CN114276370B

CN114276370B - 吲哚生物碱类化合物及其制备方法和其药物组合物与应用

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Publication number: CN114276370B
Application number: CN202210007290.7A
Authority: CN
Inventors: 张于; 罗荣灿; 郝小江; 姚永刚
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Kunming Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS; Kunming Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2022-01-04
Filing date: 2022-01-04
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-01-04
Also published as: CN114276370A

Abstract

本发明提供了一种吲哚生物碱及其制备方法和其药物组合物与应用，属于药物技术领域。本发明提供的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐对于CDK激酶（CDK4/6、CDK5）具有较显著的抑制活性，是一类有发展潜力的可用于治疗多种细胞周期蛋白依赖激酶相关的疾病（肿瘤、神经退行性疾病）的候选药物。本发明化合物及其药物组合物能用于制备治疗多种细胞周期蛋白依赖激酶相关的疾病的药物，制备治疗乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、肠癌、胰腺癌的药物，制备治疗神经退行性疾病的药物，制备治疗AD、PD、亨廷顿症、肌萎缩侧索硬化症的药物，和制备CDK激酶抑制剂。

Description

吲哚生物碱类化合物及其制备方法和其药物组合物与应用

技术领域：

本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种吲哚生物碱或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用，吲哚生物碱药物组合物及其应用。

背景技术：

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸(serine)/苏氨酸(threonine)激酶，作为细胞内重要的信号转导分子参与细胞的生长、增殖、以及凋亡。CDKs的失调可引发多种疾病(肿瘤、神经退行性疾病等)的发生，因此，CDKs已成为药物研发中有效且重要的靶点。其中CDK4/6是大多数恶性肿瘤发生、发展的关键蛋白激酶，其抑制剂可通过抑制细胞周期从G1期向S期转变来达到抑制肿瘤细胞持续增殖的目的。此外，CDKs家族中的另一成员CDK5在神经元的生理功能及神经退行性疾病病理过程中起关键作用，Cdk5已成为治疗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的潜在靶点。因此，寻找Cdk5抑制剂已成为治疗AD、PD等神经退行性疾病的可能有效药物。

目前以CDK激酶为靶点的药物已进入不同阶段的临床研究，如CDK4/6抑制剂Palbociclib、Abemaciclib、Ribociclib已被美国食品药品监督管理局(Food and DrugAdministration，FDA)批准上市，作为一线药物用于治疗ER阳性、HER2阴性乳腺癌。上述研究表明研究和开发具有高活性和选择性的CDK激酶抑制剂具有较大的临床价值。

目前，现有技术中未见有式(I)所示的吲哚生物碱的报道，也没有其相关活性的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供式(I)和式(II)所示的吲哚生物碱类化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和应用，含活性吲哚生物碱的药物组合物及其应用，本发明提供的吲哚生物碱及其药学上可接受的盐以及吲哚生物碱药物组合物具有优异的抑制CDK-4,5,6的活性(IC₅₀＝0.1-2.0μM)。

为了实现上述发明目的，本发明提供了如下的技术方案：

本发明提供了一种吲哚生物碱，具有式I所示的结构：

式I中，R₁包括氢、羟基、卤素或C_1-10烷氧基，优选包括氢、羟基、氟、氯、溴、碘、甲基氧基羰基、乙基氧基羰基或丙基氧基羰基，更优选为氢。R₂或R₃包括C_1-10醛基或C_1-10酰基或C_1-10烷氧基酯基，更优选为甲酸甲酯。

在本发明中，优选具有式II所示的吲哚生物碱1，2和3：

在本发明中，所述药学上可接受的盐包括有机酸盐或无机酸盐，即所述吲哚生物碱的药学上可接受的盐包括吲哚生物碱的有机酸盐或吲哚生物碱的无机酸盐；所述吲哚生物碱的有机酸盐优选包括吲哚生物碱的酒石酸盐、吲哚生物碱的柠檬酸盐、吲哚生物碱的甲酸盐、吲哚生物碱的乙酸盐或吲哚生物碱的乙二酸盐；所述吲哚生物碱的无机酸盐优选包括吲哚生物碱的盐酸盐、吲哚生物碱的氢溴酸盐、吲哚生物碱的硝酸盐或吲哚生物碱的硫酸盐。

