CN114213537B

CN114213537B - Cd133抗体、嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN114213537B
Application number: CN202111597400.1A
Authority: CN
Inventors: 张伟; 翟优; 李冠璋; 江涛
Original assignee: Beijing Neurosurgical Institute
Current assignee: Beijing Neurosurgical Institute
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2041-12-24
Also published as: CN114213537A

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及CD133抗体、嵌合抗原受体及其应用。本发明所提供CD133抗体或其抗原结合片段对CD133具有较好的亲和力和特异性，且含有CD133抗体片段的嵌合抗原受体具有优秀的抗肿瘤效果。

Description

CD133抗体、嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及CD133抗体、嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

人CD133蛋白与鼠prominin-1(一种富集于神经上皮干细胞顶端表面微绒毛上的表面蛋白)有大约60％的同源性，故也称人CD133为人prominin-1。CD133是一个5次跨膜糖蛋白，最初于1997年作为CD34阳性造血干细胞上的表面抗原被AC133单抗靶定而被发现。与此同时测定其分子量约为97kDa，由865个氨基酸组成，包括85个氨基酸N端胞外域、5个跨膜区、2个大的胞外环(包含8个潜在的连接N端的糖基化位点)以及一个由50个氨基酸组成的胞内尾端。有研究表明AC133抗原是一个表观分子量为120kDa的糖基化蛋白。同年发现了另一个CD133糖基化表位-AC141。CD133抗原被认为是肿瘤干细胞(CSCs)的特异性标记物，在多种实体瘤中表达。CD133在肿瘤细胞中表达对癌症的发展具有重要意义，CD133+肿瘤起始细胞是多种侵袭性癌症中化学和放射耐药的已知标志物，可能会导致肿瘤异质性。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)是人工合成的T细胞受体，由抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。抗原结合结构域位于T细胞膜外，包括单链抗体或配体，用于特异性地结合靶抗原。胞内信号传导结构域位于T细胞膜内，用于向T细胞内传导信号以刺激T细胞产生免疫反应。

CAR-T能够特异性识别肿瘤细胞依赖于CAR分子细胞外结构域的scFv。然而，目前对于实体肿瘤，尤其是脑胶质瘤的CAR-T治疗，尚缺失理想的靶点选择。实体肿瘤的异质性使得现有的表达嵌合抗原受体的T细胞不能识别肿瘤组织内低表达或不表达所选抗原的肿瘤细胞，从而整体上对肿瘤细胞的杀伤能力仍然较弱。然而，CAR-T在实体肿瘤中，特别是脑胶质瘤的应用尚没有取得理想结果。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种能够特异性识别CD133的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。

本发明的第二目的在于提供一种嵌合抗原受体，其胞外域具有如上所述scFv。

本发明的第三目的在于提供一种分离的核酸，其能够表达如上所述抗体或其抗原结合片段，或如上所述的嵌合抗原受体。

本发明的第四目的在于提供含有如上所述核酸的载体。

本发明的第五目的在于提供宿主细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体，或表达有如上所述的嵌合抗原受体。

本发明的第六目的在于提供药用组合物，其包含如上所述的宿主细胞。

本发明所提供CD133抗体或其抗原结合片段对CD133具有较好的亲和力和特异性，且含有CD133抗体片段的嵌合抗原受体具有优秀的抗肿瘤效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例所提供的SEQ ID NO:14所代表的scFv与脑胶质母细胞瘤细胞的流式细胞仪检测结果图；(standard为商品化CD133兔抗人单抗，proteintech公司，货号18470)；

图2为本发明一个实施例所提供的SEQ ID NO:14所代表的scFv与脑胶质母细胞瘤细胞的ELISA结果图；standard为商品化CD133兔抗人单抗，proteintech公司，货号18470)；

图3为本发明一个实施例所提供的CAR-T 1细胞的流式细胞仪检测结果图；

图4为本发明一个实施例所提供的CAR-T 2细胞的流式细胞仪检测结果图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。

本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。

本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。

本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

本发明中，术语“特异性结合”和“特异性地结合”是指抗体或其抗原结合片段对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M或更强的亲和力(K_D)结合。

