CN114214191B - 一种细胞挤压和电穿孔装置及电穿孔方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞挤压和电穿孔装置及电穿孔方法，其中装置包括具有纳米微通道基底的耗材和具有中空空间和底部滤膜的挤压电穿孔装置，挤压电穿孔装置与耗材配合使用；耗材内设置有含细胞的培养基，使用时，挤压电穿孔装置与耗材紧密接触，且挤压电穿孔装置的底部与耗材的底部形成一个单层。本发明的一种细胞挤压和电穿孔装置及电穿孔方法，利用过滤和挤压的方式，使悬浮在培养基中的细胞在电极之间迅速形成单层细胞，从而实现高效的电穿孔。
Description
技术领域
本发明涉及生物装置领域，尤其涉及一种细胞挤压和电穿孔装置及电穿孔方法。
背景技术
电穿孔技术是一种通过外加电场，击穿细胞膜，使外源性物质有机会进入细胞内的技术。在基因编辑、基础研究、蛋白生产、细胞治疗等领域有广泛的应用。一般的电穿孔技术是将细胞分散在缓冲溶液中，置于阴极和阳极电极之间，然后通电。由于微观下细胞在电场中的位置和微环境差异很大，因此电穿孔过程具有很强的随机性，导致阳性率低，死亡率高。尽管最新的商品化电转仪做出了一些改进，例如Thermo Fisher的Neon***将传统的比色皿电转杯改为电转吸头，通过减小电极间距使电场更均匀；又如Lonza的Nucleofector通过特制的缓冲溶液增加质粒进入细胞核的几率，但都没有从根本上解决电穿孔随机性的问题。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是现有的电转仪或电穿孔装置存在的电穿孔随机性问题，而使用单层细胞进行定向穿孔和导入的电穿孔装置存在的耗时长、需要使用特殊的生物胶将细胞临时粘附在基底上、操作复杂、生物胶的成本高等问题。因此，本发明提供了一种细胞挤压和电穿孔装置及电穿孔方法，利用过滤和挤压的方式，使悬浮在培养基中的细胞在电极之间迅速形成单层细胞，从而实现高效的电穿孔。
为实现上述目的，本发明提供了一种细胞挤压和电穿孔装置，包括具有纳米微通道基底的耗材和具有中空空间和底部滤膜的挤压电穿孔装置，挤压电穿孔装置与耗材配合使用；耗材内设置有含细胞的培养基，使用时，挤压电穿孔装置与耗材紧密接触，且挤压电穿孔装置的底部与耗材的底部形成一个单层。
进一步地，挤压电穿孔装置包括壳体、中空空间、滤膜层、电极层、导电层、下端橡胶圈、上端橡胶圈和通孔；壳体的形状与耗材的形状相同且小于耗材的尺寸，壳体的底部设置为滤膜层和电极层，导电层沿壳体的侧壁内部和顶部内部布置，导电层和滤膜层、电极层围成一个中空空间，壳体的侧壁设置有通孔，导电层的对应位置设置有通孔。
进一步地，电极层设置在滤膜层的上层。
进一步地，滤膜层设置为多孔滤膜层。
进一步地，多孔滤膜层设置为由高分子材料制成的具有多孔结构的绝缘体滤膜，其中，孔径为0.1-8μm，密度为1x 104-4x 108/cm2，厚度为5-50μm。
进一步地，电极层设置为筛网结构。
进一步地，通孔设置为2个，2个通孔分别设置在壳体侧壁和壳体侧壁的导电层的侧壁并且靠近壳体顶端的导电层，2个通孔相互对称。
进一步地，还包括样品架，挤压电穿孔装置的底部与耗材的底部挤压形成一个单层后，放置于样品架用于完成电穿孔。
进一步地，样品架包括架体、下电极和连接电极线路，下电极设置在架体的下端，下电极的上侧设置有一个凹槽，凹槽用于放置待转物水溶液，当挤压电穿孔装置的底部与耗材的底部挤压形成一个单层后放置于样品架后，挤压电穿孔装置的底部与凹槽内的待转物水溶液接触，连接电极线路分别与导电层和下电极连接，形成电流通路。
在本发明的另一较佳实施方式中，提供了一种细胞挤压和电穿孔装置的方法，包括以下步骤：
1、收获适量的细胞，分散并重悬在50-100μL新鲜培养基中，形成细胞悬液；
2、将细胞悬液加入耗材中；
3、在耗材上端***挤压电穿孔装置，缓慢下压，直到挤压电穿孔装置的底部与耗材的基底形成一个单层；
4、将下电极放入样品架的架体中，将适量待转物水溶液滴入下电极的凹槽中；
5、将步骤3中的挤压电穿孔装置和耗材放入样品架中，与下电极组合，连接电极线路，形成通路，然后通过仪器完成电穿孔；
6、小心地抽出活塞式上电极，向耗材内补充50-100μL新鲜培养基，继续培养细胞一段时间后，观察转染结果。