本发明提供了上述技术方案所述吲哚生物碱的制备方法，包括以下步骤：

将蕊木种子和提取剂混合，进行提取和浓缩，得到浸膏；

将所述浸膏依次进行调节pH值至酸性、第一萃取、调节pH值至碱性、第二萃取、硅胶柱层析、反相色谱分离和Sephadex LH-20分离，得到吲哚生物碱；

所述硅胶柱层析采用梯度洗脱方式，采用的洗脱液为石油醚和丙酮的混合溶液，所述石油醚和丙酮的体积比为10:1～1:1；

所述反相色谱分离采用的洗脱液为甲醇和水，所述甲醇和水的体积比为30:70～70:30；

所述Sephadex LH-20分离采用的溶剂为甲醇。

本发明将蕊木种子和提取剂混合，进行提取和浓缩，得到浸膏。

本发明优选是对蕊木种子进行提取。在本发明中，进行所述提取前优选还包括将所述蕊木的种子进行干燥。本发明对于所述干燥的温度和时间没有特殊限定，采用本领域熟知的干燥温度和时间即可。

在本发明中，所述提取采用的溶剂优选包括醇类溶剂、酮类溶剂、酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂；所述醇类溶剂优选包括C1～6醇，更优选包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、环戊醇、正己醇或环己醇；所述酮类溶剂优选包括C3～6酮，更优选包括丙酮、甲乙酮或甲基异丁酮；所述酯类溶剂优选包括C3～6酯，更优选包括甲酸乙酯、乙酸乙酯或丙酸乙酯；所述醚类溶剂优选包括C2～6醚，更优选包括甲醚或***；所述卤代烷类溶剂优选包括C1～6卤代烷，更优选包括二氯甲烷、氯仿或四氯乙烷。本发明优选采用甲醇或乙醇进行提取。在本发明中，所述蕊木种子和提取剂的用量优选为1g：(20～30)mL，更优选为1g：(20～25)mL。

在本发明中，所述提取的温度优选为60～70℃，更优选为65～70℃；所述提取的时间优选为3～4h，更优选为3h；所述提取的次数优选为3～4次，更优选为3次。

本发明对于所述浓缩没有特殊限定，采用本领域熟知的浓缩方式即可，具体如减压蒸馏。

得到浸膏后，本发明将所述浸膏依次进行调节pH值至酸性、第一萃取、调节pH值至碱性、第二萃取和提纯，得到吲哚生物碱。

在本发明中，所述调节pH值至酸性优选是将体系的pH值调节为2～3，更优选为2.5～3。本发明对于所述调节pH值至酸性采用的酸没有特殊限定，采用本领域熟知的酸即可，具体如盐酸、硫酸或硝酸，更优选为盐酸；所述盐酸的浓度优选为5～10wt％，更优选为5wt％。

在本发明中，所述第一萃取和第二萃取所用的有机溶剂独立的优选包括酯类溶剂、醚类溶剂或卤代烷类溶剂；所述酯类溶剂优选包括C3～6酯，更优选包括甲酸乙酯、乙酸乙酯或丙酸乙酯；所述醚类溶剂优选包括C2～6醚，更优选包括甲醚或***；所述卤代烷类溶剂优选包括C1～6卤代烷，更优选包括二氯甲烷、氯仿或四氯乙烷。本发明优选采用石油醚、乙酸乙酯进行第一萃取。在本发明中，所述第一萃取的方式优选为采用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3～4次。在本发明中，所述第二萃取所用的溶剂更优选为氯仿。在本发明中，所述浸膏和第一萃取采用的有机溶剂的用量比优选为1g：(20～30)mL，更优选为1g：(20～25)mL。在本发明中，所述浸膏和第二萃取采用的有机溶剂的用量比优选为1g：(20～30)mL，更优选为1g：(20～25)mL。

在本发明中，所述调节pH值至碱性优选是将体系的pH值调节为9～10，更优选为9.5～10。本发明对于所述调节pH值至碱性采用的碱没有特殊限定，采用本领域熟知的碱溶液即可，具体如碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液，更优选为碳酸钠溶液。

在本发明中，所述反相色谱分离采用色谱柱优选为C-18柱。

本发明对于所述硅胶柱层析、反相色谱C-18分离和Sephadex LH-20分离的操作没有特殊限定，采用本领域熟知的硅胶柱层析、反相色谱C-18分离和Sephadex LH-20分离的操作方式即可。

在本发明中，所述吲哚生物碱的药学上可接受的盐的制备方法，优选包括以下步骤：将吲哚生物碱和酸反应，得到吲哚生物碱的药学上可接受的盐；所述酸为有机酸或无机酸。在本发明中，所述有机酸优选包括酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸或乙二酸；所述无机酸优选包括盐酸、氢溴酸、硝酸或硫酸。