如本文所用，术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，在本发明中采用Kabat等人所定义(Kabat等人，Sequences of proteins ofimmunological interest,5th Ed"US Department of Health and Human Services,NIH,1991,和后来的版本)。有三个重链CDR(HCDR)和三个轻链CDR(LCDR)。此处，取决于情况，术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。

如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含能够结合抗原的胞外结构域、衍生自不同于衍生胞外结构域的多肽的多肽的跨膜结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。“嵌合抗原受体(CAR)”有时称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指可结合特定抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知在细胞中作为传输信号以引起生物过程的活化或抑制的结构域起作用的任何寡肽或多肽。

如本文所用，所述嵌合抗原受体中所包含的“区”或者“域”是指多肽中的一个区，其可以独立于其它区而折叠成为特定结构。这些“区”或者“域”可以是鼠源或其他动物源性的序列，优选为人源序列。

本发明涉及能够特异性识别CD133的抗体或其抗原结合片段，其具有SEQ ID NO:1～3所示的重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及SEQ ID NO:4～6所示的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。

抗体或其抗原结合片段的变体也在本发明范围内，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列与SEQ ID NO:4～6所示互补决定区组合中的任一组相比，分别包含至多3个氨基酸的突变(例如1个、2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加或其任意组合)；优选地，所述突变为保守突变。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的序列与SEQ ID NO:1～3所示互补决定区组合中的任一组相比，分别包含至多3个氨基酸的置换(例如1个、2个或3个氨基酸置换)。

在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段为鼠抗体、人鼠嵌合抗体或人源化抗体。

在一些实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段具有SEQ ID NO:7所示的重链可变区HCVR和SEQ ID NO:8所示的轻链可变区LCVR。

在一些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区HCVR和轻链可变区LCVR，其中所述HCVR和LCVR的氨基酸序列与SEQ ID NO:7～8所示序列相比分别具有至少80％的同一性。在一些实施方式中，所述HCVR的氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示的HCVR序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性；所述LCVR的氨基酸序列与SEQ ID NO:8所示的LCVR序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一些情况下，抗体或其抗原结合片段的变体至少包括上述6个CDR；在一些情况下，抗体的变体至少包括一个重链和一个轻链，而在其他情况下，变体形式含有两个相同的轻链和两个相同的重链(或其子部分)。在一些情况下，变体是在本发明所提供的抗体序列上发生保守突变(例如保守置换或修饰)所得到的。“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变，优选为保守置换。

“保守置换”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。

通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile中的彼此置换、羟基残基Ser和Thr的互换、酸性残基Asp和Glu的交换、酰胺残基Asn和Gln之间的置换、碱性残基Lys和Arg的交换以及芳香残基Phe、Tyr间的置换。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

修饰可以为通过天然过程(诸如加工和其他翻译后修饰)，或通过化学修饰技术所得到衍生物，例如通过添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸酯和/或其他这样的分子来进行化学修饰，其中一个或多个分子不是天然地附着到蛋白质。衍生物包括盐。这样的化学修饰在基础教科书和更详细的专论中以及在大量研究文献中有详细描述，并且它们是本领域技术人员熟知的。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定抗体或其抗原结合片段中的几个位点。此外，给定的抗体或其抗原结合片段可以含有许多类型的修饰。修饰可发生在抗体或其抗原结合片段中的任何位置，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲基化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚接、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白质酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烃基化和ADP-核糖基化、硒化、硫酸化、蛋白质的氨基酸的传递RNA介导加成(诸如精氨酰化)以及泛素化。它们还可以结合至维生素，例如生物素、叶酸或维生素B12。参见例如Proteins--Structure And Molecular Properties,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)和Wold,F.,“Posttranslational ProteinModifications：Perspectives and Prospects,”pgs.1-12in PosttranslationalCovalent Modification Of Proteins,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York(1983)；Seifter等人.,MetH.Enzymol.182：626-646(1990)和Rattan等人,“ProteinSynthesis：Posttranslational Modifications and Aging,”Ann.N.Y.Acad.Sci.663：48-621992)。

