CN114206891A - 用于生物聚合物的顺序合成的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

用于核酸合成的方法和设备。该方法使用包括至少一个进行脱保护步骤的脱保护单元、至少一个进行偶联步骤的偶联单元、至少一个进行氧化或硫醇化步骤的氧化/硫醇化单元、至少一个进行封端步骤的封端单元和至少一个进行洗涤步骤的洗涤单元的装置。根据期望核酸序列的合成方案将用于核酸合成的多个反应容器移动到单元，并且在多个单元处至少两个反应容器串行地同时作用。

Description

用于生物聚合物的顺序合成的方法和设备
本申请要求于2019年4月10日提交的美国临时申请62/831,853的权益，其公开内容通过引用并入本文。
本示例性实施方案涉及用于合成分子的***和方法。更具体地，本实施方案涉及用于合成生物聚合物(例如多肽和寡核苷酸)的装置和方法。然而，应当理解，本示例性实施方案也适用于其它类似的应用。
寡核苷酸是包含核苷的序列的大分子，每个核苷包含糖和核碱基。每个核苷通过核苷间键与相邻核苷分开，核苷间键有效地用于将核苷键合在一起。糖可以是戊糖，例如脱氧核糖、核糖或2'-O-取代的核糖。可以使用许多不同的碱基和取代的碱基，其中四种最常见的是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶(分别缩写为A、C、G和T)。核苷间键最常见的是磷酸酯，其可在非桥连氧原子处被多种取代基取代，最常见的是被硫或烷基、酯或酰胺基团取代。
寡核苷酸是在从事研究、诊断和治疗的生物技术实验室中使用的最重要和最普遍的试剂之一。对寡核苷酸的高需求源于它们对从生物样品获得的DNA或RNA中互补核苷酸序列的特异性。不同的方法用于合成寡核苷酸，包括亚磷酰胺、磷酸三酯和H-膦酸酯方法，其每一种在生物化学领域都是公知的。
使用通过固定床的受控流体流动的复杂有机分子的基于固相的多阶段合成是一种公认的核酸合成方法。这种通用技术已成功应用于肽、寡核苷酸和类似的长链生物聚合物的合成。关于寡核苷酸生产的化学和合成技术的全面讨论见“Manufacturing ofOligonucleotides”,E.Paredes,V.Aduha,KL.Ackley,和H.Cramer,ComprehensiveMedical Chemistry,第3版,2017Elsevier Inc.，以引用方式并入本文。
越来越多的寡核苷酸的商业规模生产变得越来越重要，因为这些物质已经走出实验室并进入主流治疗应用。市售寡核苷酸通常长度为至少6个核苷酸，有时长度为12-50个核苷酸，最常见的长度为15至30个核苷酸。
在用于生产寡核苷酸分子的一种***中，可以在反应容器中提供固体支持物并且可以将大量二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的核苷固定到固体支持物上。添加通过脱三苯甲基机制起作用的脱保护剂以从核苷中去除DMT，从而将羟基“脱保护”。结果，序列中的最后一个核苷具有一个羟基，准备接受下一个亚磷酰胺。将溶解在诸如乙腈(ACN)的溶剂中的核苷亚磷酰胺(phosphoramidite)(以下也称为“亚磷酰胺(amidite)”)引入容器中。也可以将活化剂引入具有亚磷酰胺的容器中。亚磷酰胺中的磷与羟基中的氧键合，从而提供支持物结合的核苷酸。在形成支持物结合的核苷酸之后，多余的亚磷酰胺可以用ACN从容器中冲洗掉。然后可以添加氧化剂以将三价磷转化为五价。在冲洗掉氧化剂后，可以添加封端剂以阻止未保护的羟基与在稍后阶段引入的亚磷酰胺反应。可以再次引入ACN以冲洗掉封端剂。这些步骤可以重复多次，以从支持物结合的核苷产生不断生长的寡核苷酸链。
传统的合成仪使用流通式设计，其中各种管线、泵和阀不断地充满液体并且液体被引入容器(称为“柱子”)。柱子通常是流通装置，其中新引入的液体替换先前引入的液体。通常，大型制造设施通过在批处理中使用合成仪的阵列来实现高吞吐量。这些合成仪通常被配置为连续执行单体添加循环的各个步骤，并且可以并行地对于多种不同的寡核苷酸这么做。因此，多个寡核苷酸的反应顺序以以下顺序执行，使得对每个寡核苷酸进行脱三苯甲基，然后对每个寡核苷酸进行偶联，然后对每个寡核苷酸进行封端，然后对每个寡核苷酸进行氧化。然后重复该循环直到获得全长寡核苷酸。
为了大规模制造生物聚合物(例如寡核苷酸、肽或其它)，可以使用广泛接受的固相合成方法。在这种方法中，起始单体通过不稳定的接头连接到不溶性基质。向该基质中加入必要的试剂和额外的反应性单体以在不溶性珠上生长低聚化合物。具体地，用于制造寡核苷酸的固相合成循环通常可以在四个迭代步骤中进行。最初，将携带第一个核苷或辅助残基的固体支持物置于固体支持物壳体上。然后用脱保护剂溶液处理支持物以去除掩蔽基团，通常是羟基基团上的DMT保护基团。然后新暴露的羟基基团在随后的步骤中自由地与低聚物序列中的下一个期望残基反应。在这种情况下，下一个残基作为与用于促进反应的活化剂混合的亚磷酰胺单体加入。新形成的磷酸三酯对于合成的其余部分不够稳定，因此通常被氧化、硫醇化或以其它方式稳定化。在重新开始下一个循环之前，未反应的物质通过使用封端试剂终止。这重新掩蔽了未反应的羟基基团，以防止在随后的偶联循环中进一步生长。迭代地重复四个步骤(暴露、偶联、键稳定化和封端)可以生成不同长度的寡核苷酸。固相低聚物合成的繁琐过程可以通过使用固相合成仪来简化。
在使用一根大柱子的大规模核酸合成中，支持层在流通路径方向上的长度(以下称为“柱长”)必须较长或直径较宽。然而，由于流量分布和高操作背压，柱直径和支持物长度都受到限制。在这些情况下难以实现均匀的传质。因此，对可行的柱尺寸和因此的生产尺寸存在固有限制。因此，典型的商业寡核苷酸长度限于15至40个Mer。
