CN114206126A - 奶酪和酸奶样组合物以及相关方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了奶酪和酸奶组合物以及使用一种或多种重组蛋白质制作该奶酪和酸奶组合物的方法。
Description
交叉引用
本申请要求于2019年5月2日提交的美国临时申请号62/842,469的权益，该美国临时申请通过引用而以其整体并入本文中。
背景技术
清洁的食物空间由植物基和细胞基食物组成。细胞基食物是大统称，包括培养肌肉和脂肪细胞来代替屠宰的肉，以及培养生物工程化生物体来表达重组动物蛋白以代替诸如乳制品和蛋等其他动物产品。由于当前动物食物生产的低效和不可持续性，所以需要寻找动物蛋白的替代来源。
奶酪是全球第三大最具不可持续性的动物产品(当按每公斤产品的温室气体排放量衡量时)，并且过去10年中引入市场的植物基替代品并未减缓乳制品奶酪的消费。相反，美国和发展中市场的马苏里拉(mozzarella)奶酪消费量逐年增长。由于缺乏酪蛋白，当前的奶酪替代品与乳制品奶酪的功能、营养和口味不匹配。
迄今为止，该领域所有公司共享的一个共同特征是难以以可承受的成本和速度规模化。重组蛋白质的生产可能非常昂贵且缓慢。这在部分上是因为蛋白质纯化的下游成本可高达整个蛋白质生产加工成本的80％，而取决于产品的纯度，蛋白质产量的降低可高达70％。
发明内容
通过示出和描述了本公开内容的仅说明性实施方案的以下详细描述，本公开内容的附加方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。正如将意识到的，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些均不脱离本公开内容。因此，附图和说明书在本质上被认为是说明性的，而不是限制性的。
在一些方面，本文描述了奶酪组合物。奶酪组合物可包含凝固胶体，其中所述凝固胶体包含以胶束形式缔合的α酪蛋白和κ酪蛋白。所述α酪蛋白和所述κ酪蛋白中的至少一种可以是重组产生的；并且其中所述奶酪组合物可以不包含β酪蛋白。
在一些实施方案中，所述重组产生的酪蛋白可由细菌宿主细胞产生。
在一些实施方案中，所述α酪蛋白和κ酪蛋白均是重组产生的。
在一些实施方案中，重组产生的α酪蛋白和κ酪蛋白由一种或多种细菌宿主细胞产生。
在一些实施方案中，与天然α酪蛋白相比，所述α酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的翻译后修饰。
在一些实施方案中，与天然α酪蛋白相比，所述α酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的磷酸化。
在一些实施方案中，与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的翻译后修饰。
在一些实施方案中，与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的糖基化。
在一些实施方案中，与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的磷酸化。
在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞可选自乳球菌属(Lactococci sp.)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、铫子短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、红城红球菌(Rhodococcus erythropolis)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳杆菌属(Lactobacilli sp.)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、集胞藻属(Synechocystis sp.)6803和大肠杆菌(E.coli)。
在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞分泌所述重组产生的酪蛋白。
在一些实施方案中，所述细菌宿主在细胞内保留所述重组产生的酪蛋白。
在一些实施方案中，在所述细菌宿主细胞中所述重组产生的蛋白质的产生可受诱导型启动子调控。
在一些实施方案中，在所述细菌宿主细胞中所述重组产生的蛋白质的产生可受组成型启动子调控。
在一些实施方案中，α酪蛋白与κ酪蛋白的比例可为约1:1至约15:1。在一些实施方案中，该比例可为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1。
在一些实施方案中，所述α酪蛋白可以是αs1或αs2。
在一些实施方案中，所述α酪蛋白可由选自SEQ ID NO.1-26的蛋白质序列或具有至少80％序列同源性的变体编码。
在一些实施方案中，所述κ酪蛋白可由选自SEQ ID NO.27-40的蛋白质序列或具有至少80％序列同源性的变体编码。
在一些实施方案中，所述奶酪组合物包含尺寸约150nm至约500nm或约100nm至约500nm的胶束形式的群体。
在一些实施方案中，所述胶束形式的群体的部分可以被设置尺寸为小于100nm或为约10nm至100nm。
在一些实施方案中，所述奶酪可包含选自钙盐、柠檬酸盐和磷酸盐中的至少一种盐。在一些实施方案中，所述奶酪缺乏任何附加的乳制品源性蛋白质。
在一些实施方案中，所述奶酪缺乏任何动物源性乳蛋白质。
在一些实施方案中，所述奶酪具有约0％至约50％的脂肪含量，并且所述脂肪可来源于植物基来源。
在一些实施方案中，所述奶酪具有约0％至约10％的糖含量，并且所述糖可来源于植物基来源。
在一些实施方案中，所述奶酪在加热时能够融化和褐变。
在一些实施方案中，所述奶酪可选自帕斯特菲拉塔(pasta-filata)样奶酪、印度奶酪(paneer)、奶油奶酪(cream cheese)和茅屋奶酪(cottage cheese)。
在一些实施方案中，所述奶酪可以是马苏里拉。
在一些实施方案中，所述奶酪可以是选自切达(cheddar)、瑞士(swiss)、布里(brie)、卡蒙贝尔(camembert)、菲达(feta)、哈罗米(halloumi)、高达(gouda)、艾丹姆(edam)、切达、曼彻格(manchego)、瑞士、科尔比(colby)、门斯特(muenster)、蓝纹奶酪(blue cheese)或帕尔玛(parmesan)中的陈化或熟化奶酪。
