CN113046248B - 一株桔青霉菌xzh-16及其应用 - Google Patents

一株桔青霉菌xzh-16及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株桔青霉菌XZH‑16及其应用。本发明提供的桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)XZH‑16菌株可分泌较高的裂解性多糖单加氧酶和纤维素酶，其中LPMO酶活力最高可达到15.22U/g底物。该桔青霉菌XZH‑16所产的纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于林木纤维素酶解，酶解效率提高14.55％。该纤维素酶和LPMO酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，从而有效地降低酶解过程的加酶量。可进一步降低纤维素乙醇的生产成本，加快其产业化进程。

Description

一株桔青霉菌XZH-16及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16及其应用。
背景技术
能源供给不平衡和生态环境破坏日益加剧，已成为社会和经济发展的潜在障碍。开发和利用清洁的可再生能源已成为全球关注的焦点。生物质是一种极具开发潜力的绿色可再生资源且具有碳中和特性，以其为原料制备醇类燃料是未来发展的重要方向。但是，如何高效、环保且低成本地将木质纤维素类生物质糖化，是制备纤维素醇类燃料的关键所在。
纤维素酶并不是单一组分的酶，而是多组分酶系的集合。主要包括：内切葡聚糖酶(EG，EC 3.2.1.4)，外切葡聚糖酶(CBH，EC 3.2.1.91)和β-葡萄糖苷酶(BGL，EC 3.2.1.21)。纤维素的有效降解至少需要这3种酶的协同作用。可是，目前纤维素酶对预处理后的纤维底物的酶解效率仍需进一步提高。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一株产纤维素酶和裂解性多糖单加氧酶的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16，该菌于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.21426。
本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16是从生态环境中的腐烂枯枝分离筛选出来。其真菌分类学表明：菌株XZH-16在PDA培养基上30℃培养3d，为白色近圆形菌落、呈花瓣形，表面些许绒状，边缘相对齐整，易挑取(如图1所示)；该菌菌丝体电镜扫描图如图2所示，菌丝体呈致密的长条型并互相缠绕。根据菌落形态结构特征，参照《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》进行比对分析，可初步确定菌株XZH-16为桔青霉属。
本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16的分类学地位根据下述方法确定：
常规方法提取菌株XZH-16的总DNA，扩增菌株的ITS区域rDNA序列，其序列如SEQID NO.3所示，将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的ITS序列，构建***发育树，如图3所示。经比较分析，本发明的菌株XZH-16属于青霉菌属，将其命名为桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16，该菌于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.21426。
本发明的第二个目的是提供所述的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16在生产纤维素酶和/或裂解性多糖单加氧酶(LPMO)中的应用。
根据LPMOs特异性底物的测定反应，发现本发明的桔青霉菌XZH-16能产较高的LPMO，由桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16固态发酵制得的酶组合制剂的最高LPMO酶活达15.22U/g底物(LPMO酶活力单位定义：在反应体系中每毫升酶液、每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位)，与目前已经报道的产LPMO的橙色嗜热子囊菌相比，LPMO酶活较高。因此，本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16所产的酶组合制剂具有较高的LPMO酶活力，是一种新型高产的酶组合制剂。
本发明的第三个目的是提供所述的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16在纤维素水解中的应用。
本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16制备的酶组合制剂可以应用在纤维素水解上，尤其是林木纤维素的水解。将杨木粉碎，加入商品纤维素酶，然后加入桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16所产的酶组合制剂进行酶解，使得高度结晶的杨木底物结构趋于松散，从而使纤维素酶更易与底物结合，最终协同提高纤维素的水解效率。
本发明的第四个目的是提供所述的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16在木质纤维素原料酶解糖化中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16在生产具有协同降解纤维素的酶组合制剂中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种具有协同降解纤维素的酶组合制剂的制备方法，包括以下步骤：制备桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16的固态发酵物，然后用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素的酶组合制剂。
