镰孢菌生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、分别构建尖孢镰孢菌基因敲除株△FoGtr2和尖孢镰孢菌基因回补株△FoGtr2-C；

S2、分别向尖孢镰孢菌野生株、基因敲除株△FoGtr2和基因回补株△FoGtr2-C中添加氨基酸，所述氨基酸选自L-Asp、L-Cys、L-Glu、L-Met中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的氨基酸协同Gtr2基因调控抑制尖孢镰孢菌生长的方法，其特征在于，S1所述尖孢镰孢菌基因敲除株△FoGtr2的构建方法包括以下步骤：

(1)、以质粒pBluescript KS(+-)(pBS)-HPH1为模板，PCR扩增HYG抗性基因，将PCR产物纯化后连接T载体，得到重组质粒HYG-T，并测序验证；

(2)、以HYG为目标基因设计正向引物和反向引物，以重组质粒HYG-T为模板，扩增得到HYG的融合片段，扩增Gtr2基因的左右同源臂，通过重叠PCR连接T载体；

(3)、按照Split-marker重组技术成功构建Gtr2的敲除结构；

(4)、通过原生质体转化，将Gtr2的敲除结构转化尖孢镰孢菌的原生质体细胞，转化后原生质体通过潮霉素HYG平板筛选，25℃条件下培养至转化子长出。

5.根据权利要求3所述的氨基酸协同Gtr2基因调控抑制尖孢镰孢菌生长的方法，其特征在于，S1所述尖孢镰孢菌基因回补株△FoGtr2-C的构建方法包括以下步骤：

(1)、以连接Gtr2基因的重组T载体为模板，利用构建回补载体的引物扩增Gtr2基因；PCR产物经过纯化后，连接到相应的经过双酶切的双元载体pCAMBIA1300-neo上，并测序进行验证；

(2)、基因回补载体向农杆菌的转化：向农杆菌中加入质粒DNA，进行涂布平板培养后挑取单克隆菌落，提取质粒，并通过PCR扩增鉴定；

(3)、将农杆菌溶液与真菌孢子按比例混匀，涂布于硝酸纤维素膜上培养3d；

(4)、将农杆菌和真菌孢子共培养物转移到真菌筛选培养基上，黑暗条件下培养3d，直至菌落出现，再转接并进行单孢培养；

(5)、培养的菌落进行测序验证。

6.根据权利要求3所述的氨基酸协同Gtr2基因调控抑制尖孢镰孢菌生长的方法，其特征在于，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指抑制菌落生长和/或产孢能力和/或产毒能力。

7.根据权利要求6所述的氨基酸协同Gtr2基因调控抑制尖孢镰孢菌生长的方法，其特征在于，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指同时抑制菌落生长、产孢能力和产毒能力；所述氨基酸为L-Asp和/或L-Cys。

8.权利要求3至6任一项所述的方法在食品防腐中的应用。

Images