CN114246951A - 一种dna纳米载体复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种DNA纳米载体复合物及其制备方法和应用。所述DNA纳米载体复合物包括DNA靶向载体、抗癌药物和治疗基因，其中，所述DNA靶向载体包括具有a个串联的重复单元的长单链DNA、a条适配体链、a条锚定链和a条互补DNA单链，其中，a为20～300的整数，以及，其中，所述长单链DNA的每个重复单元由串联的三个部分序列组成，所述适配体链通过在适配体末端延长的未配对碱基通过互补配对与所述串联的三个部分序列中的一个连接，所述锚定链用于连接治疗基因并利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的另一个连接，所述互补DNA单链利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的最后一个连接。

Description

一种DNA纳米载体复合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种DNA纳米载体复合物及其制备方法和应用。
背景技术
随着社会经济发展和人民生活水平提高，饮食结构的改变等因素使得慢性非传染病已经成为导致死亡的主要原因，其中癌症是目前全世界的主要死亡原因之一。针对癌症治疗，目前常用的方法是化学药物治疗。但由于化疗药物在静脉给药后，会表现出非特异性分布和血液半衰期较短的现象，使其容易暴露在正常器官并由肾脏排出，使得化疗效果具有一定局限性。
所以开发有效的治疗方法是人类在生物医疗面临的重大挑战。具有位点特异性的传递***逐渐成为诊疗癌症的研究热点，采用基因治疗的方法，构建纳米载体并在体内阻止蛋白表达的RNAi技术成为一种新思路。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近年来发展起来的一种基因治疗技术，即将目的基因所对应的小分子双链RNA(dsRNA)导入生物体，使相应的mRNA降解，从而阻断细胞中特定基因的表达。用RNAi能够特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而治疗各种癌症。小干扰RNA(siRNA)是19～21个碱基对的双链核糖核酸，通过RISC复合物导致目标基因的酶降解，是沉默特定蛋白质编码基因的有效RNAi工具。但在应用上却也面临着很多挑战，以癌症为例：静脉注射到体内的裸siRNA体内半衰期短(<15min)，且易被核酸酶降解；由于其本身是负电性的生物大分子(分子量约为13000)，难以渗透到整个实体瘤组织，即使有少量siRNA进入癌细胞，也很难从内涵体中逃逸出来发挥作用。
为克服这些局限性，需要寻求合适的递送载体。利用DNA碱基互补配对的原则，基于滚环扩增技术制备DNA纳米结构开始出现。滚环扩增技术是一种等温酶DNA聚合反应，环状模板在聚合酶和dNTPs的作用下，扩增出很多串联重复序列的长链。利用RCA产物的周期性、大分子量性，将此作为脚手架链，再利用几条订书钉链构建出预设形状，能够在极大程度上简化组装设计和实验过程。
DNA纳米结构虽然具有强大的载药能力，但缺乏选择性，不能实现对癌细胞的主动靶向。而适配体概念的提出为特异性识别癌细胞提供了可能。适配体由指数富集配体***进化技术(SELEX)发展而来，本质是由单链寡核苷酸折叠而形成的三维结构。由于适配体所具有的高特异性、高灵敏度、易于体外合成和修饰、稳定性好等优点，它被广泛用于生物标记物检测、靶标癌细胞等，也已经在基础研究、临床诊断和治疗中显示了广阔的应用前景。但单价适配体存在定向性差、细胞内化效率低等缺点。于是在此基础上借鉴多价协同相互作用又构建了多价适配体，多个适配体同时与靶标癌细胞上的受体结合以实现高结合亲和力和选择性，细胞膜上的多价配体受体又可以促进细胞内吞。
发明内容
本发明的目的是提供一种以滚环扩增产物为支架链的周期性循环的DNA靶向载体，引入多价适配体，采用RNAi技术实现负载药物和靶向基因的递送。既采用多价分子载药体系，又结合可以靶向抑制癌细胞增殖的siRNA双链，从而实现siRNA和Dox的共递送，达到对癌细胞的抑制及杀灭双重效果，为高效精准的癌症治疗提供新方案。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
第一方面，本公开提供了一种DNA纳米载体复合物，包括DNA靶向载体、抗癌药物和治疗基因，