对寡核苷酸的需求不断扩大，因此希望能够在短时间内以高质量和高产率廉价地制备尽可能多的寡核苷酸。本公开描述了用于制备寡核苷酸和多肽的改进的连续工艺和改进的装置，其克服了分批工艺的限制。
发明内容
以下概述了本公开内容的各种细节以提供基本的理解。该概述不是对本公开内容的广泛综述并且既不旨在鉴定本公开内容的某些要素，也不旨在描绘其范围。相反，该概述的主要目的是在下文中呈现的更详细描述之前以简化形式呈现本公开内容的一些概念。
根据第一个实施方案，提供了核酸合成方法。该方法使用包括至少一个进行脱保护步骤的脱保护单元、至少一个进行偶联步骤的偶联单元、至少一个进行氧化或硫醇化步骤的氧化/硫醇化单元和至少一个进行洗涤步骤的洗涤单元的装置。根据用于期望核酸序列的合成方案将用于核酸合成的多个反应容器或“罐”移动到单元，并且在多个单元处至少两个反应容器串行地同时作用。
根据另一个实施方案，提供了核酸合成方法。该方法使用用于链长增加的有机分子的多阶段合成的设备。该设备包括至少一个进行脱保护步骤的脱保护站；至少一个进行偶联步骤的偶联站；至少一个进行氧化或硫醇化步骤的氧化/硫醇化站；至少一个进行封端步骤的封端站；和至少一个进行洗涤步骤的洗涤站。每个站包括合适的流体储存器。根据用于构建选定核酸序列的合成方案，将多个核酸合成容器通过传送器装置并行移动到站，其中至少一个站相对于其它站执行需要最长时间(R)的反应。至少大部分容器根据设定的时间段(T)在站之间一致地(同时但不一定到每个站)移动，其中容器在反应时间小于R的站处保持T的倍数。
根据本公开内容的装置实施方案，提供了用于有机化合物的多阶段合成的设备。该设备包括以下组合：(a)多个反应容器；(b)多个流体储存器；(c)与所述流体储存器相关联的阀元件；(d)用于从流体储存器向所述容器提供进料流的流体输送装置；(e)多个能够监测来自多个所述容器的流出物的化学组成的装置；和(f)具有程序模式的传送器，其适于根据程序模式连续地将容器从与一个流体储存器的流体接合输送到随后的流体储存器。
根据进另一个实施方案，提供了用于有机化合物的多阶段合成的设备。该设备包括(a)可在轴上或围绕轴移动的传送器，所述传送器承载多个反应容器；(b)以逐步方式移动所述传送器的装置，每个逐步步骤将每个容器对接在多个流体储存器中的一个处；(c)将液体从流体储存器输送到每个对接站处的每个容器的流体输送装置；(d)将每个对接站处的每个容器的液体流出物排放到多个指定器皿中的一个的排放***；和(e)控制所述传送器、所述流体输送装置和所述排放***的可编程计算机。
根据另一个实施方案，公开了用于顺序进行构建生物分子的过程的反应器设备。该设备具有多个独立的反应容器，每个容器包括可连接所述分子的支持物。类似地提供了多个流体储存器，其能够容纳用于实现该过程的步骤的流体。传送器将每个容器单独带入与每个流体储存器的流体接触模式。传送器可以将容器定位成与至少第一流体储存器和第二流体储存器的顺序流体接触模式。容器能够与每个流体储存器的内容物顺序接触以实现分子的顺序处理。该设备的至少一种操作模式允许至少两个容器同时接收来自单个流体储存器的流体。
根据另一个实施方案，提供了用于核酸合成的设备。该设备包括至少一个进行脱三苯甲基步骤的脱三苯甲基站；至少一个进行偶联步骤的偶联站；至少一个进行氧化或硫醇化步骤的氧化/硫醇化站；至少一个进行封端步骤的封端站；和至少一个进行洗涤步骤的洗涤站。每个站都包括合适的流体储存器，并且这些站并行操作。该设备允许根据用于构建至少100个Mer的选定核酸序列的合成方案将多个核酸合成容器通过传送器装置移动到站。
根据另一个实施方案，提供了用于制造肽的方法。该方法使用多阶段合成装置，其中使连续的氨基酸处于羧基活化状态，并通过末端羧基基团在活性位点连续连接在一起。该装置包括至少一个脱三苯甲基站；至少多个进料适当氨基酸的等分试样的站；至少一个进行洗涤步骤的站；至少一个进行中和步骤的站；和至少一个进行偶联步骤的站。每个站包括合适的流体储存器。根据用于构建选定氨基酸序列的合成方案，该方法通过传送器装置同时将多个肽合成容器移动到站。该方法至少放置两个肽合成容器，以便它们在多个站处同时串行地作用。
附图说明
以下是附图的简要说明，其呈现的目的是为了说明本文公开的示例性实施方案，而不是为了对其进行限制。
图1是根据本公开内容的***的示意图；
图2A-2O提供了本公开内容的顺序方面的示意图；
图3提供了适合于遵循图2的过程的简化的第二顺序步骤的示意图；
图4提供了适合于遵循图3的过程的简化的第三顺序步骤的示意图；
图5提供了适合于遵循图4的过程的简化的第四顺序步骤的示意图；
图6提供了适合于遵循图5的过程的简化的第五顺序步骤的示意图；
图7提供了并行执行的第一至第五顺序步骤中的每一个的示意图；
图8提供了展示多阶段整合的示意图；
图9提供了反应容器或罐的示意图；
图10提供了如何使用串行方案解决反应时间差异的示意图；和
图11提供了如何使用并行方案解决反应时间差异的示意图。
具体实施方式
可以通过参考附图获得对本文公开的组件、方法和设备的更完整的理解。这些图仅仅是基于方便和易于展示本公开内容的示意性表示，并且因此，并不旨在指示装置或其组件的相对大小和尺寸和/或定义或限制示例性实施方案的范围。
尽管为了清楚起见在以下描述中使用了特定术语，但这些术语旨在仅指代为在附图中说明而选择的实施方案的特定结构，并不旨在定义或限制本公开内容的范围。在下面的附图和以下描述中，应当理解，相同的附图标记指代具有相同功能的组件。
未用数量词限定的名词包括复数所指对象，除非上下文另有明确规定。