吲哚生物碱1，2和3的制备方法，该方法包括以下步骤：蕊木干燥种子，用甲醇加热回流提取三次，每次3小时，合并提取液，减压回收甲醇，将浓缩后的浸膏用10％的盐酸水溶液捏溶并调节pH值2～3，用石油醚萃取三次，然后用10％NaOH溶液调节pH值9～10，用CH₂Cl₂萃取得到总碱部分，总碱部分利用硅胶柱层析，石油醚-丙酮梯度洗脱得到五部分Fr.A-E，Fr C利用硅胶柱层析，石油醚/丙酮(10:1→5:1，v/v)，反相色谱C-18(乙腈/水，30：70→80：20)和Sephadex LH-20(甲醇)分离得到式II所示结构的吲哚生物碱1，2和3。

本发明同时提供了一种吲哚生物碱药物组合物，包括上述技术方案所述的吲哚生物碱和/或其药学上可接受的盐。

此外，本发明还提供了所述吲哚生物碱或其药学上可接受的盐或吲哚生物碱药物组合物在制备治疗多种细胞周期蛋白依赖激酶相关的疾病的药物中的应用，

以及，在制备治疗乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、肠癌、胰腺癌的药物中的应用。

以及，在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

以及，在制备治疗AD、PD、亨廷顿症、肌萎缩侧索硬化症的药物中的应用。

和，在制备CDK激酶抑制剂中的应用。

在本发明中，所述吲哚生物碱药物组合物中药用载体和/或赋形剂的质量百分含量优选为0.5～10％，更优选为0.9～1％。

在本发明中，所述吲哚生物碱药物组合物优选包括吲哚生物碱和/或其药学上可接受的盐、药用载体和/或赋形剂。在本发明中，所述吲哚生物碱药物组合物中吲哚生物碱和/或其药学上可接受的盐的质量百分含量优选为0.1～99％，更优选为0.5～90％；所述吲哚生物碱药物组合物中药用载体和/或赋形剂的总质量百分含量优选为1～99.9％，更优选为10～99.5％。

本发明对于所述药用载体或所述赋形剂没有特殊限定，采用本领域熟知的药用载体或赋形剂即可，具体如固体、半固体或液体稀释剂，填料或药物制品辅剂中的一种或多种。在本发明中，所述吲哚生物碱药物组合物的制剂种类优选包括液体制剂、固体制剂、喷剂或雾剂；所述液体制剂优选包括注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂或糖浆剂；所述固体制剂优选包括片剂、胶囊剂、颗粒剂或冲剂。本发明中对于所述吲哚生物碱药物组合物的制备方法没有特殊限定，采用本领域熟知的制备方法即可。

在本发明中，所述吲哚生物碱药物组合物的给药方式优选为注射、口服、舌下给药或粘膜透析；所述注射优选包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射。

在本发明中，所述吲哚生物碱药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所述吲哚生物碱药物组合物优选以单位体重服用量的形式使用。在本发明中，所述单位体重服用量优选为0.5～20mg/kg。

本发明提供的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐对CDK-4,5,6具有显著的抑制活性(IC₅₀＝0.1-2.0μM)，表明本发明所提供的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐是具有发展潜力的治疗多种细胞周期蛋白依赖激酶相关的疾病(肿瘤、神经退行性疾病)候选药物。

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

与现有技术相比，本发明具备如下的优益性：

1.本发明提供了一类新的吲哚生物碱类化合物。

2.本发明提供的吲哚生物碱的制备方法不需要化学合成，以蕊木种子为原料进行提取得到，原料来源广泛、成本较低，避免使用大量的有机原料以及复杂的制备过程，绿色环保，操作简单，得率高。

3.本发明的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐，对CDK-4,5,6具有显著的抑制活性(IC₅₀＝0.1-2.0μM)，是具有发展潜力的治疗多种细胞周期蛋白依赖激酶相关的疾病(肿瘤、神经退行性疾病)候选药物。

4.本发明还提供了所述吲哚生物碱或其药学上可接受的盐或吲哚生物碱药物组合物在制备治疗多种细胞周期蛋白依赖激酶相关的疾病的药物中的应用；以及，在制备治疗乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、肠癌、胰腺癌的药物中的应用；以及，在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用；以及，在制备治疗AD、PD、亨廷顿症、肌萎缩侧索硬化症的药物中的应用，和在制备CDK激酶抑制剂中的应用。