所述的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16的固态发酵物是通过以下方法制备的：将活化的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16接种到种子培养基中，30℃，150rpm，培养3d，获得种子培养液；将种子培养液接种到固态发酵培养基中，30℃，发酵5d，获得固态发酵物；所述的种子培养基每升是通过以下方法制备的：称取200g去皮土豆，加水煮沸，过滤得土豆浸汁，然后加入葡萄糖20g，溶解后加水定容至1L；所述的固态发酵培养基包括稻杆和营养盐溶液，所述的营养盐溶液的添加量为每5g稻杆加入10.5mL营养盐溶液；所述的营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 10.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为水。
优选，所述的用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素的酶组合制剂具体为：用pH4.8 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm震荡1h，收取液体即为发酵酶液，8000rpm，4℃离心5min，取上清即为具有协同降解纤维素的酶组合制剂。
本发明的第七个目的是提供所述的制备方法制备得到的具有协同降解纤维素的酶组合制剂。
本发明的第八个目的是提供所述的具有协同降解纤维素的酶组合制剂在纤维素水解中的应用。本发明筛选的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16，该菌产生的酶组合制剂的LPMO酶活高达15.22U/g底物，该酶组合制剂的滤纸酶活为0.75IU/g底物，是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，有效地降低酶解过程的加酶量。
本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.21426。
附图说明
图1是本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16的PDA培养基上菌落的形态图。
图2是本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16的电镜扫描图，其中A的放大比例尺为10μm，B的放大比例尺为5μm。
图3是本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16的18S rDNA***发育树。
图4是本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16产的酶组合制剂的纤维素酶和LPMOs酶活，其中T2为对照菌株橙色嗜热子囊菌T2(Thermoascus aurantiacus)。
图5是添加本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16产的酶组合制剂对木质纤维素的酶解效果，其中T2为橙色嗜热子囊菌T2(Thermoascus aurantiacus)。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：菌株的筛选
从高度腐烂的枯枝进行采集。把采集的枯枝样品置于锥形瓶中，放入几粒玻璃珠，添加适量生理盐水，然后放于150rpm，1h摇床上振摇混匀；移取2mL混匀液于100mL富集培养液中，然后置于30℃，150rpm的摇床上振荡培养3d，获得富集培养物，富集培养液的配方是：NaCl 1.0g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，羧甲基纤维素(CMC)10.0g，蛋白胨2.5g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000mL。将富集培养物直接涂布置于刚果红初筛培养基，30℃观察培养2～5d，刚果红初筛培养基的配方是：每升培养基中含有KH2PO4 0.5g，(NH4)2SO4 2.0g，MgSO4·7H2O 0.25g，CMC 2.0g，刚果红0.2g，琼脂20g，余量为水，自然pH值。挑取水解透明圈较大的单菌落在PDA培养基上划线纯化，纯化的菌株进行PDA斜面保存。
菌株产纤维素酶和LPMOs活力复筛：将PDA斜面保存的纯化菌株分别接种到等量的复筛固态发酵培养基中，30℃，120rpm，培养5d，菌株经固态培养发酵后离心取上清液，即为粗酶液。上述的复筛固态发酵培养基由5g稻杆和10.5mL营养盐溶液组成，营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 10.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O0.5g，余量为水。分别用标准滤纸酶活(FPA)法和Amplex Red-辣根过氧化氢酶法测定菌株产粗酶液的FPA和LPMOs酶活。FPA法测定具体方法为：15mL具塞试管中分别加入0.25mL粗酶液，1.75mL pH4.8 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，1×6cm新华中速定量滤纸条(约50mg)，充分混匀后放入50℃水浴反应60min；然后加入2mL DNS试剂，在沸水浴中煮沸10min；冷却后用蒸馏水定容至15mL；定容后550nm下测定OD值。空白中的粗酶液用煮沸灭活的粗酶液代替。测得OD值后，查标准曲线，求出溶液中葡萄糖的含量。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每l mL粗酶液每分钟水解产生1μmol底物(葡萄糖180)所需的酶量为一个酶活单位IU。Amplex Red-辣根过氧化氢酶法的具体方法为：参照
Figure BDA0003026961360000061
Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit说明书，配制100μM Red reagent 50μL，加入粗酶液20μL，1×Reaction buffer 30μL，共100μL反应体系，使用酶标仪(EON，BioTek)在波长530nm获得吸光度数据，孵育30min后，再使用酶标仪在波长560nm下获得吸光度数据。以没有LPMO的对照样品中作为测量背景信号并从测定中扣除。30℃避光反应1h后，560nm测吸光度。以做H2O2为底物做标准曲线，求出反应释放的过氧化氢含量(LPMO酶活力单位定义：在反应体系中每毫升酶液，每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位U)。最后选择滤纸酶活和LPMOs较高的菌株使用PDA斜面保存。