变体保留特异性结合CD133的能力(优选能够特异性结合天然非变性CD133蛋白)。所属领域技术人员将能够使用熟知的技术确定如本文所阐明的抗原结合分子的合适变体。在某些实施方案中，所属领域技术人员可鉴别抗体或其抗原结合片段中对于特异性结合CD133的活性而言不重要的区来改变而不破坏活性的合适区域。对于核苷酸和氨基酸序列，术语“同一性”表明当具有适当的***或缺失的情况下最佳比对和比较时两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。

“抗原结合片段”此用语包括这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab')₂、Fd、Fv、scFv、抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物，例如scFv-Fc等，优选地为scFv。

术语“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子，其保留结合抗原的能力。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-连接肽-VH-COOH或NH₂-VH-连接肽-VL-COOH。

连接肽通常是柔性的，柔性的连接肽可以减少融合蛋白与目的蛋白之间的空间位阻，从而更有利于蛋白正确折叠。在另外的实施方案中，连接肽是刚性接头肽；即相对非柔性肽接头。刚性连接肽不要求完全缺乏柔性，而是比柔性接头肽如富甘氨酸肽接头柔性少。由于其相对缺乏柔性，刚性连接肽降低通过刚性连接肽连接在一起的两个蛋白结构域(在当前情况下是稳定剂蛋白和热稳定逆转录酶)的运动。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸数目为1～30个；可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个；优选5～20个。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸是不具有除连接以外的额外功能(例如蛋白定位、酶切位点等)的无意义多肽。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自Gly、Ser、Pro、Ala以及Glu中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n、(GS)n或(G)n，其中n选自1，2，3，4，5或6。

在一些实施方式中，所述scFv的连接肽序列为SEQ ID NO:9所示。

根据本发明的再一方面，还涉及嵌合抗原受体，其胞外域具有如上所述的scFv。

在一些实施方式中，所述的嵌合抗原受体还包含铰链区、跨膜域和胞内信号传导区。

在一些实施方式中，所述铰链区选自CD8α的hinge区；优选的氨基酸序列是TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD。

跨膜域可以选自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、和NKG2C中的一种。在一些实施方式中，所述跨膜域为CD8α跨膜区。优选的氨基酸序列是IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。

在一些实施方式中，所述胞内信号传导区包括CD3ζ信号传导域；优选的氨基酸序列是RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

在一些实施方式中，所述胞内信号传导区还包含CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、DAP12、DAP10、2B4中的一种或多种。在一些具体的实施方式中，所述胞内信号传导区还包含氨基酸序列为RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS所示的CD28。

在一些实施方式中，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

根据本发明的再一方面，还涉及分离的核酸，其能够表达得到如上所述抗体或其抗原结合片段，或如上所述的嵌合抗原受体。

根据本发明的再一方面，还涉及含有如上所述核酸的载体。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸***其中的一种核酸运载工具。当载体能使***的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、***瘤病毒、***多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

载体也可以为组合物，例如，可以将不同区段的不同核酸位于不同载体上。

在本公开的一些具体的实施方式中，所述载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体或CRISPR/CAS质粒。

根据本发明的再一方面，还涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸或如上所述的载体，或表达有如上所述的嵌合抗原受体。

在一些实施方式中，所述的宿主细胞为免疫细胞。

免疫细胞例如T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞等。

在一些实施方式中，所述的宿主细胞为T细胞。

T细胞可以为本领域所熟知的亚类，例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、γδT细胞中的任一种。

根据本发明的再一方面，还涉及药用组合物，其包含如上所述的宿主细胞。

所述药物组合物还可以包括药学上可接受的载剂。如本文所用，“药学上可接受的载剂”包括当与活性组分组合时允许所述组分保持生物学活性并且与受试者的免疫***不发生反应的任何材料。实例包括但不限于标准药物载剂(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液))和各种类型的润湿剂中的任一者。用于气雾剂或肠胃外施用的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或生理(0.9％)盐水。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法来配制(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，A.Gennaro编,Mack PublishingCo.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice ofPharmacy,第21版,Mack Publishing,2005)。

根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的宿主细胞(特别是T细胞)在制备用于预防和/或肿瘤的药物中的应用。

根据本发明的再一方面，还涉及一种治疗有需要的患者的肿瘤的方法，该方法包括向该患者施用治疗有效量的如上所述的宿主细胞或药用组合物。

肿瘤优选实体瘤，在本发明中，“实体瘤”包括：骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、***、***、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、***、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、***、外***、阴囊、睾丸、输精管、***、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、脊髓、脑脊液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。特别地，优选预期的肿瘤所具有的标志物可被本发明所提供的CD133抗体或其结合片段所靶向，例如脑胶质瘤。

应该理解的是，设想的治疗方法还将包括施用其他免疫治疗实体，特别优选为免疫治疗实体，包括病毒癌症疫苗(例如，编码癌症特异性抗原的腺病毒载体)、细菌癌症疫苗(例如，表达一种或多种癌症特异性抗原的非热原性大肠杆菌)、酵母癌症疫苗、N-803(也被称为ALT-803，ALTOR生物科学公司)、和抗体(例如，与肿瘤相关抗原或患者特异性肿瘤新抗原结合)、干细胞移植物(例如，异体或自体)和肿瘤靶向细胞因子(例如，NHS-IL12，IL-12与肿瘤靶向抗体或其片段偶联)。

“患者”是哺乳动物，哺乳动物包括但不限于人、猴子、猪和其他农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、啮齿动物(包括小鼠、大鼠、豚鼠)等。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

实施例1

本实施例用于说明CD133抗体的制备。

1.培养杂交瘤细胞

复苏杂交瘤细胞株后培养，待细胞数扩增至约1×10⁷时，1000rpm×5min，离心收集细胞。

2.提取细胞RNA

超净工作台环境下，将1ml Trizol试剂加入离心细胞，静置5min，加入氯仿2mL，剧烈摇晃15sec，室温静置3min，12000rpm×15min，移取上层水样层至新的EP管，加入0.5mL异丙醇，室温静置10min。12000rpm×10min。弃上清，加入1mL 75％乙醇，7500rpmx5 min，干燥沉淀，加入50μL双蒸水。琼脂糖电泳鉴定纯度并定量，保存于-70℃备用。

3.反转录制备cDNA

细胞总RNA1μL，RNase Free ddH₂O 6μL，oligo dT Primer 0.5μL，PRIME ScriptRT Enzyme Mix I 0.5μL，5×Prime Script Buffer 2μL，混匀，37℃15min，85℃5s。

4.扩增cDNA

用公本司设计的小鼠IgG HCVR LCVR引物库，分别扩增上述cDNA。5×Prime StarBuffer 10μL，dNTP 4μL，cDNA 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，PrimeSTAR 0.5μL，补水至50μL。按以下反应条件进行PCR反应:94℃温育5min，94℃变性45s，63℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环后72℃延伸10min。

5.琼脂糖凝胶电泳及胶回收

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果，将分子量在250-350bp的扩增产物送交测序。

所得抗体命名为4D3，测序得到CD133抗体重链可变区(HCVR)氨基酸序列：

EVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWGGGITDYNSALKSRLSISRDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARTDLGLFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:7)

CD133抗体轻链可变区(LCVR)氨基酸序列：

DNVLTQSPAFMSASPGEKVTMTCSVSSSVSDMFWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFGGSGSGTSYSLTISSMEADDAATYYCQQWSSNPHVRRGDQAGNET(SEQ ID NO:8)

实施例2

本实施例用于说明嵌合抗原受体表达载体的构建。

(1)采用全序列合成方法，分别合成表1中所示的核苷酸序列：

表1

(2)采用pLVX-IRES-ΔNGFR(购自Clontech公司，货号为631982)作为载体，采用常规方法分别***步骤(1)中合成的2种核苷酸序列(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:15)，得到本实施例的2种慢病毒表达载体。同时采用常规方法构建含有SEQ ID NO:13的质粒过表达载体。