附图说明

图1为本发明的吲哚生物碱类化合物结构式示意图；

图2为本发明优选的吲哚生物碱类化合物结构式示意图。

具体实施方式

下面将结合附图，用本发明中的实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

蕊木(Kopsia arborea)干燥种子1.2kg，用甲醇加热回流提取三次，每次3小时，合并提取液，减压回收甲醇，将浓缩后的浸膏用10％的盐酸水溶液捏溶并调节pH值2～3，用石油醚萃取三次，然后用10％NaOH溶液调节pH值9～10，用CH₂Cl₂萃取得到总碱部分154g，总碱部分利用硅胶柱层析，石油醚-丙酮梯度洗脱得到五部分(Fr.A-E)，Fr C(38g)利用硅胶柱层析，石油醚/丙酮(10:1→5:1，v/v)，反相色谱C-18(乙腈/水，30：70→80：20)和SephadexLH-20(甲醇)分离得到式II所示结构的吲哚生物碱1(6.5mg，收率0.004％，纯度98％，无色晶体)，2(12mg，收率0.008％，纯度98％，淡黄色油状)和3(8.7mg，收率0.006％，纯度98％，淡黄色油状)。

具有式II所示结构的吲哚生物碱的结构表证数据：

化合物(1):coloreless crystals；UV(MeOH)λ_max(logε)299(3.24),249(3.67)nm；ECD(0.0004M,MeOH)λ_max(Δε)212(-8.2)nm；IR(KBr)v_max3434,2926,2855,1731,1660,1475,1199cm^–1；ESIMS 645[M+H]⁺；HRESIMS m/z 645.3807(calcd for C₄₁H₄₈N₄O₃[M+H]⁺,645.3799).

化合物(2):colorless oil；UV(MeOH)λ_max(logε)293(3.25),250(3.76)nm；ECD(0.0005M,MeOH)λ_max(Δε)309(-3.7),264(+1.8),227(-7.5)nm；IR(KBr)v_max 3429,2926,2858,1739,1665,1459,and 1236cm^–1；ESIMS 613[M+H]⁺；HRESIMS m/z 613.3539(calcd for C₄₀H₄₄N₄O₂[M+H]⁺,613.3537).

化合物(3):colorless oil；UV(MeOH)λ_max(logε)296(2.82),227(3.35)nm；ECD(0.0003M,MeOH)λ_max(Δε)239(-3.0),220(+17.1)nm；IR(KBr)v_max3428,2926,2855,1731,1483,1467,and 1347cm^–1；ESIMS 633[M+H]⁺；HRESIMS m/z633.4153(calcd for C₄₁H₅₂N₄O₂[M+H]⁺,633.4163).

表1.化合物1-3的¹H NMR数据

^a Measured in CDCl₃ at 500MHz.

^b Measured in Methanol-d₄ at 500MHz.

^c Overlapped.

表2.化合物1-3的¹³C NMR数据

由表1可知，本发明成功制备得到具有式II所示结构的吲哚生物碱。

实施例2

将实施例1制备的吲哚生物碱和注射用水混合均匀，依次进行精滤、灌封灭菌，得到吲哚生物碱注射液。

实施例3

制备吲哚生物碱的医学上可接受的盐：

将实施例1制备的吲哚生物碱分别和质量浓度为4％的酒石酸、柠檬酸、甲酸、乙酸、乙二酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸反应，分别得到吲哚生物碱的酒石酸盐、柠檬酸盐、吲哚生物碱的甲酸盐、吲哚生物碱的乙酸盐、吲哚生物碱的乙二酸盐、吲哚生物碱的盐酸盐、吲哚生物碱的氢溴酸盐、吲哚生物碱的硝酸盐、吲哚生物碱的硫酸盐。

实施例4

将实施例1制备的吲哚生物碱溶于无菌注射用水中，搅拌至吲哚生物碱溶解，经无菌抽滤漏斗过滤和无菌精滤后分装于安瓿中，然后低温冷冻干燥后无菌熔封，得到吲哚生物碱药物组合物粉针剂。

实施例5

将实施例1制备的吲哚生物碱与赋形剂按照质量比为9:1混合均匀，进行低温冷冻干燥和灭菌，得到吲哚生物碱药物组合物粉剂。

实施例6

将实施例1制备的吲哚生物碱和赋形剂按照质量比分别为1:5、1:5.5、1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、、1:8、1:8.5、1:9、1:9.5、1:10混合均匀，制粒压片，得到吲哚生物碱药物组合物片剂。

