CN114276935A - 一株青霉菌xzh-22及其应用 - Google Patents
一株青霉菌xzh-22及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114276935A CN114276935A CN202111581870.9A CN202111581870A CN114276935A CN 114276935 A CN114276935 A CN 114276935A CN 202111581870 A CN202111581870 A CN 202111581870A CN 114276935 A CN114276935 A CN 114276935A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- penicillium
- xzh
- enzyme
- cellulose
- preparation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 title claims abstract description 63
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 101
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims abstract description 101
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 57
- 101710154526 Lytic chitin monooxygenase Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims abstract description 39
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 39
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims abstract description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 33
- 241000228168 Penicillium sp. Species 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000002023 wood Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 32
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 25
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 25
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 16
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 16
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 15
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 15
- 238000010563 solid-state fermentation Methods 0.000 claims description 14
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 7
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 claims description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 6
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 6
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000010902 straw Substances 0.000 claims description 6
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 5
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 5
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 2
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- 239000000835 fiber Substances 0.000 abstract description 5
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000985513 Penicillium oxalicum Species 0.000 description 12
- 241000228153 Penicillium citrinum Species 0.000 description 11
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 2
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940084434 fungoid Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011973 solid acid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一株青霉菌XZH‑22及其应用。该青霉(Penicillium sp.)XZH‑22的保藏编号为：CGMCC No.23297。本发明的青霉菌XZH‑22可分泌大量的裂解性多糖单加氧酶，该裂解性多糖单加氧酶的酶活力最高可达到12.87U/g底物，该青霉菌XZH‑22所产的纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于林木纤维素酶解，酶解效率提高22.8％。该纤维素酶和LPMO酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，从而有效地降低酶解过程的加酶量。可进一步降低纤维素乙醇的生产成本，加快其产业化进程。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株青霉(Penicillium sp.)XZH-22及其应用。
背景技术