其中，所述DNA靶向载体包括具有a个串联的重复单元的长单链DNA、a条适配体链、a条锚定链和a条互补DNA单链，其中，a为20～300的整数，优选地，a为50～100的整数，以及，其中，所述长单链DNA的每个重复单元由串联的三个部分序列组成，所述适配体链通过在适配体末端延长的未配对碱基通过互补配对与所述串联的三个部分序列中的一个连接，所述锚定链用于连接治疗基因并利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的另一个连接，所述互补DNA单链利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的最后一个连接。
本发明的DNA纳米载体复合物中，优选地，具有a个串联的重复单元的长单链DNA可以是基于滚环扩增的长单链DNA分子。滚环扩增产物具有周期性、大分子量性，将此作为脚手架链，再利用几条订书钉链构建出DNA纳米靶向载体，可以极大简化组装设计和实验过程，在此基础上构建多价适配体DNA纳米靶向载体。本发明中，长单链DNA具有周期性、大分子量性的优势，其长度主要受到滚环扩增(RCA)反应时间和dNTPs浓度影响，长度可以选择约4000bp-19000bp范围之间，更优选长度为约8000bp。在一个实施方式中，长链DNA分子链有约127个串联的63碱基重复序列；长链DNA分子链A分子量约19708g/mol。
本发明的DNA纳米载体复合物中，所述互补DNA单链可以是任意可与长单链DNA互补配对的DNA短链分子，其与所述重复单元形成双螺旋结构，但其序列设计要尽量避免形成发卡结构、G-四联体等特殊的DNA二级结构。
本发明的DNA纳米载体复合物中，优选地，所述适配体链包括能够特异性识别癌细胞的适配体，并通过在适配体末端延长的未配对碱基与DNA长单链上碱基互补配对连接。适配体的实例包括但不限于AS1411适配体、HA09适配体、Sgc8适配体。其中优选AS1411适配体。在一些实施方式中，所述适配体链包括癌细胞适配体，所述癌细胞适配体优选为选自以下各项中的一种或多种：AS1411(核仁蛋白特异核酸适配体)、人源性肝癌细胞(HepG2)的适配体HA09、白血病细胞(CEM)的适配体Sgc8等，其中优选AS1411。更优选地，所述适配体5’端标记荧光基团。
本发明的DNA纳米载体复合物中，优选地，所述锚定链用于连接治疗基因(如siRNA)，其是一段单链寡核苷酸(指60个以下碱基的短链核苷酸的总称)序列(即RNA锚定链)，通过自身的粘性末端与所述治疗基因延伸出的多个特定碱基杂交，从而负载所述治疗基因。所述锚定链可以分为两段杂交区域，一段杂交区域的序列必须与长单链DNA分子互补，另一段杂交区域的序列与治疗基因如siRNA正义链延伸出的碱基互补，前者形成杂交区域的序列可选择任意互补碱基，但后者短单链DNA分子的序列设计要尽量避免形成发卡结构、G-四联体等特殊的DNA二级结构。在一个具体实施方式中，所述锚定链的长度为25-70bp。
本发明的DNA纳米载体复合物中，优选地，所述治疗基因是指包含粘性末端以与锚定链连接的治疗基因，其在进入肿瘤细胞后因其具有针对性使得治疗癌症效率更高。其实例例如抑制致病性RNA活性的小干扰RNA(siRNA)、编码治疗性蛋白的基因或编码疫苗抗原(mRNA)的基因等。在一些实施方式中，所述治疗基因可为抑制癌细胞转移、增殖的基因，优选为选自以下各项中的一种或多种：信号转导子和转录激活子3小干扰RNA(STAT3siRNA)、再生肝磷酸酶-3小干扰RNA(PRL-3 siRNA)、结肠癌转移相关基因1小干扰RNA(MACC1siRNA)等，其中优选STAT3 siRNA。
在一个实施方式中，所述siRNA是指能够抑制癌细胞转移、增殖的治疗基因，互补DNA短链分子中的一个延伸出黏性末端与双链siRNA中的正义链延伸的引物链碱基杂交，其反义链在进入癌细胞后得以释放，在特异识别双链RNA的Dicer酶作用下形成RNA诱导沉默复合物(RISC)，RISC被激活后与mRNA同源互补形成精准定位，靶向性降解mRNA，从而抑制其翻译，有效的沉默靶基因发挥疗效。本发明中使用的siRNA是经改造后延伸出多个特定碱基以与所述锚定链连接。
本发明中，优选地，上述小干扰RNA(siRNA)会被酶解成正义链和反义链，其中正义链被切割成碎片，反义链会与细胞内含有各种核酸酶的RNA诱导的沉默复合物结合，并与其靶向的mRNA特异性结合，诱发mRNA的高效切割和降解，进而抑制蛋白的表达，治疗各种癌症。
本发明中采用小干扰RNA(siRNA)构建具有位点特异性的递送载体然后在体内阻止蛋白表达，从而达到抑制癌细胞增殖的作用。裸siRNA与DNA靶向载体结合后，既能保持siRNA在体内的稳定性，又使其能顺利进入靶细胞发挥治疗作用。
本发明的DNA纳米载体复合物中，优选地，所述互补DNA单链利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的最后一个连接，从而和DNA长单链的互补作用杂交形成双螺旋结构，以增加DNA纳米载体复合物的稳定，并且在后续载药时提高载药量。