在一些实施方案中，所述奶酪的保水性可为40-65％。
在一些实施方案中，所述奶酪的质地可与动物源性乳制品奶酪相当。
在一些实施方案中，所述奶酪的硬度可与动物源性乳制品奶酪相当。
在一些方面，本文描述了可食用组合物的生产方法。可食用组合物的生产方法可包括：在以下条件下组合重组α酪蛋白、重组κ酪蛋白和至少一种盐，其中所述α酪蛋白和所述κ酪蛋白在液体胶体中形成胶束形式，其中所述胶束形式不包含β酪蛋白；以及使所述液体胶体经受第一条件以形成凝固体。
在一些实施方案中，所述第一条件可以是添加酸或用微生物酸化所述液体胶体。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述凝固体经受热水处理并任选地拉伸，以形成菲拉塔型奶酪。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述凝固体经受凝乳剂(rennetingagent)以形成凝结的凝乳(rennetted curd)。
在一些实施方案中，所述凝乳剂可以是微生物源性凝乳酶(chymosin)。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述凝结的凝乳老化和熟化以形成奶酪样组合物。
在一些实施方案中，所述方法还包括使所述凝结的凝乳经受热水处理并任选地拉伸，以形成菲拉塔型奶酪。
在一些实施方案中，所述可食用组合物不包含β酪蛋白。
在一些实施方案中，所述可食用组合物不包含任何附加的乳制品源性蛋白质。
在一些实施方案中，所述可食用组合物不包含任何动物源性乳蛋白质。
在一些实施方案中，重组产生的α酪蛋白和κ酪蛋白由一种或多种细菌宿主细胞产生。
在一些实施方案中，与天然α酪蛋白相比，所述α酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的磷酸化。
在一些实施方案中，与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的糖基化。
在一些实施方案中，与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的磷酸化。
在一些实施方案中，所述方法不包括用调节翻译后修饰的酶处理α酪蛋白和/或κ酪蛋白。
在一些实施方案中，所述细菌宿主细胞可选自乳球菌属、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌、铫子短芽孢杆菌、耻垢分枝杆菌、红城红球菌和谷氨酸棒杆菌、乳杆菌属、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、集胞藻属6803和大肠杆菌。
在一些实施方案中，一种或多种细菌宿主细胞分泌所述重组产生的α酪蛋白和κ酪蛋白。
在一些实施方案中，一种或多种细菌宿主细胞保留所述重组产生的α酪蛋白和κ酪蛋白。
在一些实施方案中，α酪蛋白和κ酪蛋白中的一者或两者的产生可受诱导型启动子调控。
在一些实施方案中，α酪蛋白和κ酪蛋白中的一者或两者的产生可受组成型启动子调控。
在一些实施方案中，在所述胶束形式中α酪蛋白与κ酪蛋白的比例可为约1:1至约15:1。
在一些实施方案中，该比例可为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1。
在一些实施方案中，所述α酪蛋白可以是αs1或αs2。
在一些实施方案中，所述α酪蛋白可由选自SEQ ID NO.1-26的核苷酸序列或具有至少80％序列同源性的变体编码。
在一些实施方案中，所述κ酪蛋白可由选自SEQ ID NO.27-40的核苷酸序列或具有至少80％序列同源性的变体编码。
在一些实施方案中，所述液体胶体包含尺寸约150nm至约500nm或约100nm至约500nm的所述胶束形式的群体。
在一些实施方案中，所述胶束形式的群体的部分可以被设置尺寸为小于100nm或为约10nm至100nm。
在一些实施方案中，所述液体胶体中的盐可以是钙盐。
在一些实施方案中，形成所述液体胶体的步骤还包括添加磷酸盐和/或柠檬酸盐。
在一些实施方案中，其中凝乳化凝固时间可为1分钟至6小时。
在一些方面，本文描述了液体胶体胶束组合物。所述液体胶体可包含胶束形式，其中所述胶束形式包含重组α酪蛋白、重组κ酪蛋白和至少一种盐，并且其中所述α酪蛋白、所述κ酪蛋白或其组合完全缺乏或具有显著减少的翻译后修饰。
在一些实施方案中，(a)与天然α酪蛋白相比，所述α酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的磷酸化，或(b)与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的糖基化，或(c)与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或可具有显著减少的磷酸化，或(d)同时包括(a)、(b)和(c)。
在一些实施方案中，所述胶束形式不包含β酪蛋白。
在一些实施方案中，可使用本文所述的方法形成酸奶组合物。可使用本文所述的液体胶体形成所述酸奶。所述方法可包括将所述液体胶体加热然后冷却，以及用微生物酸化所述液体胶体。所述微生物可包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳杆菌或双歧杆菌(bifidobacteria)中的一种或多种。
在一些实施方案中，可通过本文所述的方法形成所述酸奶组合物，其中所述α酪蛋白包含牛、人、绵羊、山羊、水牛、野牛、马或骆驼α酪蛋白的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可通过本文所述的方法形成所述酸奶组合物，其中所述κ酪蛋白包含牛、人、绵羊、山羊、水牛、野牛、马或骆驼κ酪蛋白的氨基酸序列。
在一些方面，本文所提供的可以是一种组合物，该组合物包含：第一生长培养基的浓缩物，其中所述浓缩物包含至少一种重组酪蛋白；其中所述第一生长培养基可相容于支持重组微生物的生长，所述重组微生物表达和分泌所述至少一种重组酪蛋白；并且其中所述第一生长培养基包含非乳制品非动物源性乳清；以及至少一种乳酸菌菌种，其中所述组合物可相容于所述至少一种乳酸菌菌种的生长。