生物质作为一种极具开发潜力的绿色可再生资源且具有碳中和特性，以其为原料制备醇类燃料是未来发展的重要方向。但是，木质纤维素生物降解过程酶解效率不高，用酶量大，成本高成为主要瓶颈。
木质纤维素高效糖化需要数十种酶协同作用，纤维素降解酶系的组成及组分间的比例平衡直接影响酶解效率。其中，裂解性多糖单加氧酶(LPMOs)是近年发现的一种具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，有效地降低酶解过程的加酶量。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株产纤维素酶和裂解性多糖单加氧酶的青霉(Penicillium sp.)XZH-22，该菌于2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.23297。
本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-22是从腐烂的枯枝中分离筛选得到。其真菌分类学表明：菌株XZH-22在PDA培养基上30℃培养3d，如图2所示，初始为白色，培养表面干燥有白粉，培养3d后菌落表面呈粉末状并伴随菌丝绒毛，菌体中心菌丝变稠密、边缘变为青绿色，长成近圆形菌落。菌株XZH-22在含有CMC-Na的刚果红培养基上30℃划线培养5d，如图3所示，培养3d后刚果红平板开始出现部分水解现象，培养5d后刚果红平板水解明显，表明该菌具有较强的纤维素水解能力。该菌菌丝体及孢子电镜扫描图如图4所示，菌丝体呈杆状、细长，出芽生殖。根据菌落形态和分生孢子结构特征，参照《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》进行比对分析，可初步确定该具有纤维素水解能力的菌株XZH-22为青霉菌属。
本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-22的分类学地位根据下述方法确定：
常规方法提取该菌株XZH-22的总DNA，扩增菌株的ITS区域rDNA序列，其序列如SEQID NO.3所示。经比较分析，本发明的菌株XZH-22属于青霉菌属，将其命名为青霉(Penicillium sp.)XZH-22，该菌于2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.23297。
本发明的第二个目的是提供所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22在生产纤维素酶和/或裂解性多糖单加氧酶(LPMO)中的应用。
根据LPMO特异性底物的测定反应，发现本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-22能产较高的LPMO，由青霉(Penicillium sp.)XZH-22固态发酵制得的酶组合制剂的最高LPMO 酶活高达12.87U/g底物(LPMO酶活力单位定义：在反应体系中每毫升酶液、每分钟催化1 μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位)，而该酶组合制剂的滤纸酶活为0.76IU/g底物。本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-22所产的LPMO具有较高的LPMO酶活力，因此，是一种新型高产的产LPMO菌株。
本发明的第三个目的是提供所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22在纤维素水解中的应用。
本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-22制备的酶组合制剂可以应用在纤维素水解上，尤其是林木纤维素的水解。杨木经过预处理后，加入商品纤维素酶，然后加入青霉(Penicillium sp.)XZH-22所产的酶组合制剂进行酶解，使得高度结晶的杨木底物结构趋于松散，从而使纤维素酶更易与底物结合，最终协同提高纤维素水解效率的22.8％。
本发明的第四个目的是提供所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22在木质纤维素原料酶解糖化中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22在生产具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂的制备方法，包括以下步骤：制备青霉(Penicillium sp.)XZH-22的固态发酵物，然后用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂。
所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22的固态发酵物是通过以下方法制备的：将活化的青霉(Penicillium sp.)XZH-22接种到种子培养基中，30℃，150rpm，培养3d，获得种子培养液；将种子培养液接种到固态发酵培养基中，30℃，发酵5d，获得固态发酵物；所述的种子培养基每升是通过以下方法制备的：称取200g去皮土豆，加水煮沸，经纱布过滤得土豆浸汁，然后加入葡萄糖20g，溶解后加水定容至1L；所述的固态发酵培养基包括稻秆和营养盐溶液，所述的营养盐溶液的添加量为每5g稻秆加入10.5mL营养盐溶液；所述的营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 10.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为水。
优选，所述的用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂具体为：用pH4.8 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm震荡1h，收取液体即为发酵酶液，8000rpm，4℃离心5 min，取上清即为具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂。
本发明的第七个目的是提供所述的制备方法制备得到的具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂。
本发明的第八个目的是提供所述的具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂在纤维素水解中的应用。
本发明筛选的青霉(Penicillium sp.)XZH-22，该菌能产生一种新型的LPMO，该菌固态发酵制得的酶组合制剂的最高LPMO酶活高达12.87U/g底物(LPMO酶活力单位定义：在反应体系中每毫升酶液，每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位)，该酶组合制剂的滤纸酶活为0.76IU/g底物，该酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率的22.8％，有效地降低酶解过程的加酶量。