在一个实施方式中，所述长单链DNA的重复单元具有如SEQ ID NO:3所示的序列；所述锚定链具有如SEQ ID NO:4所示的序列；所述互补DNA单链具有如SEQ ID NO:6所示的序列；所述适配体链选自以下一种或多种：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12；所述治疗基因选自以下一种或多种：STAT3 siRNA、PRL-3 siRNA、MACC1 siRNA。在一个实施方式中，所述治疗基因为STAT3 siRNA，其正义链如SEQ ID NO:7所示，以及反义链如SEQ ID NO:8所示。
本发明的DNA纳米载体复合物中，优选地，所述抗癌药物可为化疗药物，优选选自以下各项中的一种或多种：盐酸阿霉素(Dox)、佛波酯(PMA)、紫杉醇等，更优选Dox。
本发明的DNA纳米载体复合物中，所述适配体链通过碱基互补配对与滚环扩增产物所得的长单链DNA连接，所述抗癌药物负载在所述DNA靶向载体的DNA链之间，所述治疗基因如siRNA双链中正义链通过延伸的引物链碱基与DNA互补短链杂交。
多价适配体的DNA靶向载体含有的大量适配体可同时与目标癌细胞上的受体结合，实现高结合亲和力与选择性，细胞膜上的多价配体受体又可以促进细胞内吞，相比于单价分子载药体系治疗效率更高。
本公开利用滚环扩增产物的周期性和多价适配体高效精准结合癌细胞的特点，构建具有极大载药量的靶向体系。
本公开的靶向载药体系为DNA纳米结构能够使得药物直接进入细胞内，并通过多价适配体诱导协同结合癌细胞，在进入癌细胞后释放抗癌药物，直接作用于细胞核，达到精确靶向、有效治疗的效果。
本公开通过实验表明，当采用阿霉素(DOX)和DNA靶向载体混合时，二者能够通过形成稳定复合物负载抗癌药物，且在30min内就能释放到同浓度游离Dox的水平。
第二方面，本公开提供了上述DNA纳米载体复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)滚环扩增合成长单链DNA：采用DNA环状模板与引物，在聚合酶和缓冲液作用下，于10～80℃温度中聚合1～30min后升至40～120℃终止，所得溶液冷却至室温制得长单链DNA；
(2)DNA靶向载体的组装：将长单链DNA与互补DNA单链、适配体链、锚定链杂交，并和退火缓冲液混合，在25～170℃热处理后在PCR仪中以1℃/min的速度冷却，10～40℃恒温过夜组装，其中DNA靶向载体与互补DNA单链、适配体链、锚定链加入的浓度比分别为1:10～1:300；
(3)向载体对抗癌药物和治疗基因(如siRNA)的双负载：将上述所得DNA靶向载体与抗癌药物(如Dox)于室温孵育20～50min，再加入治疗基因(如siRNA)双链，20～100℃隔夜退火得到双负载体系，其中：治疗基因(如siRNA)与DNA靶向载体浓度比为1：30～90。
优选地，本发明方法步骤(1)中，所述的聚合酶为用于生物催化合成脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的聚合酶，优选为选自以下各项中的一种或多种：Phi29聚合酶、Pwo聚合酶、Vent DNA聚合酶等，其中优选Phi29聚合酶。
优选地，本发明方法步骤(2)中，所述适配体链包括癌细胞适配体，所述癌细胞适配体优选为选自以下各项中的一种或多种：AS1411(核仁蛋白特异核酸适配体)、人源性肝癌细胞(HepG2)的适配体HA09、白血病细胞(CEM)的适配体Sgc8等，其中优选AS1411。更优选地，所述适配体5’端标记荧光基团。
优选地，本发明方法步骤(3)中，所述治疗基因为抑制癌细胞转移、增殖的siRNA，优选为选自以下各项中的一种或多种：信号转导子和转录激活子3小干扰RNA(STAT3siRNA)、再生肝磷酸酶-3小干扰RNA(PRL-3siRNA)、结肠癌转移相关基因1小干扰RNA(MACC1siRNA)等，其中优选STAT3 siRNA。
优选地，本发明方法步骤(3)中，所述抗癌药物为化疗药物，优选选自以下各项中的一种或多种：盐酸阿霉素(Dox)、佛波酯(PMA)、紫杉醇等，更优选Dox。
小干扰RNA(siRNA)会被酶解成正义链和反义链，其中正义链被切割成碎片，反义链会与细胞内含有各种核酸酶的RNA诱导的沉默复合物结合，并与其靶向的mRNA特异性结合，诱发mRNA的高效切割和降解，进而抑制蛋白的表达，治疗各种癌症。
本公开采用小干扰RNA(siRNA)构建具有位点特异性的递送载体然后在体内阻止蛋白表达，从而达到抑制癌细胞增殖的作用。裸siRNA与DNA靶向载体结合后，既能保持siRNA在体内的稳定性，又使其能顺利进入靶细胞发挥治疗作用。