在一些实施方案中，本文所提供的可以是一种组合物，该组合物包含：包含非乳制品非动物源性乳清的第一生长培养基，其中所述第一生长培养基可相容于支持重组微生物的生长，所述重组微生物表达和分泌至少一种重组酪蛋白；并且其中所述第一生长培养基的浓缩物可相容于至少一种乳酸菌菌种的生长以及相容于形成奶酪样稠度。
在一些实施方案中，所述组合物还包含至少一种重组酪蛋白。在一些实施方案中，所述至少一种重组酪蛋白可选自α酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白。
在一些实施方案中，所述组合物包含两种重组酪蛋白。
在一些实施方案中，所述第一生长培养基的所述浓缩物包含胶束，并且所述胶束包含至少一种重组酪蛋白。
在一些实施方案中，所述重组微生物可以是革兰氏阳性菌。
在一些实施方案中，所述乳酸菌菌种可以是乳球菌属。
在一些实施方案中，所述第一生长培养基能够支持重组微生物生长至接近或处于固定相处。
在一些方面，本文所描述的可以是一种发酵的乳制品样产品。所述发酵的乳制品样产品可以是选自硬奶酪、软奶酪、凝乳奶酪、涂抹奶酪和酸奶中的产品。
在一些方面，本文所描述的可以是一种发酵的乳制品样产品的制作方法，该方法包括：在非乳制品非动物源性乳清中培养表达重组酪蛋白的重组微生物，其中所述酪蛋白可被分泌到所述乳清中；将所述微生物从所述乳清中移除；将所述乳清与至少一种乳酸菌菌种合并；由此在温育期后，所述乳清与所述至少一种乳酸菌菌种的合并产生发酵的乳制品样产品。
在一些实施方案中，可在添加所述乳酸菌之前将所述乳清浓缩。
在一些实施方案中，所述重组微生物可以是革兰氏阳性菌。
在一些实施方案中，所述重组微生物可以是酵母。
在一些实施方案中，所述重组微生物可以是乳球菌属。
在一些实施方案中，培养步骤包括使所述重组微生物生长至接近或处于固定相处。
在一些实施方案中，所述发酵的乳制品样产品可选自硬奶酪、软奶酪、凝乳奶酪、涂抹奶酪和酸奶。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而并入本文中，其程度如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
附图说明
在所附权利要求书中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解。
图1是生产过程的基本技术图。
图2图示了奶酪生产的示例性方案。
图3图示了表达***。
图4A示出了酸奶样凝胶和凝乳。
图4B图示了由胶束酪蛋白液体胶体(补充有乳糖)(左)和脱脂奶(右)通过使用细菌发酵剂培养物而微生物酸化制作的凝乳。在这两种情况下均制作出硬实、可切割和粘着性的凝乳。左下：由用脱味椰子油乳化的胶束液体胶体(补充有乳糖)通过使用细菌发酵剂培养物而微生物酸化制作的凝乳的示例。
图4C图示了使用细菌发酵剂培养物相比于柠檬酸由微生物酪蛋白液体胶体相比于由脱脂奶制作的马苏里拉样奶酪的奶酪和凝乳的硬实度(在应力松弛试验中以g力计)和松弛。
图5A图示了马苏里拉奶酪的质地剖面和硬度/硬实度(以g力计)。
图5B图示了由融化的胶束酪蛋白制作的马苏里拉样品，并放在“比萨饼”上用于三角测试品尝。
图6图示了在各种盐条件下使用α酪蛋白、β-酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束(黑色)和亚胶束(灰色)的平均胶束直径(nm)。检测到的胶束(黑色)和亚胶束(灰色)峰的相对强度比例表示为弧形尺寸/角度。
图7A图示了由在各种盐条件下使用α酪蛋白、β-酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束构成的液体奶样胶体。
图7B示出了液体奶样胶体经由柠檬酸酸化(顶行)和经由重组凝乳酶凝乳化凝固(中行)，形成乳制品凝乳(底行，X未采集数据)。样品B和F在酸化和凝乳化过程中沉淀，并在孔底上形成凝乳。所有其他样品在酸化过程中保持悬浮状态并在整个孔中形成凝乳。然后将凝乳浸入热水中并拉伸成帕斯特菲拉塔奶酪球。
图8示出了在各种盐条件下使用α酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束(黑色)和亚胶束(灰色)的平均胶束直径(nm)。检测到的胶束(黑色)和亚胶束(灰色)峰的相对强度比例表示为弧形尺寸/角度。
图9A示出了由α酪蛋白和κ酪蛋白组装的酪蛋白胶束的液体奶样胶体制作的奶酪的硬度(以施加g力计)。将酪蛋白酸钠(混合奶酪蛋白的来源)用作对照。误差棒代表一式三份样品的标准偏差。
图9B示出了由α酪蛋白和κ酪蛋白组装的酪蛋白胶束的液体奶样胶体制作的奶酪的照片(一式三份)。
图10示出了在各种盐条件下使用低磷酸化(酶促去磷酸化)α酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束的液体奶样胶体经由柠檬酸酸化(顶行)和经由重组凝乳酶凝乳化凝固，从而产生乳制品凝乳(底行，其中X指凝乳已用于制作奶酪)。样品F在酸化和凝乳化过程中沉淀，并在孔底上形成凝乳。所有其他样品在酸化过程中保持悬浮状态并在整个孔中形成凝乳。然后将凝乳浸入热水中并拉伸成帕斯特菲拉塔奶酪球。
图11示出了在各种盐条件下由低磷酸化(酶促去磷酸化)α酪蛋白和κ酪蛋白组装的酪蛋白胶束的液体奶样胶体制作的奶酪的照片。
图12示出了在盐条件下在奶样蛋白质浓度下(总酪蛋白2.8％，总酪蛋白3.2％)使用低磷酸化(酶促去磷酸化)α酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束(黑色)和亚胶束(灰色)的平均胶束直径(nm)。检测到的胶束(黑色)和亚胶束(灰色)峰的相对强度比例表示为弧形尺寸/角度。
图13示出了由使用α酪蛋白和去糖基化κ酪蛋白或者α酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束构成的液体奶样胶体。α-酪蛋白保持不变，而κ酪蛋白增加2倍和3倍。
图14示出了使用α酪蛋白和去糖基化κ酪蛋白或者α酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束的平均胶束直径(nm)。α-酪蛋白保持不变，而κ酪蛋白增加2倍和3倍。误差棒代表一式三份样品的标准偏差。
图15示出了由使用α酪蛋白和去糖基化κ酪蛋白或者α酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束构成的液体胶体经由酸化和凝乳化制作的凝乳。α-酪蛋白保持不变，而κ酪蛋白增加2倍和3倍。除了形成聚集体的左上样品外，形成的所有凝乳均是强硬的足以倒置而不会变形。
