CN114231422B

CN114231422B - 一株降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌及其应用

Info

Publication number: CN114231422B
Application number: CN202111490799.3A
Authority: CN
Inventors: 孙扬; 常兴平; 李永涛; 梁军锋; 赵丽霞; 李晓晶; 符芙蓉; 叶会科; 周斌
Original assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Current assignee: Agro Environmental Protection Institute Ministry of Agriculture
Priority date: 2021-12-08
Filing date: 2021-12-08
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2041-12-08
Also published as: CN114231422A

Abstract

本发明公开了一株降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌，所述菌株的名称为：F‑F1，分类命名为：腐皮镰刀菌Fusarium solani，保藏号为CGMCC No.23288，保藏日期为：2021年10月19日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明菌株F‑F1的rDNA‑ITS序列由573个碱基组成，对筛选得到的镰刀菌Fusarium solani作为单一菌株与适量营养物质对除草剂腐皮镰刀菌进行共代谢，测定了连续7d培养过程中氟磺胺草醚残留浓度的变化，结果表明腐皮镰刀菌F‑F1与适量营养物质能够很好地降解氟磺胺草醚。

Description

一株降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其是一株降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌及其应用。

背景技术

当今我国农田土壤质量状况堪忧，化学肥料和农药的不合理使用是主要原因之一。二苯醚类除草剂(diphenyl ether herbicides，DEHs)因具有高效、低毒、高选择性等优点而在世界各地得到广泛应用。现使用的多为高活性的含氟品种，主要包括氟磺胺草醚、乙氧氟草醚、三氟羧草醚和乳氟禾草灵等。其中氟磺胺草醚应用于我国80％-90％的大豆田，而且为了推进农业结构优化，2020年全国种植业结构调整，增加大豆面积到1.4亿亩。随着大豆农田杂草类群演替，对农药不敏感杂草增加，近年来氟磺胺草醚使用量及施用面积呈现增加态势。由于氟磺胺草醚在土壤中积累残效期长，持续多年施药导致田间残留量居高不下，造成后茬敏感作物如白菜、甜菜、玉米、小麦等减产甚至绝收，严重威胁到中国粮食主产区农业种植结构的调整和农业生产的安全，也成为我国农业面源污染的重要因素。因此如何清洁高效地去除土壤中氟磺胺草醚的残留毒性成为当前亟待解决的问题。DEHs虽然也可能通过光降解、淋溶等途径消解，但因为很多微生物体内具有易于转化硝基基团的酶类而使得微生物降解成为其降解的主要方式。利用土壤主要生物类群协同修复农田土壤中DEHs的污染，对于探索新的环境友好型污染修复技术，实现农业的绿色可持续发展具有重要意义。

当前研究认为腐皮镰刀菌是土壤习居菌，可引起植物***性或局部感染，造成植物萎蔫腐烂。但同时也有学者发现麸皮镰刀菌对多种致病菌具有抑制作用。还有研究报道腐皮镰刀菌能产生药物单体成分大黄酸和大黄素以及降解农用抗生素土霉素、诺氟沙星和磺胺二甲嘧啶的功能。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌及其应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一株降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌，所述菌株的名称为：F-F1，分类命名为：腐皮镰刀菌Fusarium solani，保藏号为CGMCC No.23288，保藏日期为：2021年10月19日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

进一步地，所述菌株F-F1的rDNA-ITS序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述腐皮镰刀菌F-F1在外加营养物质的共代谢作用下能够对除草剂氟磺胺草醚进行降解，氟磺胺草醚的降解率能够达到96.2％。

进一步地，所述营养物质为基础盐培养基+2％(质量分数)葡萄糖；

其中，所述基础盐培养基为：硫酸铵1.0g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠1.0g/L，七水硫酸镁0.4g/L，蒸馏水定容，用盐酸调pH至中性；使用前在121℃温度下高压灭菌20分钟。

包含如上所述的降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌的氟磺胺草醚降解试剂。

进一步地，所述试剂还包含外加碳源和/或氮源。

进一步地，所述试剂还包含外加碳源葡萄糖。

如上所述的腐皮镰刀菌在作为降解氟磺胺草醚药剂方面中的应用。

如上所述的腐皮镰刀菌在作为土壤修复剂方面中的应用。

如上所述的腐皮镰刀菌在作为水体修复剂方面中的应用。

本发明取得的有益效果是：

1、本发明菌株F-F1的rDNA-ITS序列由573个碱基组成，对筛选得到的镰刀菌Fusarium solani作为单一菌株与适量营养物质对除草剂腐皮镰刀菌进行共代谢，测定了连续7d培养过程中氟磺胺草醚残留浓度的变化，结果表明腐皮镰刀菌F-F1与适量营养物质能够很好地降解氟磺胺草醚。