本发明制备的治疗基因-抗癌药物双负载体系载有所述治疗基因和抗癌药物的核酸骨架上，由于其包括多个串联的重复单元，根据需要和调整，治疗基因(如siRNA)和适配体可以在核酸序列的中间碱基序列选择性进行多修饰，构建载有极大负载量的，治疗基因(如siRNA)和抗癌药物(如化疗药物)的多价适配体体系，起到良好的协同增效作用。
本公开通过实验证明，所述双杀灭体系在进入癌细胞后释放siRNA，能够显著抑制癌细胞的迁移能力，高效杀灭靶标细胞。
第三方面，本公开提供了上述DNA纳米载体复合物在制备用于治疗癌症的药物中应用。
本发明中，所述癌症是指机体中正常组织细胞，在不同的始动因素与促进因素长期作用下，产生的细胞增生与异常分化而形成的病理性新生物。优选选自以下各项中的一种或多种：黑色素瘤、肝癌、乳腺癌等，其中优选小鼠黑色素瘤。
本发明的DNA纳米载体复合物可以施用于哺乳动物，包括但不限于，人，鼠，猪，狗，牛，羊，兔，马，等等。
本公开以基于滚环扩增的DNA靶向载体作为药物载体，利用滚环扩增产物的周期性，与特异性靶向癌细胞的多价适配体结合，负载抗癌药物和治疗基因，构建协同递送siRNA和Dox的双杀灭体系。
实验结果表明，该双重杀灭体系对小鼠黑色素瘤细胞(B16)有高效的抑制和杀灭作用，并且本公开的双重杀灭***具有特异性靶向基因、载药能力强和生物相容性等优点。
在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。
附图说明
图1为实施例1的STAT3-Dox-DNA靶向载体复合物与B16/L929细胞结合时的荧光曲线。
图2为不同DNA靶向载体复合物(实施例1的STAT3-Dox-DNA靶向载体复合物(STAT3-Dox-组装体)、实施例2的MACC1-PMA-DNA靶向载体复合物(MACC1-PMA-组装体)、实施例3的STAT3-紫杉醇-DNA靶向载体复合物(STAT3-紫杉醇-组装体)、实施例4的PRL-3-PMA-DNA靶向载体复合物(PRL-3-PMA-组装体)、实施例5的MACC1-Dox-DNA靶向载体复合物(MACC1-Dox-组装体))和B16孵育后的细胞抑制率数据图。
图3为不同DNA靶向载体复合物(实施例1的STAT3-Dox-DNA靶向载体复合物(siSTAT3-Dox-DNA靶向载体)、实施例6的STAT3-DNA靶向载体复合物(siSTAT3-DNA靶向载体)、实施例7的Dox-DNA靶向载体复合物(Dox-DNA靶向载体))、空白对照组和B16孵育后的细胞迁移率数据图。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面将对本发明实施例中的技术方案进行进一步的说明，但所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明所用DNA、RNA序列(包括STAT3 siRNA等)均购自生工生物技术有限公司。琼脂糖、TAE缓冲溶液、DNA Ladder购于上海碧云天生物技术有限公司。盐酸阿霉素购于上海源叶生物科技有限公司。
表1：实施例1中涉及的DNA/RNA序列
Figure BDA0003432302200000091
Figure BDA0003432302200000101
实施例1
(1)滚环扩增合成长单链DNA
依次将RCA引物(10μM)、环状DNA模板(10μM)、10×Phi29 DNA聚合酶缓冲液、dNTPs(7mM)和Phi29 DNA聚合酶混合，混匀离心后在恒温30℃反应4min后再升温至65℃灭活，所得溶液冷却至室温制得RCA产物。
(2)DNA靶向载体的组装
将上述得到的RCA产物与适配体链、RNA锚定链、互补DNA单链一步退火进行杂交，和2×TE-Mg2+退火缓冲液混合，在94℃热处理后在PCR仪中以1℃/min速度冷却，25℃恒温12小时制得DNA靶向载体；所述DNA靶向载体与各短链浓度比为1：80。
(3)靶向载体对药物和siRNA的双负载
将上述所得DNA靶向载体与化疗药物Dox于室温下孵育30min，再加入2μL STAT3siRNA双链(10μM)，37℃隔夜退火得到STAT3-Dox-DNA靶向载体复合物。所述DNA靶向载体与Dox浓度比为1：400；所述DNA靶向载体与siRNA浓度比为1：50。
实施例2
(1)滚环扩增合成长单链DNA
依次将表1中RCA引物(2μM)、表1中环状DNA模板(5μM)、DNA聚合酶缓冲液、dNTPs(10mM)和Vent DNA聚合酶混合，混匀离心后在恒温50℃反应8min后再升温至70℃灭活，所得溶液冷却至室温制得RCA产物。
(2)DNA靶向载体的组装