图16示出了由使用α酪蛋白和去糖基化κ酪蛋白或者α酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束的凝乳制作的奶酪的湿产量(mg)。α-酪蛋白保持不变，而κ酪蛋白增加2倍和3倍。通过将凝乳浸入热水中，拉伸并塑造成奶酪球而制作奶酪(马苏里拉)。
图17示出了使用低磷酸化(酶促去磷酸化)α酪蛋白和去糖基化κ酪蛋白或者低磷酸化(酶促去磷酸化)α酪蛋白和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束的平均胶束直径(nm)。α-酪蛋白保持不变，而κ酪蛋白增加2倍。误差棒代表一式三份样品的标准偏差。
图18示出了使用重组α-S1-酪蛋白(去磷酸化的)和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束的平均胶束直径(nm)。α-S1-酪蛋白保持不变，而κ酪蛋白增加2倍。误差棒代表一式三份样品的标准偏差。
图19示出了由使用重组α-S1-酪蛋白(去磷酸化的)和κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束的凝乳制作的奶酪的湿产量(mg)。α-酪蛋白保持不变，而κ酪蛋白增加2倍。通过将凝乳浸入热水中，拉伸并塑造成奶酪球而制作奶酪(马苏里拉)。
图20示出了使用重组α-S1-酪蛋白(去磷酸化的)和去糖基化κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束的平均胶束直径(nm)。α-S1-酪蛋白保持不变，而κ酪蛋白增加2倍。误差棒代表一式三份样品的标准偏差。
图21示出了由使用重组α-S1-酪蛋白(去磷酸化的)和去糖基化κ酪蛋白诱导的酪蛋白胶束的凝乳制作的奶酪的湿产量(mg)。α-酪蛋白保持不变，而κ酪蛋白增加2倍。通过将凝乳浸入热水中，拉伸并塑造成奶酪球而制作奶酪(马苏里拉)。
具体实施方式
尽管已经在本文中示出和描述了本发明的各种实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应该理解，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种可替选方案。
尽管乳制品行业价值3300亿美元，但仍需要研究使用重组乳蛋白质的清洁乳制品解决方案。由于乳制品奶酪和酸奶是低效的乳制品产品(就每克所需的资源而言)以及最难以仅从植物基成分准确再生产的乳制品产品，本文提出了重组奶酪和重组酸奶的方法和组合物。
赋予乳制品奶酪或酸奶其独特特性的一种组分是在奶中形成胶束的酪蛋白。胶束是由四种酪蛋白(α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白)构成的蛋白质胶体，所述酪蛋白与在胶体中心处的不溶性磷酸钙相互作用。一旦将凝乳酶添加到奶中，奶中的胶束就会相互吸引。这形成了凝乳，之后所述凝乳用于制作所有奶酪的99％。本公开内容基于以下发现：可使用重组α和κ酪蛋白并且在不添加β酪蛋白的情况下来生成胶束和其后的奶酪。在酸奶的情况下，可使用已知用于酸奶生产的细菌的发酵剂培养物来对包含胶束的液体胶体进行酸化。本公开内容还描述了可使用重组α和κ酪蛋白并且在不添加β酪蛋白的情况下生成的胶束和其后的酸奶。
重组α酪蛋白和κ酪蛋白可在微生物有机体，例如，细菌诸如革兰氏阳性菌乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌以及革兰氏阴性模式有机体大肠杆菌中表达。这些重组蛋白质可与植物基培养基(矿物质、脂肪、糖和维生素)组合以制作在行为、气味、味道、外观和感觉上都像动物源性乳制品奶酪的奶酪。重组奶酪可不含：i)乳糖，ii)胆固醇，iii)饱和脂肪(取决于它如何影响味道和口感)，以及iv)乳清蛋白(在奶酪制作过程中，奶酪制造商通常无法从酪蛋白凝乳中完全去除乳清)。
方法可包括生产可能需要较少纯化和下游加工的重组蛋白质。细菌(正在表达目标蛋白质)可在可用于奶酪生产的丰富生长培养基中生长。生长培养基或“乳清”(serum)可以是上文提到的可能缺乏蛋白质的植物基溶液(因为蛋白质将通过工程化细菌菌株表达到培养基中)。
在一些实施方案中，该方法包括在细菌宿主细胞中生产重组蛋白质，从而这些蛋白质从细胞分泌到周围培养基中。在一些实施方案中，该方法包括在细菌宿主细胞中生产重组蛋白质，从而这些蛋白质处于细胞内。然后可将重组蛋白质分离、纯化或部分纯化，并用于制作胶束、液体胶体、凝固胶体、凝乳和奶酪的方法中。
可针对相对于体质量的高蛋白质产量对发酵过程进行优化，体质量是对于通过发酵进行的典型重组蛋白质表达可能很重要的参数。可在整个发酵过程中控制和/或维持pH，以使其不超过所表达蛋白质的等电点。这可由于敏感的酪蛋白行为而完成。
在一些实施方案中，在达到最佳滴度后，可对基因修饰的细菌进行离心分离，并且可收集上清液，可将上清液经过一步或两步向下加工成为奶酪制作肉汤。奶酪制作肉汤的主要步骤可以是将溶液浓缩以达到与奶相似的蛋白质浓度。在这个阶段，酪蛋白胶束可能已经形成。浓缩后，可添加嗜温或嗜热的奶酪制作发酵剂培养物以使溶液发酵，直到溶液达到最佳凝乳酶活性的合适pH(对于天然胶束而言，pH5.8-6.0，对于不同胶束，合适pH可能会有所不同)。然后可添加凝乳酶以诱导凝乳形成，然后可将凝乳制成奶酪。图1是生产过程的基本技术图。
如本文所用，术语“约”可以指在1个或多于1个标准偏差内。备选地，“约”可以指给定值的不超过10％、不超过5％或不超过1％的范围。例如，约可以指给定值的不超过±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％。
如本文所用，术语“乳蛋白质”是指具有来源于奶中发现的蛋白质(包括其变体)的氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用，术语“动物源性”乳蛋白质是指来源于奶的蛋白质，诸如从产奶生物(包括但不限于牛、绵羊、山羊、人、野牛、水牛、骆驼和马)获得和/或分离的蛋白质。“动物源性酪蛋白”是指从产奶生物中获得和/或分离的酪蛋白。
如本文所用，术语“重组乳蛋白质”是指在异源或重组生物体中表达的具有来源于奶中发现的蛋白质(包括其变体)的氨基酸序列的蛋白质。“重组酪蛋白”是指由重组生物或在异源宿主细胞中产生的酪蛋白。
组合物和组合物制作方法