技术效果
本发明的一种细胞挤压和电穿孔装置及方法，大大缩短了电穿孔样品的准备时间，无需使用生物胶，避免生物胶对细胞的损伤，同时，耗材基底可反复使用，大大降低成本。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例的一种细胞挤压和电穿孔装置的耗材示意图；
图2是本发明的一个较佳实施例的一种细胞挤压和电穿孔装置的挤压电穿孔装置与耗材配合使用的示意图；
图3是本发明的一个较佳实施例的一种细胞挤压和电穿孔装置的示意图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下描述中，为了说明而不是为了限定，提出了诸如特定内部程序、技术之类的具体细节，以便透彻理解本发明实施例。然而，本领域的技术人员应当清楚，在没有这些具体细节的其它实施例中也可以实现本发明。在其它情况中，省略对众所周知的***、装置、电路以及方法的详细说明，以免不必要的细节妨碍本发明的描述。
本发明实施例提供了一种细胞挤压和电穿孔装置，包括具有纳米微通道基底的耗材和具有中空空间和底部滤膜的挤压电穿孔装置，挤压电穿孔装置与耗材配合使用；如图1所示，耗材1内设置有含细胞3的培养基2，耗材的底部为具有纳米微通道的基底，本实施例中，纳米微通道的孔径为50nm-8μm，厚度为5-10μm，密度为1x104-1x108个/cm2。使用时，挤压电穿孔装置与耗材紧密接触，且挤压电穿孔装置的底部与耗材的底部形成一个单层，可通过以下方式保证其底部形成一个单层：1、控制注入的细胞量，减少堆叠的可能；2、控制间距足够小，通过挤压使得膜间距仅能容纳一个细胞的高度。
如图2所示，挤压电穿孔装置包括壳体5、中空空间6、滤膜层7、电极层8、导电层9、下端橡胶圈10、上端橡胶圈11和通孔12；如图2所示，壳体5的形状与耗材1的形状相同且小于耗材的尺寸，壳体5的底部设置为滤膜层7和电极层8，本实施例中，电极层8设置在滤膜层7的上层。滤膜层设置为多孔滤膜层。多孔滤膜层设置为由高分子材料例如聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)，聚乙烯对苯二甲酸酯(Polyester，PET)，聚酰亚胺(Polyimide，PI)等制成的具有多孔结构的绝缘体滤膜，其中，孔径为0.1-8μm，密度为1x 104-4x 108/cm2，厚度为5-50μm。电极层设置为筛网结构，材料是导电塑料，金属，石墨等中的一种或多种，厚度为0.1-2mm，孔径为0.05-0.5mm，密度为1x 102-2x 104/cm2。筛网电极层通过与导电涂层连接或者导线的方式与导电层的部分连通。导电层沿壳体的侧壁内部和顶部内部布置，导电层和滤膜层、电极层围成一个中空空间，壳体的侧壁设置有通孔，导电层的对应位置设置有通孔。如图2所示，通孔设置为2个，2个通孔分别设置在壳体侧壁和壳体侧壁的导电层的侧壁并且靠近壳体顶端的导电层，2个通孔相互对称。通孔用于排除空气及压缩空气。
如图3所示，还包括样品架，挤压电穿孔装置的底部与耗材的底部挤压形成一个单层后，放置于样品架用于完成电穿孔。
样品架包括架体13、下电极14和连接电极线路16、17，下电极14设置在架体的下端，下电极的上侧设置有一个凹槽，凹槽用于放置待转物水溶液15，当挤压电穿孔装置的底部与耗材的底部挤压形成一个单层后放置于样品架后，挤压电穿孔装置的底部与凹槽内的待转物水溶液接触，连接电极线路分别与导电层和下电极连接，形成电流通路。
在本发明的另一较佳实施方式中，提供了一种细胞挤压和电穿孔装置的方法，包括以下步骤：
1、收获适量的细胞，分散并重悬在50-100μL新鲜培养基中，形成细胞悬液；
2、将细胞悬液加入耗材中；
3、在耗材中***挤压电穿孔装置(也可称为活塞式上电极，将挤压电穿孔装置的各部件通过共注塑，热压，激光焊接等方法制作成一体)，缓慢下压，直到挤压电穿孔装置的底部与耗材的基底形成一个单层；
4、将下电极放入样品架的架体中，将适量待转物水溶液滴入下电极的凹槽中；
5、将步骤3中的挤压电穿孔装置和耗材放入样品架中，与下电极组合，连接电极线路，形成通路，然后通过仪器完成电穿孔；
6、小心地抽出活塞式上电极，向耗材内补充50-100μL新鲜培养基，继续培养细胞一段时间后，观察转染结果。
其中，步骤3，在挤压电穿孔装置的上端***活塞式上电极，缓慢下压，直到挤压电穿孔装置的底部与耗材的基底形成一个单层，具体包括：
(1)下压可以通过机器自动或者手动的方式完成；
(2)下压的过程中，细胞培养基透过电极底面的滤膜进入到电极内中空空间的部分，从而不断浓缩细胞；
(3)靠近电极底部的下端橡胶圈起到密封的作用，避免细胞悬液从侧壁溢出；
(4)在下压初期，电极内部的空气可以在培养基的推动下从通孔中逸出；
(5)靠近电极上端的上端橡胶圈在下压后期，剩余的空气被密封在电极内，由压缩空气产生的压力使得电极底部滤膜更加贴近细胞层；
(6)下压完成后，细胞在耗材基底和电极滤膜间形成一个单层。
另外步骤6，观察转染结果时，也可以将耗材内的细胞悬液吸出，转移到其它培养皿/瓶或者多孔板中继续培养。经过一段时间后观察转染结果。
本发明实施例一种细胞挤压和电穿孔装置和电穿孔方法采用独特的设计，包括密封圈的使用，通孔导气，滤网的使用，筛网电极的结合，实现了快速形成细胞单层，极大地降低了电穿孔的随机性，同时，缩短了电穿孔样品的准备时间，从8-24小时，缩短到15分钟以内；避免使用生物胶，对细胞损伤更小，同时成本更低；耗材基底可反复使用，进一步降低了实验成本。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种细胞挤压和电穿孔装置，其特征在于，包括具有纳米微通道基底的耗材和具有中空空间和底部滤膜的挤压电穿孔装置，所述挤压电穿孔装置与所述耗材配合使用；所述耗材内设置有含细胞的培养基，使用时，所述挤压电穿孔装置与所述耗材紧密接触，且所述挤压电穿孔装置的底部与所述耗材的底部形成一个单层；所述挤压电穿孔装置包括壳体、中空空间、滤膜层、电极层、导电层、下端橡胶圈、上端橡胶圈和通孔；所述壳体的形状与所述耗材的形状相同且小于所述耗材的尺寸，所述壳体的底部设置为所述滤膜层和所述电极层，所述导电层沿所述壳体的侧壁内部和顶部内部布置，所述导电层和所述滤膜层、所述电极层围成一个所述中空空间，所述壳体的侧壁设置有通孔，所述导电层的对应位置设置有所述通孔；所述电极层设置在所述滤膜层的上层；所述滤膜层设置为多孔滤膜层；所述多孔滤膜层设置为由高分子材料制成的具有多孔结构的绝缘体滤膜，其中，孔径为0.1-8μm，密度为1x 104-4x 108/cm2，厚度为5-50μm；所述电极层设置为筛网结构；所述通孔设置为2个，2个通孔分别设置在壳体侧壁和壳体侧壁的所述导电层的侧壁并且靠近壳体顶端的所述导电层，2个所述通孔相互对称；还包括样品架，所述挤压电穿孔装置的底部与所述耗材的底部挤压形成一个单层后，放置于所述样品架用于完成电穿孔；所述样品架包括架体、下电极和连接电极线路，所述下电极设置在所述架体的下端，所述下电极的上侧设置有一个凹槽，所述凹槽用于放置待转物水溶液，当所述挤压电穿孔装置的底部与所述耗材的底部挤压形成一个单层后放置于所述样品架后，所述挤压电穿孔装置的底部与所述凹槽内的待转物水溶液接触，所述连接电极线路分别与所述导电层和所述下电极连接，形成电流通路。
2.一种使用如权利要求1所述的细胞挤压和电穿孔装置的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1、收获适量的细胞，分散并重悬在50-100μL新鲜培养基中，形成细胞悬液；
2、将所述细胞悬液加入所述耗材中；
3、在耗材上端***所述挤压电穿孔装置，缓慢下压，直到所述挤压电穿孔装置的底部与所述耗材的基底形成一个单层；
4、将下电极放入样品架的架体中，将适量待转物水溶液滴入所述下电极的凹槽中；
5、将步骤3中的所述挤压电穿孔装置和所述耗材放入样品架中，与下电极组合，连接电极线路，形成通路，然后通过仪器完成电穿孔；
6、小心地抽出所述活塞式上电极，向耗材内补充50-100μL新鲜培养基，继续培养细胞一段时间后，观察转染结果。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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