2、本发明进行了无机盐培养基中腐皮镰刀菌联合营养物质葡萄糖共代谢农田常施除草剂氟磺胺草醚的降解修复研究，测定了培养168h(7d)过程中培养基中氟磺胺草醚的变化。初步证明该镰刀菌可以作为降解菌株来降解氟磺胺草醚，可以作为农田土壤除草剂氟磺胺草醚污染修复的候选菌株。

3、本发明经过试验证实：菌株F-F1的培养基为：2％葡萄糖存在的情况下共代谢50mg L^-1氟磺胺草醚，培养7d时，F-F1+2％葡萄糖(GFM)处理中氟磺胺草醚的降解率分别可达96.2％，空白(CK)处理中氟磺胺草醚的降解率小于4.4％。而仅添加真菌的处理(FM)中氟磺胺草醚的降解率仅为19.5％。

4、本发明分析测试了由菌株F-F1纯菌在外加营养物质的共代谢作用下对除草剂氟磺胺草醚的降解作用，本菌株具有作为农田除草剂氟磺胺草醚降解修复的候选菌株的前景。

附图说明

图1为本发明中腐皮镰刀菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上的菌落形态及显微特征图；

图2为本发明中腐皮镰刀菌在纯培养和加有外加碳/氮源的生长状况图；

图3为本发明中氟磺胺草醚在空白基础盐培养基及加营养物质对照中的降解曲线图；

图4为本发明中腐皮镰刀菌在空白基础盐培养基和营养物质共代谢下的氟磺胺草醚降解率图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。

本发明中所使用的的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。

较优地，所述菌株F-F1的rDNA-ITS序列为SEQ ID NO.1。

较优地，所述腐皮镰刀菌F-F1在外加营养物质的共代谢作用下能够对除草剂氟磺胺草醚进行降解，氟磺胺草醚的降解率能够达到96.2％。

较优地，所述营养物质为基础盐培养基+2％(质量分数)葡萄糖；

较优地，所述试剂还包含外加碳源和/或氮源。

较优地，所述试剂还包含外加碳源葡萄糖。

如上所述的腐皮镰刀菌在作为土壤修复剂方面中的应用。

如上所述的腐皮镰刀菌在作为水体修复剂方面中的应用。

具体地，相关的制备及检测如下：

本发明从哈尔滨市某农场大豆地土壤中，分离得到一株腐皮镰刀菌，分别进行了形态学和分子生物学方法鉴定。形态学分析包括培养方法、压片染色和小培养鉴定，分子生物学方法选择ITS(the internal transcribed spacer region ofthe rRNA gene，即基因转录间隔区)和β-微管蛋白基因(TUB)，通过扩增测序，结果显示，与腐皮镰刀菌Fusariumsolani rDNA ITS基因高度同源。分类命名为：Fusarium solani，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23288，保藏日期为：2021年10月19日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明在实验室里利用无机盐培养基研究了氟磺胺草醚在腐皮镰刀菌菌株F-F1和营养物质葡萄糖共代谢作用下的降解情况，为此种真菌未来在农田污染土壤以及水体中的应用提供了坚实的科学依据。

上述菌株的筛选和生理特性试验过程如下：

1.材料与方法

1.1样品、仪器、试剂与培养基

样品来源：分离筛选菌种土壤样品采集自哈尔滨市某农场大豆地土壤。

仪器：恒温摇床(金坛华特，常州)，离心机(Centrifuge 5810R，Eppendorf德国)，微孔滤膜(0.22μm，Pall，美国)，基因分析仪(3730xl DNAanalyzer，ABI，美国)，毛细管(50cm，96道，4331246，ABI，美国)，PCR仪(2720，ABI，美国)，电泳仪(DYY-8C，六一仪器厂，北京)，紫外分析仪(UV-IV，新技术应用研究所，北京)，涡旋仪(VORTEX-5，其林贝尔仪器制造有限公司，江苏海门)，超高效液相色谱仪(H-Class，Waters，美国)。

试剂耗材见表1.

表1实验所用试剂耗材一览表

富集培养基：蛋白胨5g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L，蒸馏水定容，调pH至7.0，使用前在121℃温度下高压灭菌20分钟。

基础盐培养基：硫酸铵1.0g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氯化钠1.0g/L，七水硫酸镁0.4g/L，蒸馏水定容，用盐酸调pH至中性。使用前在121℃温度下高压灭菌20分钟。

纯化培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：马铃薯浸出粉5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂14.0g/L，pH(25℃)5.6±0.2。蒸馏水定容，分装后121℃高压灭菌20min，灭菌后摇匀备用。