本文的奶酪组合物包含凝固胶体，该凝固胶体包含以胶束形式缔合的一种或多种重组蛋白质。胶束形式可存在于液体悬浮液或胶体形式中。可将包括但不限于蛋白质、脂肪、糖、矿物质、维生素的其他组分添加到胶束中(例如，添加到液体胶体中的胶束中)。可用酸化条件并任选地用凝固剂(诸如用于凝乳形成的蛋白酶)处理包含用一种或多种重组酪蛋白形成的胶束的液体胶体。此后，然后可对包含一种或多种重组蛋白质的凝乳进行处理以生成奶酪或奶酪样组合物。在酸奶形成的情况下，可用酸化条件(诸如通过细菌发酵剂培养物进行酸化)处理包含用一种或多种重组酪蛋白形成的胶束的液体胶体。
I.胶束和液体胶体
在哺乳动物乳汁中，酪蛋白(α-s1-酪蛋白、α-s2-酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白，以及称为γ酪蛋白的β酪蛋白裂解形式)以及磷酸钙和柠檬酸盐形成称为酪蛋白胶束的大胶体颗粒。酪蛋白胶束的主要功能是为酪蛋白分子提供流动性并溶解磷酸盐和钙。
由于酪蛋白胶束的大尺寸会干扰绝对结构的测定，因此提出了不同的胶束形成模型。模型可分为三类：壳核(coat-core)模型、亚基或亚胶束模型和内部结构模型。
如本文所述，酪蛋白胶束可由分离的酪蛋白(诸如重组产生的酪蛋白)形成。由重组酪蛋白形成的胶束可包含α酪蛋白(诸如α-s1-酪蛋白和/或α-s2-酪蛋白)、β酪蛋白和/或κ酪蛋白。在一些情况下，胶束包含α酪蛋白和κ酪蛋白。在一些情况下，胶束包含α酪蛋白和κ酪蛋白，并且不包含任何β酪蛋白。
在一些情况下，胶束包含2种酪蛋白，诸如α(α-S1或α-S2)和κ酪蛋白或β和κ酪蛋白。在胶束中α或β-酪蛋白与κ-酪蛋白的比例可为约2:1至10:1或约1:1至15:1。胶束可占据约2-6mL/g，并且酪蛋白胶束可具有10-400nm或10-500nm的平均直径。
形成稳定胶束的两种酪蛋白可以是共表达的。这可能需要对溶剂的确切盐含量(钙、磷酸盐、钾、柠檬酸盐等)的形式进行工程化和调整，以及对酪蛋白进行可能地工程化。
在一些实施方案中，本文所述的胶束包括在液体溶液中形成的胶束。在一些实施方案中，包含酪蛋白的胶束存在于液体胶体中，其中胶束保持分散并且不会从液体溶液中沉淀出来。在一些情况下，液体胶体包含含有酪蛋白的胶束和酪蛋白的其他形式，诸如蛋白质的聚集体和/或单体形式。
α酪蛋白：在一些实施方案中，本文的液体胶体可包含α酪蛋白。液体胶体中的α酪蛋白可以是αS1酪蛋白。液体胶体中的α酪蛋白可以是αS2酪蛋白。液体胶体中的α酪蛋白可以是αS1酪蛋白和αS2酪蛋白的组合。液体胶体中的α酪蛋白可构成酪蛋白的0％至100％。在一些情况下，可仅使用α酪蛋白，特别地仅使用αS1酪蛋白生产液体胶体。备选地，在一些情况下，可在不含任何α酪蛋白的情况下生产液体胶体。在一些情况下，α酪蛋白构成液体胶体中酪蛋白的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。液体胶体中的α酪蛋白可包含0％至100％的αS1酪蛋白、αS2酪蛋白或其组合。
在一些情况下，液体胶体中的酪蛋白由50％的αS1酪蛋白至100％的αS1酪蛋白构成。在一些情况下，液体胶体包含α酪蛋白并且总酪蛋白包含100％的αS1酪蛋白。在一些情况下，液体胶体包含α酪蛋白并且总酪蛋白包含至少50％的αS1酪蛋白。液体胶体中的α酪蛋白可包含50％的αS1酪蛋白至70％的αS1酪蛋白、50％的αS1酪蛋白至90％的αS1酪蛋白、50％的αS1酪蛋白至100％的αS1酪蛋白、70％的αS1酪蛋白至90％的αS1酪蛋白、70％的αS1酪蛋白至100％的αS1酪蛋白或90％的αS1酪蛋白至100％的αS1酪蛋白。液体胶体中的α酪蛋白可包含约50％的αS1酪蛋白、70％的αS1酪蛋白、90％的αS1酪蛋白或100％的αS1酪蛋白。
在一些实施方案中，液体胶体中的α酪蛋白是αS2酪蛋白。在一些情况下，液体胶体中的酪蛋白由50％的αS2酪蛋白至100％的αS2酪蛋白构成。在一些情况下，液体胶体包含α酪蛋白并且总酪蛋白包含100％的αS2酪蛋白。在一些情况下，液体胶体包含α酪蛋白并且总酪蛋白包含至少50％的αS2酪蛋白。液体胶体中的α酪蛋白可包含50％的αS2酪蛋白至70％的αS2酪蛋白、50％的αS2酪蛋白至90％的αS2酪蛋白、50％的αS2酪蛋白至100％的αS2酪蛋白、70％的αS2酪蛋白至90％的αS2酪蛋白、70％的αS2酪蛋白至100％的αS2酪蛋白或90％的αS2酪蛋白至100％的αS2酪蛋白。液体胶体中的α酪蛋白可包含50％的αS2酪蛋白、70％的αS2酪蛋白、90％的αS2酪蛋白或100％的αS2酪蛋白。
在一些实施方案中，液体胶体中的α酪蛋白是αS1酪蛋白和αS2酪蛋白的混合物。这样的液体胶体中的α酪蛋白可包含例如分别1％的αS2酪蛋白至99％的αS2酪蛋白和99％的αS1酪蛋白至1％的αS1酪蛋白。在一些实施方案中，液体胶体中的α酪蛋白是αS1酪蛋白和αS2酪蛋白按10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20或90:10比例的混合物。在一些情况下，液体胶体中的α酪蛋白不包括αS2酪蛋白。在一些情况下，液体胶体中的α酪蛋白不包括αS1酪蛋白。在一些情况下，液体胶体中的α酪蛋白不包括αS2酪蛋白。
本文中液体胶体的蛋白质含量可包含30％至90％或50％至95％的α酪蛋白。在一些情况下，液体胶体的蛋白质含量可包含至少30％的α酪蛋白。在一些情况下，液体胶体的蛋白质含量可包含至少50％的α酪蛋白。在一些情况下，液体胶体的蛋白质含量可包含至少90％或至少95％的α酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含30％至35％、30％至40％、30％至50％、30％至55％、30％至70％、30％至75％、30％至80％、30％至85％、30％至90％、35％至40％、35％至50％、35％至55％、35％至70％、35％至75％、35％至80％、35％至85％、35％至90％、40％至50％、40％至55％、40％至70％、40％至75％、40％至80％、40％至85％、40％至90％、50％至55％、50％至70％、50％至75％、50％至80％、50％至85％、50％至90％、55％至70％、55％至75％、55％至80％、55％至85％、55％至90％、70％至75％、70％至80％、70％至85％、70％至90％、75％至80％、75％至85％、75％至90％、80％至85％、80％至90％、85％至90％或90至95％的α酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含30％、35％、40％、50％、55％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的α酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含至少30％、35％、40％、50％、55％、70％、75％、80％、85％或90％的α酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含至多40％、50％、55％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的α酪蛋白。
α酪蛋白(包括S1和/或S2酪蛋白)可以是重组产生的。在一些情况下，液体胶体可包含仅重组产生的α酪蛋白。在某些情况下，液体胶体可包含基本上仅重组产生的α酪蛋白。例如，α酪蛋白可以有90％、92％、95％、97％、99％的重组α酪蛋白。备选地，液体胶体可包含重组产生的α酪蛋白和动物源性α酪蛋白的混合物。
根据用于表达α酪蛋白的宿主生物体，α酪蛋白可能具有与动物源性α酪蛋白不同的糖基化或磷酸化模式(翻译后修饰)。在一些情况下，α酪蛋白不包含翻译后修饰(PTM)。在一些情况下，α酪蛋白包含显著减少的PTM。如本文所用，显著减少的PTM是指与动物源性α酪蛋白中PTM的量相比，一种或多种类型的PTM减少至少50％。例如，与动物源性α酪蛋白相比，α酪蛋白的翻译后修饰可减少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、99％。备选地，α酪蛋白可包含与动物源性α酪蛋白PTM相当的PTM。
α酪蛋白中的PTM可经化学或酶促修饰。在一些情况下，在没有化学或酶促处理的情况下，α酪蛋白包含显著减少的PTM或不含PTM。可使用具有减少的PTM或不含PTM的α酪蛋白生产液体胶体，其中PTM的缺乏不是由于蛋白质的化学或酶处理，例如通过重组生产α酪蛋白，其中重组蛋白质缺乏PTM。
α酪蛋白中的磷酸化可经化学或酶促修饰。在一些情况下，在没有化学或酶促处理的情况下，α酪蛋白包含显著减少的磷酸化或不含磷酸化。例如，与动物源性α酪蛋白相比，α酪蛋白的磷酸化可减少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、99％。可使用具有减少的磷酸化或不含磷酸化的α酪蛋白生产液体胶体，其中磷酸化的缺乏不是由于化学或酶处理，例如其中重组生产提供具有减少的磷酸化或不含磷酸化的α酪蛋白。
β酪蛋白：在一些实施方案中，与动物源性胶束(或动物来源的液体胶体)相比，本文的液体胶体包含显著更少量的β酪蛋白。可生成本文所述的液体胶体以包含小于10％的β酪蛋白。本文液体胶体的蛋白质含量可包含小于10％、8％、5％、3％、2％、1％或0.5％的β酪蛋白。在优选的实施方案中，本文所述的液体胶体不包含任何β酪蛋白。
κ酪蛋白：在一些实施方案中，本文的液体胶体可包含κ酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含0％至100％的κ酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含至少1％的κ酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含100％或至多50％或至多30％的κ酪蛋白。液体胶体可包含1％至5％、1％至7％、1％至10％、1％至12％、1％至15％、1％至18％、1％至20％、1％至25％、1％至30％、5％至7％、5％至10％、5％至12％、5％至15％、5％至18％、5％至20％、5％至25％、5％至30％、7％至10％、7％至12％、7％至15％、7％至18％、7％至20％、7％至25％、7％至30％、10％至12％、10％至15％、10％至18％、10％至20％、10％至25％、10％至30％、12％至15％、12％至18％、12％至20％、12％至25％、12％至30％、15％至18％、15％至20％、15％至25％、15％至30％、18％至20％、18％至25％、18％至30％、20％至25％、20％至30％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40至45％或45％至50％的κ酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含1％、5％、7％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％、60％、70％、80％、90％或100％的κ酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含至少1％、5％、7％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％或45％的κ酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含至多5％、7％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的κ酪蛋白。在一些情况下，可仅使用κ酪蛋白生产液体胶体。备选地，在一些情况下，可在不含任何κ酪蛋白的情况下生产液体胶体。
κ酪蛋白可以是重组产生的。在一些情况下，液体胶体可包含仅重组产生的κ酪蛋白。在某些情况下，液体胶体可包含基本上仅重组产生的κ酪蛋白。在某些情况下，κ酪蛋白可以有90％、92％、95％、97％、99％的重组κ酪蛋白。备选地，液体胶体可包含重组产生的κ酪蛋白和动物源性κ酪蛋白的混合物。
根据用于表达κ酪蛋白的宿主生物体，κ酪蛋白可具有翻译后修饰，诸如与动物源性κ酪蛋白不同的糖基化或磷酸化模式。在一些情况下，本文组合物中的κ酪蛋白不包含翻译后修饰(PTM)。在一些情况下，κ酪蛋白包含显著减少的PTM。如本文所用，显著减少的PTM是指与动物源性κ酪蛋白中PTM的量相比，一种或多种类型的PTM减少至少50％。例如，与动物源性κ酪蛋白相比，κ酪蛋白的翻译后修饰可减少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、99％。备选地，κ酪蛋白可包含与动物源性κ酪蛋白PTM相当的PTM。
κ酪蛋白中的PTM可经化学或酶促修饰。在一些情况下，在没有化学或酶促处理的情况下，κ酪蛋白包含显著减少的PTM或不含PTM。可使用具有减少PTM的或不含PTM的κ酪蛋白生产液体胶体，其中PTM的缺乏或减少不是由于化学或酶处理，例如通过在宿主中生产重组κ蛋白，其中κ酪蛋白没有翻译后修饰或PTM的水平显著降低。
κ酪蛋白中的糖基化可经化学或酶促修饰。在一些情况下，在没有化学或酶促处理的情况下，κ酪蛋白包含显著减少的糖基化或不含糖基化。例如，与动物源性κ酪蛋白相比，κ酪蛋白的糖基化可减少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、99％。可使用具有减少糖基化的或不含糖基化的κ酪蛋白生产液体胶体，其中糖基化的缺乏不是由于重组生产后的化学或酶促处理。
κ酪蛋白中的磷酸化可经化学或酶促修饰。在一些情况下，在没有化学或酶促处理的情况下，κ酪蛋白包含显著减少的磷酸化或不含磷酸化。例如，与动物源性κ酪蛋白相比，κ酪蛋白的磷酸化可减少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、99％。可使用具有减少磷酸化的或不含磷酸化的κ酪蛋白生产液体胶体，其中磷酸化的缺乏不是由于化学或酶处理，例如通过在宿主中生产重组κ蛋白，其中κ酪蛋白没有翻译后修饰或PTM的水平显著降低。
液体胶体的蛋白质含量可包含约5％的κ酪蛋白和约95％的α酪蛋白至约50％的κ酪蛋白和约50％的α酪蛋白。液体胶体的蛋白质含量可包含约6％的κ和约94％的α、约5％的κ和约95％的α、约7％的κ和约93％的α、约10％的κ和约90％的α、约12％的κ和约88％的α、约15％的κ和约85％的α、约17％的κ和约83％的α、约20％的κ和约80％的α、约25％的κ和约75％的α、约30％的κ和约70％的α酪蛋白、约35％的κ和约65％的α、约40％的κ和约60％的α、约45％的κ和约55％的α或约50％的κ和约50％的α。
液体胶体中的α酪蛋白与κ酪蛋白的比例可为约1:1至约15:1。液体胶体中的α酪蛋白与κ酪蛋白的比例可为1:1、2:1至4:1、2:1至6:1、2:1至8:1、2:1至10:1、2:1至12:1、2:1至14:1、2:1至15:1、4:1至6:1、4:1至8:1、4:1至10:1、4:1至12:1、4:1至14:1、4:1至15:1、6:1至8:1、6:1至10:1、6:1至12:1、6:1至14:1、6:1至15:1、8:1至10:1、8:1至12:1、8:1至14:1、8:1至15:1、10:1至12:1、10:1至14:1、10:1至15:1、12:1至14:1、12:1至15:1或14:1至15:1。液体胶体中的α酪蛋白与κ酪蛋白的比例可为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1。
在一些实施方案中，液体胶体包含α和κ酪蛋白并且不包含β酪蛋白，并且附加地，α酪蛋白、κ酪蛋白或α酪蛋白和κ酪蛋白二者均缺乏翻译后修饰。例如，液体胶体包含(与动物源性奶的α酪蛋白相比)缺乏或显著减少磷酸化的α酪蛋白和κ酪蛋白，或者包含(与动物源性奶的α酪蛋白相比)缺乏或显著减少磷酸化的α酪蛋白以及(与动物源性奶的κ酪蛋白相比)糖基化或磷酸化或糖基化和磷酸化二者缺乏或显著减少的κ酪蛋白。在一些情况下，液体胶体包含α酪蛋白和κ酪蛋白，其中(与动物源性奶的κ酪蛋白相比)κ酪蛋白的糖基化或磷酸化或糖基化和磷酸化二者缺乏或显著减少。在一些情况下，液体胶体包含在细菌宿主细胞中重组产生的并且一种或多种PTM缺乏或显著减少的α酪蛋白、κ酪蛋白或两者。
在一些实施方案中，本文的液体胶体(和由其制作的产品)不包含除α和κ酪蛋白之外的任何其他乳蛋白质。在一些情况下，本文的液体胶体(和由其制作的产品)不包含任何乳清蛋白。在一些实施方案中，本文的液体胶体(和由其制作的产品)不包含任何动物源性乳蛋白质。
本文的胶束直径(诸如液体胶体中的胶束)可为约10nm至约500nm。本文的胶束直径可为至少10nm。本文的胶束直径可为至多500nm。本文的胶束直径可为10nm至20nm、10nm至50nm、10nm至100nm、10nm至150nm、10nm至200nm、10nm至250nm、10nm至300nm、10nm至350nm、10nm至400nm、10nm至450nm、10nm至500nm、20nm至50nm、20nm至100nm、20nm至150nm、20nm至200nm、20nm至250nm、20nm至300nm、20nm至350nm、20nm至400nm、20nm至450nm、20nm至500nm、50nm至100nm、50nm至150nm、50nm至200nm、50nm至250nm、50nm至300nm、50nm至350nm、50nm至400nm、50nm至450nm、50nm至500nm、100nm至150nm、100nm至200nm、100nm至250nm、100nm至300nm、100nm至350nm、100nm至400nm、100nm至450nm、100nm至500nm、150nm至200nm、150nm至250nm、150nm至300nm、150nm至350nm、150nm至400nm、150nm至450nm、150nm至500nm、200nm至250nm、200nm至300nm、200nm至350nm、200nm至400nm、200nm至450nm、200nm至500nm、250nm至300nm、250nm至350nm、250nm至400nm、250nm至450nm、250nm至500nm、300nm至350nm、300nm至400nm、300nm至450nm、300nm至500nm、350nm至400nm、350nm至450nm、350nm至500nm、400nm至450nm、400nm至500nm或450nm至500nm。本文的胶束直径可为约10nm、约20nm、约50nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm或约500nm。本文的胶束直径可为至少10nm、20nm、50nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm或450nm。本文的胶束直径可为至多20nm、50nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm。