实施例3

本实施例用于说明本案例中的重组抗CD133单链抗体对脑胶质瘤肿瘤干细胞的结合活性。

(1)将实施例2中构建的质粒过表达载体按照下述方法进行大肠杆菌的转染、扩增以及蛋白质纯化。

(2)蛋白表达与纯化流程：

将构建好的质粒转化BL21 DE3感受态细胞，接种抗性LB平板培养基，生长过夜；挑选转化平板的6个单克隆，分别接种3ml抗性液体培养基；37℃，220RPM培养至OD600nm 0.5-0.6，加入0.5mM IPTG 20℃诱导表达3.5小时；离心收集菌体，超声破碎，SDS-PAGE检测表达情况。小样表达结果分析：蛋白质在上清和包涵体中均有表达，可继续进行可溶性表达纯化。

选择小样表达良好的菌株进行大样表达。接种60ul菌种至200ml抗性培养基中，37℃，220RPM培养过夜。次日加入新鲜抗性培养基至800ml，培养1-2h至OD600nm 0.5-0.6。加入200ul的1M IPTG(28℃或37℃)诱导表达3.5h。4℃离心收集菌体(66转/秒×15min)，弃上清，加入30ml PBST悬浮菌体，加入终浓度1mM PMSF，冰浴条件下超声波200W破碎6min。摇床4℃孵育1h。4℃高速离心，133转/秒×15min，取上清，加入400ul镍柱4℃结合过夜。收集镍柱(33转/秒×5min)，用20mM imidazole洗涤液洗涤beads，洗去杂蛋白(1ml×3次)。加入300ul 300mM imidazole洗脱液，让洗脱液与beads充分结合1h，离心收集上清。向beads中再次加入300ul的洗脱液，洗脱1h，离心收集上清，两次洗脱液合为一管。对PBS缓冲液透析换液。SDS-PAGE鉴定蛋白质分子量，纯度及浓度。大样表达结果分析：目标蛋白质为可溶性上清表达，总量2mg。

(3)通过倍比稀的方法对scFv进行稀释并与脑胶质瘤细胞株进行结合。具体方法为：将原浓度为10ug/ml的scFv按照4倍进行倍比稀释，并设立1ug/ml作为标准工作浓度。同时作为对比，选用商品化小鼠抗人CD133抗体(proteintech)进行相同浓度的对照实验。浓度梯度，10、2.5、1、0.625、1.6、0.04、0.01ug/ml。不同浓度抗体溶液体积均为100ul，重悬10⁵个脑胶质瘤细胞。室温孵育20分钟。此后，用1ml PBS重悬，1000g离心5分钟，去上清，保留细胞沉淀。再次用1ml PBS重悬，1000g离心5分钟，去上清，保留细胞沉淀。此后，用100ulPBS重悬细胞，加入1ul APC标记的山羊抗小鼠/兔H+L抗体(abcam)，室温避光孵育20分钟。用1ml PBS重悬，1000g离心5分钟，去上清，保留细胞沉淀。再次用1ml PBS重悬，1000g离心5分钟，去上清，保留细胞沉淀。此后，用500ul PBS重悬细胞，上机检测各个scFv浓度处理下肿瘤干细胞APC的荧光强度。实验结果如图1所示。

(4)通过倍比稀的方法对scFv进行稀释并与重组人CD133蛋白进行结合。具体做法为：用ELISA包被液(solarbio)稀释重组人CD133蛋白(sino biological)至1ug/ml，4℃过夜包被96孔板。次日吸去液体，每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔用2％FBS的PBS溶液室温封闭30分钟。加入scFv及商品化小鼠抗人CD133抗体(proteintech)。通过倍比稀释的方法进行2倍稀释。浓度梯度，5、2.5、1.25、0.625、0.03、0.015、0.08、0.04、0.02、0.01ug/ml。每孔100ul，室温孵育1小时。弃上清，每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔加入100ul 1:1000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠H+L抗体(abcam)，室温孵育1h。弃上清，每个孔用300ul PBS清洗3次。每孔加入100ul ELISA显影剂(solarbio)，室温避光15分钟，加入100ul ELISA终止液(solarbio)，450nm波长下检测吸光度。实验结果如图2所示。