本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-22于2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.23297。
本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-6于2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.23296。
附图说明
图1是本发明实施例1中复筛4种菌株的纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解中的酶解效果。其中，XZH-2为草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)XZH-2；XZH-6为青霉(Penicillium sp.)XZH-6；XZH-16为桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16；XZH-22 为青霉(Penicillium sp.)XZH-22。
图2是本发明青霉(Penicillium sp.)XZH-22在PDA培养基上的菌落形态。
图3是本发明青霉(Penicillium sp.)XZH-22在含CMC-Na的刚果红培养基的水解图。
图4是本发明青霉(Penicillium sp.)XZH-22菌丝体及孢子电镜扫描图。
图5是本发明青霉(Penicillium sp.)XZH-22的***发育树图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：菌株的筛选
从腐烂的枯枝进行采集。把采集的枯枝样品置于锥形瓶中，放入几粒玻璃珠，添加适量生理盐水，然后放于150rpm，1h摇床上振摇混匀；移取2mL混匀液于100mL富集培养液中，然后置于30℃，150rpm的摇床上振荡培养3d，获得富集培养物，富集培养液的配方是：NaCl 1.0g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，羧甲基纤维素(CMC)10.0g，蛋白胨2.5g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000mL，配制：将上述各组分溶于水，灭菌，即得。将富集培养物直接涂布于刚果红初筛培养基，30℃观察培养3d，刚果红初筛培养基的配方是：每升培养基中含有KH2PO4 0.5g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.25g，CMC 2.0g，刚果红0.2g，技术琼脂粉20g，余量为水，自然pH值，配制：将上述各组分溶于水，灭菌，即得。挑取水解透明圈较大的单菌落在PDA平板培养基上划线纯化，纯化的菌株进行PDA斜面保存。
菌株产纤维素酶和LPMO活力复筛：将PDA斜面保存的纯化菌株分别接种到等量的复筛固态发酵培养基中，30℃，120rpm，培养5d，上述的复筛固态发酵培养基由5g稻秆和10.5mL营养盐溶液组成，营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 10.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为1000mL水。菌株经固态培养发酵后离心取上清液，即为粗酶液。分别用标准滤纸酶活(FPA)法和Amplex Red-辣根过氧化氢酶法测定菌株产粗酶液的FPA和LPMO酶活。FPA法测定具体方法为：15mL具塞试管中分别加入0.25mL粗酶液，1.75mL pH4.8 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，1×6cm新华中速定量滤纸条(约50mg)，充分混匀后放入50℃水浴反应60min；然后加入2mL DNS试剂，在沸水浴中煮沸10min；冷却后用蒸馏水定容至15mL；定容后550nm下测定OD值。空白中的粗酶液用煮沸灭活的粗酶液代替。测得OD值后，查标准曲线，求出溶液中葡萄糖的含量(酶活力单位定义：在上述测定条件下，每l mL粗酶液每分钟水解产生1μmol底物(葡萄糖180) 所需的酶量为一个酶活单位IU)。Amplex Red-辣根过氧化物酶法的具体方法为：参照
Red HydrogenPeroxide/Peroxidase Assay Kit说明书，配制100μM Red reagent 50μL，加入粗酶液20μL，1×Reaction buffer 30μL，共100μL反应体系，使用酶标仪(EON，BioTek) 在波长530nm获得吸光度数据，孵育30min后，再使用酶标仪在波长560nm下获得吸光度数据。以没有LPMO的对照样品中作为测量背景信号并从测定中扣除。以H2O2为底物做标准曲线，求出反应释放的过氧化氢含量(LPMO酶活力单位定义：在反应体系中每毫升粗酶液，每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位U)。最后选择LPMO和滤纸酶活较高的菌株使用PDA斜面保存。
经筛选获得1株LPMOs活力较高的菌株XZH-22。采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒B518259提取该菌株总DNA，选择扩增真菌18S rDNA序列的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，如SEQ ID NO.1所示)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATG C-3′，如SEQ ID NO.2所示)对菌株XZH-22总DNA进行ITS区域rDNA序列的扩增。在 50μL的PCR反应体系中含有10×Taq Buffer(with MgCl2)5μL，dNTP(mix)(10mmol/L each) 2μL，10μM引物ITS1 2μL，10μM引物ITS4 2μL，Tag酶(5U/μL)0.5μL，20～50ng/μL 的模板DNA 1μL，其余体积以无菌超纯水补足。变性梯度PCR扩增条件为：95℃预变性4min， 94℃变性30sec，55～60℃退火30sec，72℃延伸50sec，35个循环，72℃延伸10min。PCR 扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，经测序，其序列如SEQ ID NO.3所示，将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，如图5所示，经序列比对分析，发现菌株XZH-22与草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)XZH-2(accession number: MW686749)、桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16(accession number:MW686751)等菌株均处于同一分支。综合菌落特征及***发育分析，可以确定菌株XZH-22为青霉(Penicillium sp.)，将其命名为青霉(Penicillium sp.)XZH-22，提交序列后获得的登录号为MW686752。该菌于2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCCNo.23297。