将上述得到的RCA产物与Sgc8适配体链、表1中RNA锚定链、表1中互补DNA单链一步退火进行杂交，和2×TE-Mg2+退火缓冲液混合，在85℃热处理后在PCR仪中以5℃/min速度冷却，20℃恒温7小时制得DNA靶向载体。其中，Sgc8适配体链碱基序列为：ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA(SEQ IDNO:9)；所述DNA靶向载体与各短链浓度比为1：100。
(3)靶向载体对药物和siRNA的双负载
将上述所得DNA靶向载体与化疗药物佛波酯(PMA)于室温下孵育25min，再加入7μLMACC1 siRNA双链(10μM)，45℃隔夜退火得到MACC1-PMA-DNA靶向载体复合物。其中，MACC1siRNA双链的碱基序列为：正义链：GAACGUUGUUGGAAAUCAUTT(SEQ ID NO:10)；反义链：AUGAUUUCCA ACAACGGGCTT(SEQ ID NO:11)。所述DNA靶向载体与PMA浓度比为1：300；siRNA与DNA靶向载体浓度比为1：60。
实施例3
(1)滚环扩增合成长单链DNA
依次将表1中RCA引物(5μM)、表1中环状DNA模板(4μM)、DNA聚合酶缓冲液、dNTPs(23mM)和Pwo聚合酶混合，混匀离心后在恒温62℃反应10min后再升温至95℃灭活，所得溶液冷却至室温制得RCA产物。
(2)DNA靶向载体的组装
将上述得到的RCA产物与HA09适配体链、表1中RNA锚定链、表1中互补DNA单链一步退火进行杂交，和7×TAE-Mg2+退火缓冲液混合，在94℃热处理后在PCR仪中以3℃/min速度冷却，28℃恒温9小时制得DNA靶向载体。其中，HA09适配体链碱基序列为：ACGCTCGGATGCCACTACAGGACAGGGCACCACCATAGTACCTGTACTACCCAGCCGAGGCTCATGGACGTGCTGGTGAC(SEQ ID NO:12)；所述DNA靶向载体与各短链浓度比为1：180。
(3)靶向载体对药物和siRNA的双负载
将上述所得DNA靶向载体与化疗药物紫杉醇于室温下孵育40min，再加入2μL表1中STAT3 siRNA双链(10μM)，50℃隔夜退火得到STAT3-紫杉醇-DNA靶向载体复合物。所述DNA靶向载体与紫杉醇浓度比为1：400；siRNA与DNA靶向载体浓度比为1：65。
实施例4
(1)滚环扩增合成长单链DNA
依次将表1中RCA引物(6μM)、表1中环状DNA模板(20μM)、DNA聚合酶缓冲液、dNTPs(15mM)和Vent DNA聚合酶混合，混匀离心后在恒温40℃反应4min后再升温至100℃灭活，所得溶液冷却至室温制得RCA产物。
(2)DNA靶向载体的组装
将上述得到的RCA产物与适配体链、表1中RNA锚定链、表1中互补DNA单链一步退火进行杂交，和2×TE-Mg2+退火缓冲液混合，在125℃热处理后在PCR仪中以4℃/min速度冷却，33℃恒温13小时制得DNA靶向载体；所述DNA靶向载体与各短链浓度比为1：300。
(3)靶向载体对药物和siRNA的双负载
将上述所得DNA靶向载体与化疗药物佛波酯(PMA)于室温下孵育37min，再加入8μLPRL-3 siRNA双链(10μM)，70℃隔夜退火得到PRL-3-PMA-DNA靶向载体复合物。其中，PRL-3siRNA双链的碱基序列为：正义链：UCACCUACCUGGAGAAAUA(SEQ ID NO:13)；反义链：UAUUUCUCCAGGUAGGUGA(SEQ ID NO:14)。所述DNA靶向载体与PMA浓度比为1：500；siRNA与DNA靶向载体浓度比为1：70。
实施例5
(1)滚环扩增合成长单链DNA
依次将表1中RCA引物(14μM)、表1中环状DNA模板(18μM)、DNA聚合酶缓冲液、dNTPs(20mM)和Vent DNA聚合酶混合，混匀离心后在恒温20℃反应21min后再升温至98℃灭活，所得溶液冷却至室温制得RCA产物。
(2)DNA靶向载体的组装
将上述得到的RCA产物与Sgc8适配体链、表1中RNA锚定链、表1中互补DNA单链一步退火进行杂交，和2×TE-Mg2+退火缓冲液混合，在165℃热处理后在PCR仪中以5℃/min速度冷却，38℃恒温15小时制得DNA靶向载体。其中，Sgc8适配体链碱基序列为：ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA(SEQ IDNO:9)；所述DNA靶向载体与各短链浓度比为1：150。
(3)靶向载体对药物和siRNA的双负载
将上述DNA靶向载体与化疗药物Dox于室温下孵育45min，再加入10μL MACC1siRNA双链(10μM)，93℃隔夜退火得到MACC1-Dox-DNA靶向载体复合物。其中，MACC1 siRNA双链的碱基序列为：正义链：GAACGUUGUUGGAAAUCAUTT(SEQ ID NO:10)；反义链：AUGAUUUCCAACAACGGGCTT(SEQ ID NO:11)。所述DNA靶向载体与Dox浓度比为1：380；siRNA与DNA靶向载体浓度比为1：85。
