CN114224900A - 用于治疗病毒感染的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗病毒感染的方法和组合物。提供一种治疗病毒感染的方法，所述病毒感染例如由丝状病毒科、黄病毒科或披膜病毒科的病毒导致的病毒感染。将具有至少一种强心苷的组合物用于治疗病毒感染。所述组合物可进一步包括至少一种三萜。

Description

用于治疗病毒感染的方法和组合物
本申请是申请日为2018年7月16日、申请号为201880059793.0、发明名称 为“用于治疗病毒感染的方法和组合物”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗病毒组合物以及其用于治疗哺乳动物中黄病毒科 (Flaviviridae)感染、披膜病毒科(Togaviridae)感染、或丝状病毒科(Filoviridae) 感染的用途。一些实施方案涉及出血性病毒感染的治疗。
背景技术
作为夹竹桃属(Nerium specie)的成员的夹竹桃(Nerium oleander)，是一种 广泛分布于亚热带亚洲、美国西南部、和地中海的观赏性植物。它的医学和 毒物学特性早已被认识到。已提议其用于例如痔疮、溃疡、麻风病、蛇咬伤、 癌症、肿瘤、神经学病症、细胞增殖性疾病等的治疗。
传统上使用沸水、冷水、或有机溶剂来进行来自夹竹桃属的植物的组分 的提取。
市售可得的ANVIRZELTM(Ozel的US 5,135,745)含有夹竹桃的热水提取 物的浓缩形式或粉末形式。Muller等人(Pharmazie.(1991)九月，46(9), 657-663)公开了关于夹竹桃的水提取物的分析的结果。他们报道，存在的多 糖主要是半乳糖醛酸。其他糖类包括鼠李糖、***糖和半乳糖。Newman 等人(J.Herbal Pharmacotherapy,(2001)vol 1,pp.1-16)也已报道了夹竹桃的 热水提取物中的多糖含量和多糖的单个糖组成。Selvaraj等人的美国专利号 5,869,060涉及夹竹桃属的提取物和生产方法。为了制备提取物，将植物材料置于水中并煮沸。然后从植物物质分离粗提取物并通过过滤灭菌。然后将所 得提取物冻干来生产粉末。美国专利号6,565,897(Selvaraj等人的美国早期公 开号(U.S.PregrantPublication No.)20020114852和PCT国际公开号WO 2000/016793)公开了用于基本上无菌的提取物的制备的热水提取方法。
Erdemoglu等人(J.Ethnopharmacol.(2003)十一月，89(1),123-129)公开 了基于它们的镇痛和抗炎活性，包括夹竹桃的植物的水性和乙醇提取物的比 较的结果。
Adome等人(Afr.Health Sci.(2003)八月，3(2),77-86；乙醇提取物)、 el-Shazly等人(J.Egypt Soc.Parasitol.(1996),八月，26(2),461-473；乙醇提取 物)、Begum等人(Phytochemistry(1999)二月，50(3),435-438；甲醇提取物)、 Zia等人(J.Ethnolpharmacol.(1995)十一月，49(1),33-39；甲醇提取物)、和 Vlasenko等人(Farmatsiia.(1972)九月-十月，21(5),46-47；醇提取物)也公开 了夹竹桃的有机溶剂提取物。
已知夹竹桃属的超临界流体提取物(US 8394434,US 8187644,US 7402325)并且已在治疗神经学病症(US 8481086,US 9220778,US 9358293, US 20160243143 A1)和细胞增殖性病症(US 8367363)中显示功效。
已知三萜具有各种治疗活性。一些已知的三萜包括齐墩果酸、熊果酸、 白桦脂酸、巴多索隆、山楂酸、和其他。主要单个地评价三萜的治疗活性而 不是作为三萜的组合评价。
齐墩果酸属于以例如巴多索隆等化合物为代表的三萜化合物的一类，其 已显示是先天性细胞2期排毒途径的有效激活剂，其中转录因子Nrf2的激活 导致含有抗氧化剂转录应答元件(ARE)的下游抗氧化剂基因的程序中的转录 增加。巴多索隆自身已在炎症条件下的临床试验中被广泛研究；然而，慢性 肾脏疾病中的3期临床试验，由于可能与以提高的浓度包括巴多索隆的某些 三萜系化合物的已知细胞毒性有关的不良事件而被终止。
作为植物提取物，发现了组合含有三萜与其他治疗组分的组合物。 Fumiko等人(Biol.Pharm.Bull(2002),25(11),1485-1487)公开了迷迭香 (Rosmarimus officinalisL.)的甲醇提取物用于治疗锥虫病的评价。Addington 等人(US 8481086,US 9220778,US9358293,US 20160243143 A1)公开了用于 神经学病症的治疗的、含有夹竹桃苷和三萜的夹竹桃的超临界流体提取物(SCF；PBI-05204)。Addington等人(US 9011937,US20150283191 A1)公开了 用于神经学病症的治疗的、含有夹竹桃苷和三萜的夹竹桃的SCF提取物的含 三萜的级分(PBI-04711)。
Figure BDA0003242244600000031
等人(Molecules(2009),14,2016-2031)公开了含 有齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其他组分的混合物的各种植物提取物。 Mishra等人(PLoS One 2016 25；11(7):e0159430.Epub 2016年7月25日)公开了 含有齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其他组分的混合物的糙皮桦(Betula utilis) 树皮的提取物。Wang等人(Molecules(2016),21,139)公开了含有齐墩果酸、 熊果酸、白桦脂酸和其他组分的混合物的糖胶树(Alstonia scholaris)的提取物。 L.e Silva等人(Molecules(2012),17,12197)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、白 桦脂酸和其他组分的混合物的Eriope blanchetti的提取物。Rui等人(Int.J.Mol. Sci.(2012),13,7648-7662)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其他组 分的混合物的蓝桉(Eucaplyptus globulus)的提取物。Ayatollahi等人(Iran.J. Pharm.Res.(2011),10(2),287-294)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸 和其他组分的混合物的Euphorbia microsciadia的提取物。Wu等人(Molecules (2011),16,1-15)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其他组分的混合 物的女贞属(Ligustrumspecies)的提取物。Lee等人(Biol.Pharm.Bull(2010), 33(2),330)公开了含有齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸和其他组分的混合物的 金钟花(Forsythia viridissima)的提取物。
齐墩果酸(O或OA)、熊果酸(U或UA)和白桦脂酸(B或BA)是在PBI-05204 (PBI-23；夹竹桃的超临界流体提取物)和PBI-04711(PBI-05204的含三萜级分 0-4)中发现的三种主要的三萜组分。通过比较三萜在相似浓度下在脑片糖氧 剥夺(OGD)模型试验中的神经保护活性，我们(发明人中的两名)先前报道了 (Van Kanegan等人,在Nature ScientificReports(2016年5月),6:25626.doi: 10.1038/srep25626中)三萜对功效的贡献。我们发现PBI-05204(PBI)和 PBI-04711(0-4部分)提供神经保护活性。
已知夹竹桃属的提取物含有许多不同种类的化合物：强心苷、糖基、类 固醇、三萜、多糖及其他。具体化合物包括夹竹桃苷；夹竹桃它罗苷；奥多 诺甙；齐墩果酸；熊果酸；白桦脂酸；夹竹桃苷元；夹竹桃苷A；白桦脂醇(乌 索-12-烯-3β,28-二醇)(urs-12-ene-3β,28-diol)；28-去甲乌索-12-烯-3β-醇 (28-norurs-12-en-3β-ol)；乌索-12-烯-3β-醇；3β,3β-羟基-12-齐墩果烯-28-酸 (3β,3β-hydroxy-12-oleanen-28-oic acid)；3β,20α-二羟基乌索-21-烯-38-酸 (3β,20α-dihydroxyurs-21-en-38-oic acid)；3β,27-二羟基-12-乌索烯-38-酸 (3β,27-dihydroxy-12-ursen-38-oic acid)；3β,13β-二羟基乌索-11-烯-28-酸 (3β,13β-dihydroxyurs-11-en-28-oic acid)；3β,12α-二羟基齐墩果烷-28,13β-内酯(3β,12α-dihydroxyoleanan-28,13β-olide)；3β,27-二羟基-12-齐墩果-28-酸 (3β,27-dihydroxy-12-oleanan-28-oic acid)；和其他组分。
病毒性出血热(VHF)可由5种不同的病毒科导致：沙粒病毒科 (Arenaviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、丝状病毒科、黄病毒科、和副 粘病毒科(Paramyxoviridae)。例如埃博拉病毒(EBOV)和马尔堡病毒(MARV) 等的丝状病毒是人类已知的最致病性病毒并且是死亡率高达90％的病毒性 出血热爆发的病原体。各病毒体含有一个分子的单链负义RNA。除了支持治 疗或对症治疗外，没有可用于治疗EBOV(埃博拉病毒)和MARV(马尔堡病毒) 感染(即丝状病毒感染)的市售治疗有效药或预防药。已识别埃博拉病毒的5 个物种：塔伊森林型(
Figure BDA0003242244600000041
Forest)(原名为象牙海岸型，Ivory Coast)、苏丹型 (Sudan)、扎伊尔型(Zaire)、雷斯顿型(Reston)和本迪布焦型(Bundibugyo)。
黄病毒是正义、单链、包膜的RNA病毒。它们被发现于节肢动物中，主 要为蜱和蚊子，并且在全世界引起广泛的发病率和死亡率。一些蚊子-传播 的病毒包括黄热病、登革热、日本脑炎、西尼罗病毒、和寨卡病毒。一些蜱 -传播的病毒感染包括蜱媒脑炎、科萨努尔森林病、Alkhurma症、鄂木斯克 出血热。尽管不是出血性感染，波瓦生病毒是黄病毒。
夹竹桃苷已显示抗-HIV活性，但未针对许多病毒进行评价。三萜齐墩果 酸、白桦脂酸和熊果酸已报道表现不同水平的抗病毒活性，但未针对许多病 毒进行评价。白桦脂酸已显示针对HSV-1 1C株、甲型流感H7N1、ECHO 6、 和HIV-1的一些抗病毒活性。齐墩果酸已显示针对HIV-1、HEP C、和HCV H 株NS5B的一些抗病毒活性。熊果酸已显示针对HIV-1、HEPC、HCV H株NS5B、 HSV-1、HSV-2、ADV-3、ADV-8、ADV-11、HEP B、ENTV CVB1和ENTV EV71 的一些抗病毒活性。就针对特定病毒的功效而言，夹竹桃苷、齐墩果酸、熊 果酸和白桦脂酸的抗病毒活性是不可预测的。存在夹竹桃苷、齐墩果酸、熊 果酸和/或白桦脂酸对其几乎没有抗病毒活性的病毒，意味着无法先验地预测 夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸和/或白桦脂酸是否会对特定病毒属表现抗病毒 活性。
Barrows等人(“对于Zikavirus感染抑制剂的FDA批准的药物的筛选(A screen ofFDA-approved drugs for inhibitors of Zikavirus infection)”，Cell Host Microbe(2016),20,259–270)报道了地高辛针对寨卡病毒显示抗病毒活性，但 剂量太高且可能有毒。Cheung等人(“毛花苷C对登革热病毒感染的抗病毒活 性(Antiviral activity oflanatoside C against dengue virus infection)”，Antiviral Res.(2014)111,93–99)报道了毛花苷C针对登革热病毒显示抗病毒活性。
尽管已证明强心苷针对少数病毒表现一些抗病毒活性，特定化合物针对 不同病毒表现非常不同水平的抗病毒活性，意味着当针对相同病毒(一种或 多种)进行评价时，一些表现非常差的抗病毒活性且一些表现较好的抗病毒 活性。
仍需要改进针对特定病毒感染具有治疗活性的，含有夹竹桃苷、齐墩果 酸、熊果酸、白桦脂酸或其任何组合的药物组合物。
发明内容
本发明提供了用于治疗哺乳类马中的病毒感染的药物组合物和方法。本 发明还提供了用于治疗哺乳类马中的例如病毒性出血热(VHF)感染等病毒感 染的药物组合物和方法。本发明还提供了通过施用所述药物组合物治疗哺乳 动物中病毒感染的方法。本发明人已成功制备抗病毒组合物，其表现足够的 抗病毒活性来证明其在治疗人类和动物中病毒感染的用途。本发明人已开发 采用特定给药方案的相应治疗方法。
在一些实施方案中，病毒感染由任何以下病毒科导致：沙粒病毒科、布 尼亚病毒科、丝状病毒科、黄病毒科、副粘病毒科、或披膜病毒科。
本发明的一些实施方案涉及治疗丝状病毒感染、黄病毒感染、亨尼病毒 感染、甲病毒感染、或皮膜病毒感染的组合物和方法。可以治疗的病毒感染 至少包括埃博拉病毒、马尔堡病毒、甲病毒、黄病毒、黄热病、登革热、日 本脑炎、西尼罗病毒、寨卡病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎(脑炎)(VEE)病毒、基 孔肯雅病毒、西部马脊髓炎(脑炎)(WEE)病毒、东部马脑脊髓炎(脑炎)(EEE) 病毒、蜱媒脑炎、科萨努尔森林病、Alkhurma症、鄂木斯克出血热、亨德拉 病毒、尼帕病毒、及其物种。
本发明的一些实施方案涉及用于治疗来自丝状病毒科、黄病毒科、副粘 病毒科、或披膜病毒科的病毒的病毒感染的组合物和方法。
本发明的一些实施方案涉及用于治疗来自亨尼病毒属、埃博拉病毒属、 黄病毒属、马尔堡病毒属、或甲病毒属的病毒的病毒感染的组合物和方法。
在一些实施方案中，本发明提供了含有以下(实质上由以下组成)的抗病 毒组合物：a)特定强心苷(一种或多种)；b)多种三萜；或c)特定强心苷(一种 或多种)和多种三萜的组合。
本发明的一方面提供了通过向马长期施用抗病毒组合物来治疗马中病 毒感染的方法。通过向马长期施用治疗有效量(治疗相关剂量)的组合物来治 疗马，从而提供与病毒感染相关的症状的减轻或病毒感染的改善。可在感染 后立即开始、或在感染后1天至5天内的任何时间开始、或在病毒感染的明确 诊断后的最早时间开始向马施用组合物。
因此，本发明还提供了用于治疗哺乳动物中病毒感染的方法，所述方法 包括向哺乳动物施用一个或多个治疗有效剂量的抗病毒组合物。一个或多个 剂量基于每天、每周或每月施用。每天可施用一个或多个剂量。
本发明还提供了用于治疗有需要的马中病毒感染的方法，所述方法包括：
确定马是否患有病毒感染；
指示抗病毒组合物的施用；
根据规定的初始给药方案向马施用初始剂量的抗病毒组合物一段时间；
定期确定马对于用抗病毒组合物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当 性；和
如果马的临床反应和/或治疗反应是适当的，则按需继续用抗病毒组合物 的治疗直至达到期望的临床终点；或
如果马的临床反应和/或治疗反应在初始剂量和初始给药方案下不适当， 则递增或递减剂量直至在马中达到期望的临床反应和/或治疗反应。
按需继续对马进行用抗病毒组合物的治疗。可按需调整剂量或给药方案 直至患者达到期望的临床终点(一个或多个)，例如减少或缓和与病毒感染相 关的特定症状。可通过熟悉病毒感染的临床医生来进行临床反应和/或治疗反 应的适当性的确定。
本发明的方法的各个步骤可在分开的设施或同一设施内进行。
抗病毒组合物可长期施用，即以重复方式，例如每天、每隔一天、每两 天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每隔一周、每两周、每三周、 每月、每两个月(bimonthly)、每半个月、每隔一个月、每两个月、每季度、 每隔一个季度、每三个月、季节性地、每半年和/或每年。治疗期为一周或多 周、一个月或多月、一季度或多个季度和/或一年或多年。一天中施用有效剂 量的强心苷一次或多次。
在一些实施方案中，向马施用强心苷140μg至315μg每天。在一些实施方 案中，一个剂量包括20μg至750μg、12μg至300μg、或12μg至120μg的强心苷。 强心苷的日剂量可为20μg至750μg、0.01μg至100mg、或0.01μg至100μg的强 心苷/每天。SCF提取物中存在的夹竹桃苷的推荐日剂量通常为约0.25至50μg 每日两次、或约0.9至5μg每日两次或约每12小时。剂量可为约0.5至约100μg/ 每天、约1至约80μg/每天、约1.5至约60μg/每天、约1.8至约60μg/每天、约1.8 至约40μg/每天。最大耐受剂量可为约100μg/每天、约80μg/每天、约60μg/每天、约40μg/每天、约38.4μg/每天或约30μg/每天的含有夹竹桃苷的夹竹桃提 取物，最小有效剂量可为约0.5μg/每天、约1μg/每天、约1.5μg/每天、约1.8μg/ 每天、约2μg/每天、或约5μg/每天。含有强心苷和三萜的合适剂量可为约 0.05-0.5mg/kg/每天、0.05-0.35mg/kg/每天、0.05-0.22mg/kg/每天、 0.05-0.4mg/kg/每天、0.05-0.3mg/kg/每天、0.05-0.5μg/kg/每天、0.05-0.35μg/kg/ 每天、0.05-0.22μg/kg/每天、0.05-0.4μg/kg/每天、或0.05-0.3μg/kg/每天。
所述抗病毒组合物可全身施用。全身施用的方法包括肠胃外、颊部、肠 内、肌内、皮下、舌下、经口、或口服。所述组合物也可通过注射或静脉内 施用。
如果存在于抗病毒组合物中，强心苷优选夹竹桃苷，但也可包括奥多诺 甙、夹竹桃它罗苷、或夹竹桃苷元。在一些实施方案中，组合物进一步包括： a)一种或多种三萜；b)一种或多种类固醇；c)一种或多种三萜衍生物；d)一种 或多种类固醇衍生物；或e)其组合。在一些实施方案中，组合物包括强心苷 和：a)两种或三种三萜；b)两种或三种三萜衍生物；c)两种或三种三萜盐； 或d)其组合。在一些实施方案中，三萜选自由齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸 及其盐或衍生物组成的组。
本发明的一些实施方案包括其中药物组合物含有至少一种药物赋形剂 和抗病毒组合物的那些。在一些实施方案中，抗病毒组合物包括：a)至少一 种强心苷和至少一种三萜；b)至少一种强心苷和至少两种三萜；c)至少一种 强心苷和至少三种三萜；d)至少两种三萜且不包括强心苷；e)至少三种三萜 且不包括强心苷；或f)至少一种强心苷，例如夹竹桃苷。如本文所使用的， 除非另外指出，通用术语三萜和强心苷也包括其盐和衍生物。
强心苷可在药物组合物中以纯的形式存在或作为含有一种或多种强心 苷的提取物的一部分存在。三萜(一种或多种)可在药物组合物中以纯的形式 存在或作为含有三萜(一种或多种)的提取物的一部分存在。在一些实施方案 中，强心苷在药物组合物中作为主要治疗成分存在，意味着是主要负责抗病 毒活性的成分。在一些实施方案中，三萜(一种或多种)在药物组合物中作为 主要治疗成分(一种或多种)存在，意味着是主要负责抗病毒活性的成分(一种 或多种)。
在一些实施方案中，通过植物材料的提取来获得含有抗病毒组合物的提 取物。提取物可包括植物材料的热水提取物、冷水提取物、超临界流体(SCF) 提取物、有机溶剂提取物、或其组合。在一些实施方案中，植物材料是夹竹 桃属或黄花夹竹桃属(Thevetiaspecies)植物块。特定物种包括夹竹桃或黄花夹 竹桃(Thevetia nerifolia)。在一些实施方案中，提取物包括在提取期间与强心 苷一起获得的至少一种其他药理学活性剂，当向马施用提取物时，其有助于 强心苷的治疗功效。在一些实施方案中，组合物进一步包括一种或多种其他 非强心苷治疗有效剂，即一种或多种不为强心苷的药剂。在一些实施方案中，组合物进一步包括一种或多种抗病毒化合物。在一些实施方案中，抗病毒组 合物不包括药理学活性多糖。
在一些实施方案中，提取物包括一种或多种强心苷和一种或多种强心苷 前体(例如强心甾、强心二内戊酯(cardadienolides)和强心三内戊酯 (cardatrienolides)，其全部为强心苷的糖苷配基成分，例如，洋地黄毒甙、乙 酰洋地黄毒甙、毛地黄毒苷配基、地高辛、乙酰基地高辛、甲地高辛、毒毛 花甙、磁麻苷、哇巴因、或毒毛旋花子甙元)。提取物可进一步包括强心苷 的一种或多种糖基成分(例如葡萄糖苷、果糖苷、和/或葡糖苷酸)作为强心苷 前体。因此，抗病毒组合物可包括一种或多种强心苷和选自由一种或多种糖 苷配基(aglycone)成分和一种或多种糖基(glycone)成分组成的组的两种以上 的强心苷前体。
在一些实施方案中，当比较基于夹竹桃苷含量的等效剂量时，含有夹竹 桃苷(OL)、齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)和白桦脂酸(BA)的组合物比纯夹竹桃 苷更有效。
在一些实施方案中，总三萜含量(OA+UA+BA)与夹竹桃苷的摩尔比的 范围为约15:1至约5:1、或约12:1至约8:1、或约100:1至约15:1、或约100:1至 约50:1、或约100:1至约75:1、或约100:1至约80:1、或约100:1至约90:1、或约 10:1。
在一些实施方案中，单个三萜与夹竹桃苷的摩尔比的范围如下：2-8 (OA):2-8(UA):0.1-1(BA):0.5-1.5(OL)；或3-6(OA):3-6(UA):0.3-8(BA): 0.7-1.2(OL)；或4-5(OA):4-5(UA):0.4-0.7(BA):0.9-1.1(OL)；或4.6(OA): 4.4(UA):0.6(BA):1(OL)。
在一些实施方案中，其他治疗剂不为提取物制备期间得到的多糖，意味 着其不为酸性均聚半乳糖醛酸(homopolygalacturonan)或***半乳糖醛酸(arabinogalaturonan)。在一些实施方案中，提取物不包括其它治疗剂和/或不 包括提取物制备期间得到的均聚半乳糖醛酸或***半乳糖醛酸。
本发明还提供了强心苷在用于治疗马中病毒感染的药物的制备中的用 途。在一些实施方案中，这样的药物的制备包括：提供一种或多种本发明的 抗病毒化合物；包含一个剂量的药物剂型中的抗病毒化合物(一种或多种)； 并且包装药物剂型。在一些实施方案中，可如PCT国际申请号 PCT/US06/29061中所述进行生产。生产还可包括一个或多个附加步骤，例如： 将包装的剂型递送至供应商(零售商、批发商和/或经销商)；向患有病毒感染的马销售或另外提供包装的剂型；包括药物标签和包装说明书，其提供关于 剂型的使用、给药方案、施用、含量和毒理学概况的说明。在一些实施方案 中，病毒感染的治疗包括：确定马患有病毒感染；根据给药方案指示对马的 药物剂型的施用；向马施用一个或多个药物剂型，其中根据给药方案施用所 述一个或多个药物剂型。
药物组合物可进一步包括选自由水溶性(混溶性)共溶剂、水不溶性(不混 溶性)共溶剂、表面活性剂、抗氧化剂、螯合剂、和吸收促进剂组成的组的 至少一种材料的组合。
增溶剂至少是单一表面活性剂，但其可以是材料的组合，例如以下的组 合：a)表面活性剂和水混溶性溶剂；b)表面活性剂和水不混溶性溶剂；c)表 面活性剂、抗氧化剂；d)表面活性剂、抗氧化剂、和水混溶性溶剂；e)表面 活性剂、抗氧化剂、和水不混溶性溶剂；f)表面活性剂、水混溶性溶剂、和 水不混溶性溶剂；或g)表面活性剂、抗氧化剂、水混溶性溶剂、和水不混溶 性溶剂。
药物组合物任选地进一步包括：a)至少一种液体载体；b)至少一种乳化 剂；c)至少一种增溶剂；d)至少一种分散剂；e)至少一种其他赋形剂；或f) 其组合。
在一些实施方案中，水混溶性溶剂是低分子量(小于6000)PEG、乙二醇、 或乙醇。在一些实施方案中，表面活性剂是聚乙二醇化表面活性剂，意味着 表面活性剂含有聚(乙二醇)官能团。
本发明包括本文公开的本发明的方面、实施方案和子实施方案的所有组 合。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分并且描述了要求保护的发明的示例性 实施方案。根据这些附图和本文的描述，本领域技术人员可在无过度实验情 况下实践本发明。
图1-2为描述总结各种组合物针对埃博拉病毒的体外剂量反应抗病毒活 性的图表。
图3-4为描述总结各种组合物针对马尔堡病毒的体外剂量反应抗病毒活 性的图表。
图5为描述总结夹竹桃苷针对Vero E6细胞中寨卡病毒(SIKV PRVABC59 株)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图6为描述地高辛针对Vero E6细胞中寨卡病毒(SIKV PRVABC59株)的体 外剂量反应抗病毒活性的图表。
图7为描述总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6 细胞中埃博拉病毒的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图8为描述总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6 细胞中马尔堡病毒的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
图9为描述总结在存在各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)的情 况下，Vero E6细胞的体外细胞存活率的图表。
图10A和10B为描述总结在暴露于病毒后不久，组合物(夹竹桃苷和 PBI-05204)抑制Vero E6细胞中埃博拉病毒的能力的图表：图10A–感染后2 小时；图10B–感染后24小时。
图11A和11B为描述总结在暴露于病毒后不久，组合物(夹竹桃苷和 PBI-05204)抑制Vero E6细胞中马尔堡病毒的能力的图表：图11A–感染后2 小时；图11B–感染后24小时。
图12A和12B为描述总结组合物(夹竹桃苷和PBI-05204)通过已暴露于夹 竹桃苷的病毒感染的Vero E6细胞来抑制传染性子代产物的能力的图表：图 12A–埃博拉病毒；图12B–马尔堡病毒。
图13A和13B为描述总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针 对VeroE6细胞中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(图13A)和西部马脑脊髓炎病毒 (图13B)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。
具体实施方式
本发明提供了通过向马长期施用有效剂量的抗病毒组合物(或含有抗病 毒组合物和至少一种药物赋形剂的药物组合物)来治疗马中病毒感染的方法。 根据最适合马的给药方案施用药物组合物，根据常规临床实践和病毒感染的 临床治疗终点可确定剂量和给药方案的适合性。
如本文所使用的，术语“马”用于指温血动物如哺乳动物，例如，猫、狗、 小鼠、豚鼠、马、牛、绵羊、和人类。
如本文所使用的，具有病毒感染风险的马为：a)居住在特别是伊蚊(Aedesspecie)(埃及伊蚊(Aedes egypti)、白纹伊蚊(Aedes albopictus))等蚊子生活的地 理区域中的马；b)与具有病毒感染的人居住在一起或附近的马；c)与具有病 毒感染的人存在性关系的马；d)居住在特别是硬蜱(Ixodes specie)(马科斯硬蜱 (Ixodes marx)、肩突硬蜱(Ixodes scapularis)、或考克硬蜱(Ixodes cooke))等蜱 生活的地理区域的马；e)居住在果蝠生活的地理区域的马；f)居住在热带地 区的马；g)居住在非洲的马；h)接触具有病毒感染的其他马的体液的马；i) 儿童；或j)免疫***低下的马。在一些实施方案中，马为女性、能够怀孕的 女性、或怀孕的女性。
根据本发明治疗的马将表现治疗反应。“治疗反应”是指作为用强心苷治 疗的结果，患有病毒感染的马将享受以下临床受益的至少一种：马血液或血 浆中的活病毒滴度的降低，马血液或血浆中的活病毒的根除，感染的改善， 与感染相关的症状的发生的减少，感染的部分或全部缓解或感染进展时间增 加。治疗反应可为全部或部分治疗反应。
如本文所使用的，“进展时间”是确诊(或治疗)病毒感染后直至感染开始 恶化的时段、长度或持续时间。这是其间维持感染水平而无进一步的感染进 展的时间段，并且该时间段在感染再次开始进展时结束。通过在治疗开始之 前或开始时，将遭受感染的马“分阶段”来确定疾病的进展。例如，在治疗开 始之前或开始时确定马的健康。然后用强心苷治疗马，并定期地监测病毒滴 度。在稍后的时间点，感染的症状可能恶化，由此标记感染的进展和“进展 时间”的结束。期间感染不发展或感染的水平或严重程度没有恶化的时间段 就是“进展时间”。
给药方案包括根据给药计划施用的治疗相关剂量(或有效剂量)的一种或 多种强心苷。因此，治疗相关剂量是其中观察到病毒感染对抗病毒组合物治 疗的治疗反应、并且可向马施用抗病毒组合物而没有过量的不需要的或有害 的副作用的治疗剂量。治疗相关剂量对于马是非致死的，尽管其在患者中可 能导致一些副作用。其是其中对于施用抗病毒组合物的马的临床受益水平超 过由于抗病毒组合物或其组分(一种或多种)的施用而导致马经历的有害副作 用水平的剂量。根据各种确立的药理学、药效学和药代动力学原理，治疗相 关剂量在不同马中变化。然而，治疗相关剂量(例如相对于夹竹桃苷)通常不 超过25μg、100μg、250μg、500μg或750μg的强心苷/每天，或者其可在每剂 量25-750μg强心苷的范围中。根据药剂学的基础原理，本领域中已知在马中 提供目标治疗结果所需的抗病毒组合物的实际量可在不同马中变化。
可根据通常用于病毒感染治疗的任何给药方案来施用治疗相关剂量。治 疗相关剂量可每天一次、两次、三次或多次施用。其可以每隔一天、每三天、 每四天、每五天、每半周、每周、每两周、每三周、每四周、每月、每两个 月(bimonthly)、每半月、每三个月、每四个月、每半年、每年，或根据上述 的任何组合来施用以达到合适的给药计划。例如，治疗相关剂量可以在一周 或多周内每天一次或多次施用。
实施例15提供了体外试验的详细描述，所述试验用于评价含有夹竹桃苷 (作为唯一活性的)、Anvirzel和PBI-05204(夹竹桃的超临界流体(SCF)提取物) 的组合物对埃博拉病毒(图1-2)和马尔堡病毒(图3-4)感染的治疗的功效，埃博 拉病毒和马尔堡病毒都为丝状病毒。
通过将组合物以40μg/mL添加至细胞，然后添加病毒并培养1小时来设置 实验。将病毒添加至细胞时，组合物的最终浓度为20μg/mL。根据其含有的 夹竹桃苷的浓度，可调节含有不同量的夹竹桃苷的组成，并转换为摩尔浓度。 图1-4描述了基于提取物的夹竹桃苷含量的功效。OL自身就是有效的。作为 含有OL、OA、UA和BA的夹竹桃的SCF提取物的PBI-05204实质上比OL自身 更有效。作为夹竹桃的热水提取物的Anvirzel比OL自身更有效。两种提取物 在纳摩尔范围中清楚地表现功效。PBI-05204提取物中的夹竹桃苷的百分比(1.74％)比Anvirzel中的(0.459％，4.59μg/mg)更高。在PBI-05204的最高剂量下， 其完全抑制EBOV和MARV感染，然而Anvirzel不表现完全抑制，因为在高于 20μg/mL剂量的Anvirzel下，观察到毒性。数据说明PBI-05204具有针对埃博 拉病毒和马尔堡病毒的最高抗病毒活性。PBI-05204中的三萜的组合增加了 夹竹桃苷的抗病毒活性。
实施例6提供了体外试验的详细描述，所述试验用于评价强心苷治疗寨 卡病毒(一种黄病毒)感染的功效。在存在夹竹桃苷(图5)或地高辛(图6)的情况 下，以0.2的MOI用Zika病毒(ZIKV PRVABC59株)感染Vero E6细胞。用病毒 和强心苷培养细胞1小时，然后去除接种物和未吸收的强心苷(如果存在)。在 新鲜培养基中浸渍细胞并且培养48小时，然后用***固定细胞并且对于 ZIKV感染染色。数据说明两种强心苷具有针对寨卡病毒的抗病毒活性；然 而，夹竹桃苷表现比地高辛更高(几乎大8-倍)的抗病毒活性。
实施例14提供了用于评价试验组合物针对寨卡病毒和登革热病毒的抗 病毒活性的试验的详细描述。数据说明夹竹桃苷显示针对寨卡病毒和登革热 病毒的功效。
图7为总结各种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6细胞 中埃博拉病毒(EBOV)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。图8为描述总结各 种组合物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6细胞中马尔堡病毒 (MARV)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。图9为描述总结在存在各种组合 物(夹竹桃苷、地高辛和PBI-05204)的情况下，Vero E6细胞的体外细胞存活 率的图表。对于图7-8，，将宿主细胞在用病毒感染之前暴露于组合物。在存 在夹竹桃苷、地高辛或PBI-05204(一种含夹竹桃苷的植物提取物)的情况下， 用EBOV/Kik(图7，MOI＝1)或MARV/Ci67(图8，MOI＝1)感染Vero E6细胞。1 小时后，去除接种物和组合物并向细胞添加新鲜培养基。48小时后，固定细 胞并且免疫染色来检测用EBOV或MARV感染的细胞。使用Operetta计数感染 的细胞。
为了确保在抗病毒活性方面没有观察到假阳性，测试在组合物存在的情 况下的细胞存活率。对于图9中的数据，用上述化合物处理Vero E6细胞。通 过CellTiter-Glo测量ATP水平作为细胞存活率的测定。已确定夹竹桃苷、地高 辛、和PBI-05204不降低细胞存活率，意味着在本文其他附图中详述的抗病 毒活性不是由于单个化合物的细胞毒性导致的假阳性。
因此，本发明提供了治疗哺乳动物或宿主细胞中病毒感染的方法，所述 方法包括：在染上所述病毒感染之前，向哺乳动物或宿主细胞施用抗病毒组 合物，从而在所述哺乳动物或宿主细胞被病毒感染时，抗病毒组合物降低病 毒滴度并且改善、降低或消除病毒感染。
本发明的抗病毒组合物和方法在治疗在施用抗病毒组合物前发生的病 毒感染方面也是有用的。用EBOV(图10A、10B)或MARV(图11A、11B)感染 Vero E6细胞。在感染后2小时(图10A、11A)或感染后24小时(图10B、11B)， 向细胞添加夹竹桃苷或PBI-05204 1小时，然后丢弃，并且将细胞返回至培养 基。
图10A和10B描述了总结在暴露于病毒后不久，组合物(夹竹桃苷和 PBI-05204)抑制Vero E6细胞中埃博拉病毒的能力的图表：图10A–感染后2 小时；图10B–感染后24小时。当在病毒感染后2小时内(或在长达12小时内) 施用抗病毒组合物时，抗病毒组合物提供有效治疗并且降低EBOV病毒滴度。 即使在24小时后，病毒组合物也是有效的；然而，其功效随着初始病毒感染 后时间的增加而降低。对MARV进行相同的评价。图11A和11B描述了总结在暴露于病毒后不久，组合物(夹竹桃苷和PBI-05204)抑制Vero E6细胞中马尔 堡病毒的能力的图表：图11A–感染后2小时；图11B–感染后24小时。当在 病毒感染后2小时内(或在长达12小时内)施用抗病毒组合物时，抗病毒组合物 提供有效治疗并降低MARV病毒滴度。即使在24小时后，病毒组合物也是有 效的；然而，其功效随着初始病毒感染后时间的增加而降低。
考虑到本发明的组合物的抗病毒能力对于病毒感染细胞的单代为降低 的，例如在感染后24小时内，我们评价了抗病毒组合物是否能够抑制病毒增 殖，意味着抑制传染性后代的产生。在存在夹竹桃苷或PBI-05204的情况下， 用EBOV或MARV感染Vero E6细胞，并且培养48小时。将来自感染细胞培养 基的上清液传递至新鲜Vero E6细胞，培养1小时，然后丢弃。培养含有传递 的上清液的细胞48小时。如本文所述评价用EBOV(B)或MARV(C)感染的细 胞。EBOV的对照感染率为66％，MARV的对照感染率为67％。本发明的抗 病毒组合物抑制传染性后代的产生。
因此，本发明的抗病毒组合物：a)可在病毒感染前预防性地施用以在暴 露于病毒后抑制病毒感染；b)可在病毒感染后施用以抑制或降低病毒复制以 及传染性后代的产生；或c)a)和b)的组合。
使用Vero E6细胞中的VEE病毒和WEE病毒来评价抗病毒组合物针对披 膜病毒科甲病毒的抗病毒活性。图13A和13B描述了总结各种组合物(夹竹桃 苷、地高辛和PBI-05204)针对Vero E6细胞中委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(图13A) 和西部马脑脊髓炎病毒(图13B)的体外剂量反应抗病毒活性的图表。在存在 或不存在指示化合物的情况下，用委内瑞拉马脑炎病毒(图13A，MOI＝0.01) 或西部马脑炎病毒(图13B，MOI＝0.1)感染Vero E6细胞18小时。如前所述检 测感染的细胞并在Operetta上计数。已发现本发明的抗病毒组合物是有效的。
因此，本发明提供了治疗马或宿主细胞中由丝状病毒科病毒、黄病毒科 病毒或披膜病毒科的病毒导致的病毒感染的方法，所述方法包括施用有效量 的抗病毒组合物，从而将病毒暴露于抗病毒组合物并治疗所述病毒感染。
针对鼻病毒(rhinovirus)感染评价了本文所述组合物的抗病毒活性。鼻病 毒属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae family)和肠病毒属(Enterovirus genus)。其是无包膜的并且是(+)极性的ss-RNA病毒。在本文采用的浓度和试 验中，已发现夹竹桃苷针对鼻病毒是无活性的。
PBI-05204(如本文和Addington的US 8187644 B2(2012年5月29日发布)、Addington的US 7402325 B2(2008年7月22日发布)、Addington等人的US 8394434B2(2013年3月12日发布)中所描述的，其全部公开内容通过引用结 合在此)包括强心苷(夹竹桃苷，OL)和三萜(齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)和白 桦脂酸(BA))作为主要药理学活性组分。OL与全部三萜的摩尔比为约 1:(10-96)。OA:UA:BA的摩尔比为约7.8:7.4:1。当基于等摩尔OL进行比较时， PBI-05204中的OA、UA和BA的组合增加了夹竹桃苷的抗病毒活性。 PBI-04711是PBI-05204的一部分，但其不含有强心苷(OL)。PBI-04711中的 OA:UA:BA的摩尔比为约3:2.2:1。PBI-04711也具有抗病毒活性。因此，基于 等摩尔含量的OL，含有OL、OA、UA、和BA的抗病毒组合物比含有OL作为 唯一活性成分的组合物更有效。在一些实施方案中，单个三萜与夹竹桃苷的 摩尔比范围如下：2-8(OA):2-8(UA):0.1-1(BA):0.5-1.5(OL)；或3-6(OA):3-6(UA):0.3-8(BA):0.7-1.2(OL)；或4-5(OA):4-5(UA):0.4-0.7(BA): 0.9-1.1(OL)；或4.6(OA):4.4(UA):0.6(BA):1(OL)。
含有夹竹桃苷作为唯一抗病毒剂的抗病毒组合物在本发明的范围内。
含有夹竹桃苷和多种三萜作为抗病毒剂的抗病毒组合物在本发明的范 围内。在一些实施方案中，抗病毒组合物含有夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离 酸、盐、衍生物或前药)、熊果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)、和白桦脂 酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)。化合物的摩尔比如本文所述。
含有多种三萜作为主要活性成分(意味着不包含类固醇、强心苷和药理 学活性组分)的抗病毒组合物也在本发明的范围内。如上所述，PBI-04711包 含OA、UA和BA作为主要活性成分，并且其表现抗病毒活性。在一些实施方 案中，基于三萜的抗病毒组合物包含OA、UA和BA，其在每次出现时各自独 立地选自其游离酸形式、盐形式、氘化形式和衍生物形式。
PBI-01011是含有OA、UA和BA的、改善的基于三萜的抗病毒组合物， 其中OA:UA:BA的摩尔比为约9-12:高达约2:高达约2、或约10:约1:约1、或约 9-12:约0.1-2:约0.1-2、或约9-11:约0.5-1.5:约0.5-1.5、或约9.5-10.5:约0.75-1.25: 约0.75-1.25、或约9.5-10.5:约0.8-1.2:约0.8-1.2、或约9.75-10.5:约0.9-1.1:约 0.9-1.1。
在一些实施方案中，抗病毒组合物至少包括以本文所述的OA与UA的摩 尔比存在的、齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和熊果酸(其游离酸、 盐、衍生物或前药)。OA以超过UA的大摩尔过量存在。
在一些实施方案中，抗病毒组合物至少包括以本文所述的OA与BA的摩 尔比存在的、齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)和白桦脂酸(其游离酸、 盐、衍生物或前药)。OA以超过BA的大摩尔过量存在。
在一些实施方案中，抗病毒组合物至少包括以本文所述的OA与UA对 BA的摩尔比存在的、齐墩果酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)、熊果酸(其 游离酸、盐、衍生物或前药)和白桦脂酸(其游离酸、盐、衍生物或前药)。OA 以超过UA和BA两者的大摩尔过量存在。
在一些实施方案中，基于三萜的抗病毒组合物不包含强心苷。
通常，如下所述治疗患有丝状病毒科感染、黄病毒科感染或披膜病毒科 感染的马。评价马来确定所述马是否被所述病毒感染。指示抗病毒组合物的 施用。根据指定的给药方案向马施用初始剂量的抗病毒组合物一段时间(一 个治疗期)。定期确定马的临床反应和治疗反应水平。如果治疗反应水平在 一个剂量下过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至实现在马 中期望的治疗反应水平。按需继续对马进行抗病毒组合物的治疗。可按需调 节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点(一个或多个)，例如感染自 身的中止、感染相关症状的减少、和/或感染的进展的减少。
如果临床医生打算用抗病毒组合物和一种或多种其他治疗剂的组合来 治疗患有病毒感染的马，并且已知马患有的病毒感染对所述一种或多种其他 治疗剂的治疗具有至少部分地治疗反应，则本方法发明包括：向有需要的马 施用治疗相关剂量的抗病毒组合物和治疗相关剂量的所述一种或多种其他 治疗剂，其中根据第一给药方案施用抗病毒组合物并且根据第二给药方案施 用一种或多种其他治疗剂。在一些实施方案中，第一和第二给药方案是相同 的。在一些实施方案中，第一和第二给药方案是不同的。
本发明的抗病毒组合物(一种或多种)可作为主要抗病毒疗法、辅助抗病 毒疗法、或联合抗病毒疗法来施用。本发明的方法包括抗病毒组合物与至少 一种其他已知抗病毒组合物的分开施用或共同施用，意味着本发明的抗病毒 组合物可在已知抗病毒组合物(化合物(一种或多种))或用于治疗病毒感染相 关症状的组合物的施用之前、期间或之后施用。例如，用于治疗炎症、呕吐、 恶心、头痛、发热、腹泻、恶心、荨麻疹、结膜炎、身体不适、肌肉痛、关 节痛、癫痫、或***药物可与本发明的抗病毒组合物一起施用或分开施用。
一个或多个其他治疗剂可以以临床医生公认的治疗有效的剂量和给药 方案或临床医生公认的亚治疗有效的剂量施用。通过抗病毒组合物和一种或 多种其他治疗剂的组合的施用来提供的临床受益和/或治疗效果可为累加的 或协同的，这种受益或效果的水平可通过比较组合施用与单独的抗病毒组合 物组分(一种或多种)以及一种或多种其他治疗剂的施用来确定。可以以美国 食品药品监督管理局、世界卫生组织、欧洲药品管理局(E.M.E.A.)、药物管 理局(TGA，澳大利亚)、泛美卫生组织(PAHO)、药品和医疗器械安全管理局 (Medsafe，新西兰)或各种世界***门推荐或描述的剂量和给药方案来施用 一种或多种其他治疗剂。
实施例5提供了哺乳动物中寨卡病毒的治疗的示例性过程。实施例12提 供了哺乳动物中丝状病毒感染(埃博拉病毒、马尔堡病毒)的治疗的示例性过 程。图13提供了哺乳动物中黄病毒感染(黄热病、登革热、日本脑炎、西尼 罗病毒、寨卡病毒、蜱媒脑炎、科萨努尔森林病、Alkhurma症、鄂木斯克出 血热、波瓦生病毒感染)的治疗的示例性过程。
存在于药物组合物中的抗病毒化合物(一种或多种)(三萜(一种或多种)、 强心苷(一种或多种)，等)可以其未修饰形式、盐形式、衍生物形式或其组合 存在。如本文所使用的，术语“衍生物”是指：a)与第一化学物质结构上相关 并且理论上可衍生自其的化学物质；b)如果第一化合物的一个原子被另一 个原子或原子团取代，则为由相似第一化合物形成的化合物或可想象成由另 一个第一化合物产生的化合物；c)由母体化合物衍生或获得的并且含有母体 化合物的基本元素的化合物；或d)通过一个或多个步骤从相似结构的第一化 合物产生的化学化合物。例如，衍生物可包括其氘化形式、氧化形式、脱水 的、不饱和的、聚合物共轭的或糖基化形式，或可包括其酯、酰胺、内酯、 同系物、醚、硫醚、氰基、氨基、烷基氨基、硫氢基、杂环、稠合杂环、聚 合、聚乙二醇化、亚苄基、***基、哌嗪基或氘化形式。
如本文所使用的，除非另外指出，术语“夹竹桃苷”是指夹竹桃苷的所有 已知形式。夹竹桃苷可以外消旋的、光学纯的或光学富集的形式存在。可从 例如AldridgeNursery(Atascosa,Texas)等商业植物供应商处获得夹竹桃植物 材料。
可以如US 7,402,325、US 8394434、US 8187644、或PCT国际公开号WP 2007/016176A2中所述制备超临界流体(SCF)提取物，其全部公开内容通过引 用结合在此。可以在存在或不存在例如乙醇等改性剂(有机溶剂)的情况下， 用超临界二氧化碳进行提取。
其他含有强心苷、特别是夹竹桃苷的提取物可通过各种不同的工艺制备。 可通过Huseyin Ziya Ozel博士(美国专利号5,135,745)开发的工艺来制备提取 物，其描述了用于制备热水提取物的过程。据报道，水性提取物含有分子量 在2KD至30KD变化的多种多糖、夹竹桃苷和夹竹桃苷元、奥多诺甙和夹竹 桃它罗苷。据报道，多糖包括酸性均聚半乳糖醛酸或***半乳糖醛酸。 Selvaraj等人的美国专利号5,869,060公开了夹竹桃属的热水提取物及其生产 方法，例如实施例2。然后冻干所得提取物来产生粉末。美国专利号6,565,897 (Selvaraj等人的美国早期公开号20020114852和PCT国际公开号WO 2000/016793)公开了用于制备基本上无菌的提取物的热水提取工艺。 Erdemoglu等人(J.Ethnopharmacol.(2003)十一月.89(1),123-129)公开了基 于其镇痛和抗炎活性，包括夹竹桃的植物的水性和乙醇提取物的比较结果。 Adome等人(Afr.Health Sci.(2003)八月.3(2),77-86；乙醇提取物)、el-Shazly 等人(J.Egypt Soc.Parasitol.(1996),八月.26(2),461-473；乙醇提取物)、 Begum等人(Phytochemistry(1999)二月.50(3),435-438；甲醇提取物)、Zia 等人(J.Ethnolpharmacol.(1995)十一月.49(1),33-39；甲醇提取物)、和 Vlasenko等人(Farmatsiia.(1972)九月-十月.21(5),46-47；醇提取物)公开了 夹竹桃苷的有机溶剂提取物。Singh等人的美国早期专利申请公开号(U.S. Pregrant Patent ApplicationPublication No.)20040247660公开了用于癌症治疗 的夹竹桃苷的蛋白质稳定的脂质体制剂(protein stabilized liposomal formulation)的制备。Singh等人的美国早期专利申请公开号20050026849公开 了含有环糊精的夹竹桃苷的水溶性制剂。Singh等人的美国早期专利申请公 开号20040082521公开了来自热水提取物的夹竹桃苷的蛋白质稳定的纳米颗 粒制剂的制备。
提取物的多糖和碳水化合物的含量也不同。相对于用葡萄糖制作的标准 曲线，热水提取物含有407.3葡萄糖当量单位的碳水化合物，而SCF CO2提取 物的分析发现了以低于定量限的非常低的水平发现的碳水化合物。然而，夹 竹桃的热水提取物中的碳水化合物的量比SCF CO2提取物中的碳水化合物的 量高至少100倍。SCF提取物的多糖含量可为0重量％、<0.5重量％、<0.1重量％、 <0.05重量％、或<0.01重量％。在一些实施方案中，SCF提取物不包括在植物 块的提取期间得到的多糖。
Figure BDA0003242244600000221
通过JEOL AccuTOF-DART质谱仪(JEOL USA,Peabody,MA,USA)上 DART TOF-MS(实时飞行时间质谱仪中的直接分析，Direct Analysis in Real Time Time of FlightSpectrometry)来确定SCF CO2提取物和热水提取物的部 分组分。
夹竹桃属或黄花夹竹桃属的SCF提取物是例如夹竹桃苷和三萜等药理 学活性化合物的混合物。通过SCF工艺得到的提取物在环境温度下为基本上 水不溶的、粘性半固体(在去除溶剂后)。SCF提取物包括许多具有各种不同 水溶性范围的不同组分。来自超临界流体工艺的提取物含有以重量计理论范 围为0.9重量％至2.5重量％的夹竹桃苷、或1.7重量％至2.1重量％的夹竹桃苷、 或1.7重量％至2.0重量％的夹竹桃苷。已得到包含不同量的夹竹桃苷的SCF提 取物。在一个实施方案中，SCF提取物包含约2重量％的夹竹桃苷。与热水提 取物相比，SCF提取物含有3-10倍更高浓度的夹竹桃苷。这由HPLC以及 LC/MS/MS(串联质谱)分析证实。
SCF提取物包含夹竹桃苷和三萜齐墩果酸、白桦脂酸和熊果酸以及任选 地本文所述的其他组分。夹竹桃苷和三萜的含量可在批次之间不同；然而， 变化程度不可过度。例如，针对一批SCF提取物(PBI-05204)分析这四种组分， 发现每种的如下近似量。
Figure BDA0003242244600000231
WRT表示“相对于”。
相对于指定的值，各个组分的含量可以±25％、±20％、±15％、±10％或±5％变化。因此，SCF提取物中的夹竹桃苷的含量范围可为：每mg SCF提取物为 20mg±5mg(其为20mg的±25％)。
夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸及其衍生物也可购自 Sigma-Aldrich(www.sigmaaldrich.com；St.Louis,MO,USA)。
如本文所使用的，单独命名的三萜可在每次出现时独立地选自其天然 (未修饰、游离酸)形式、其盐形式、衍生物形式、前药形式、或其组合。含 有氘化形式的三萜的组合物和采用氘化形式的三萜的方法也在本发明的范 围内。
齐墩果酸衍生物、前药和盐在以下文献中公开：Gribble等人的US 20150011627A1(2015年1月8日出版)、Rong等人的US 20140343108 A1(2014 年11月20日出版)、Xu等人的US 20140343064 A1(2014年11月20日出版)、 Anderson等人的US 20140179928 A1(2014年6月26日出版)、Bender等人的US 20140100227 A1(2014年4月10日出版)、Jiang等人的US20140088188 A1 (2014年3月27日出版)、Jiang等人的US 20140088163 A1(2014年3月27日出版)、 Jiang等人的US 20140066408 A1(2014年3月6日出版)、Anderson等人的US20130317007 A1(2013年11月28日出版)、Gribble等人的US 20130303607 A1 (2013年11月14日出版)、Anderson等人的US 20120245374(2012年9月27日出 版)、Jiang等人的US20120238767 A1(2012年9月20日出版)、Shode等人的US 20120237629 A1(2012年9月20日出版)、Anderson等人的US 20120214814 A1 (2012年8月23日出版)、Lee等人的US20120165279 A1(2012年6月28日出版)、 Arntzen等人的US 20110294752 A1(2011年12月1日出版)、Majeed等人的US 20110091398 A1(2011年4月21日出版)、Arntzen等人的US20100189824 A1 (2010年7月29日出版)、Jiang等人的US 20100048911 A1(2010年2月25日出版)、 和Arntzen等人的US 20060073222 A1(2006年4月6日出版)，其全部公开内容 通过引用结合在此。
熊果酸衍生物、前药和盐在以下文献中公开：Gribble等人的US 20150011627 A1(2015年1月8日出版)、Gribble等人的US 20130303607 A1 (2013年11月14日出版)、Yoon等人的US 20150218206 A1(2015年8月6日出版)、 Fritsche等人的US 6824811(2004年11月30日公布)、Ochiai等人的US 7718635 (2010年5月8日公布)、Lin等人的US 8729055(2014年5月20日公布)、和Yoon 等人的US 9120839(2015年9月1日公布)，其全部公开内容通过引用结合在此。
白桦脂酸衍生物、前药和盐在以下文献中公开：Gribble等人的US 20150011627A1(2015年1月8日出版)、Gribble等人的US 20130303607 A1 (2013年11月14日出版)、Shode等人的US 20120237629 A1(2012年9月20日出 版)、Regueiro-Ren等人的US20170204133 A1(2017年7月20日出版)、Nitz等 人的US 20170096446 A1(2017年4月6日出版)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20150337004 A1(2015年11月26日出版)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20150119373 A1(2015年4月30日出版)、Yan等人的US20140296546 A1(2014 年10月2日出版)、Swidorski等人的US 20140243298 A1(2014年8月28日出版)、 Parthasaradhi Reddy等人的US 20140221328 A1(2014年8月7日出版)、Leunis 等人的US 20140066416 A1(2014年3月6日出版)、Durst等人的US 20130065868 A1(2013年3月14日出版)、Regueiro-Ren等人的US 20130029954 A1(2013年1月31日出版)、Zhang等人的US 20120302530 A1(2012年11月29 日出版)、Power等人的US 20120214775A1(2012年8月23日出版)、Honda等 人的US 20120101149 A1(2012年4月26日出版)、Bullock等人的US 20110224182(2011年9月15日出版)、Hemp等人的US 20110313191 A1(2011 年12月22日出版)、Pichette等人的US 20110224159 A1(2011年9月15日出版)、Parthasaradhi Reddy等人的US 20110218204(2011年9月8日出版)、Safe等人的 US20090203661 A1(2009年8月13日出版)、Krasutsky等人的US 20090131714 A1(2009年5月21日出版)、Krasutsky等人的US 20090076290(2009年3月19日 出版)、Leunis等人的US20090068257 A1(2009年3月12日出版)、Mukherjee 等人的US 20080293682(2008年11月27日出版)、Pezzuto等人的US 20070072835 A1(2007年3月29日出版)、Jansen等人的US20060252733 A1 (2006年11月9日出版)、和O’Neill等人的US 2006025274 A1(2006年11月9日出 版)，其全部公开内容通过引用结合在此。
抗病毒组合物可以以任何合适的药学上可接受的剂型配制。肠胃外、耳、 眼、鼻、可吸入的、颊部、舌下、肠内、局部的、口服、经口、以及可注射 剂型是特别有用的。特定剂型包括固体或液体剂型。示例性合适的剂型包括 片剂、胶囊、丸剂、囊片、锭剂、冲剂、溶液、混悬剂、分散剂、小瓶、袋、 瓶、可注射液体、i.v.(静脉内)、i.m.(肌肉内)或i.p.(腹腔内)可施用的液体和 药学领域普通技术人员已知的其他此类剂型。
可通过将抗病毒组合物和药学上可接受的赋形剂混合来制备含有抗病 毒组合物的合适的剂型，如本文或以下文献中所述：Pi等人(“熊果酸纳米晶 体的溶出度和生物利用度的提高：不同粒径的影响(Ursolic acid nanocrystals for dissolution rate andbioavailability enhancement:influence of different particle size)”，Curr.DrugDeliv.(Mar 2016),13(8),1358-1366)、Yang等人(“用 于改善齐墩果酸的口服生物利用度的自微乳化药物递送***：设计和评价 (Self-microemulsifying drug delivery systemfor improved oral bioavailability of oleanolic acid:design and evaluation)”，Int.J.Nanomed.(2013),8(1), 2917-2926)、Li等人(“通过湿式球磨法制备的优化的蔗糖酯稳定的齐墩果酸 纳米悬浮液的研发和评价与实验设计(Development and evaluationof optimized sucrose ester stabilized oleanolic acid nanosuspensions preparedby wet ball milling with design of experiments)”，Biol.Pharm.Bull.(2014),37(6), 926-937)、Zhang等人(“通过脂质纳米球增强三萜的口服生物利用度：制备、 表征和吸收评价(Enhancement of oral bioavailability of triterpene through lipidnanospheres:preparation,characterization,and absorption evaluation)”，J.Pharm.Sci.(June 2014),103(6),1711-1719)、Godugu等人(“新型抗癌药物小檗碱和白 桦脂酸的口服生物利用度改善方法(Approaches to improve the oral bioavailability andeffects of novel anticancer drugs berberine and betulinic acid)”，PLoS One(Mar2014),9(3):e89919)、Zhao等人(“通过抗溶剂沉淀的口 服降血糖药白桦素纳米颗粒的制备及其表征(Preparation and characterization of betulin nanoparticles for oralhypoglycemic drug by antisolvent precipitation)”， Drug Deliv.(Sep 2014),21(6),467-479)、Yang等人(“使用超临界抗溶剂(SAS) 工艺的熊果酸纳米颗粒的理化性质和口服生物利用度(Physicochemical properties and oral bioavailability of ursolicacid nanoparticles using supercritical anti-solvent(SAS)process)”，Food Chem.(May 2012),132(1),319-325)、Cao 等人(“齐墩果酸的乙二醇连接的氨基酸二酯前药用于PEPT1介导的运输：合 成、肠道通透性和药代动力学(Ethylene glycol-linked aminoacid diester prodrugs of oleanolic acid for PEPT1-mediated transport:synthesis,intestinal permeability and pharmacokinetics)”，Mol.Pharm.(Aug.2012),9(8), 2127-2135)、Li等人(“齐墩果酸的蔗糖酯稳定的纳米悬浮液的制剂、生物学 和药代动力学研究(Formulation,biological and pharmacokinetic studies ofsucrose ester-stabilized nanosuspensions of oleanolic acid)”，Pharm.Res.(Aug2011),28(8),2020-2033)、Tong等人(“用聚乙烯吡咯烷酮和癸酸钠喷雾冷冻干 燥以改善齐墩果酸(BCS IV类化合物)的溶解度和口服生物利用度(Spray freeze drying withpolyvinylpyrrolidone and sodium caprate for improved dissolution and oralbioavailablity of oleanolic acid,a BCS Class IV compound)”，Int.J.Pharm.(Feb2011),404(1-2),148-158)、Xi等人(“齐墩果 酸的自纳米乳化给药***的制剂开发和生物利用度评价(Formulation development and bioavailability evaluation of a self-nanoemulsified drug delivery system of oleanolic acid)”，AAPS PharmSciTech(2009),10(1), 172-182)、Chen等人(“齐墩果酸纳米悬浮液：制备、体外表征和增强的肝保护作用(Oleanolic acid nanosuspensions:preparation,in-vitro characterizationand enhanced hepatoprotective effect)”，J.Pharm.Pharmacol.(Feb 2005),57(2),259-264)，其全部公开内容通过引用结合在此。
还可根据Addington的US 8187644 B2(2012年5月29日公开)、Addington 的US7402325 B2(2008年7月22日公开)、Addington等人的US 8394434 B2 (2013年3月12日公开)来制备合适的剂型，其全部内容通过引用结合在此。还 可如实施例13-15中所述制备合适的剂型。
特别考虑了抗病毒化合物(强心苷、三萜或其组合)的有效量或治疗相关 量。术语“有效量”应理解为预期的药学有效量。药学有效量是足以用于所需 或期望的治疗反应的活性成分的量(amount)或量(quantity)，或换言之，当向 患者施用时足以产生可觉察的生物反应的量。可觉察的生物反应可作为活性 物质的单一或多个剂量的施用结果而产生。一个剂量可包括一种或多种剂型。 应理解的是，任何患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括治疗的适应 症、适应症的严重程度、患者健康、年龄、性别、体重、饮食、药理反应、采用的特定剂型、和其他此类因素。
口服施用的期望剂量为至多5剂型，尽管少至1个和多至10个剂型可作为 单一剂量施用。示例性剂型可包括每剂型0.01-100mg或0.01-100μg的抗病毒 组合物，每剂量总计0.1至500mg(1至10剂量水平)。将根据可预先确定的和/ 或定制的以在马中实现特定治疗反应或临床受益的给药方案来施用剂量。
强心苷可以以足以向马提供20至100μg、12μg至300μg、或12μg至120μg 的初始剂量的夹竹桃苷的量存在于剂型中。剂型可包括20至100μg的夹竹桃 苷、0.01μg至100mg或0.01μg至100μg夹竹桃苷、夹竹桃苷提取物或含有夹竹 桃苷的夹竹桃的提取物。
抗病毒剂可包含在口服剂型中。剂型的一些实施方案为没有肠溶衣的并 且在0.5至1小时或更短的时间内释放其携带的抗病毒组合物。剂型的一些实 施方案为有肠溶衣的并且例如从空肠、回肠、小肠、和/或大肠(结肠)等胃的 下游释放其携带的抗病毒组合物。有肠溶衣的剂型将在口服给药后1-10小时 内将抗病毒组合物释放至体循环。
抗病毒组合物可以包含在快速释放、立即释放、受控释放、缓释、延长 释放、延迟释放、突释、连续释放、缓慢释放、或脉冲释放剂型中、或在表 现这些释放类型的两种以上的剂型中。来自剂型的抗病毒组合物的释放曲线 可为零阶、伪零阶、一阶、伪一阶或S型释放曲线。在其中施用抗病毒组合 物的马中的三萜的血浆浓度曲线可表现一个或多个极大值(maxima)。
基于人类临床数据，预期夹竹桃苷的施用剂量的50％至75％将是口服生 物可利用的，因此提供每剂型10至20μg、20至40μg、30至50μg、40至60μg、 50至75μg、75至100μg的夹竹桃苷。考虑到成年人的平均血容量为5升，预期 的夹竹桃苷的血浆浓度将在0.05至2ng/ml、0.005至10ng/ml、0.005至8ng/mL、 0.01至7ng/mL、0.02至7ng/mL、0.03至6ng/mL、0.04至5ng/mL、或0.05至 2.5ng/mL的范围内。存在于SCF提取物中的夹竹桃苷的推荐日剂量通常为约 0.2μg至约4.5μg/kg体重，一日两次。夹竹桃苷的剂量可为约0.2μg至约1μg/kg体重/天、约0.5至约1.0μg/kg体重/天、约0.75至约1.5μg/kg体重/天、约1.5至约 2.52μg/kg体重/天、约2.5至约3.0μg/kg体重/天、约3.0至约4.0μg/kg体重/天或 约3.5至4.5μg夹竹桃苷/kg体重/天。夹竹桃苷的最大耐受剂量可为约3.5μg/kg 体重/天至约4.0μg/kg体重/天。最小有效剂量可为约0.5μg/天、约1μg/天、约 1.5μg/天、约1.8μg/天、约2μg/天、或约5μg/天。
由于存在的三萜的组合以及它们存在时的摩尔比，可以以低至高剂量施 用抗病毒组合物。用于人类的治疗有效剂量为约100-1000mg或100-1000μg的 抗病毒组合物/kg体重。可以在24小时内高达10次施用这样的剂量。以下指定 其他合适的剂量范围。
Figure BDA0003242244600000291
所有值为近似的，意味着“约”指定值。
应注意的是，本发明的化合物在本发明的组合物或制剂中可具有一种或 多种功能。例如，化合物可用作表面活性剂和水混溶性溶剂或用作表面活性 剂和水不混溶性溶剂二者。
液体组合物可包括一种或多种药学上可接受的液体载体。液体载体可为 水性、非水性、极性、非极性、和/或有机载体。液体载体包括，例如但不限 于，水混溶性溶剂、水不混溶性溶剂、水、缓冲液及其混合物。
如本文所使用的，可交换使用的术语“水溶性溶剂”或“水混溶性溶剂”是 指与水不形成两相混合物的有机液体、或充分溶于水来提供含有至少5％的 溶剂且无液相分离的水性溶剂混合物的有机液体。溶剂适用于施用给人类或 动物。示例性水溶性溶剂包括，例如但不限于，PEG(聚(乙二醇))、PEG 400 (聚(具有约400的分子量的乙二醇)、乙醇、丙酮、烷醇、醇、***、丙二醇、 丙三醇、三乙酸甘油酯、聚(丙二醇)、PVP(聚(乙烯基吡咯烷酮))、二甲基亚 砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、吡啶、丙醇、N-甲基 乙酰胺、丁醇、soluphor(2-吡咯烷酮)、pharmasolve(N-甲基-2-吡咯烷酮)。
如本文所使用的，可交换使用的术语“水不溶性溶剂”或“水不混溶性溶 剂”是指其与水形成两相混合物的有机液体、或当水中的溶剂的浓度超过5％ 时形成相分离的有机液体。溶剂适用于施用给人类或者动物。示例性水不溶 性溶剂包括，例如但不限于，中/长链甘油三酯、油、蓖麻油、玉米油、维生 素E、维生素E衍生物、油酸、脂肪酸、橄榄油、softisan 645(二甘油辛酸酯/ 癸酸酯/硬脂酸酯/羟硬脂酸酯己二酸酯)、miglyol、captex(Captex 350：甘油 三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸甘油三酯；Captex 355：甘油三辛酸酯/癸酸甘油三 酯；Captex 355EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中链甘油三酯)。
在“用于工业Q3C杂质的统一人类使用药品注册技术要求国际会议(ICH) 指南：残留溶剂(International Conference on Harmonisation of Technical Requirementsfor Registration of Pharmaceuticals for Human Use(ICH) guidance for industryQ3C Impurities:Residual Solvents)”(1997)中列出合适的 溶剂，这对在药物中多少量的残留溶剂被视为安全的提出了建议。示例性溶 剂被列为2类或3类溶剂。3类溶剂包括，例如，乙酸、丙酮、苯甲醚、1-丁 醇、2-丁醇、乙酸丁酯、叔丁基甲基醚、异丙基苯、乙醇、***、乙酸乙酯、 甲酸乙酯、甲酸、庚烷、乙酸异丁酯、乙酸异丙酯、乙酸甲酯、甲基-1-丁醇、 甲基乙基酮、甲基异丁基酮、2-甲基-1-丙醇、戊烷、1-戊醇、1-丙醇、2-丙 醇、或乙酸丙酯。
可在本发明中用作水不混溶性溶剂的其他材料包括：Captex 100：丙二 醇二癸酸酯；Captex 200：丙二醇二辛酸酯/二癸酸酯；Captex 200P：丙二醇 二辛酸酯/二癸酸酯；丙二醇二辛酸癸酸酯(Propylene Glycol Dicaprylocaprate)； Captex 300：甘油三辛酸酯/癸酸酯；Captex 300EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸 中链甘油三酯；Captex 350：甘油三辛酸酯/癸酸酯/月桂酸酯；Captex 355： 甘油三辛酸酯/癸酸酯；Captex 355EP/NF：甘油三辛酸酯/癸酸中链甘油三酯； Captex 500：三乙酸甘油酯；Captex 500P：三乙酸甘油酯(医药级)；Captex 800： 丙二醇二(2-乙基己酸酯)；Captex 810D：甘油三辛酸酯/癸酸酯/亚油酸酯；Captex 1000：甘油三癸酸酯；Captex CA：中链甘油三酯；Captex MCT-170： 中链甘油三酯；Capmul GMO：甘油单油酸酯；Capmul GMO-50EP/NF：甘 油单油酸酯；Capmul MCM：中链甘油一酯&中链甘油二酯(Medium Chain Mono-&Diglycerides)；Capmul MCM C8：甘油单辛酸酯；Capmul MCM C10： 甘油单癸酸酯；Capmul PG-8：丙二醇单辛酸酯；Capmul PG-12：丙二醇单 月桂酸酯；Caprol 10G10O：十油酸十甘油酯；Caprol 3GO：三聚甘油单油 酸酯；Caprol ET：混合的脂肪酸的聚甘油酯；Caprol MPGO：六聚甘油二油 酸酯；Caprol PGE860：十聚甘油单、二油酸酯(Decaglycerol Mono-,Dioleate)。
如本文所使用的，“表面活性剂”是指含有极性或带电的亲水性部分以及 非极性疏水性(亲脂性)部分的化合物；即，表面活性剂是两亲性的。术语表 面活性剂可指一种化合物或多种化合物的混合物。表面活性剂可以是增溶剂、 乳化剂、或分散剂。表面活性剂可为亲水性的或疏水性的。
亲水性表面活性剂可为任何适用于药物组合物的亲水性表面活性剂。这 样的表面活性剂可为阴离子型、阳离子型、两性离子型或非离子型，尽管目 前优选非离子型亲水性表面活性剂。如前论述的，这些非离子型亲水性表面 活性剂通常将具有大于约10的HLB值。亲水性表面活性剂的混合物也在本发 明的范围内。
类似地，疏水性表面活性剂可为任何适用于药物组合物的疏水性表面活 性剂。通常，合适的疏水性表面活性剂将具有小于约10的HLB值。疏水性表 面活性剂的混合物也在本发明的范围内。
其他合适的增溶剂的实例包括：醇类和多元醇类，例如乙醇、异丙醇、 丁醇、苯甲醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇及其异构体、甘油、季戊四醇、山 梨醇、甘露醇、卡必醇(transcutol)、异山梨醇二甲基醚、聚乙二醇、聚丙二 醇、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素及其他纤维素衍生物、环糊精及环糊精衍 生物；具有约200至约6000平均分子量的聚乙二醇的醚类，例如四氢糠醇聚 乙二醇醚(三缩四乙二醇，可商购自BASF，商品名为Tetraglycol)或甲氧基聚 乙二醇(Union Carbide)；酰胺类，例如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、己内酰胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羟基烷基吡咯烷酮、N-烷基哌啶酮、N-烷基己内酰胺、 二甲基乙酰胺、和聚乙烯吡咯烷酮；酯类，例如丙酸乙酯、柠檬酸三丁酯、 乙酰柠檬酸三乙酯、乙酰柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、油酸乙酯、辛酸乙 酯、丁酸乙酯、三乙酸甘油酯、丙二醇单乙酸酯、丙二醇二乙酸酯、己内酯 及其异构体、戊内酯及其异构体、丁内酯及其异构体；以及其他本领域已知 的增溶剂，例如二甲基乙酰胺、异山梨醇二甲基醚(Arlasolve DMI(ICI))、N- 甲基吡咯烷酮(Pharmasolve(ISP))、单辛酸甘油酯、二甘醇单***(可购自 Gattefosse，商品名Transcutol)、和水。增溶剂的混合物也在本发明的范围内。
除非另外指出，本文提及的化合物可容易地从标准商业来源获得。
尽管不是必需的，组合物或制剂可进一步包括一种或多种螯合剂、一种 或多种防腐剂、一种或多种抗氧化剂、一种或多种吸附剂、一种或多种酸化 剂、一种或多种碱化剂、一种或多种消泡剂、一种或多种缓冲剂、一种或多 种着色剂、一种或多种电解质、一种或多种盐、一种或多种稳定剂、一种或 多种张力调节剂(tonicity modifier)、一种或多种稀释剂、或其组合。
本发明的组合物还可包括油类，例如固定油、花生油、芝麻油、棉籽油、 玉米油和橄榄油；脂肪酸类，例如油酸、硬脂酸和异硬脂酸；以及脂肪酸酯 类，例如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、脂肪酸甘油酯和乙酰化脂肪酸甘油酯。 组合物还可包括醇类，例如乙醇、异丙醇、十六烷醇、甘油和丙二醇；甘油 缩酮类，例如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇；醚类，例如聚(乙二醇)450； 石油烃类，例如矿物油和凡士林；水；药学上适合的表面活性剂、悬浮剂或 乳化剂；或其组合。
应理解的是，用于药物制剂领域的化合物通常具有多种功能或目的。因 此，如果本文命名的化合物仅被提及一次或被用于定义一个以上的本文的术 语，其目的或功能不应为解释为仅限于所命名的目的(一个或多个)或功能(一 种或多种)。
制剂的一种或多种组分可以以其游离碱、游离酸或者药学上或分析上可 接受的盐形式存在。如本文所使用的，“药学上或分析上可接受的盐”是指已 经按需要通过将其与酸反应来形成离子键对而改性的化合物。可接受的盐的 实例包括由例如无毒无机或有机酸形成的常规无毒盐。适合的无毒盐类包括 源自如盐酸、氢溴酸、硫酸、磺酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等无机酸的那些， 和本领域普通技术人员已知的其他那些。由有机酸制备的盐，和本领域普通 技术人员已知的其他那些，所述有机酸为例如氨基酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、 乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、帕莫酸、马 来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2- 乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲基磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙 基磺酸。另一方面，在药学上活性成分具有酸性官能团的情况下，添加药学 上可接受的碱来形成药学上可接受的盐。在Remington′s PharmaceuticalSciences,17th.ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA,1985,p.1418中发现 其他合适的盐的列表，相关公开内容通过引用结合在此。
本文采用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用 于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应、或任何其他 问题或并发症，与合理的受益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物、和 /或剂型。
可以通过制药工厂中公知的任何常规手段来制造剂型。可通过在容器中 提供至少一种液体载体和抗病毒组合物来制备液体剂型。一种或多种其他赋 形剂可包含在液体剂型中。可通过提供至少一种固体载体和抗病毒组合物来 制备固体剂型。一种或多种其他赋形剂可包含在固体剂型中。
可以使用常规包装设备和材料来包装剂型。其可包含在包装、瓶、小瓶、 袋、注射器、包膜(envelope)、小包(packet)、泡罩包装、盒、安瓿瓶、或其 他这样的容器中。
本发明的组合物可包含在任何剂型中。特定剂型包括固体或液体剂型。 示例性合适的剂型包括片剂、胶囊、丸剂、囊片、锭剂、冲剂、和药学领域 普通技术人员已知的其他这样的剂型。
鉴于以上描述和以下实施例，本领域技术人员将能够实践所要求保护的 本发明而无需过度试验。参考以下实施例将更好的了解前述内容，这些实施 例详述了制备本发明的实施方案的某些过程。对于这些实施例做出的所有参 考都是为了说明的目的。以下实施例不应被认为是详尽的，仅说明了本发明 所预期的许多实施方案的少数。
实施例1
粉末状夹竹桃叶的超临界流体提取
方法A.用二氧化碳
通过收获、清洗、并干燥夹竹桃叶材料，然后将夹竹桃叶材料通过例如 美国专利号5,236,132、5,598,979、6,517,015、和6,715,705中所述的那些等的 粉碎和脱水设备，来制备粉末状夹竹桃叶。使用的起始材料的重量为3.94kg。
在提取器装置中、在300巴压力(30MPa，4351psi)和50℃(122℉)的温度 下，将起始材料与纯CO2组合。使用了总计197kg的CO2，以达到50:1的溶剂 与原材料比。然后，使CO2和原材料的混合物通过分离器装置，其改变混合 物的压力和温度并将提取物与二氧化碳分离。
获得为具有良好香味(fragrance)的褐色的、胶黏的(sticky)、粘稠(viscous) 材料的提取物(65g)。颜色可能是由于叶绿素和其他残留的发色化合物所导致 的。为了确定提取物的产率，用丙酮冲洗管和分离器，并且蒸发丙酮来得到 另外9g的提取物。总提取量为74g。基于起始材料的重量，提取物的产率为 1.88％。使用高压液相色谱法和质谱法计算的提取物中的夹竹桃苷的含量为 560.1mg、或产率为0.76％。
方法B.用二氧化碳和乙醇的混合物
通过收获、清洗、并干燥夹竹桃叶材料，然后将夹竹桃叶材料通过例如 美国专利号5,236,132、5,598,979、6,517,015、和6,715,705中所述的那些等的 粉碎和脱水设备，来制备粉末状夹竹桃叶。使用的起始材料的重量为3.85kg。
在提取器装置中、在280巴(28MPa，4061psi)压力和50℃(122℉)的温度 下，将起始材料与纯CO2以及作为改性剂的5％乙醇组合。使用了总计160kg 的CO2和8kg的乙醇，以达到43.6:1的溶剂与原材料比。然后，将CO2、乙醇 和原材料的混合物通过分离器装置，其改变混合物的压力和温度并且将提取 物与二氧化碳分离。
去除乙醇后得到为明显含有一些叶绿素的深绿色、胶黏的、粘稠块的提 取物(207kg)。基于起始材料的重量，提取物的产率为5.38％。使用高压液相 色谱法和质谱法计算的提取物中的夹竹桃苷的含量为1.89g、或产率为0.91％。
实施例2
粉末状夹竹桃叶的热水提取物。
(比较例)
通常使用热水提取以从夹竹桃叶提取夹竹桃苷和其他活性组分。热水提 取工艺的实例可在美国专利号5,135,745和5,869,060中找到。
使用5g粉末状夹竹桃叶来进行热水提取。向粉末状夹竹桃叶添加10体积 的沸水(按夹竹桃起始材料的重量计)，并持续搅拌混合物6小时。然后过滤混 合物并收集叶残留物，在相同条件下再提取一次。合并滤液并冻干。提取物 的外观为褐色的。干燥的提取物材料的重量为约1.44g。在水中溶解34.21mg 的提取物材料并使用高压液相色谱法和质谱法进行夹竹桃苷含量分析。确定 的夹竹桃苷的量为3.68mg。基于提取物的量，夹竹桃苷的产率计算为0.26％。
实施例3
药物组合物的制备。
方法A.基于Cremophor的药物递送***
以下成分以所示量提供。
试剂名称 功能 制剂的百分比(％w/w)
抗病毒组合物 活性剂 3.7
维生素E 抗氧化剂 0.1
Labrasol 表面活性剂 9.2
乙醇 共溶剂 9.6
Cremophor EL 表面活性剂 62.6
Cremophor RH40 表面活性剂 14.7
将赋形剂分配至广口瓶中并在60℃下在New Brunswick Scientific C24KC冷冻培养箱摇床(Refrigerated Incubator shaker)中摇动24小时以确保均 匀。然后拉出样品并目视检查是否溶解。24小时后，对于所有制剂，赋形剂 和抗病毒组合物均全部溶解。
方法B.基于GMO/Cremophor的药物递送***
以下成分以所示量提供。
试剂名称 功能 制剂的百分比(％w/w)
抗病毒组合物 活性剂 4.7
维生素E 抗氧化剂 0.1
Labrasol 表面活性剂 8.5
乙醇 共溶剂 7.6
Cremophor EL 表面活性剂 56.1
甘油单油酸酯 表面活性剂 23.2
遵循方法A的步骤。
方法C.基于Labrasol的药物递送***
以下成分以所示量提供。
试剂名称 功能 制剂的百分比(％w/w)
抗病毒组合物 活性剂 3.7
维生素E 抗氧化剂 0.1
Labrasol 表面活性剂 86.6
乙醇 共溶剂 9.6
遵循方法A的步骤。
方法D.基于维生素E-TPGS的胶束形成***
以下成分以所示量提供。
组分 功能重量％(w/w)
维生素E 抗氧化剂1.0
维生素E TPGS 表面活性剂95.2
抗病毒组合物 活性剂3.8
遵循方法A的步骤。
方法E.多组分药物递送***
以下成分以所示量提供。
组分 重量(g) 重量％(w/w)
维生素E 10.0 1.0
Cremophor ELP 580.4 55.9
Labrasol 89.0 8.6
甘油单油酸酯 241.0 23.2
乙醇 80.0 7.7
抗病毒组合物 38.5 3.7
总计 1038.9 100
遵循方法A的步骤。
方法F.多组分药物递送***
以下成分以所示的包含在胶囊中的量提供。
Figure BDA0003242244600000371
遵循方法A的步骤。
实施例4
肠溶胶囊的制备
步骤I：充液胶囊的制备
用实施例3的液体组合物填充硬明胶胶囊(50只，00尺寸)。将这些胶囊手 动填充800mg的制剂，然后用50％乙醇/50％水溶液手动密封。然后用以指示 量含有以下成分的22％明胶溶液手工捆扎这些胶囊。
Figure BDA0003242244600000381
充分混合明胶溶液并溶胀1-2小时。溶胀期后，盖紧溶液并置于55℃烘 箱中使其液化。一旦全部明胶溶液变为液体，进行捆扎(banding)。
使用尖圆头3/0绘画画笔将溶胶溶液涂在胶囊上。使用Shionogi提供的捆 扎工具。捆扎后，在环境条件下保持胶囊12小时以使捆扎固化。
步骤II：充液胶囊的包衣
由下表中列出的成分制备包衣分散液。
成分 重量％ 固体％ 固体(g) g/批
Eudragit L30D55 40.4 60.5 76.5 254.9
TEC 1.8 9.0 11.4 11.4
AlTalc 500V 6.1 30.5 38.5 38.5
水 51.7 不适用(na) 不适用 326.2
总计 100.0 100.0 126.4 631.0
如果使用根据步骤I的捆扎的胶囊，将分散液以20.0mg/cm2的涂覆水平施 涂至胶囊。以下条件用于包衣胶囊。
参数 设置
包衣设备 Vector LDCS-3
批量 500g
进气温度 40℃
排气温度 27-30℃
进气量 20-25CFM
包衣锅转速(Pan Speed) 20rpm
泵速 9rpm(3.5至4.0g/min)
喷嘴压力 15psi
喷嘴直径 1.0mm
与平板床(tablet bed)的距离* 2-3in
*设置喷雾喷嘴使得喷嘴和喷雾通路在进气流路的下方。
实施例5
马中Zika病毒感染的治疗
方法A.抗病毒组合物疗法
对患有Zika病毒感染的马指定抗病毒组合物，并且根据指定的给药方案 向马施用治疗相关剂量一段时间。定期确定马的治疗反应水平。可通过确定 马血液或血浆中的Zika病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治 疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到在马 中期望的治疗反应水平。按需继续对马进行抗病毒组合物的治疗，并且可按 需调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向马指定并施用一种或多种其他用于治疗Zika病毒感染或其症状 的治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗病 毒组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的剂 量递增(或递减)。
实施例6
针对Zika病毒感染的抗病毒活性的体外评价
方法A.纯化合物
在强心苷的存在下，以0.2的MOI(感染复数)用ZIKV(Zika病毒 PRVABC59株；ATCCVR-1843；https://www.atcc.org/Products/All/VR-1843.aspx) 感染Vero E6细胞(也称为Vero C1008细胞，ATTC No.CRL-1586； https://www.atcc.org/Products/All/CRL-1586.aspx)。用病毒和化合物培养细胞1 小时，其后丢弃接种物和化合物。给予细胞新鲜培养基并培养48小时，其后 用***固定细胞并对于ZIKV感染染色。描述了由闪烁扫描法确定夹竹 桃苷和地高辛的代表性感染率。在相同条件下评价其他化合物以及它们针对Zika病毒表现不同水平的抗病毒活性。
方法B.提取物形式中的化合物
除了将提取物的量归一化为提取物中目标化合物的量之外，如方法A中 详述的评价含有待试验的目标化合物的提取物。例如，含有2重量％的夹竹 桃苷的提取物含有20μg的夹竹桃苷/1mg提取物。因此，如果用于评价的夹竹 桃苷的预期量为20μg，则1mg的提取物将用于检测。
实施例7
含有抗病毒组合物的片剂的制备
混合3％Syloid 244FP和97％微晶纤维素(MCC)的初始制片混合物。然后， 通过湿法造粒将根据实施例3制备的组合物现有批次混入Syloid/MCC混合物 中。该混合物在下表中标记为“初始制片混合物”。颗粒外添加另外的MCC 来增加压缩性。向初始制片混合物的该添加物标记为"颗粒外添加"。来自颗 粒外添加的所得混合物与"最终制片混合物"为相同组合物。
组分 重量(g) 重量％(w/w)
初始制片混合物
微晶纤维素 48.5 74.2
胶态二氧化硅/Syloid 244FP 1.5 2.3
来自实施例3的制剂 15.351 23.5
总计 65.351 100.0
颗粒外添加
组分 重量(g) 重量％(w/w)
初始制片混合物 2.5 50.0
微晶纤维素 2.5 50.0
总计 5 100.0
最终制片混合物：
缩略的
组分 重量(g) 重量％(w/w)
微晶纤维素 4.36 87.11
胶态二氧化硅/Syloid 244FP 0.06 1.15
来自实施例3的制剂 0.59 11.75
总计 5.00 100
最终制片混合物：
详细的
组分 重量(g) 重量％(w/w)
微晶纤维素 4.36 87.11
胶态二氧化硅/Syloid 244FP 0.06 1.15
维生素E 0.01 0.11
Cremophor ELP 0.33 6.56
Labrasol 0.05 1.01
甘油单油酸酯 0.14 2.72
乙醇 0.05 0.90
SCF提取物 0.02 0.44
总计 5.00 100.00
Syloid 244FP是由Grace Davison制造的胶态二氧化硅。胶态二氧化硅通 常用于提供各种功能，例如吸附剂、助流剂、和片剂崩解剂。选择Syloid 244FP 因其在油中吸收3倍其重量的能力且具有5.5微米的粒径。
实施例8
含有夹竹桃苷的溶液的HPLC分析
使用以下条件在HPLC(Waters)中分析样品(夹竹桃苷标准、SCF提取物 和热水提取物)：对称(Symmetry)C18柱(5.0μm，150×4.6mm I.D.；Waters)； MeOH:水＝54:46(v/v)的流动相以及1.0ml/min的流速。检测波长设定为 217nm。通过在固定量的HPLC溶剂中溶解化合物或提取物来制备样品以实 现近似目标浓度的夹竹桃苷。通过使用内标物确定夹竹桃苷的保留时间。通 过使用内标物形成信号响应曲线来确定/校正夹竹桃苷的浓度。
实施例9
药物组合物的制备
可通过任何以下方法来制备本发明的药物组合物。可以在湿或干燥条件 下进行混合。在制备期间，可压制、干燥或压制并干燥药物组合物。药物组 合物可被分配至剂型。
方法A.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少一种抗病毒化合物混合。
方法B.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少两种抗病毒化合物混合。
方法C.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少一种强心苷混合。
方法D.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少两种三萜混合。
方法E.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少一种强心苷和本文公开的至 少两种三萜混合。
方法D.
将至少一种药物赋形剂与本文公开的至少三种三萜混合。
实施例10
三萜混合物的制备
通过将指定的三萜以所示的近似摩尔比混合来制备以下组合物。
Figure BDA0003242244600000431
对于各组合物，制备三种不同的各自的溶液，由此各溶液中的三萜的总 浓度为约9μM、18μM、或36μM。
Figure BDA0003242244600000441
实施例11
抗病毒组合物的制备
可通过将其单独的三萜组分混合以形成混合物来制备抗病毒组合物。将 提供可接受的抗病毒活性的、上述制备的三萜混合物配制成抗病毒组合物。
具有齐墩果酸和熊果酸的抗病毒组合物
根据本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的齐墩果酸和熊果酸。 组分以固体形式混合或在以下溶剂(一种或多种)中混合：例如甲醇、乙醇、 氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙 酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含有如 本文所述相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的抗病毒组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂 与药理学活性剂混合。配制抗病毒组合物以用于施用于哺乳动物。
具有齐墩果酸和白桦脂酸的抗病毒组合物
根据本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的齐墩果酸和白桦脂 酸。组分以固体形式混合或在以下溶剂(一种或多种)中混合：例如甲醇、乙 醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲 基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合物含 有如本文所述相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的抗病毒组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂 与药理学活性剂混合。配制抗病毒组合物以用于施用于哺乳动物。
具有齐墩果酸、熊果酸、和白桦脂酸的抗病毒组合物
根据本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的齐墩果酸、熊果酸 和白桦脂酸。组分以固体形式混合或在以下溶剂(一种或多种)中混合：例如 甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、 二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混合物。所得混合 物含有如本文所述相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的抗病毒组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂 与药理学活性剂混合。配制抗病毒组合物以用于施用于哺乳动物。
具有夹竹桃苷、齐墩果酸、熊果酸、和白桦脂酸的抗病毒组合物
根据本文所定义的组分的预定摩尔比，混合已知量的夹竹桃苷、齐墩果 酸、熊果酸和白桦脂酸。组分以固体形式混合或在以下溶剂(一种或多种)中 混合：例如甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、丙醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基 甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAC)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、水或其混 合物。所得混合物含有如本文所述相对摩尔比的组分。
对于药学上可接受的抗病毒组合物，将至少一种药学上可接受的赋形剂 与药理学活性剂混合。配制抗病毒组合物以用于施用于哺乳动物。
实施例12
马中丝状病毒感染的治疗
示例性丝状病毒感染包括埃博拉病毒和马尔堡病毒。
方法A.抗病毒组合物疗法
对患有丝状病毒感染的马指定抗病毒组合物，并且根据指定的给药方案 向马施用治疗相关剂量一段时间。定期确定马的治疗反应水平。可通过确定 马血液或血浆中的丝状病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治 疗反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到在马 中期望的治疗反应水平。按需继续对马进行抗病毒组合物的治疗，并且可按 需调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向马指示并施用一种或多种用于治疗丝状病毒感染或其症状的其 他治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗病 毒组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的剂 量递增(或递减)。
实施例13
马中黄病毒感染的治疗
示例性黄病毒感染包括黄热病、登革热、日本脑炎、西尼罗病毒、寨卡 病毒、蜱媒脑炎、科萨努尔森林病、Alkhurma症、基孔肯雅病毒、鄂木斯克 出血热、波瓦生病毒感染
方法A.抗病毒组合物疗法
对患有黄病毒感染的马指定抗病毒组合物，并且根据指定的给药方案向 马施用治疗相关剂量一段时间。定期确定马的治疗反应水平。可通过确定马 血液或血浆中的黄病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗反 应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到在马中期 望的治疗反应水平。按需继续对马进行抗病毒组合物的治疗，并且可按需调 节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向马指示并施用一种或多种用于治疗黄病毒感染或其症状的其他 治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗病毒 组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的剂量 递增(或递减)。
实施例14
针对寨卡病毒和登革热病毒的抗病毒活性的评价
通过在存在或不存在测试组合物的情况下、以一定浓度范围下感染靶细 胞来进行基于CPE的抗病毒试验。感染靶细胞导致细胞病变效应和细胞死亡。 在该类型的试验中，在存在试验组合物的情况下CPE的降低和细胞存活率的 相应增加用作抗病毒活性的指标。对于基于CPE的试验，用中性红读数确定 细胞存活率。活细胞在其溶酶体中混有中性红。中性红的摄取依赖于活细胞 维持其溶酶体内的pH低于细胞质中的pH的能力，该活性过程需要ATP。一旦 进入溶酶体，中性红染料变得带电并且保留在细胞内。在用中性红(0.033％)培养3小时后，去除细胞外染料，用PBS洗涤细胞，并用50％乙醇+1％乙酸 的溶液溶解细胞内的中性红。通过在490nm下读取各个孔的吸光度(光密度) 来量化溶液中的中性红的量。
贴壁细胞系用于评价组合物针对一组病毒的抗病毒活性。在向细胞添加 病毒前，将组合物与靶细胞预先培养30分钟。组合物在感染培养期间存在于 细胞培养基中。对于各个感染试验，使用相同浓度的组合物(一式两份)平行 建立存活率试验，以确定在不存在病毒的情况下组合物的细胞毒性效果。
通过将测试条件下细胞的感染水平(基于免疫染色的试验)或存活率(基 于CPE的试验)与未感染细胞的感染水平或存活率相比较，来确定测试组合物 的抗病毒活性。通过将存在抑制剂的情况下的存活率与假处理的细胞的存活 率相比较，在未感染的细胞中评价细胞毒性效果。通过XTT存活率试验来确 定细胞毒性，所述XTT存活率试验在与相应感染试验的读数的相同时间点进 行。
将测试组合物溶解于100％甲醇中。通过进行8倍稀释来产生8种浓度的 组合物(一式两份)，以50μM作为最高测试浓度开始。组合物的最高测试浓度 (50μM)致使培养基中的甲醇的最终浓度为0.25％(v/v％)。在各个试验板中含 有甲醇媒介物的8倍稀释系列，其浓度反映了各个组合物测试条件中甲醇的 最终浓度。在可能的情况下，使用GraphPadPrism软件确定各个试验的组合 物的EC50和CC50。
通过针对病毒诱导的细胞病变效应(CPE)的保护程度来评价抗病毒活性。 在存在不同浓度的对照或组合物的情况下，用病毒攻击细胞。在感染6天后 (ZIKV，寨卡病毒)或7天后(DENV，登革热病毒)，通过定量不同测试条件下 的细胞存活率并将数值与未处理的细胞和仅用媒介物(感染培养基)处理的细 胞进行比较，来监测针对CPE的保护程度。
在每个板上进行中和测定的质量控制以确定：i)信号对背景(S/B)值；ii) 由已知抑制剂的抑制；和iii)试验的变化，其由所有数据点的变化系数(C.V.) 来测定。感染试验中的总体变化范围为3.4％至9.5％，并且存活率试验中的总 体变化范围为1.4％至3.2％，以全部C.V.值的平均值计算。感染试验的信号- 对-背景(S/B)范围为2.9至11.0，而存活率试验的信号-对-背景(S/B)范围为6.5 至29.9。
DENV2-诱导的细胞病变效应(CPE)用中性红读数的保护：对于DENV2 抗病毒试验，使用08-10381 Montserrat株。在C6/36昆虫细胞中产生病毒原液。 在具有5％FBS的MEM(MEM5)中维持Vero细胞(源自绿猴(Cercopithecus aethiops)的上皮肾细胞)。对于感染和存活率试验二者，在96孔透明平底板中 以10,000细胞/孔接种细胞，并且在37℃下在MEM5中维持24小时。在感染当 天，将样品使用具有1％牛血清白蛋白(BSA)的MEM在U底板中8倍稀释。以 1.25X的最终浓度制备测试材料稀释液，并且将40μl与靶细胞在37℃下培养30 分钟。测试材料预培养之后，将10μl的在具有1％BSA的MEM中制备的病毒 稀释液添加至各个孔(50μl最终体积/孔)并且将板在具有5％CO2的潮湿培养 箱中在37℃下培养3小时。预先确定用于试验的病毒的体积以产生被利巴韦 林(Ribavirin)和化合物A3(已知的DENV2的抑制剂)抑制的线性范围中的信 号。感染培养后，用PBS、接着用含有2％FBS的MEM(MEM2)洗涤细胞以 去除未结合的病毒。其后，将50μl的含有在MEM2中以1X浓度制备的抑制剂 稀释液的培养基添加至各个孔。在培养箱(5％CO2)中在37℃下将板培养7天。 试验板中包括无病毒对照(“假感染”)、仅用培养基培养的感染细胞、仅用媒 介物(甲醇)培养的感染细胞、和无细胞的孔(以确定背景)。试验板上还包括 含有50μM利巴韦林和0.5μM化合物A3的对照孔。感染7天后，将细胞用中性 红染色以监测细胞存活率。使用感染培养基中的系列8倍稀释液一式两份地 评价测试材料。对照包括用无病毒培养的细胞(“假感染”)、仅用培养基培养 的感染细胞、或存在有利巴韦林(0.5μM)或A3(0.5μM)的感染细胞。在同一试 验板上包括仅用甲醇媒介物的完全重复抑制曲线。