实施例2：生理生化鉴定
Biolog微生物鉴定***是根据微生物利用化学物质进行呼吸时会将四唑类氧化还原染色剂从无色还原成紫色，从而在微生物鉴定板上形成该微生物特征性的反应模式或“指纹”，通过纤维光学读取设备—读数仪来读取颜色变化，并将该反应模式或“指纹”与数据库相比就可以在瞬间得到鉴定结果。
分别对草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)XZH-2(即菌株2)，青霉(Penicilliumsp.) XZH-6(即菌株6)，桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16(即菌株16)，青霉(Penicillium sp.)XZH-22(即菌株22)，进行生理生化鉴定。
其中，草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)XZH-2已公开于申请号为CN202110419980.9 的中国发明专利中，桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16(即菌株16)已公开于申请号为CN202110418557.7的中国发明专利中。
青霉(Penicillium sp.)XZH-6于2021年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，其保藏编号为：CGMCC No.23296。
菌株生理生化鉴定在GEN III Microstation自动微生物鉴定***进行，将2、6、16、22 四株菌的新鲜培养物放入真菌鉴定板(FF板)中，培养一定时间读数，菌株2、6、16、22生理生化鉴定结果如表1，四株菌都可以利用核糖、木糖，2号在***糖、蔗糖上均呈阳性，6号、16号在***糖、葡萄糖上均呈阳性，22号在海藻糖、蔗糖、甘露糖上均呈阳性。根据生理生化指标，通过与数据库比对，最后得出2、6、16、22号四株菌为不同的青霉菌。
表1菌株的生理生化特性
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
实施例3：酶组合制剂的制备以及酶活力测定
1.酶组合制剂的制备：挑取PDA斜面保存的青霉(Penicillium sp.)XZH-22菌块接种到 50mL PDA液体培养基(种子培养基)中，30℃，150rpm培养3d活化，将活化的青霉(Penicillium sp.)XZH-22以50μL的接种量接种到50mL PDA种子培养基中，30℃，150rpm，培养3d，获得种子培养液。PDA种子培养基为每升培养基含土豆200.0g浸汁，葡萄糖20.0 g，余量为水；配制方法：称取200.0g去皮土豆，加入适量水煮沸30分钟，纱布过滤，滤液即土豆浸汁，然后加入葡萄糖20.0g，溶解后加水定容至1L，115℃灭菌30min。将种子培养液以2mL的接种量接种到固态发酵培养基中，30℃，发酵5d，获得固态发酵物。上述的固态发酵培养基由5g稻秆和10.5mL营养盐溶液组成，营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 10.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为1000mL 水。然后用50mL pH4.8 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm震荡1h，收取液体即为发酵酶液，8000rpm，4℃冷冻离心5min，取上清即为酶组合制剂(即纤维素酶和LPMO酶组合制剂)，4℃保存备用。
2.LPMO酶活力测定：参照
Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase AssayKit说明书，配制100μM Red reagent 50μL，加入纤维素酶和LPMO酶组合制剂20μL，1×Reaction buffer 30μL，共100μL反应体系，使用酶标仪(EON，BioTek)在波长530nm获得吸光度数据，孵育30min后，再使用酶标仪在波长560nm下获得吸光度数据。以没有LPMO的对照样品中作为测量背景信号并从测定中扣除。以H2O2为底物做标准曲线，求出反应释放的过氧化氢含量(LPMOs酶活力单位定义：在反应体系中每毫升纤维素酶和LPMO酶组合制剂，每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位U)。经测定，经步骤1得到的青霉(Penicillium sp.)XZH-22产的纤维素酶和LPMO酶组合制剂的LPMO酶活达到12.87U/g 底物，具有较高的酶活力。
结果表明，本发明的青霉(Penicillium sp.)XZH-22能高产LPMO，由青霉(Penicillium sp.)XZH-22固态发酵制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂的LPMO酶活高达12.87U/g底物。因此，本发明的产纤维素酶和LPMO的青霉(Penicillium sp.)XZH-22具有较高的产酶能力，是一种新型高产的产纤维素酶和LPMO菌株。
按照上述步骤1(除了接种菌种不同，其余参数一致)，分别制备由草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)XZH-2(即菌株2)、青霉(Penicillium sp.)XZH-6(即菌株6)、桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16菌株(即菌株16)固态发酵制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂，以进行实施例4试验比较。
实施例4：纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解
1.反应底物：杨木粉碎至60目，105℃烘干至恒重，称取2.5g杨木粉与2.5g固体酸(具体制备方法参见专利ZL 201110126178.7的实施例3)混合，170℃预处理30min，得到反应底物。