实施例6
(1)滚环扩增合成长单链DNA
依次将表1中RCA引物(10μM)、表1中环状DNA模板(10μM)、10×Phi29 DNA聚合酶缓冲液、dNTPs(7mM)和Phi29 DNA聚合酶混合，混匀离心后在恒温30℃反应4min后再升温至65℃灭活，所得溶液冷却至室温制得RCA产物。
(2)DNA靶向载体的组装
将上述得到的RCA产物与表1中适配体链、表1中RNA锚定链、表1中互补DNA单链一步退火进行杂交，和2×TE-Mg2+退火缓冲液混合，在94℃热处理后在PCR仪中以1℃/min速度冷却，25℃恒温12小时制得DNA靶向载体；所述DNA靶向载体与各短链浓度比为1：80。
(3)靶向载体对siRNA的负载
将上述所得DNA靶向载体与2μL STAT3 siRNA双链(10μM)，37℃隔夜退火得到STAT3-Dox-DNA靶向载体复合物；所述DNA靶向载体与siRNA浓度比为1：50。
实施例7
(1)滚环扩增合成长单链DNA
依次将表1中RCA引物(10μM)、表1中环状DNA模板(10μM)、10×Phi29 DNA聚合酶缓冲液、dNTPs(7mM)和Phi29 DNA聚合酶混合，混匀离心后在恒温30℃反应4min后再升温至65℃灭活，所得溶液冷却至室温制得RCA产物。
(2)DNA靶向载体的组装
将上述得到的RCA产物与适配体链、表1中互补DNA单链一步退火进行杂交，和2×TE-Mg2+退火缓冲液混合，在94℃热处理后在PCR仪中以1℃/min速度冷却，25℃恒温12小时制得DNA靶向载体；所述DNA靶向载体与各短链浓度比为1：80。
(3)靶向载体对药物的负载
将上述所得DNA靶向载体与化疗药物Dox于室温下孵育30min得到Dox-DNA靶向载体复合物。所述DNA靶向载体与Dox浓度比为1：400。
实验实施例
该系列实施例中，所述肿瘤细胞为小鼠黑色素瘤细胞(B16)，对照组细胞为小鼠成纤维细胞(L929)，两种细胞均购自北京北纳创联生物技术研究院。
对上述实施例1-7所得双负载的DNA靶向载体进行实验如下：
细胞培养：
使用含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素的RPMI-1640完全培养基，在37℃恒温、5％CO2的湿润培养箱中培养。
特异性识别实验：
使用细胞计数板计数细胞，数后的细胞稀释成约100万个细胞/mL的细胞悬液，分别加入96孔板中(0.51mL)，再分别向孔中加入不同浓度的样品(Dox：40nM、100nM、200nM、400nM、1μM、2μM)与细胞共同孵育。用移液枪慢慢吸走所有上清液，重复两次。最后分别向4个孔中加入100μLPBS重悬细胞，转移至黑色96孔板，酶标仪测定荧光。激发波长485nm，发射波长518nm，比较荧光强弱。采用L929细胞进行对照实验。
CCK-8法测定细胞毒性：
收集对数生长期细胞接种于96孔板中，孵育24h后依次加入实施例1的STAT3-Dox-DNA靶向载体复合物、实施例2的MACC1-PMA-DNA靶向载体复合物、实施例3的STAT3-紫杉醇-DNA靶向载体复合物、实施例4的PRL-3-PMA-DNA靶向载体、实施例5的MACC1-Dox-DNA靶向载体复合物及培养基与细胞共孵育，利用CCK－8法测定细胞增殖抑制率。
细胞划痕实验：
为了更好的量化细胞的迁移过程，两种细胞都在12孔培养板中以5万细胞/毫升/孔的初始播种密度进行培养。孵育24h后形成单层细胞时，用10μL的吸头划伤单层，以形成线性伤口。清洗单层以去除脱落的细胞，然后用含有相同浓度的实施例1的STAT3-Dox-DNA靶向载体复合物、实施例7的Dox-DNA靶向载体复合物、实施例6的siSTAT3-DNA靶向载体复合物和空白对照组的基础培养基继续孵育，在0、12h、24h、36h、48h用BDS 400倒置荧光显微镜观察拍摄伤口，使用OLYMPUS cellSens Standard软件测量伤口宽度计算细胞迁移率。
结果
图1实验结果证明，不同浓度梯度的STAT3-Dox-DNA靶向载体与B16/L929分别共存时，B16细胞的荧光强度明显高于L929细胞。这表明附着在STAT3-Dox-DNA靶向载体上的大量核酸诱导体可以同时与细胞表面的多个受体结合，具有很高的亲和力，证明了所述靶向载体对癌细胞的特异性识别能力。
图2实验结果证明，负载STAT3 siRNA的DNA靶向载体复合物对癌细胞发挥作用的效果更明显。在同样的浓度当量下，所述体系处理后的B16细胞比其他负载体系处理后的抑制率都更高。这证明了所述靶向载体复合物在进入目标细胞后会被细胞内溶酶体的核酸内切酶分解，释放出负载的药物Dox和siRNA，高效精准地杀灭靶标细胞，同时降低对非目标细胞的毒副作用。