实施例4

本实施例用于说明表达抗CD133的单链抗体的T细胞的制备及检测。

(1)将实施例2构建的2种CAR慢病毒表达载体和pLVX-IRES-ΔNGFR空载体分别进行慢病毒包装，然后按照下述方法分别进行T细胞的体外培养、转染和扩增。

(2)按照下述方法分离血液中的T细胞：将1mL无菌PBS与1mL血液混匀，然后缓慢加入到淋巴细胞分离液Ficoll的上层，并于4℃、400g条件下离心30min，加减速分别设置为0。离心结束后，去掉上层血浆，吸取中间白膜层细胞，加入PBS重悬洗涤，并于100g条件下离心10min，加减速正常。离心结束后，去掉上层洗涤液，加入1mL的1640+10％FBS+1％双抗+1×Glutamine培养基重悬细胞，然后利用抗人CD3/CD28磁珠(购自Thermo Fisher公司)刺激扩增，其中，重悬后细胞浓度为1×10⁶细胞/mL，磁珠加入量为100μL，再加入100IU/mL rhIL-2(Peprotech)，刺激培养2天，得到T细胞。

(3)按照下述方法进行慢病毒转染：取7份上述分离得到的T细胞，分别加入步骤(1)包装好的慢病毒，然后加入终浓度为6μg/mL的polybrene，混匀，并于32℃、800g的条件下离心100min。离心结束后放入培养箱中继续培养24h。培养结束后将培养物于1500rpm的条件下离心15min，并将离心得到的细胞以1×10⁶/mL的密度接种于培养板内，以rhIL2-100IU/mL刺激培养，以后每2-3天换液一次，直至2-4周，得到转染后的T淋巴细胞CAR-T 1(表达SEQ ID NO:12所示融合蛋白)、CAR-T 2(表达SEQ ID NO:10所示融合蛋白)。

培养结束后，用PBS重悬细胞，并用流式细胞仪检测上述2种CAR-T细胞的比例及表面CAR蛋白的表达。检测方法为：分别离心收集转染后的待检测CAR-T细胞，PBS洗涤1次后弃上清，按抗体说明书加入相应检测量的单抗避光30min后，利用PBS洗涤、重悬，过膜后采用流式细胞仪进行夹心法检测，检测时使用的抗体为His-tag标记的CD133和APC标记的抗His-tag的抗体的混合物。结果如图3-4所示。

实施例5

本实施例用于验证表达抗CD133单链抗体的T细胞对CD133阳性肿瘤干细胞的杀伤能力。

本实施例中进行LDH释放实验检测的试剂盒购自同仁化学公司。

分别取实施例3中转染并培养得到的2种CAR-T细胞，分别与CD133阳性的胶质瘤干细胞GSC 2-4按照不同的效靶比(T细胞数量：胶质瘤干细胞数量)混合。将混合后的细胞置于96孔板中进行培养，其中，每孔中含有胶质瘤干细胞4×10⁴个，每孔反应体系为200μL。培养条件包括：37℃，5％CO₂，饱和湿度孵箱孵育4小时。

乳酸脱氢酶活性测定：离心结束后，每孔吸取上清液100μL置于96孔酶标板中，同时，每孔加入100μL LDH底物，室温避光反应30min。反应结束后，每孔加50μL终止液终止酶促反应。在酶标仪490nm测定光密度值(OD)。计算各组平均光密度值(OD)，按下式计算每种T细胞对胶质瘤干细胞的裂解率。结果如表2所示。

裂解率％＝(实验组OD-胶质瘤干细胞自发释放OD-效应细胞自然释放OD)/(胶质瘤干细胞最大释放OD-胶质瘤干细胞自发释放OD)

表2

注：CAR-T 1为传统靶向脑胶质瘤的CAR-T，即靶向EGFRvIII靶点的CAR-T。CAR-T 2为本公开所提供的靶向CD133的CAR-T

由表2可以看出，本公开提供的表达抗CD133的单链抗体的T淋巴细胞能够特异性杀伤CD133阳性的肿瘤干细胞，且特异性较高、杀伤能力较强。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市神经外科研究所