2.称取步骤1的反应底物0.5g，加入商品纤维素酶10FPU/g反应底物，分别加入实施例3步骤1制得的4种不同青霉菌(即菌株2、菌株6、菌株16、菌株22)所产纤维素酶和 LPMO酶组合制剂25mg，得到酶解反应体系；50℃水解72h。HPLC检测还原糖含量。
以不加本发明的纤维素酶和LPMO酶组合制剂作为对照比较，研究由青霉(Penicillium sp.)XZH-22菌株固态发酵制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解的效果。
结果如图1所示，复筛4种菌株的纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解过程，筛选所得青霉(Penicillium sp.)XZH-22菌株固态发酵制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解中，与不加纤维素酶和LPMO酶组合制剂相比，酶解率提高22.8％。并且，与青霉(Penicillium sp.)XZH-6(即菌株6)、草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum) XZH-2(即菌株2)、桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16菌株(即菌株16)固态发酵制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂的酶解率比较，本发明青霉(Penicillium sp.)XZH-22(即菌株22)固态发酵制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂的酶解率最佳，分别提高了26.85％、 10.13％、10.06％。本发明青霉(Penicillium sp.)XZH-22(即菌株22)固态发酵制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂使得高度结晶的杨木底物结构趋于松散，从而使纤维素酶更易与底物结合，最终协同提高纤维素的水解效率，尤其适合于林木纤维素降解的应用。该纤维素酶和LPMO酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，从而有效地降低酶解过程的加酶量。对于促进纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的发展前景。
上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (10)
1.一株青霉(Penicillium sp.)XZH-22，其保藏编号为：CGMCC No.23297。
2.权利要求1所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22在生产纤维素酶和/或裂解性多糖单加氧酶中的应用。
3.权利要求1所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22在纤维素水解中的应用。
4.权利要求1所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22在木质纤维素原料酶解糖化中的应用。
5.权利要求1所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22在生产具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂中的应用。
6.一种具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备青霉(Penicillium sp.)XZH-22的固态发酵物，然后用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的青霉(Penicillium sp.)XZH-22的固态发酵物是通过以下方法制备的：将活化的青霉(Penicillium sp.)XZH-22接种到种子培养基中，30℃，150rpm，培养3d，获得种子培养液；将种子培养液接种到固态发酵培养基中，30℃，发酵5d，获得固态发酵物；所述的种子培养基每升是通过以下方法制备的：称取200g去皮土豆，加水煮沸，经纱布过滤得土豆浸汁，然后加入葡萄糖20g，溶解后加水定容至1L；所述的固态发酵培养基包括稻秆和营养盐溶液，所述的营养盐溶液的添加量为每5g稻秆加入10.5mL营养盐溶液；所述的营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO410.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为水。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂具体为：用pH4.8 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm震荡1h，收取液体即为发酵酶液，8000rpm，4℃离心5min，取上清即为具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂。
9.权利要求6-8任一项所述的制备方法制备得到的具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂。
10.权利要求9所述的具有协同降解纤维素作用的酶组合制剂在林木纤维素水解中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111581870.9A CN114276935A (zh) | 2021-12-22 | 2021-12-22 | 一株青霉菌xzh-22及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111581870.9A CN114276935A (zh) | 2021-12-22 | 2021-12-22 | 一株青霉菌xzh-22及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114276935A true CN114276935A (zh) | 2022-04-05 |
Family
ID=80873827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111581870.9A Pending CN114276935A (zh) | 2021-12-22 | 2021-12-22 | 一株青霉菌xzh-22及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114276935A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113046248A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-06-29 | 中国科学院广州能源研究所 | 一株桔青霉菌xzh-16及其应用 |