如本文所用，术语“约”、“一般地”和“基本上”旨在包括不会显著影响由这样的术语修饰的元件或数字的目的的结构或数字修饰。
如本文所用，某些合成步骤有时被概括地描述，有时被描述为特定的化学反应。例如，词语脱保护用于描述去除掩蔽基团的步骤，并且脱三苯甲基用于描述用酸溶液特异性去除DMT(4,4’–二甲氧基三苯甲基)基团。然而，这些术语可以互换使用来描述寡核苷酸合成中的步骤。
如本文所用，通过端点记载的数字范围包括包含在该范围内的所有数字(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.6、4和5等)。类似地，当针对一个项目提出多个范围时，旨在该多个范围反映其各种组合(例如，1至5或2至3还包括范围1至3和2至5等)。
如在说明书和权利要求中使用的，术语“包括”可以包括实施方案“由……组成”和“基本上由……组成”。如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”及其变体旨在是开放式过渡短语、术语或词语，其需要存在指定的成分/步骤，并允许存在其它成分/步骤。然而，这样的描述应该被解释为也将组合物或方法描述为“由”和“基本上由”所列举的成分/步骤组成，这允许仅存在指定的成分/步骤，以及可能由此产生的任何杂质，并排除其它成分/步骤。
参考图1，示出了本合成仪设备2的基本组件。组件包括反应物/试剂进料容器4，其含有用于进行必要的合成步骤的液体，例如洗涤(例如ACN)、脱三苯甲基(例如二氯乙酸(DCA)/甲苯)、偶联(例如ACN、亚磷酰胺、活化剂)、硫醇化(例如吡啶/ACN))、封端(例如吡啶/ACN/N-甲基咪唑(NMI)和合成后洗涤(例如TBA/ACN)。术语反应物用于鉴定生长低聚物的液体。术语试剂是用于鉴定用于合成过程的制备和/或活化的液体。示出了多个未标记的进料容器以证明合成设备可以容纳预期合成所需的任何合适的额外进料。类似地，图示的材料可能不是每个合成过程都需要。
合成仪设备2还包括与进料容器4流体连通的泵6(或流体注射器)。泵6向阀8提供选定的试剂/反应物以输送到反应罐10。阀可以是截止阀。可以提供流量计12来监测引入的试剂/反应物的量。流量计和阀可以与控制器如PLC14一起操作以提供流体输送控制，从而为下面更详细地描述的反应站处的每个反应罐提供精确的量。
至少一个分析装置16(例如UV光谱仪)可以与该设备相关联以监测分子合成过程中的步骤。泵6、流量计12、截止阀8和分析装置16的操作和监测可以由程序逻辑控制器(PLC)14执行。技术人员应认识到，管道18设置在整个合成仪设备中，但为了改善可视性，仅在通过其存在更好地传达本发明概念的方面的位置示出。例如，可以提供管道以将反应残余物从反应罐10输送到收集容器20。这可以允许改进试剂/反应物的再循环，甚至允许在该过程中重新使用收集的材料。合成仪设备2包括大量单独的反应罐10，其与传送机构22(例如传送带)相关联。十一个反应罐的顶部以阵列形式示出在传送器机构上。设想了传送机构在配置上是圆形的、线性的或锯齿形的。
预期合成仪设备的组件，特别是与试剂/反应物直接接触的那些，可以由合适的材料形成，例如不锈钢、聚醚醚酮和/或聚四氟乙烯。建议按照FDA规定例如CFR 21Part 117中的cGMP来构建合成仪设备。进一步预期合成仪设备在受控环境中容纳和/或操作，该受控环境可以用惰性气体例如氩气或低反应性气体例如氮气吹扫。
每个反应站(例如参见图1)可以包括至少一个进料容器、至少一个泵、至少一个流量计和至少一个控制阀。合适的管道当然存在以输送适合特定站的试剂/反应物。根据反应的需要和试剂的类型，预计每个站将具有以约10-1000ml/分钟的体积分散其相关试剂/反应物液体的能力。
每个进料容器与其相关联的泵、管道、流量计、阀、分析装置和收集容器的组合可被视为反应或处理站。与站相关的任何仪器都可以被加热或冷却和/或包括用于处理泵、阀、管道和/或容器的加压气体源。站可以各自进一步包括分离、过滤、膜提取和/或色谱单元中的一个或多个。
现在转向PLC，有线或无线反馈线使PLC 14与合成仪保持通信，从而实时保持反应罐的位置。可以提供位置传感器来监测反应罐的位置。PLC在整个反应方案中控制反应罐10的移动，根据程序合成过程使各个罐与站形成流体连接。
合成也可以由PLC控制。来自PLC的指令可以控制引入反应罐的试剂/反应物的时间、体积、流速和顺序，从而确定低聚物合成的顺序。这些指令(例如打开或关闭各种阀、移动传送器/反应罐、操作各种泵、监测流量计或分析装置等)可以和与构建特定结构的长链分子相关的主指令相关联。
PLC可以是可编程的，使得该设备可以制备第一长链分子的多个反应罐的“批次”，然后重新编程以制备不同长链分子的多个反应罐的批次。
在多个(或所有)站处，可提供分析装置(或多于一个)如UV光谱仪以分析反应罐10内的反应产物或从反应罐10收集的残余物中的一种或其两者。此外，或作为UV光谱仪的替代，该***可包括液相色谱质谱仪(LCMS)、光监测器、温度监测器、红外监测器、NMR光谱仪和/或拉曼光谱仪以用于质量控制。该***有利地允许将表现出不令人满意的结果(例如合成错误或未完全反应的分子)的反应罐从传送机构去除或以其它方式撤走并排除在进一步的处理步骤之外。这可以包含失败的反应步骤对单个反应罐的影响，而不污染整个生产运行。
参考图2A-O，描述了与本设备相关联的合成过程的顺序性质。特别地，在图2A，将第一反应罐1引入第一站(合成前洗涤)。反应罐2定位为接下来被传送机构接收。
所示的步骤顺序当然只是示例性的。此外，每个步骤不是必需的，也不是必须按照所示的精确顺序执行。例如，在每个阶段结束时的氨基洗涤可能不是必要的。类似地，示例性步骤不需要使用列出的化学品来执行。相反，能够执行类似/相同功能的替代流体在本领域中是已知的。
反应罐1(和随后的罐)可以包含支持物，例如
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HL。可以在反应罐中提供玻璃料或滤布来承载支持物。支持物可以包括具有小于传统(例如小于80μm或甚至40μm或甚至1μm或0.3μm)的尺寸的颗粒，因为鉴于反应罐的尺寸相对较小，压力损失相对较低。值得注意的是，液相合成也被考虑在内。
反应罐1首先与合成前洗涤站相关联，在那里其接收ACN。废物收集容器与合成前站处的反应罐相连，以回收过量的ACN用于再循环。每个站可以具有其自己的泵，用于从进料容器引入液体。每个站还可以包括其自己的流量计以控制流体引入的速率以匹配在该站处发生的反应/处理的动力学。每个站还可以包括其自己的控制阀(或一系列控制阀)以确保将足够体积的流体输送到反应罐以完成相关的反应/处理。此外，可以在站处提供多个控制阀，其允许同时处理多个反应罐。
现在转向图2B，反应罐1已经转移到进行脱三苯甲基的第二站，而反应罐2已经进入传送机构并定位在第一站处进行合成前洗涤。反应罐1和2中的每一个可以在它们各自的合成站处定位至少大约相同的时间段。第二站可以以不同于第一(或后续)站的流速和/或体积操作。对于设备的其它站也是如此。
第二站可以包括UV光谱仪16或其它分析装置以允许评估反应罐1的状态和/或其残余物。在第二站处提供了独立的废物收集(再循环)容器，用于过量试剂的回收和可能的再循环。对于设备的其它站也是如此。
现在转向图2C中，传送机构已将反应罐1移动到第三站以使用不同浓度的DCA/甲苯进料进行第二脱三苯甲基阶段。至少基本上同时，反应罐2已经被传送机构移动到第二站以进行第一脱三苯甲基处理并且反应罐3已经在第一站处进入设备以进行合成前洗涤。已提供UV光谱仪来评估反应罐1的内容物和/或其在第三站处的残余物。
有利地，因为在每个站处使用相同的泵、管道和阀设备以及相同的试剂，所以不需要在合成步骤之间排放液体残余物或清洁。该优势还扩展到从形成第一分子的合成顺序到配置为形成第二分子的合成顺序的转变。这改善了处理速度并减少了浪费。
现在转向图2D，反应罐1已经到达第四站以进行偶联，而反应罐4已经被传送机构拾取并输送到第一站以进行合成前。反应罐1-4中的每一个至少基本上同时在它们各自的站处作用。偶联站被示出为具有三个反应罐(三个反应罐仅出于说明目的示出)，其可以在反应罐1之前。逆流流动用于提供与引入相对昂贵的亚磷酰胺相关的卓越效率。此外，亚磷酰胺废物比传统批处理过程中的少。
偶联站处的反应罐可与阵列中的其它反应罐同时移动，但仍与偶联站保持流体连通达多个活动期(即反应罐从站接收流体的时间)。液体的逆流流动允许同时处理多个反应罐。在图2D中，四个反应罐同时接收亚磷酰胺反应原料胸腺嘧啶、ACN和活化剂(如乙硫基-1H-四唑(ETT))。亚磷酰胺进料的浓度可以超过单个反应罐所需的浓度。亚磷酰胺可以以大于3:1的化学计量要求引入第一反应罐。例如，基于支持物体积，可以以反应容量的约大于0至5.0或约1.5至3.0的量添加亚磷酰胺。过量的亚磷酰胺进入串行连接的反应罐。以这种方式，来自一个串行连接的反应罐的未反应的亚磷酰胺将流向下一个反应罐并被拾取进行分子构建，导致相对于批处理的亚磷酰胺损失显著减少。
在某些合成过程中，可能需要为偶联程序提供间歇和/或脉冲洗涤特征。此外，脉冲洗涤可用于去除未反应的亚磷酰胺，否则其可能不容易流到下游反应罐。洗涤可以通过液体如ACN或气体如N2或它们的组合进行。
引入的亚磷酰胺被添加到生长中的分子。通过将反应罐串行连接起来，然后顺着逆流链向上移动，该方法通过在偶联站的最后位置处将反应罐暴露于最高化学计量浓度的亚磷酰胺来确保适当的分子构建。简而言之，一个反应罐中的“残余”亚磷酰胺用于“预处理”后续反应罐，减少了浪费。还应注意，与亚磷酰胺进料站结合使用的逆流方法同样适用于合成仪设备的任何或所有其它站。
图2E-2G表明，当反应罐在传送机构上向下游移动时，新的反应罐5、6和7加入反应罐的串行进程，而反应罐2、3和4则在胸腺嘧啶偶联站处以逆流流动布置加入反应罐1。
图2H和2I分别示出了反应罐1和反应罐2如何顺序地移动到偶联洗涤站。偶联洗涤站也可以是逆流流动配置。示出了其中两个反应罐串行接收偶联流体的实例。当然，也可以串行连接多于两个反应罐。显然，反应罐之后是新的反应罐(反应罐8和9)。
现在转向图2J和2K，反应罐1和反应罐2已经顺序地移动到硫醇化站(吡啶/ACN)。很明显，反应罐之后是新的反应罐(反应罐10和11)。
图2L和2M分别示出了反应罐1和反应罐2再次使用逆流流动配置顺序地移动到封端站(吡啶/ACN/NMI/AC20)。显然，反应罐之后是新的反应罐(反应罐13和14)。
图2N和2O分别示出了反应罐1和反应罐2顺序地移动到了合成后胺洗涤站。合成过程中的反应罐之后是新的反应罐(反应罐15和16)。合成后胺洗涤完成后，可认为示例性第一合成阶段完成，产生大量反应罐，其中包含具有第一寡核苷酸单元dT的过程中分子。
图3示出了第二合成阶段，其中接收来自第一合成阶段的反应罐并进一步处理。有利地，可以在阶段2中使用与阶段1中使用的相同的站。事实上，设想了这些站将同时执行阶段1、阶段2、阶段3等。第二合成阶段可能不需要某些步骤，例如预洗和第一脱三苯甲基步骤。为清楚起见，需要注意的是，阶段1中的站3、5、6、7和8将在阶段2中重复使用，并且将提供胞嘧啶的站9添加到阶段2方案。
此外，虽然在第二合成阶段可以处理任何亚磷酰胺，但示出了胞嘧啶的合成。这可以通过添加胞嘧啶进料站9来实现。还设想提供完整的站(进料容器、泵、流量计、阀组(valve block)、分析装置和残余物收集装置)用于胞嘧啶引入。可以为在分子中包含的每个亚磷酰胺添加更多站。值得注意的是，由于合成仪设备可以被配置为形成任何数量的寡核苷酸，它可能会为每种常用的亚磷酰胺或所有亚磷酰胺配备站。
图4、5和6示出了用于构建聚合物长度的进一步合成阶段，其中按顺序引入先前阶段的反应罐以添加亚磷酰胺。提供站10来进料新的亚磷酰胺dG。然而，泵(4)再次用于在阶段4的第二次引入dT。站9用于在阶段5的第二次引入dC。尽管图5代表合成过程中的新步骤，其也构成了方案中步骤1的重复。图6表示顺序方案中的阶段2的重复。
这种亚磷酰胺站的再利用可以根据需要重复以构建具有期望结构和长度的分子。在这种情况下，设想了可以产生具有2至300个Mer、或至少100个Mer、或大于200个Mer、或大于300个Mer的分子(当考虑多肽时，适当参考碱基对)。在多个反应罐中合成期望分子后，可以将其内容物合并到更大的储存器皿中。可以按照传统的寡核苷酸制造/纯化技术处理合并的内容物。
该***可以包括超过15个传送器阵列，处理超过100个反应罐以获得期望的分子长度。一般而言，可以设想每个传送器阵列将接收多个(例如至少7个)反应罐。
设想本公开内容的反应器可以在一排中具有多个(例如，超过20个)反应并且可以提供多排(例如，超过20排)。在这种情况下，超过400个反应器罐可以同时作用于，其中大多数罐处于分子构建的不同阶段。通常，示例性反应器可具有5至25个反应站并包括5至10排。
参考图7，本合成仪设备提供的效率是可见的。例如，为合成顺序的每个步骤提供单个进料容器和进料仪器(站)是可行的。通过提供独立的泵、流量计、阀和管道，单个储存器可以供应阶段1至5(或更高)中的任一阶段的反应罐。类似地，单个亚磷酰胺储存器可以将亚磷酰胺提供给合成顺序中的不同步骤(例如，胸腺嘧啶到阶段1和4)。
此外，预期可以在分子合成的不同步骤以不同浓度提供试剂/反应物。例如，可能需要在阶段5引入比在阶段1更多的活化剂。类似地，可能需要向合成过程的后期阶段添加较低浓度的偶联洗涤。类似地，引入的亚磷酰胺的量可以根据在单个反应站处串行连接的反应罐的数目而变化。
因为在合成过程的步骤之间不需要清洁泵、流量计、阀，所以使用仅具有一种类型的反应物/试剂的每个反应站具有进一步的益处。同样，在反应阶段之间不需要清空仪器。在这种情况下，单个站(例如硫醇化)可用于在聚合物合成的不同阶段处理多个反应罐。
还预期合成仪设备包括在一个或多个站处的裂解、脱保护、分离、过滤、膜提取和/或色谱单元中的一个。
图8表明除了其中可以为使用的每种亚磷酰胺提供泵的偶联站之外，每个站可以使用单个泵。此外，多个站可以包括具有同时输送多个进料流的能力的多截止阀。以偶联站为例，多截止阀可以同时将来自站4的dT进料流输送到阶段1和4的串行连接的反应罐，将来自站9的dC进料流输送到阶段2和5的串行连接的反应罐。其它站可以包括多截止阀，以允许将不同的进料流浓度输送到合成过程的不同阶段。例如，可能需要在阶段5向封端站输送比阶段1更高的NMI浓度。为了清楚起见，需要注意的是“阶段……”包括传送板机构的示意图(参见下面图9中的120)，其包括适用于接收反应罐的“U”形入口/出口管。这种传送板机构允许以合适的阵列和间距排列反应罐，以最有效地构建期望的生物聚合物。每个阶段的阵列可以是单独的板，其中反应罐从第一板阵列移除并附接到下一个板阵列，或者阵列可以机械集成。
图9示出了示例性反应罐100。罐100可包括容器112，其包括反应床113。罐的顶表面114可包括用于将液体进料流引入到反应罐的顶部的入口116和用于在液体通过反应床113后去除来自罐下部区域的液体的出口118。可以通过入口116(或另一通道)引入气体以帮助去除。反应罐100可以被配置为与位于每个站处基本上平坦的板120配合并且包括可密封的配合接头。板120可以竖直移动以接合/脱离反应罐110，而反应罐110水平地从一个站移动到另一个站。然而，设想了反应罐输送机构将能够接收不同尺寸和形状的罐。反应罐可以是一次性使用的(例如一次性容器和/或袋)，也可以根据所进行的合成的要求重复使用。
示例性的反应罐尺寸可以是约1至100mm、或约10至50mm的内径和高至150mm的高度。可以指定反应罐中支持物的有效尺寸。例如，处于被溶剂溶胀状态的支持物可具有约大于0至约150mm、或约5至30mm、或约10至40mm的高度和大于0至约100mm或约10至50mm的直径。然而应注意，容器形状不必是圆柱形的。
通过操作具有相对小体积(例如，小于15cm3)的多个反应罐的***，改善了每个反应罐中发生的反应的传质。改善的传质可具有诸如小于约5巴的每个反应罐的压降等优点。尽管如此，当考虑整个***时，许多反应罐的使用提供的合成设备的反应体积大于目前在批处理过程中的实际体积(例如2,000mm直径和200mm高度＝3,140cm3)，而200个40mm直径和150mm高度的反应罐提供9,420cm3的体积。
反应罐可配备有温度控制装置、混合装置、压力调节设备和/或pH调节设备。可能需要改变站之间反应罐的条件(例如温度)以最大化进行处理/反应的环境。反应罐还可包括用于监测温度、压力、pH、电导率和时间中的至少一种的探针。
反应罐也可以单独标记(例如条形码)用于鉴定。以这种方式，每个反应罐的合成分子的方面可以存储在数据库中。该信息可以包括，例如，制造阶段、预期或实际分子结构、生产日期、纯度等。
在某些实施方案中，反应罐根据设定的时间段(T)在站之间一致地移动(一起但不一定移动到每个站)。然而，合成过程中的每个步骤可能不会在相同的时间内完成。此外，至少一个步骤可以具有最长的反应时间(R)。因此，反应罐可以移动位置但是在反应时间小于R的站处保持T倍数，T可以是整数。在这种情况下，在某些站处，反应罐可以在站不活动时保持在站处。
在启动模式中，容器可以在为T的分数的一段反应时间之后移动，直到至少一个容器与每个站相关联。启动后，每个站可放置至少一个反应容器并开始正常的运动速率T。根据正在形成的分子，预计每个反应罐将约每隔几秒至10分钟或大约每1/2-5分钟移动一次。
现在参考图10，描绘了根据设定的时间间隔操作串行的本公开内容的合成仪的概念。此外，每个步骤被配置为具有等于预期反应时间的罐位置。例如，脱三苯甲基步骤可以具有3分钟的反应时间和相应的三个罐位置以同时从单一进料接收进料液体(例如DCA/甲苯)。在这种配置中，每个罐都可以在整个组装过程中跟随其前面的罐。
现在参考图11，示出了根据设定的时间间隔操作并行的本公开内容的合成仪的概念。此外，站处罐的数目对应于相关的反应时间。例如，两个罐位于第一脱三苯甲基站处，其中DCA/甲苯从两个罐中的第一个依次进料到第二个。在这种配置中，罐将在不跟随紧接在前的罐之后的较长反应步骤移动到位置。在图10和11的任一个方案中，布置的目的是将每个罐放置在站处足够的时间段以完成反应。在这种情况下，可以设想串行和/或并行策略可以一起使用，也可以在站处交替使用。
在期望大分子的构建结束时，该程序考虑从合成仪设备阵列中去除含有期望大分子的反应罐。类似地，该程序设想已完成向最终反应罐进料的站可以停止引入其指定的试剂/反应物。在这种情况下，设想了每个站可以包括清洁液的进料(可能来自清洁流体的集中储存器)。以这种方式，循环关闭罐可以跟随最终的大分子构建反应罐并接收用于关闭阵列中每个站的清洁液。示例性的清洁液是ACN。
还预期了从单个站再循环的过量试剂/反应物可以被输送到沿排的不同站，或者甚至输送到不同排中的站。这在构建大分子的任何点都是可能的，并且当在循环结束时使用时，允许封闭的反应站将活性反应站进料到阵列中。例如，不是将ACN从站1再循环回站1进料容器，而是可以执行再循环到站5(或其它合适的)以保存原材料并提高操作效率，尤其是在过程结束时。
尽管说明了具体的试剂和反应物，但本公开内容不限于这些实例或顺序。相反，技术人员将认识到合成顺序中的无数变化是可行的。
合成仪还可以配置成分配将合成多肽的反应溶液。在固体支持物上的肽合成过程通常涉及从羧基末端构建肽。该肽通过其羧基末端氨基酸连接到固体支持物上，并且在氨基末端α-氨基基团上还包括保护基团。然后从肽上切下保护基团以形成脱保护的肽。接下来，在脱保护肽的α-氨基基团与单体氨基酸的α-羧基基团之间形成肽键的条件下，使同样含有α-氨基保护基团的单体氨基酸与脱保护肽接触。单体氨基酸可以以活化形式提供，或者可以向氨基酸和生长中肽加入活化剂。可以在步骤之间进行洗涤以去除试剂。可以重复脱保护先前氨基酸和偶联额外氨基酸的循环，直到合成期望长度的肽。氨基酸的任何反应性侧链通常由能够抵挡偶联和α-氨基脱保护程序的化学基团保护。然而，这些侧链保护基团可以在合成结束时被去除。可以根据本文的教导和肽合成的已知反应方案，包括例如Goodman等人(编辑)Synthesis of Peptides and Petidomimetics,第E22a卷.GeorgThieme Verlag,Stuttgart(2002)描述的那些，将站阵列和阵列间彼此通信的方案相关联。
以下实例以说明而非限制的方式呈现。
使用本文所述的设备根据物理步骤制造寡核苷酸，所述物理步骤包括将流体输送到多个反应罐，和从反应罐排出流体。计算机被编程为以指定的顺序将合适的反应物输送到指定的反应罐。
寡核苷酸合成包括脱保护、缩合、氧化和封端。脱保护是从糖部分的5'-OH中去除酸不稳定的DMTr基团。缩合是将过量的活化单体偶联到生长中链上。氧化是将3'-5'核苷酸间亚磷酸三酯键氧化为更稳定的磷酸三酯键。然后处理聚合物以去除保护基团，从而产生磷酸二酯键。封端步骤是对未能缩合为乙酸酯的5'-羟基基团的封端。一般方案是1.洗涤支持物；2.分配包含解封闭剂的液体以去除保护基团；和排放；3.分配包含受保护的核苷酸和偶联活化剂的液体；排放；4.分配包含封端剂的液体；和排放液体；洗涤支持物；排放含有氧化剂的液体。重复步骤直到核苷酸序列完成。
多肽合成可以包括通过以下方式将氨基酸添加到新生多肽链上：1.通过去除基团以使生长中肽链一端的α氨基基团可用而进行脱保护(Fmoc或Boc)；2.通过将氨基酸残基活化成活性酯，然后与生长中肽链末端的脱保护α-氨基基团形成酰胺键进行偶联；和3.用DNA/RNA合成中使用的相同试剂将未反应的α-氨基基团封端。在Fmoc合成中，碱不稳定保护基团(Fmoc)在每个循环中都被去除。在合成结束时，侧链保护基团用弱酸去除，这也会裂解将肽锚定到支持物上的键。在Boc化学中，Boc保护基团是酸不稳定的，并且可以用弱酸去除。强酸用于最后的脱保护和裂解步骤。
使用Fmoc化学的肽合成方案可以包括以下步骤：1.脱保护(至少一次)-哌啶，2×-7分钟；2.排放；3.洗涤(至少一次)-N-甲基吡咯烷酮(NMP)或二甲基甲酰胺(DMF)，6×；4.偶联-18秒激活+35分钟偶联；5.排放；6.封端[任选]-1分钟；7.排放；8.洗涤(至少一次)-NMP或DMF，3×。重复步骤1-8，直到氨基酸序列完成。使用Boc化学的肽合成方案可包括以下步骤：1.洗涤(至少一次)-氯甲烷(DCM)，l×；2.脱保护(至少一次)-三氟乙酸(TFA)，2×-6分钟；3.排放；4.洗涤(至少一次)-氯甲烷(DCM)，l×；5.洗涤(至少一次)-NMP或DMF，6×；6.偶联-18秒激活+35分钟偶联；7.排放；8.封端[任选]-1分钟；9.排放；10.洗涤(至少一次)-NMP或DMF，3×。重复步骤1-10，直到氨基酸序列完成。
已经参考优选实施方案描述了示例性实施方案。显然，其他人在阅读和理解前面的详细描述后会想到修改和改变。旨在将示例性实施方案解释为包括所有这样的修改和改变，只要它们落入所附权利要求或其等同物的范围内。
为了帮助专利局和本申请以及由此产生的专利的任何读者解释所附权利要求，申请人不意欲任何所附权利要求或权利要求要素触发35U.S.C.112(f)，除非在特定权利要求中明确使用了“用于……的手段”或“用于……的步骤”等词。

Claims (63)

1.一种核酸合成方法，所述方法使用包括至少一个进行脱保护步骤的脱保护单元、至少一个进行偶联步骤的偶联单元、至少一个进行氧化或硫醇化步骤的氧化/硫醇化单元和至少一个进行洗涤步骤的洗涤单元的装置，其中，根据期望核酸序列的合成方案将用于核酸合成的多个反应容器移动到所述单元，并且其中在多个单元处至少两个反应容器串行地同时作用。
2.根据权利要求1所述的核酸合成方法，其中所述反应容器中的支持物为玻璃固相、聚合物固相和混合悬浮液中的一种。
3.根据权利要求1和2中的一项所述的方法，其中每个反应容器是可重复使用的或仅一次性使用的。
4.根据权利要求1至3中的一项所述的核酸合成方法，其中每个单元仅用于一种类型的核酸或处理化学品。
5.根据权利要求1至4中的一项所述的方法，其中在所述核酸的合成中所述单元中的至少多个被使用多于一次。
6.根据权利要求1至5中的一项所述的方法，其中在向反应容器的单次添加期间以大于3:1的化学计量要求添加亚磷酰胺。
7.根据权利要求1至6中的一项所述的方法，其中所有反应容器同时移动。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在选定的单元，所述反应容器移动但保持与同一单元流体连通。
9.根据权利要求1至8中的一项所述的方法，其中所述偶联单元中使用的材料是亚磷酰胺，并且亚磷酰胺以大于0至5.0当量、优选1.5至3.0当量的量添加。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述偶联单元中使用的材料是活化剂，并且所述活化剂在合成顺序的不同点以不同浓度添加。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应和洗涤单元中使用的材料在合成顺序的不同点以不同浓度添加。
12.根据权利要求1至11中的一项所述的方法，其中从单元处的反应容器回收的材料被所述单元重新用于所述合成方案中的后面反应容器的反应或处理。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在多个或所有反应站评价所述反应容器中的反应产物，并且其中从合成程序中去除表现出不令人满意的结果的反应容器。
14.根据权利要求1所述的方法，包括液相合成。
15.根据权利要求6所述的方法，其中添加的亚磷酰胺的量根据串行连接的反应容器的数目而变化。
16.一种核酸合成方法，所述方法使用包括用于链长增加的有机分子的多阶段合成的设备的装置，所述设备包括至少一个进行脱保护步骤的脱保护站；
至少一个进行偶联步骤的偶联站；
至少一个进行氧化或硫醇化步骤的氧化/硫醇化站；和
至少一个进行洗涤步骤的洗涤站；
每个站包括合适的流体储存器；
其中，根据用于构建选定核酸序列的合成方案，将多个核酸合成容器通过传送器装置移动到所述站；
其中至少一个站相对于其它站执行需要最长时间(R)的反应；
其中所述站并行操作；和
其中至少大部分所述容器根据设定的时间段(T)在所述站之间一致地移动，所述容器在反应时间小于R的站处保持T的倍数。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述倍数是整数。
18.根据权利要求16所述的方法，包括启动模式，其中所述容器在为部分的T的一段反应时间之后移动，直到至少一个容器与每个站相关联。
19.根据权利要求16所述的方法，其中在所述启动模式之后，多个容器串行连接在一个或多个站处并且容器在等于或接近T的时间移动。
20.根据权利要求16所述的方法，其中在启动模式期间，其中至少多个空的反应容器位于选定的单元处。
21.一种用于制造肽的方法，所述方法使用包括用于多阶段合成的设备的装置，其中使连续的氨基酸处于羧基活化状态并通过末端羧基基团在活性位点连续连接在一起，所述设备包括：
至少一个脱保护站；
至少多个进料适当氨基酸的等分试样的站；
至少一个进行洗涤步骤的站；
至少一个进行中和步骤的站；
至少一个进行偶联步骤的站；
每个站包括合适的流体储存器；
其中根据用于构建选定氨基酸序列的合成方案将多个肽合成容器通过传送器装置移动到所述站，并且其中在多个站处至少两个肽合成容器串行地同时作用。
22.一种用于有机分子的多阶段合成的设备，所述设备包括以下组合：(a)多个反应容器；(b)多个流体储存器；(c)与所述流体储存器相关联的阀元件；(d)用于从所述流体储存器向所述容器提供进料流的流体输送装置；(e)多个能够监测来自多个所述容器的流出物的化学组成的装置；和(f)具有程序模式的传送器，适于根据所述程序模式连续地将容器从与一个流体储存器的流体接合输送到随后的流体储存器。
23.一种用于有机分子的多阶段合成的设备，包括(a)可在轴上或围绕轴移动的传送器，所述传送器承载多个反应容器；(b)以逐步方式移动所述传送器的装置，每个逐步步骤将每个容器对接在多个流体储存器中的一个处；(c)将液体从流体储存器输送到每个对接站处的每个容器的流体输送装置；(d)将来自每个对接站处的每个容器的液体流出物排放到多个指定器皿中的一个的排放***；和(e)控制所述传送器、所述流体输送装置和所述排放***的可编程计算机。