<120> CD133抗体、嵌合抗原受体及其应用

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ser

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 2

Ile Trp Gly Gly Gly Ile Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 3

Ala Arg Thr Asp Leu Gly Leu Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 4

Ser Ser Val Ser Asp

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 5

Leu Thr Ser

1

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 6

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro His Val Arg Arg Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Thr Asp Leu Gly Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 8

<211> 106

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 8

Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Asp Met

20 25 30

Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Asp

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro His Val

85 90 95

Arg Arg Gly Asp Gln Ala Gly Asn Glu Thr

100 105

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 10

<211> 459

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 10

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr

20 25 30

Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Thr Asp Leu Gly Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala

130 135 140

Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Val

145 150 155 160

Ser Asp Met Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro

165 170 175

Trp Ile Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

180 185 190

Gly Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met

195 200 205

Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn

210 215 220

Pro His Val Arg Arg Gly Asp Gln Ala Gly Asn Glu Thr Thr Thr Thr

225 230 235 240

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

245 250 255

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

260 265 270

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

275 280 285

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

290 295 300

Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

305 310 315 320

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

325 330 335

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser

340 345 350

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

355 360 365

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

370 375 380

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

385 390 395 400

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

405 410 415

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

420 425 430

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

435 440 445

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

450 455

<210> 11

<211> 1416

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

catcatcacc atcaccatag tggtggtggt ggttctcagg tgcaggtgtt ggagtctggg 60

ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg agactctcct gtgcagcctc tggattcacc 120

tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc 180

tcggctatta gtggtagtgg tggtagtaca aactacgcag actccgtgaa gggccggttc 240

accatctcca gagacaattc caagaacaca ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc 300

gaggacacgg ccgtctatta ctgtgctggg agcagtggct ggtccgagta ctggggccag 360

ggaaccctgg tcaccgtctc ctcgggaggt ggtggatccg gaggtggtgg atccggaggt 420

ggtggatccg acatccagat gacccagtct ccatcctccc tgtctgcatc tgtaggagac 480

agagtcacca tcacttgccg ggctagtcag ggcattagaa ataatttagc ctggtatcag 540

cagaaaccag ggaaagcccc taagcgcctg atctatgctg cctccaattt gcaaagtggg 600

gtcccatcaa ggttcaccgg cagtggatct gggacagaat tcactctcat agtcagcagc 660

ctgcagcctg aagattttgc gacttattac tgtctacagc atcacagtta cccgctcact 720

tccggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa accactaccc cagcaccgag gccacccacc 780

ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca 840

gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc 900

cctctggctg gtacttgcgg ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtagg 960

agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 1020

cccacccgca agcactacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 1080

cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 1140

tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 1200

cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 1260

gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 1320

agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 1380

tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 1416

<210> 12

<211> 471

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 12

His His His His His His Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Val

1 5 10 15

Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

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Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp

35 40 45

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

65 70 75 80

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

85 90 95

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Ser Ser

100 105 110

Gly Trp Ser Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

130 135 140

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

145 150 155 160

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asn Leu

165 170 175

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr

180 185 190

Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ile Val Ser Ser Leu Gln Pro Glu