| CN113512501A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-10-19 | 中国科学院广州能源研究所 | 一株草酸青霉菌xzh-2及其应用 |
-
2021
- 2021-12-22 CN CN202111581870.9A patent/CN114276935A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113046248A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-06-29 | 中国科学院广州能源研究所 | 一株桔青霉菌xzh-16及其应用 |
| CN113512501A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-10-19 | 中国科学院广州能源研究所 | 一株草酸青霉菌xzh-2及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| XU ZI-HAN ET AL.: "Optimization of solid state fermentation of mixed-culture of Penicillium consortium for cellulase and lytic polysaccharide monooxygenases production", JOURNAL OF BIOBASED MATERIALS AND BIOENERGY, vol. 15, no. 2, pages 181 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Elisashvili et al. | Lignocellulose-degrading enzyme production by white-rot Basidiomycetes isolated from the forests of Georgia | |
| CN101503659B (zh) | 一种哈茨木霉菌株及其应用 | |
| CN113046248B (zh) | 一株桔青霉菌xzh-16及其应用 | |
| CN111961596B (zh) | 一株高效降解木质素的白囊耙齿菌 | |
| Syed et al. | A novel cellulase from an endophyte, Penicillium sp. NFCCI 2862 | |
| CN113512501B (zh) | 一株草酸青霉菌xzh-2及其应用 | |
| Helal et al. | Studies on cellulases of some cellulose-degrading soil fungi | |
| CN101855973A (zh) | 一种漆酶产生真菌菌株白耙齿菌及其培养方法和应用 | |
| Ilić et al. | Valorization of lignocellulosic wastes for extracellular enzyme production by novel Basidiomycetes: screening, hydrolysis, and bioethanol production | |
| Teixeira et al. | Minimal enzymes cocktail development by filamentous fungi consortia in solid-state cultivation and valorization of pineapple crown waste by enzymatic saccharification | |
| Sutaoney et al. | Bioprospecting cellulolytic fungi associated with textile waste and invitro optimization of cellulase production by Aspergillus flavus NFCCI-4154 | |
| Manan et al. | Multi-enzymes production studies in single tray solid state fermentation with opened and closed system | |
| Acheampong et al. | Conversion of cassava peels into bioethanol using the OSTEP approach | |
| CN113122460B (zh) | 一种水稻秸秆降解菌及其筛选方法和应用 | |
| CN114276935A (zh) | 一株青霉菌xzh-22及其应用 | |
| Kaur et al. | Screening of Alternaria pathogens associated with Parthenium hysterophorus for the production of lignocellulolytic enzymes | |
| CN114045223A (zh) | 来源于黄花梨的拟盘多毛孢属菌株p6、繁育方法和用途 | |
| CN102787076B (zh) | 一株耐冷玫红假裸囊菌及其在制备冷水纤维素酶中的应用 | |
| AKINRULI et al. | Isolation of microorganisms from cassava peels for the production of bioethanol | |
| Okagbue et al. | Isolation of Aureobasidium pullulans from Zimbabwean sources and glucosidase activities of selected isolates | |
| Rasmey | Kinetic Properties of α-amylase Produced by Bacillus megaterium RAS103 under Optimum Conditions in Submerged Fermentation | |
| CN113980823B (zh) | 发菌科下一株新属菌株及其应用 | |
| CN113151004B (zh) | 一株阿泽拉霉新种及其应用 | |
| CN115404172B (zh) | 塔宾曲霉菌株Yw-4及其应用 | |
| CN112980698B (zh) | 微生物发酵碳源及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20220405 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |