CN114214202A - 异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了异养‑光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，属于微藻生物技术领域。该方法包括微藻接种于发酵罐内在黑暗避光条件下进行异养培养，待微藻培养至对数生长中期时，先后分别以流加补料和半连续补料的方式补充碳源和氮源，待异养培养结束后藻液稀释并转移至与发酵罐串联的光反应器中进行光诱导培养。本发明利用异养‑光诱导两阶段培养获得高密度微藻生物量的同时提高叶黄素和蛋白质含量，解决微藻自养培养过程中活性物质产率低的问题。
Description
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法。
背景技术
小球藻(Chlorella)为绿藻门小球藻属单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，因其富含蛋白、色素、多糖、多不饱和脂肪酸、维生素和矿物质等营养成分，在食品保健、饲料和医药等多个领域具有广泛的应用价值。
微藻内蛋白质含量可达40％–70％，是重要的单细胞蛋白来源。叶黄素是一种类胡萝卜素，具有眼部保护活性和抗氧化性，能对抗神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病视网膜病变和呼吸疾病等，此外，叶黄素还被用作人类食用的着色剂和食品添加剂(欧盟称为E161b着色剂)，也被用作加深蛋黄颜色的饲料添加剂。微藻是叶黄素的潜在来源，藻细胞叶黄素含量高，生长不受季节变化的影响，对土地和水资源需求较低，同时藻细胞培养过程还能产生其他高附加值产品。如何提高小球藻培养密度并获得高附加值产物是当前小球藻大规模培养的关键技术问题，现有的利用有机碳源异养培养小球藻可以提高生物量产率，但是异养条件不利于积累蛋白质、叶黄素等需要光诱导条件的高附加值产物。
发明内容
本发明的目的在于提供异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，利用异养-光诱导两阶段培养获得高密度微藻生物量的同时提高叶黄素和蛋白质含量，解决微藻自养培养过程中活性物质产率低的问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明提供的异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，包括以下步骤：
(1)异养培养阶段：将微藻按照接种量为1％–30％接种于发酵罐内的异养培养基中，在pH为6.5、温度为27.5–28.5℃和黑暗避光的条件下进行异养培养，待微藻培养至对数生长中期时，先以流加补料的方式向发酵罐中补充碳源和氮源得到高密度微藻生物量后，再以半连续补料的方式向发酵罐中补充碳源和氮源促进叶黄素积累；
(2)光诱导培养阶段：步骤(1)中微藻异养培养结束后，将微藻藻液稀释并转移至与所述发酵罐串联的光反应器中，在其内的光诱导培养基中进行光诱导培养，诱导微藻细胞快速合成蛋白质，光照强度为60–100μmol/m2/s，光暗比为14：10(h/h)。
优选地，所述微藻为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
优选地，所述异养培养基为改良的BG11培养基，按照终浓度(mg/L)计组成为：葡萄糖7500，KNO3：500，NaNO3：150，Na2CO3：20，K2HPO4：40，MgSO4·7H2O：75，CaCl2·2H2O：36，柠檬酸：6，Na2MoO4·2H2O：0.71，Na2EDTA：1，柠檬酸铁铵：6，ZnSO4·7H2O：8.82，MnCl4·4H2O：1.44，CuSO4·5H2O：1.57，Co(NO3)2·2H2O：0.49；
所述光诱导培养基为BG11培养基，其按照终浓度(mg/L)计组成为：Na2CO3：20，K2HPO4：40，MgSO4·7H2O：75，CaCl2·2H2O：36，柠檬酸：6，Na2MoO4·2H2O：0.71，Na2EDTA：1，柠檬酸铁铵：6，ZnSO4·7H2O：8.82，MnCl4·4H2O：1.44，CuSO4·5H2O：1.57，Co(NO3)2·2H2O：0.49。
优选地，步骤(1)中，通过搅拌或振荡的方式保持异养培养过程中微藻处于均匀混合状态。
优选地，所述发酵罐包括罐体、搅拌浆和排气阀，所述光反应器包括主体容器、外部光照装置和通气装置，所述发酵罐和所述光反应器通过管道串联连接，且均设有补料瓶经蠕动泵输送营养液/培养基。
优选地，步骤(1)中，待微藻细胞达到最大比生长速率或所述培养基中碳源消耗至初始浓度的80％–85％时开始进行补料，所述流加补料和半连续补料均分多次进行。根据微藻细胞对营养盐的消耗程度确定补料量，补料后的营养盐浓度为微藻细胞进入对数生长中期时即达到最大比生长速率时培养基中营养盐浓度。
优选地，步骤(1)中，所述半连续补料时每次收获和补加的培养基体积为初始培养基体积的二分之一。
优选地，步骤(2)中，所述微藻藻液的稀释倍数为1–5倍。
优选地，步骤(2)中，采用半连续补料的方式补料提高微藻内蛋白质的含量。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明通过异养-光诱导两阶段串联培养，先通过异养培养结合流加补料和半连续补料方式提高微藻生物量和叶黄素产量，然后利用光诱导培养提高蛋白质和叶黄素的产量，解决微藻自养培养活性物质产率低的难题，实现微藻高效联产叶黄素和蛋白质的目的，培养方法简便，培养周期短，适用于微藻规模化高密度培养。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：
图1是异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的装置结构示意图；其中，1–发酵罐罐体、2–搅拌桨、3–排气阀、4–带阀门的管道、5–光反应器主体容器、6–通气管道、7–气体分布器、8–照明灯管；
图2是不同补料方式下异养培养小球藻叶黄素含量对比。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
图1示例性地描述了一种异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质采用的装置，包括发酵罐和光反应器通过带阀门的管道串联连接，发酵罐和光反应器均设有补料瓶经蠕动泵输送培养基，其中：发酵罐包括罐体1、搅拌浆2和排气阀3，搅拌桨2伸入罐体1底部、排气阀3位于罐体1顶部；光反应器包括主体容器5、外部光照装置和通气装置，外部光照装置采用照明灯管8，通气装置由通气管道6通入主体容器5底部与气体分布器7连接而成。
以下实施例中异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质采用的小球藻为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)由中国科学院海洋研究所提供。
实施例1
采用如图1所示的装置进行异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，步骤如下：在pH 6.5、培养温度为28±0.5℃、光照强度为50μmol/m2/s和光暗周期为14h：10h的条件下，将蛋白核小球藻放入新鲜BG11培养基中扩大培养至对数期，然后接种至发酵罐内改良的BG11培养基中异养培养，接种密度为1.4×106cells/mL，于pH 6.5、培养温度为28±0.5℃和摇床转速为180vvm的条件下培养54h后，待培养体系中葡萄糖和KNO3浓度分别下降为原始浓度的82％和70％时进行流加补料培养，根据培养体系内小球藻葡萄糖和KNO3消耗曲线和细胞密度生长曲线确定48h为小球藻进入对数中期的时间节点，补料时将培养基中葡萄糖和NO3-N浓度恢复到48h的浓度，即葡萄糖和KNO3补料量分别为2g/L和0.1g/L，进行3次流加补料后小球藻细胞密度达2.73×108cells/mL，然后进行2次半连续补料来提高藻细胞内叶黄素的含量。运用该方法补料后，叶黄素和蛋白质含量分别为10.05mg/L和57.63mg/L，比单独半连续培养和流加培养都有明显提高(图2)，其中叶黄素含量比单独流加补料和单独半连续补料时分别提高了232.28％和87.85％。
异养培养结束后，将小球藻液用新鲜BG11培养基稀释2倍，然后转入光反应器内进行光诱导培养，光照强度为60μmol/m2/s，光暗周期为14h：10h，培养温度为28±0.5℃、通气量为1.8vvm，在此培养条件下获得最高蛋白质含量为111.05mg/L，比异养培养阶段提高1.92倍；叶黄素含量为15.34mg/L，比异养培养阶段提高52.6％。本实施例中异养培养阶段改良的BG11培养基和光诱导培养阶段BG11培养基如表1所示。
表1
Claims (9)
1.异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)异养培养阶段：将微藻接种于发酵罐内的异养培养基中，接种量为1％–30％，在pH为6.5、温度为27.5–28.5℃和黑暗避光的条件下进行异养培养，待微藻培养至对数生长中期时，先以流加补料的方式向发酵罐中补充碳源和氮源得到高密度微藻生物量后，再以半连续补料的方式向发酵罐中补充碳源和氮源促进叶黄素积累；
(2)光诱导培养阶段：步骤(1)中微藻异养培养结束后，将微藻藻液稀释并转移至与所述发酵罐串联的光反应器内，在光诱导培养基中进行光诱导培养，诱导微藻细胞快速合成蛋白质，光照强度为60–100μmol/m2/s，光暗比为14：10(h/h)。
2.根据权利要求1所述异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，其特征在于，所述异养培养基为改良的BG11培养基，按照终浓度(mg/L)计组成为：葡萄糖7500，KNO3：500，NaNO3：150，Na2CO3：20，K2HPO4：40，MgSO4·7H2O：75，CaCl2·2H2O：36，柠檬酸：6，Na2MoO4·2H2O：0.71，Na2EDTA：1，柠檬酸铁铵：6，ZnSO4·7H2O：8.82，MnCl4·4H2O：1.44，CuSO4·5H2O：1.57，Co(NO3)2·2H2O：0.49；
所述光诱导培养基为BG11培养基，按照终浓度(mg/L)计组成为：Na2CO3：20，K2HPO4：40，MgSO4·7H2O：75，CaCl2·2H2O：36，柠檬酸：6，Na2MoO4·2H2O：0.71，Na2EDTA：1，柠檬酸铁铵：6，ZnSO4·7H2O：8.82，MnCl4·4H2O：1.44，CuSO4·5H2O：1.57，Co(NO3)2·2H2O：0.49。
3.根据权利要求1所述异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，其特征在于，步骤(1)中，通过搅拌或振荡的方式保持异养培养过程中微藻处于均匀混合状态。
4.根据权利要求1所述异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，其特征在于，所述发酵罐包括罐体、搅拌浆和排气阀，所述光反应器包括主体容器、外部光照装置和通气装置，所述发酵罐和所述光反应器通过管道串联连接，均设有补料瓶经蠕动泵输送培养基。
5.根据权利要求1所述异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，其特征在于，步骤(1)中，待微藻细胞达到最大比生长速率或所述异养培养基的碳源为初始浓度的80％–85％时开始补料，且所述流加补料和半连续补料均分多次进行。
6.根据权利要求1所述异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，其特征在于，步骤(1)中，半连续补料时每次收获和补加的培养基体积为初始培养基体积的二分之一。
7.根据权利要求1所述异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述微藻藻液的稀释倍数为1–5倍。
8.根据权利要求1所述异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，其特征在于，步骤(2)中，光诱导培养过程中以半连续补料的方式补料。
9.根据权利要求1所述异养-光诱导串联培养微藻联产叶黄素和蛋白质的方法，其特征在于，所述微藻为蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。
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