图3实验结果能够得出，空白对照组的细胞伤口愈合速度最快，单负载体系组次之，而STAT3-Dox-DNA靶向载体复合物的处理会导致B16细胞迁移率显著下降，表明本发明所设计的双负载体系的双杀灭效果远强于单负载体系，能够显著抑制小鼠纤维瘤细胞系的迁移能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国石油大学（华东）
安丘市增塑剂厂
<120> 一种DNA纳米载体复合物及其制备方法和应用
<130> DI21-2357-XC37
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 环状DNA模板
<400> 1
tgtcttcgcc ttcttgaatc gtttccttga acatgaacct tctctttcga ctaagc 56
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RCA引物
<400> 2
ggcgaagaca cctagttagt c 21
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RCA产物的重复单元
<400> 3
ggtgcttagc tgaaagaaag aaaggaagaa gtttcaagga aaggaaacaa gaaggcgaag 60
aca 63
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RNA锚定链
<400> 4
atccggtcga tgtcatactg ctgatcatgc cttcttgttt cc 42
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AS1411适配体链
<400> 5
ttttggtggt ggtggtgttg gtggtggtgg tttttttcct tgaaacttct tcctt 55
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 互补DNA单链
<400> 6
tcatactttc gactaagcac c 21
<210> 7
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAT3 siRNA正义链
<400> 7
atgacatcau tgugttgcac gacuuugauu ucaactt 37
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> STAT3 siRNA反义链
<400> 8
ttguccauag ccaaagucgu cc 22
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sgc8适配体链
<400> 9
atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MACC1 siRNA正义链
<400> 10
gaacguuguu ggaaaucaut t 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MACC1 siRNA反义链
<400> 11
augauuucca acaacgggct t 21
<210> 12
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HA09适配体链
<400> 12
acgctcggat gccactacag gacagggcac caccatagta cctgtactac ccagccgagg 60
ctcatggacg tgctggtgac 80
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRL-3 siRNA正义链
<400> 13
ucaccuaccu ggagaaaua 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PRL-3 siRNA反义链
<400> 14
uauuucucca gguagguga 19

Claims (10)

1.一种DNA纳米载体复合物，包括DNA靶向载体、抗癌药物和治疗基因，