降解实验用培养基：同基础盐培养基。

2方法

2.1菌株筛选

取来源于哈尔滨市某农场大豆地土壤的土壤样品10g，在无菌操作条件下，加到含氟磺胺草醚浓度为50mg/L的100mL富集培养基的三角瓶中，在30℃下150r/min振荡频率下培养5天；然后按10％的接种量将其转接到含氟磺胺草醚浓度为100mg/L的100mL富集培养基的三角瓶中，继续培养5天；再按10％的接种量将其转接到含氟磺胺草醚浓度为200mg/L的100mL富集培养基的三角瓶中，继续培养5天；然后取1mL上述富集培养基菌液加入到10mL离心管中，蒸馏水定容，逐级稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，分别转接0.1mL稀释液到含氟磺胺草醚浓度为100mg/L的纯化培养基平板上，涂布平板，置于30℃恒温培养箱中培养3天，选取不同形态特征的单菌落接种于含氟磺胺草醚浓度为100mg/L的纯化培养基上，采用平板划线法分别进行3次分离纯化。纯化后选取平板上长势较好的单菌落菌株，保存于具有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的斜面试管中。

2.2氟磺胺草醚功能降解菌的筛选

将纯化后的菌株在富集培养基中培养至对数周期(对数周期采用测定OD600值来确定，OD600值达到0.9即为对数周期)，然后以5％接种量(本实验中“5％的接种量”是指接种液与被接种培养基的体积比)将其接入含氟磺胺草醚浓度为50mg/L的基础无机盐培养液中，无机盐培养基有以下处理：灭菌前分别加入2％葡萄糖(质量分数)，同时设不接菌的培养液作对照，每个样品处理3个重复。培养结束后，吸取上清液2mL，加入10mL乙腈，2g氯化钠，涡旋1min，8000r/min离心5min，吸取上清液1mL，过0.22μm滤膜用超高效液相色谱仪测定氟磺胺草醚的残留量。通过筛选，得到一株对氟磺胺草醚共代谢功能优良的真菌菌株，命名为F-F1。具体设置及结果见表2、3。

表2不同编号处理的意义解释

表3本发明菌株和营养物质共代谢下氟磺胺草醚的残留量及降解率

如图2所示，结果表明：接种F-F1后，没有营养物质加入的处理(FM)中氟磺胺草醚的降解效果高于CK(培养168h降解率为4.4％)，但培养168h降解率也仅为19.5％。而加入2％葡萄糖(GFM)营养物质后，基础盐培养基中氟磺胺草醚的降解大幅度加快，培养168h后，氟磺胺草醚残留量降解至1.7mg/L，降解率达到96.2％.

2.3农药氟磺胺草醚的残留量检测方法

2.3.1采用外标法：用等体积乙腈:去离子水(1:1)将氟磺胺草醚标准溶液依次稀释成0.02、0.1、0.2、0.5、1、2、5mg/L浓度，然后用超高效液相色谱仪测定，每次进样1μL，每个样品处理3个重复，取峰面积的平均值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标做标准曲线。

2.3.2氟磺胺草醚的液相色谱条件：WatersACQUITYBEH C18色谱柱，1.7μm*2.1mm*100mm；柱温箱温度：40℃；流动相：乙腈:超纯水:甲酸(80:20:0.1,v/v/v)；波长：275nm；进样量：5μL。

通过标准曲线得到培养液中氟磺胺草醚的残留量，进而通过公式1计算出氟磺胺草醚的降解率，结果见图3、图4。

公式1：降解率(％)＝(初始培养液中氟磺胺草醚浓度-处理培养液中氟磺胺草醚的残留浓度)/初始培养液中氟磺胺草醚浓度×100％

2.4氟磺胺草醚功能降解菌株F-F1的鉴定

菌株基因组DNA提取：分离菌株使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基于30℃培养箱静置培养5天，使用RAidlab DN14真菌提取试剂盒按照其说明书方法进行，操作过程如下：刮取0.2-0.5mg菌丝，放入2.0ml离心管中；加2颗直径3-4mm玻璃珠和100μl CTAB裂解液，在Retsch MM400匀浆机上研磨两次，每次2min；加入400μl 65℃水浴预热CTAB裂解液，颠倒混匀后于65℃水浴0.5-1hr；加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀50次；12000rpm室温条件下离心5min，取上清液至新离心管中；向上清液中加入1.5倍体积结合液，混合均匀后转移到吸附柱中，12000rpm室温条件下离心30sec，弃去废液；加500μl抑制物去除液，12000rpm室温条件下离心30sec，弃去废液；加入600μl漂洗液，12000rpm室温条件下离心30sec，弃去废液；将吸附柱放回到空收集管中，12000rpm室温条件下离心2min；吸附柱转移到灭菌的1.5ml离心管中，敞口在室温下干燥5min；加50～100μl洗脱缓冲液，室温下放置3-5min，12000rpm离心30sec收集基因组DNA溶液，立即使用或-20℃条件下贮存备用。