经筛选获得1株LPMO活力较高的菌株XZH-16。采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒B518259提取该菌株总DNA，选择扩增真菌18S rDNA序列的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，如SEQ ID NO.1所示)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，如SEQ ID NO.2所示)对菌株XZH-16总DNA进行ITS区域rDNA序列的扩增。在50μL的PCR反应体系中含有10×Taq Buffer(with MgCl2)5μL，dNTP(mix)(10mmol/L each)2μL，10μM引物ITS1 2μL，10μM引物ITS4 2μL，Tag酶(5U/μL)0.5μL，20ng/μL的模板DNA 1μL，其余体积以无菌超纯水补足。梯度变性PCR扩增条件为：95℃预变性4min，94℃变性30sec，55～60℃退火30sec，72℃延伸50sec，35个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司测序，经测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的ITS区域rDNA序列，构建***发育树，如图3所示。经比较分析，菌株XZH-16属于青霉属，将其命名为桔青霉菌(Penicilliumcitrinum)XZH-16，该菌于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.21426。
实施例2：酶组合制剂的制备及其酶活力测定
1.酶组合制剂的制备：挑取PDA斜面保存的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16菌块接种到50mL PDA液体培养基中，30℃，150rpm培养3d活化，将活化的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16以50μL的接种量接种到50mL种子培养基中，30℃，150rpm，培养3d，获得种子培养液。种子培养基为每升培养基含土豆200.0g浸汁，葡萄糖20.0g，余量为水；称取200.0g去皮土豆，加入适量水煮沸30分钟，纱布过滤，滤液即土豆浸汁，然后加入葡萄糖20.0g，溶解后加水定容至1L，115℃灭菌30min。将种子培养液以2mL的接种量接种到固态发酵培养基中，30℃，发酵5d，获得固态发酵物。上述的固态发酵培养基由5g稻杆和10.5mL营养盐溶液组成，营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 10.0g，KH2PO4 4.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为水。然后用50mL pH4.8 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，30℃，150rpm震荡1h，收取液体即为发酵酶液，8000rpm，4℃冷冻离心5min，取上清即为酶组合制剂(即纤维素酶和LPMO酶组合制剂)，4℃保存备用。
2.滤纸酶活(FPA)测定：15mL具塞试管中分别加入0.25mL纤维素酶和LPMO酶组合制剂，1.75mL pH4.8 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，1×6cm新华中速定量滤纸条(约50mg)，充分混匀后放入50℃水浴反应60min；然后加入2mL DNS试剂，在沸水浴中煮沸10min；冷却后用蒸馏水定容至15mL；定容后550nm下测定OD值。空白中的纤维素酶和LPMO酶组合制剂用煮沸灭活的纤维素酶和LPMO酶组合制剂代替。测得OD值后，查标准曲线，求出溶液中葡萄糖的含量。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每l mL纤维素酶和LPMO酶组合制剂每分钟水解产生1μmol底物(葡萄糖180)所需的酶量为一个酶活单位IU。经测定，经步骤1得到的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16产的纤维素酶和LPMO酶组合制剂的滤纸酶活达到0.75IU/g底物。
3.LPMO酶活力测定：参照
Figure BDA0003026961360000081
Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase AssayKit说明书，配制100μM Red reagent 50μL，加入纤维素酶和LPMO酶组合制剂20μL，1×Reaction buffer30μL，共100μL反应体系，使用酶标仪(EON，BioTek)在波长530nm获得吸光度数据，孵育30min后，再使用酶标仪在波长560nm下获得吸光度数据。以没有LPMO的对照样品中作为测量背景信号并从测定中扣除。30℃避光反应1h后，560nm测吸光度。以做H2O2为底物做标准曲线，求出反应释放的过氧化氢含量(LPMO酶活力单位定义：在反应体系中每毫升酶液，每分钟催化1μmol过氧化氢降解，定义为一个酶活力单位U)。经测定，经步骤1得到的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16产的纤维素酶和LPMO酶组合制剂的LPMO酶活达到15.22U/g底物，具有较高的酶活力。
结果表明，本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16能高产LPMO，由桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16固态发酵制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂的LPMO最高酶活达15.22U/g底物，该纤维素酶和LPMO酶组合制剂的滤纸酶活为0.75IU/g底物(见图4)。目前已经报道的产LPMO的橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)，经步骤1同样的固态发酵方式制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂的LPMO酶活为12.5U/g底物，滤纸酶活仅为0.66U/g底物(见图4)。因此，本发明的桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂与现有报道中的橙色嗜热子囊菌(Thermoascusaurantiacus)制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂相比具有较高的酶活力，桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16是一种新型高产的产纤维素酶和LPMO菌株。