其中，所述DNA靶向载体包括具有a个串联的重复单元的长单链DNA、a条适配体链、a条锚定链和a条互补DNA单链，其中，a为20～300的整数，优选地，a为50～100的整数，以及，其中，所述长单链DNA的每个重复单元由串联的三个部分序列组成，所述适配体链通过在适配体末端延长的未配对碱基通过互补配对与所述串联的三个部分序列中的一个连接，所述锚定链用于连接治疗基因并利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的另一个连接，所述互补DNA单链利用碱基互补配对与所述串联的三个部分序列中的最后一个连接。
2.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物，其中，所述具有a个串联的重复单元的长单链DNA是基于滚环扩增的长单链DNA分子，优选地，所述具有a个串联的重复单元的长单链DNA的长度为4000bp-19000bp，更优选约8000bp，还更优选地，所述具有a个串联的重复单元的长单链DNA具有约127个串联的63碱基重复序列。
3.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物，其中，所述适配体链包括能够特异性识别癌细胞的适配体，并通过在适配体末端延长的未配对碱基与DNA长单链上碱基互补配对连接，优选地，所述适配体为选自以下各项中的一种或多种：AS1411(核仁蛋白特异核酸适配体)、人源性肝癌细胞(HepG2)的适配体HA09、白血病细胞(CEM)的适配体Sgc8，更优选地，所述适配体5’端标记荧光基团。
4.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物，其中，所述治疗基因包括抑制致病性RNA活性的小干扰RNA(siRNA)、编码治疗性蛋白的基因或编码疫苗抗原的基因，优选地，所述治疗基因为选自以下各项中的一种或多种：信号转导子和转录激活子3小干扰RNA(STAT3siRNA)、再生肝磷酸酶-3小干扰RNA(PRL-3 siRNA)、结肠癌转移相关基因1小干扰RNA(MACC1 siRNA)，其中优选STAT3 siRNA。
5.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物，其中，所述长单链DNA的重复单元具有如SEQ ID NO:3所示的序列；所述锚定链具有如SEQ ID NO:4所示的序列；所述互补DNA单链具有如SEQ ID NO:6所示的序列；所述适配体链选自以下一种或多种：SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:12；所述治疗基因选自以下一种或多种：STAT3 siRNA、PRL-3 siRNA、MACC1 siRNA，优选地，所述治疗基因为STAT3 siRNA，其正义链如SEQ ID NO:7所示，以及反义链如SEQ ID NO:8所示。
6.根据权利要求1所述的DNA纳米载体复合物，其中，所述抗癌药物为化疗药物，优选选自以下各项中的一种或多种：盐酸阿霉素(Dox)、佛波酯(PMA)、紫杉醇，更优选Dox。
7.权利要求1-6中任一项所述的DNA纳米载体复合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)滚环扩增合成长单链DNA：采用DNA环状模板与引物，在聚合酶和缓冲液作用下，于10～80℃温度中聚合1～30min后升至40～120℃终止，所得溶液冷却至室温制得长单链DNA；
(2)DNA靶向载体的组装：将长单链DNA与互补DNA单链、适配体链、锚定链杂交，并和退火缓冲液混合，在25～170℃热处理后在PCR仪中以1℃/min的速度冷却，10～40℃恒温过夜组装，其中DNA靶向载体与互补DNA单链、适配体链、锚定链加入的浓度比分别为1:10～1:300；
(3)向载体对抗癌药物和治疗基因的双负载：将上述所得DNA靶向载体与抗癌药物于室温孵育20～50min，再加入治疗基因，20～100℃隔夜退火得到双负载体系，其中：治疗基因与DNA靶向载体浓度比为1：30～90。
8.根据权利要求7的所述制备方法，其中，所述的聚合酶为用于生物催化合成脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的聚合酶，优选为选自以下各项中的一种或多种：Phi29聚合酶、Pwo聚合酶、Vent DNA聚合酶等，其中优选Phi29聚合酶。
9.权利要求1-6中任一项所述的DNA纳米载体复合物在制备用于治疗癌症的药物中应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述癌症包括选自以下各项中的一种或多种：黑色素瘤、肝癌、乳腺癌，其中优选黑色素瘤。
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