实施例7

将实施例1制备的吲哚生物碱采用常规口服液的制备方法，制备得到吲哚生物碱药物组合物口服液。

实施例8

将实施例1制备的吲哚生物碱和赋形剂按照质量比为5:1混合均匀，分别采用常规的胶囊剂、颗粒剂和冲剂的制备方法，制备得到吲哚生物碱药物组合物胶囊、吲哚生物碱药物组合物颗粒剂和吲哚生物碱药物组合物冲剂。

实施例9

将实施例1制备的吲哚生物碱和赋形剂按照质量比为3:1混合均匀，分别采用常规的胶囊剂、颗粒剂和冲剂的制备方法，制备得到吲哚生物碱药物组合物胶囊、吲哚生物碱药物组合物颗粒剂和吲哚生物碱药物组合物冲剂。

实施例10

1、化合物溶液(A)：5mM的化合物母液用DMSO通过1/2log稀释至所需的浓度点，吸取3μl的化合物稀释液和空白对照(DMSO)加入到997μl的反应液里，得到3倍的15μM的化合物溶液A。

2、酶溶液(B)：100ng/μl的激酶母液用激酶稀释液稀释成3倍所需终浓度的酶反应溶液B。

3、ATP和底物混合溶液(C)：10mM的ATP母液和底物母液分别稀释成6倍所需终浓度的溶液，再等体积混合得到3倍浓度的ATP和底物混合液C。将各2μl的溶液A和溶液B加入孔板中混合并于室温孵育15分钟，然后各孔加入2μl的混合溶液C，于室温继续孵育45分钟；孵育一个小时之后，每孔加入6μl恢复至室温的ADP-Glo试剂以终止ADP的产生和消耗完剩余的ATP，于室温孵育40分钟；40分钟后每孔加入12μl的ADP检测试剂，于室温避光平衡30分钟以后，再半小时以内读取荧光信号。根据未加化合物的DMSO空白对照作为酶活性的最大值Max，化合物的抑制率＝[1-(ΔA测定/Max)]×100％，结果如表3所示。

表3.化合物1-3对CDK-4,5,6的抑制活性(IC₅₀ in nM)^a.

^a IC₅₀:50％inhibitory concentration.

^b Positive control.

由表3可知，吲哚生物碱对CDK-4,5,6具有明显的抑制活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.如下结构式所示的吲哚生物碱1，2和3或其药学上可接受的盐，

2.根据权利要求1所述的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐为有机酸盐或无机酸盐，所述有机酸盐为吲哚生物碱的酒石酸盐、柠檬酸盐、甲酸盐、乙酸盐或乙二酸盐；所述吲哚生物碱的无机酸盐为吲哚生物碱的盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐或硫酸盐。

3.权利要求1所述吲哚生物碱1，2和3的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：取蕊木干燥种子，用甲醇加热回流提取三次，每次3小时，合并提取液，减压回收甲醇，将浓缩后的浸膏用10％的盐酸水溶液捏溶并调节pH值2～3，用石油醚萃取三次，然后用10％NaOH溶液调节pH值9～10，用CH₂Cl₂萃取得到总碱部分，总碱部分利用硅胶柱层析，石油醚-丙酮梯度洗脱得到五部分Fr.A-E，Fr C利用硅胶柱层析，以石油醚/丙酮重量比10:1→5:1，反相色谱C-18：乙腈/水30:70→80:20和Sephadex LH-20甲醇分离得到结构式所示的吲哚生物碱1，2和3。

4.一种吲哚生物碱药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的吲哚生物碱和/或其药学上可接受的盐。

5.根据权利要求4所述的吲哚生物碱药物组合物，其特征在于，还包括可药用载体和/或赋形剂。

6.权利要求1-2任一项所述的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐或权利要求4-5任一项所述的吲哚生物碱药物组合物在制备治疗CDK4、CDK5、CDK6相关的疾病的药物中的应用。

7.权利要求1-2任一项所述的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐或权利要求4-5任一项所述的吲哚生物碱药物组合物在制备治疗乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、肠癌、胰腺癌的药物中的应用。

8.权利要求1-2任一项所述的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐或权利要求4-5任一项所述的吲哚生物碱药物组合物在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用。

9.权利要求1-2任一项所述的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐或权利要求4-5任一项所述的吲哚生物碱药物组合物在制备治疗AD、PD、亨廷顿症、肌萎缩侧索硬化症的药物中的应用。

10.权利要求1-2任一项所述的吲哚生物碱或其药学上可接受的盐或权利要求4-5任一项所述的吲哚生物碱药物组合物在制备CDK4、CDK5、CDK6激酶抑制剂中的应用。