实施例3：纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解
1.反应底物：杨木粉碎至60目，105℃烘干至恒重，称取2.5g杨木粉与2.5g固体酸(具体制备方法参照专利ZL 201110126178.7的实施例3)混合，170℃预处理30min得到反应底物。
2.称取步骤1的反应底物0.5g，加入商品纤维素酶10FPU/g反应底物，再加入实施例2步骤1制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂25mg，得到酶解反应体系；50℃水解72h。HPLC检测还原糖含量。
以不加本发明的纤维素酶和LPMO酶组合制剂作为对照，同时以实施例2步骤1同样的固态发酵方式发酵橙色嗜热子囊菌T2(Thermoascus aurantiacus)所产的纤维素酶和LPMO酶组合制剂与商品纤维素酶按照步骤2的酶解反应体系和反应条件共同作用比较，研究桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16菌株所产纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解的效果。
结果如图5所示，筛选所得桔青霉菌(Penicillium citrinum)XZH-16菌株固态发酵制得的纤维素酶和LPMO酶组合制剂应用于杨木纤维素酶解中，与不加纤维素酶和LPMO酶组合制剂相比，酶解率提高14.55％。该纤维素酶和LPMO酶组合制剂使得高度结晶的杨木底物结构趋于松散，从而使纤维素酶更易与底物结合，最终协同提高纤维素的水解效率，尤其适合于林木纤维素降解的应用。该纤维素酶和LPMO酶组合制剂是具有协同降解纤维素作用的氧化水解酶，它能够通过氧化作用来断裂纤维素的糖苷键，并促进纤维素酶与纤维底物结合以提高酶解效率，从而有效地降低酶解过程的加酶量。对于促进纤维素乙醇的产业化进程具有广阔的发展前景。
上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110> 中国科学院广州能源研究所
<120> 一株桔青霉菌XZH-16及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 543
<212> DNA
<213> 桔青霉菌XZH-16(Penicillium citrinum XZH-16)
<400> 3
tattgatatg cttaagttca gcgggtatcc ctacctgatc cgaggtcaac ctgagataat 60
taaaggttgg gggtcggctg gcgccggccg ggcctactag agcgggtgac gaagccccat 120
acgctcgagg accggacgcg gtgccgccgc tgcctttcgg gcccgtcccc ccggcggggg 180
ggacggggcc caacacacaa gccgggcttg agggcagcaa tgacgctcgg acaggcatgc 240
cctccggaat accagagggc gcaatgtgcg ttcaaagact cgatgattca ctgaattctg 300
caattcacat tagttatcgc atttcgctgc gttcttcatc gatgccggaa ccaagagatc 360
cgttgttgaa agttttaact aatttcgtta taggtctcag actgcaactt cagacagcgt 420
tcaggggggc cgtcggcggg cgcggggccc gccgaggcaa cataggttcg ggcaacacgg 480
gtgggaggtt gggccccgag gggcccgcac tcggtaatga tccttccgca ggttcaccta 540
cgg 543

Claims (8)

1.一株桔青霉菌（Penicillium citrinum）XZH-16，其保藏号为：CGMCC No. 21426。
2.权利要求1所述的桔青霉菌（Penicillium citrinum）XZH-16在生产纤维素酶和/或裂解性多糖单加氧酶中的应用。
3. 权利要求1所述的桔青霉菌（Penicillium citrinum）XZH-16在纤维素水解中的应用。
4. 权利要求1所述的桔青霉菌（Penicillium citrinum）XZH-16在木质纤维素原料酶解糖化中的应用。
5. 权利要求1所述的桔青霉菌（Penicillium citrinum）XZH-16在生产具有协同降解纤维素的酶组合制剂中的应用。
6. 一种协同降解纤维素的酶组合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备如权利要求1所述的桔青霉菌（Penicillium citrinum）XZH-16的固态发酵物，然后用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素的酶组合制剂。
7. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的桔青霉菌（Penicillium citrinum）XZH-16的固态发酵物是通过以下方法制备的：将活化的桔青霉菌（Penicillium citrinum）XZH-16接种到种子培养基中，30 ℃，150 rpm，培养3 d，获得种子培养液；将种子培养液接种到固态发酵培养基中，30 ℃，发酵5 d，获得固态发酵物；所述的种子培养基每升是通过以下方法制备的：称取200 g去皮土豆，加水煮沸，过滤得土豆浸汁，然后加入葡萄糖20 g，溶解后加水定容至1 L；所述的固态发酵培养基包括稻杆和营养盐溶液，所述的营养盐溶液的添加量为每5 g稻杆加入10.5 mL营养盐溶液；所述的营养盐溶液成分为：每升营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 10.0 g，KH2PO4 4.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.5g，余量为水。
8. 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，收集液体即为发酵酶液，离心后取上清即为具有协同降解纤维素的酶组合制剂具体为：用pH为4.8的 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液浸泡固态发酵物，30 ℃，150 rpm震荡1 h，收取液体即为发酵酶液，8000 rpm，4 ℃离心5 min，取上清即为具有协同降解纤维素的酶组合制剂。
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