核糖体基因(rDNA)序列扩增测序：将PCR MIX缓冲液和引物(上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTT-ATTGATATGC-3’)溶液取出，在4℃或冰块上融化30分钟。

PCR扩增体系(50μl)：dd H2O 19μl；PCR MIX酶缓冲液30μl；上游引物1μl；下游引物1μl；模板1.5μl(前4种成分配成混合液，分装PCR反应管后，加DNA模板)。

PCR扩增反应程序：94℃变性5min,94℃解链0.5min,50℃复性30s,72℃延伸1min,扩增35个循环后72℃延伸7min，完成后产物在4℃下保存。

PCR产物纯化：配制2％琼脂糖凝胶：将2g琼脂糖加入到100mL 1×TBE加热溶解；电泳电压100V，电泳时间30min；割胶后按照试剂盒说明书操作进行PCR产物纯化。

对PCR产物进行乙醇沉淀纯化，然后应用BigDyeTr v3.1 Cycle Seq Kit(4336921)试剂盒上ABI 3730XL测序仪电泳将符合条带大小的PCR产物交由天津景阳生物科技有限公司进行分析测序，得到该菌株的rDNA-ITS序列组成：

上述rDNA-ITS序列由573个碱基(bp)组成。

2.5菌落形态特征观察

F-F1菌株在马铃薯葡萄糖培养基上生长很快，于28℃恒温培养5天菌落直径50～90mm，单菌落菌丝为气生菌丝，呈低平的棉絮状，贴基生长，生长茂盛。菌株边缘白色，中部浅紫肉桂色，背面呈现淡黄色。显微镜下观察菌丝内无横隔膜，为长管状单细胞。小型分生孢子以假头状方式着生，孢子呈椭圆形、长椭圆形、短腊肠形或逗号形，无隔，透明、光滑。大型分生孢子呈镰刀形、纺锤形、披针形或柱形等，稍弯，顶端细胞短，稍窄细或变钝，壁厚，无隔；无脚胞。菌株F-F1的菌落形态和显微形态见图1。

2.5菌株F-F1鉴定为一种新功能菌株

将测序结果与NCBI中的GenBank进行Blast比对，得到F-F1与Fusarium solani的ITS序列的同源性为99％。根据菌株F-F1的形态特征以及rDNA-ITS序列分析结果，将该菌株鉴定为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)，命名为腐皮镰刀菌F-F1(Fusarium solani F-F1)。截止目前，国内外尚没有研究者发现腐皮镰刀菌(Fusarium solani)具有降解氟磺胺草醚的功能的报道。因此，菌株F-F1属于一种新功能菌株，已于2021年10月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.23288。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

序列表

<110> 农业农村部环境保护科研监测所

<120> 一株降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> 菌株F-F1的rDNA-ITS序列(Unknown)

<400> 1

cctccgtagg gggtgactgc ggagggatca ttaccgagtt atacaactca tcaaccctgt 60

gaacatacct aaaacgttgc ttcggcggga acagacggcc ctgtaacaac gggccgcccc 120

cgccagagga cccctaactc tgtttttata atgtttttct gagtaaacaa gcaaataaat 180

taaaactttc aacaacggat ctcttggctc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg 240

ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc 300

cgccagtatt ctggcgggca tgcctgttcg agcgtcatta caaccctcag gcccccgggc 360

ctggcgttgg ggatcggcgg aagccccctg tgggcacacg ccgtccctca aatacagtgg 420

cggtcccgcc gcagcttcca ttgcgtagta gctaacacct cgcaactgga gagcggcgcg 480

gccatgccgt aaaacaccca acttctgaat gttgacctcg aatcaggtag gaatacccgc 540

tgaacttaag catatcaaaa ggcggaggaa ctt 573

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 上游引物ITS1(Unknown)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物ITS4(Unknown)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一株降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌，其特征在于：所述菌株的名称为：F-F1，分类命名为：腐皮镰刀菌Fusarium solani，保藏号为CGMCC No. 23288，保藏日期为：2021年10月19日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.包含如权利要求1所述的降解氟磺胺草醚的腐皮镰刀菌的氟磺胺草醚降解试剂。

3.根据权利要求2所述的氟磺胺草醚降解试剂，其特征在于：所述试剂还包含外加碳源和/或氮源。

4.根据权利要求2所述的氟磺胺草醚降解试剂，其特征在于：所述试剂还包含外加碳源葡萄糖。

5.如权利要求1所述的腐皮镰刀菌在作为降解氟磺胺草醚药剂方面中的应用。

6.如权利要求1所述的腐皮镰刀菌在作为土壤修复剂方面中的应用。

7.如权利要求1所述的腐皮镰刀菌在作为水体修复剂方面中的应用。