24.一种用于顺序进行构建分子的过程的反应器设备，所述设备包括：多个独立的反应容器，每个容器包括能够连接所述分子的支持物；多个流体储存器，能够容纳用于实现所述过程的步骤的流体；和用于将每个容器单独带入与每个所述流体储存器的流体接触模式的传送器，其中所述传送器能够将容器定位成与至少第一流体储存器和第二流体储存器的顺序流体接触模式，所述容器能够与每个所述流体储器的内容物顺序接触，导致所述分子的顺序处理，并且其中所述设备还包括至少一种其中至少两个容器同时接收来自单个流体储器的流体的模式。
25.根据权利要求22至24中的一项所述的设备，其中每个流体储存器包括反应和/或处理站。
26.根据权利要求25所述的设备，其中所述设备还包括在多个所述站处的切割、脱保护、分离、过滤、膜提取、封端、色谱和/或其它传统寡核苷酸处理单元中的一种。
27.根据权利要求25和26中的一项所述的设备，其中至少一个站同时与至少三个容器连接。
28.根据权利要求27所述的设备，其中所述流体储存器以逆流或并流流动机制与所述反应容器连接。
29.根据权利要求27所述的设备，其中所述至少三个容器串行连接。
30.根据权利要求25和26中的一项所述的设备，其中每个容器是温度受控的，包括混合装置，或者是能够调节压力和/或pH的。
31.根据权利要求22至30中的一项所述的设备，其中所述长链有机化合物或分子在寡核苷酸的情况下包含至少100个Mer或在多肽的情况下包含至少100个碱基对，优选至少200个。
32.根据权利要求22至30中的一项所述的设备，其中所述流体储存器中的至少多个包含核酸。
33.根据权利要求22至30中的一项所述的设备，包括至少100个反应容器。
34.根据权利要求22和23中的一项所述的设备，其中所述流体输送装置包括泵和/或流体注射器。
35.根据权利要求23所述的设备，其中所述流出物被输送到远程再循环装置。
36.根据权利要求22至35中的一项所述的设备，其中所述容器包括支持物。
37.根据权利要求36所述的设备，其中所述支持物是固体。
38.根据权利要求37所述的设备，其中所述固体支持物包括尺寸小于80μm或40μm或1μm或0.3μm的颗粒。
39.根据权利要求22至38中的一项所述的设备，还包括用于单独再循环从每个容器取出的流体的机构，其中再循环的流体返回到其源自的流体储存器和/或被输送到另一个流体储存器。
40.根据权利要求39所述的设备，还包括用于处理取出的流体的装置。
41.根据权利要求22至40中的一项所述的设备，其中所述设备是可编程的，使得在第一合成中制备第一长链有机化合物并且在第二合成中制备第二长链有机化合物。
42.根据权利要求22所述的设备，其中所述能够监测化学组成的装置选自LCMS、光监测器、温度监测器、pH监测器、红外监测器、NMR光谱仪和/或拉曼光谱仪，并且其中来自所述装置的数据被提供给PLC，并且所述设备的操作参数由所述PLC响应于所述数据而修改。
43.根据权利要求42所述的设备，其中在不同的流体储存器位置处提供至少两个不同的装置。
44.根据权利要求42所述的设备，其中如果监测装置识别出预定范围之外的流出物，则能够从所述程序模式中移除相关容器。
45.根据权利要求22至44中的一项所述的设备，其中所述传送器是圆形的或线性的。
46.根据权利要求22至45中的一项所述的设备，其中所述容器包括开口顶部罐，所述开口顶部用至少基本平坦的板密封。
47.根据权利要求46所述的设备，其中所述板包括至少一个入口和至少一个出口。
48.根据权利要求22至47中的一项所述的设备，其中每个容器包括用于监测温度、压力、pH、电导率和时间中的至少一种的探针。
49.根据权利要求22和23中的一项所述的设备，其中所述流体储存器中的至少多个包含氨基酸。
50.根据权利要求25和26中的一项所述的设备，其中所述流体储存器或相关联的泵、管道和/或阀被加热和/或冷却。
51.根据权利要求22至50中的一项所述的设备，其中所述反应容器能够在流体储存器之间进行温度调节。
52.根据权利要求22至50中的一项所述的设备，包括用于处理泵、阀、管道和/或至少一个容器中的加压气体源。
53.根据权利要求22至50中的一项所述的设备，包括至少X个流体储存器和至少Y个容器，其中Y＞X。
54.根据权利要求53所述的设备，其中在启动之后，至少一个反应容器Y位于每个流体储存器X处。
55.根据权利要求53所述的设备，其中Y是至少3X。
56.根据权利要求55所述的设备，其中至少3个容器Y位于每个流体储存器X处。
57.一种用于核酸合成的设备，所述设备包括至少一个进行脱保护步骤的脱保护站；至少一个进行偶联步骤的偶联站；至少一个进行氧化或硫醇化步骤的氧化/硫醇化站；至少一个进行封端步骤的封端站；和至少一个进行洗涤步骤的洗涤站；每个站包括合适的流体储存器；其中根据用于构建至少100个Mer的选定核酸序列的合成方案，多个核酸合成容器通过传送器装置移动到所述站；并且其中所述站并行操作。
58.根据权利要求57所述的设备，其中所述偶联站同时向至少两个容器提供亚磷酰胺。
59.根据权利要求57所述的设备，其中每个站同时向至少两个容器提供试剂和/或溶剂。
60.根据权利要求58和59中的一项所述的设备，其中所述至少两个容器中的第一个向所述容器中的第二个提供流通。
61.根据权利要求60所述的设备，其中第一容器的分子比第二容器的分子包含更多个Mer单元。
62.一种用于制造长链有机化合物的设备，包括附图和相应文本中所示的元件，包括单独示出但在其它方面一起可用的元件的组合。
63.一种使用权利要求22至62中的一项所述的设备进行核酸合成的方法。
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