210 215 220

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His His Ser Tyr Pro Leu Thr

225 230 235 240

Ser Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro

245 250 255

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

260 265 270

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

275 280 285

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

290 295 300

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg

305 310 315 320

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

325 330 335

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

340 345 350

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

355 360 365

Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

370 375 380

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

385 390 395 400

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

405 410 415

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

420 425 430

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

435 440 445

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

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465 470

<210> 13

<211> 746

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 13

catcatcacc atcaccatag tggtggtggt ggttctgaag ttcagctgca ggaaagtggc 60

ccgggcctgg ttgcaccgag ccagagtctg agcattacct gcaccgttag tggctttagt 120

ctgagtcgct atagcgttca ttgggtgcgc cagccgccgg gtaaaggcct ggaatggctg 180

ggcatgattt ggggcggcgg cattaccgat tataatagtg ccctgaaaag ccgtctgagt 240

attagccgtg ataatagcaa aagtcaggtt tttctgaaaa tgaatagcct gcagaccgat 300

gataccgcaa tgtattattg tgcccgcacc gatctgggtc tgtttgccta ttggggccag 360

ggcaccctgg tgaccgttag cgcaggtggc ggcggtagcg gtggcggtgg tagtggtggt 420

ggcggtagcg ataatgttct gacccagagc ccggcattta tgagcgccag tccgggtgaa 480

aaagtgacca tgacctgtag tgtgagcagt atgtgagtga tatgttttgg tatcagcaga 540

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aagccgatga tgccgcaacc tattattgtc agcagtggag cagcaatccg catgttcgtc 720

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<210> 14

<211> 249

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 14

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245

<210> 15

<211> 1413

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 15

catcatcacc atcaccatag tggtggtggt ggttctgaag ttcagctgca ggaaagtggc 60

ccgggcctgg ttgcaccgag ccagagtctg agcattacct gcaccgttag tggctttagt 120

ctgagtcgct atagcgttca ttgggtgcgc cagccgccgg gtaaaggcct ggaatggctg 180

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attagccgtg ataatagcaa aagtcaggtt tttctgaaaa tgaatagcct gcagaccgat 300

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ggcggtagcg ataatgttct gacccagagc ccggcattta tgagcgccag tccgggtgaa 480

aaagtgacca tgacctgtag tgtgagcagt agtgtgagtg atatgttttg gtatcagcag 540

aaaccgcgca gcagtccgaa accgtggatt tatctgacca gtaatctggc aagtggtgtg 600

ccggcccgct ttggcggcag cggttcaggt accagctata gtctgaccat tagcagcatg 660

gaagccgatg atgccgcaac ctattattgt cagcagtgga gcagcaatcc gcatgttcgt 720

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gctcctacca tcgcctccca gcctctgtcc ctgcgtccgg aggcatgtag acccgcagct 840

ggtggggccg tgcatacccg gggtcttgac ttcgcctgcg atatctacat ttgggcccct 900

ctggctggta cttgcggggt cctgctgctt tcactcgtga tcactcttta ctgtaggagt 960

aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 1020

acccgcaagc actaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctcccgc 1080

gtgaaattca gccgcagcgc agatgctcca gcctacaagc aggggcagaa ccagctctac 1140

aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg 1200

gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag 1260

ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga 1320

agaggcaaag gccacgacgg actgtaccag ggactcagca ccgccaccaa ggacacctat 1380

gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg 1413

Claims

1.能够特异性识别CD133的抗体或其抗原结合片段，其重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3依次如SEQ ID NO:1～3所示，轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3依次如SEQ IDNO:4～6所示。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其为鼠抗体、人鼠嵌合抗体或人源化抗体。

3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其重链可变区HCVR如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区LCVR如SEQ ID NO:8所示。

4.根据权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为scFv。

5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，所述scFv的连接肽序列为SEQ IDNO:9所示。

6.嵌合抗原受体，其胞外域具有权利要求4或5中所述scFv。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其还包含铰链区、跨膜域和胞内信号传导区。

8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，所述铰链区选自CD8α的hinge区。

9.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，所述跨膜域为CD8α跨膜区。

10.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，所述胞内信号传导区包括CD3ζ信号传导域。

11.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，所述胞内信号传导区还包含CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD27、CD40-MyD88、DAP12、DAP10、2B4中的一种或多种。

12.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO:10所示。

13.分离的核酸，其能够编码得到权利要求1～5任一项所述抗体或其抗原结合片段，或权利要求6所述的嵌合抗原受体。

14.含有权利要求13所述核酸的载体。

15.宿主细胞，其含有权利要求13所述的核酸或权利要求14所述的载体，或含有权利要求6～12任一项所述的嵌合抗原受体。

16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其为T细胞。

17.药用组合物，其包含权利要求15或16所述的宿主细胞。