ZIKV-诱导的细胞病变效应(CPE)用中性红读数的保护：对于ZIKV抗病 毒试验，使用PLCal_ZV株。在具有5％FBS的MEM(MEM5)中维持Vero细胞 (源自绿猴的上皮肾细胞)。对于感染和存活率试验二者，在96孔透明平底板 中以10,000细胞每孔接种细胞，并且在37℃下在MEM5中维持24小时。在感 染当天，将样品使用具有1％牛血清白蛋白(BSA)的MEM在U底板中8倍稀释。 以1.25X的最终浓度制备试验材料稀释液，并且将40μl与靶细胞在37℃下培养 30分钟。测试材料预培养之后，将10μl的在具有1％BSA的MEM中制备的病 毒稀释液添加至各个孔(50μl最终体积每孔)并且将板在具有5％CO2的潮湿培 养箱中在37℃下培养3小时。感染培养后，用PBS、接着用含有2％FBS的MEM (MEM2)洗涤细胞以去除未结合的病毒。其后，将50μl的含有在MEM2中以1X 浓度制备的抑制剂稀释液的培养基添加至各个孔。在培养箱(5％CO2)中在37℃ 下将板培养6天。在试验板中包括无病毒对照(“假感染”)、仅用培养基培养的 感染细胞、仅用媒介物(甲醇)培养的感染细胞、和无细胞的孔(以确定背景)。 感染6天后，将细胞用中性红染色以监测细胞存活率。使用感染培养基中的 系列8倍稀释液一式两份地评价测试材料。对照包括无病毒培养的细胞(“假感 染”)、仅用培养基培养的感染细胞、或存在有A3(0.5μM)的感染细胞。在同 一试验板上包括仅用甲醇媒介物的完全重复抑制曲线。
基于CPE的存活率数据的分析：对于中性红试验，通过监测490nm处的 吸光度来确定细胞存活率。从所有样品中减去在无细胞的孔中获得的平均信 号。然后，将所有数据点以在相同试验板上在假(未感染)细胞的8个孔中观察 到的平均信号的百分比计算。仅用培养基处理的感染细胞将信号降低至未感 染细胞中观察到的信号的平均4.2％(对于HRV)、26.9％(对于DENV)、和5.1％ (对于ZIKV)。该实验的信号-对-背景(S/B)为2.9(对于DENV)、和7.2(对于 ZIKV)，其确定为与仅用媒介物处理的感染细胞的存活率百分比比较的“假感染”细胞中的存活率百分比。
测试化合物诱导的细胞毒性的存活率试验(XTT)：使用与相应感染试验 中所用的相同实验设置和抑制剂浓度、用抑制剂稀释液(或仅培养基)培养假 感染的细胞。培养温度和培养期持续时间反映相应感染试验的条件相同。用 XTT法评价细胞存活率。XTT试验测量了线粒体活性并且是基于黄色四唑盐 (XTT)的裂解，其形成橙色甲臜染料。所述反应仅在具有活性线粒体的活细 胞中发生。使用扫描多孔分光光度计直接定量甲臜染料。从所有数据-点减 去从无细胞的孔获得的背景水平。存活率试验板中包括仅用甲醇媒介物的对 照(7个浓度，反映了各个夹竹桃苷测试孔的甲醇最终百分比)。通过测量 490nm处的吸光度来监测存活能力。
细胞毒性数据的分析：对于XTT实验，通过监测490nm处的吸光度来确 定细胞存活率。从所有样品减去从无细胞的孔获得的平均信号。然后，所有 数据点以在相同试验板上在假(未感染)细胞的8个孔中观察到的平均信号的 百分比计算。该实验的信号-对-背景(S/B)为29.9(对于IVA)、8.7(对于HRV)、6.5(对于DENV)、和6.7(对于ZIKV)，其确定为与对于无细胞的孔观察到的 信号比较的“假感染”细胞中的存活率百分比。
实施例15
针对丝状病毒(埃博拉病毒和马尔堡病毒)的抗病毒活性的评价
方法A.
在存在夹竹桃苷、地高辛或PBI-05204(一种含夹竹桃苷的植物提取物) 的情况下，用EBOV/Kik(A，MOI＝1)或MARV/Ci67(B，MOI＝1)感染Vero E6 细胞。1小时后，去除接种物和化合物并向细胞添加新鲜培养基。48小时后， 固定细胞并免疫染色细胞以检测感染有EBOV或MARV的细胞。使用Operetta 计数感染的细胞。C)用上述化合物处理Vero E6细胞。通过CellTiter-Glo测量 的ATP水平作为细胞存活率的度量。
方法B.
用EBOV(A、B)或MARV(C、D)感染Vero E6细胞。感染后2小时(A、C) 或感染后24小时(B、D)，向细胞添加夹竹桃苷或PBI-05204 1小时，然后丢弃 并将细胞返回至培养基。感染后48小时，感染细胞的分析如图1所示。
方法C.
在存在夹竹桃苷或PBI-05204的情况下，用EBOV或MARV感染Vero E6 细胞并且培养48小时。将来自感染细胞培养物的上清液传递至新鲜Vero E6 细胞，培养1小时，然后丢弃(如A中所述)。培养含有传递的上清液的细胞48 小时。如前所述检测用EBOV(B)或MARV(C)感染的细胞。EBOV的对照感 染率为66％，MARV的对照感染率为67％。
实施例16
针对披膜病毒科病毒的抗病毒活性的评价
(甲病毒：VEEV和WEEV)
在存在或不存在指示化合物的情况下，用委内瑞拉马脑炎病毒(A， MOI＝0.01)或西部马脑炎病毒(B，MOI＝0.1)感染Vero E6细胞18小时。如本文 所述检测感染的细胞并在Operetta上计数。
实施例17
马中副粘病毒科感染的治疗
示例性副粘病毒科病毒感染包括亨尼病毒属感染、尼帕病毒感染、或亨 德拉病毒感染。
方法A.抗病毒组合物疗法
对患有副粘病毒科感染的马指定抗病毒组合物，并且根据指定的给药方 案向马施用治疗相关剂量一段时间。定期确定马的治疗反应水平。可通过确 定马血液或血浆中的病毒滴度来确定治疗反应水平。如果一个剂量下的治疗 反应水平过低，则根据预先确定的剂量递增计划来递增剂量直至达到在马中 期望的治疗反应水平。按需继续对马进行抗病毒组合物的治疗，并且可按需 调节剂量或给药方案直至患者达到期望的临床终点。
方法B.组合疗法：抗病毒组合物与其它药剂
除了向马指示并施用一种或多种用于治疗副粘病毒科感染或其症状的 其他治疗剂之外，遵循上述方法A。于是，一种或多种其他治疗剂可以在抗 病毒组合物之前、之后或与其一起施用。也可进行一种或多种其他治疗剂的 剂量递增(或递减)。
如本文所使用的，术语“约(about)”或“近似(approximately)”是指特定值的 ±10％、±5％、±2.5％或±1％。如本文所使用的，术语“基本上”是指“在很大程 度上”或“至少大部分的”或“多于50％的”。
以上是本发明的特定实施方案的详细描述。应理解的是，尽管出于说明 的目的，本文已描述了本发明的特定实施方案，可在不脱离本发明的精神和 范围的情况下进行各种修改。因此，除所述权利要求书以外，本发明不受限 制。根据本公开内容，可在不过度实验的情况下，制造并实施本文公开的和 要求保护的所有实施方案。

Claims (17)

1.一种抗病毒组合物在制备用于通过以下方法治疗有需要的马中病毒感染的药物中的用途，所述病毒感染由西部马脊髓炎病毒(WEEV)、东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)或委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)导致，所述方法包括向所述马施用抗病毒组合物，所述抗病毒组合物包括夹竹桃苷和至少两种三萜的组合，所述至少两种三萜选自由齐墩果酸(其游离酸或盐)、熊果酸(其游离酸或盐)和白桦脂酸(其游离酸或盐)组成的组。
2.一种抗病毒组合物在制备用于通过以下方法预防性处置具有染上病毒感染的风险的马的药物中的用途，所述病毒感染由西部马脊髓炎病毒(WEEV)、东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)或委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)导致，所述方法包括在马染上病毒感染之前，在延长的处置期内以重复方式向马长期施用一个或多个剂量的抗病毒组合物，从而防止马染上病毒感染；其中所述抗病毒组合物包括夹竹桃苷和至少两种三萜的组合，所述至少两种三萜选自由齐墩果酸(其游离酸或盐)、熊果酸(其游离酸或盐)和白桦脂酸(其游离酸或盐)组成的组。
3.一种抗病毒组合物在制备用于通过以下方法治疗有需要的马中病毒感染的药物中的用途，所述病毒感染由西部马脊髓炎病毒(WEEV)、东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)或委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)导致，所述方法包括向马施用抗病毒组合物，所述抗病毒组合物包括夹竹桃苷或者包括夹竹桃苷和至少两种三萜的组合，所述至少两种三萜选自由齐墩果酸(其游离酸或盐)、熊果酸(其游离酸或盐)和白桦脂酸(其游离酸或盐)组成的组，并且所述方法包括：确定马是否患有所述病毒感染，指示抗病毒组合物的施用；根据规定的初始给药方案向马施用初始剂量的抗病毒组合物一段时间；定期确定马对于用抗病毒组合物治疗的临床反应和/或治疗反应的适当性；和按需继续用抗病毒组合物的治疗，或者递增或递减剂量。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗病毒组合物包括：a)夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸或盐)和熊果酸(其游离酸或盐)；b)夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸或盐)和白桦脂酸(其游离酸或盐)；或c)夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸或盐)、熊果酸(其游离酸或盐)和白桦脂酸(其游离酸或盐)。
5.根据权利要求1所述的用途，其中一个或多个剂量每天、每周或每月施用。
6.根据权利要求1所述的用途，其中用于所述用途的所述抗病毒组合物通过肠胃外、颊部、肠内、肌内、皮下、舌下、经口、口服或它们的组合施用。
7.根据权利要求1所述的用途，其中夹竹桃苷以纯的形式存在或作为提取物的一部分存在。
8.一种抗病毒组合物在制备用于通过以下方法治疗有需要的马中西部马脊髓炎病毒(WEEV)、东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)或委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)感染的药物中的用途，所述方法包括向所述马施用抗病毒组合物，所述抗病毒组合物包括夹竹桃苷。
9.一种抗病毒组合物在制备用于通过以下方法预防具有染上西部马脊髓炎病毒(WEEV)、东部马脑脊髓炎病毒(EEEV)或委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(VEEV)感染的风险的马中所述病毒感染的药物中的用途，所述方法包括在延长的处置期内以重复方式向所述马长期施用一个或多个剂量的抗病毒组合物，从而防止马染上由所述病毒感染引起的疾病，其中所述抗病毒组合物包括夹竹桃苷。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述抗病毒组合物包括：a)夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸或盐)和熊果酸(其游离酸或盐)；b)夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸或盐)和白桦脂酸(其游离酸或盐)；或c)夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸或盐)、熊果酸(其游离酸或盐)和白桦脂酸(其游离酸或盐)。
11.根据权利要求9所述的用途，其中所述抗病毒组合物包括：a)夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸或盐)和熊果酸(其游离酸或盐)；b)夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸或盐)和白桦脂酸(其游离酸或盐)；或c)夹竹桃苷、齐墩果酸(其游离酸或盐)、熊果酸(其游离酸或盐)和白桦脂酸(其游离酸或盐)。
12.根据权利要求1所述的用途，其中总三萜含量(齐墩果酸+熊果酸+白桦脂酸)与夹竹桃苷的摩尔比的范围为约15:1至约5:1、或约12:1至约8:1、或约100:1至约15:1、或约100:1至约50:1、或约100:1至约75:1、或约100:1至约80:1、或约100:1至约90:1、或约10:1。
13.根据权利要求1所述的用途，其中单个三萜(齐墩果酸(OA):熊果酸(UA):白桦脂酸(BA))与夹竹桃苷(OL)的摩尔比的范围如下：2-8(OA):2-8(UA):0.1-1(BA):0.5-1.5(OL)；或3-6(OA):3-6(UA):0.3-8(BA):0.7-1.2(OL)；或4-5(OA):4-5(UA):0.4-0.7(BA):0.9-1.1(OL)；4.6(OA):4.4(UA):0.6(BA):1(OL)；约9-12(OA)：最高约2(UA)：最高约2(BA)，或约10(OA)：约1(UA)：约1(BA)，或约9-12(OA)：约0.1-2(UA)：约0.1-2(BA)，或约9-11(OA)：约0.5-1.5(UA)：约0.5-1.5(BA)，或约9.5-10.5(OA)：约0.75-1.25(UA)：约0.75-1.25(BA)，或约9.5-10.5(OA)：约0.8-1.2(UA)：约0.8-1.2(BA)，或约9.75-10.5(OA)：约0.9-1.1(UA)：约0.9-1.1(BA)。
14.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗病毒组合物包括来自夹竹桃属或黄花夹竹桃属的植物材料的提取物。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述提取物进一步包括夹竹桃苷、奥多诺甙或夹竹桃它罗苷的一种或多种糖苷配基成分，夹竹桃苷、奥多诺甙或夹竹桃它罗苷的一种或多种糖基成分，或其组合。
16.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗病毒组合物作为主要抗病毒疗法、辅助抗病毒疗法、或联合抗病毒疗法施用。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述施用包括所述抗病毒组合物与至少一种其它抗病毒组合物或与用于治疗与所述病毒感染相关的症状的至少一种其它组合物分开施用或共同施用。
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