盐：液体胶体中的酪蛋白混合物可包含如本文其他地方所述的α、β和/或κ酪蛋白。在一些实施方案中，液体胶体包含α酪蛋白和κ酪蛋白，但不包含β酪蛋白。在本文的液体胶体中形成胶束可包括将各种盐添加到包含酪蛋白混合物的溶液中。可添加到酪蛋白混合物中的盐可包括钙盐、含磷盐、柠檬酸盐、钾盐、钠盐和/或氯化物盐。在一些情况下，盐被包含在胶束中。在一些情况下，盐被包含在液体胶体中，从而部分的盐被包含在胶束中，而另一部分的盐在溶液中(例如，在胶束“外部”)。
包含酪蛋白胶束的液体胶体可包含钙盐。钙盐可选自氯化钙、碳酸钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、乳酸钙、葡萄糖酸钙、醋酸钙、其等效物和/或其组合。液体胶体中钙盐的浓度可为约10mM至约55mM。液体胶体中钙盐的浓度可为至少10mM。液体胶体中钙盐的浓度可为至多50mM。在一些实施方案中，液体胶体中钙盐的浓度可为28mM或不超过28mM，或者可为55mM或不超过55mM。液体胶体中钙盐的浓度可为10mM至15mM、10mM至20mM、10mM至25mM、10mM至30mM、10mM至35mM、10mM至40mM、10mM至45mM、10mM至50mM、10mM至55mM、15mM至20mM、15mM至25mM、15mM至30mM、15mM至35mM、15mM至40mM、15mM至45mM、15mM至50mM、15mM至55mM、20mM至25mM、20mM至30mM、20mM至35mM、20mM至40mM、20mM至45mM、20mM至50mM、20mM至55mM、25mM至30mM、25mM至35mM、25mM至40mM、25mM至45mM、25mM至50mM、25mM至55mM、30mM至35mM、30mM至40mM、30mM至45mM、30mM至50mM、30mM至55mM、35mM至40mM、35mM至45mM、35mM至50mM、35mM至55mM、40mM至45mM、40mM至50mM、40mM至55mM、45mM至50mM、45mM至55mM或50mM至55mM。液体胶体中钙盐的浓度可为10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或55mM。液体胶体中钙盐的浓度可为至少10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。液体胶体中钙盐的浓度可为至多15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或55mM。
包含酪蛋白胶束的液体胶体可包含磷酸盐。磷酸盐可选自诸如磷酸一钠(磷酸二氢钠)、磷酸二钠、磷酸三钠、磷酸一钾(磷酸二氢钾)、磷酸二钾、磷酸三钾等正磷酸盐；诸如焦磷酸二钠或二钾、焦磷酸三钠或三钾、焦磷酸四钠或四钾等焦磷酸盐；诸如三聚磷酸五钠或钾、四聚磷酸钠或钾、六偏磷酸钠或钾等多聚磷酸盐。液体胶体中磷酸盐的浓度可为约8mM至约45mM。液体胶体中磷酸盐的浓度可为至少8mM。液体胶体中磷酸盐的浓度可为至多25mM或至多30mM或至多40mM或至多45mM。液体胶体中磷酸盐的浓度可为8mM至10mM、8mM至15mM、8mM至20mM、8mM至25mM、8mM至30mM、8mM至35mM、8mM至40mM、8mM至45mM、10mM至15mM、10mM至20mM、10mM至25mM、10mM至30mM、10mM至35mM、10mM至40mM、10mM至45mM、15mM至20mM、15mM至25mM、15mM至30mM、15mM至35mM、15mM至40mM、15mM至45mM、20mM至25mM、20mM至30mM、20mM至35mM、20mM至40mM、20mM至45mM、25mM至30mM、25mM至35mM、25mM至40mM、25mM至45mM、30mM至35mM、30mM至40mM、30mM至45mM、35mM至40mM、35mM至45mM或40mM至45mM。液体胶体中磷酸盐的浓度可为约8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM。液体胶体中磷酸盐的浓度可为至少8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM或40mM。液体胶体中磷酸盐的浓度可为至多10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM或45mM。
包含酪蛋白胶束的液体胶体可包含柠檬酸盐。柠檬酸盐可选自柠檬酸钙、柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸三钠、柠檬酸三钾或其等效物。液体胶体中柠檬酸盐的浓度可为约2mM至约20mM。液体胶体中柠檬酸盐的浓度可为至少2mM。液体胶体中柠檬酸盐的浓度可为至多15mM或至多20mM。液体胶体中柠檬酸盐的浓度可为2mM至4mM、2mM至6mM、2mM至8mM、2mM至10mM、2mM至12mM、2mM至14mM、2mM至16mM、2mM至18mM、2mM至20mM、4mM至6mM、4mM至8mM、4mM至10mM、4mM至12mM、4mM至14mM、4mM至16mM、4mM至18mM、4mM至20mM、6mM至8mM、6mM至10mM、6mM至12mM、6mM至14mM、6mM至16mM、6mM至18mM、6mM至20mM、8mM至10mM、8mM至12mM、8mM至14mM、8mM至16mM、8mM至18mM、8mM至20mM、10mM至12mM、10mM至14mM、10mM至16mM、10mM至18mM、10mM至20mM、12mM至14mM、12mM至16mM、12mM至18mM、12mM至20mM、14mM至16mM、14mM至18mM、14mM至20mM、16mM至18mM、16mM至20mM或18mM至20mM。液体胶体中柠檬酸盐的浓度可为2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM或20mM。液体胶体中柠檬酸盐的浓度可为至少2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM、14mM、16mM或18mM。液体胶体中柠檬酸盐的浓度可为至多4mM、6mM、8mM、10mM、12mM、14mM、16mM、18mM或20mM。
包含酪蛋白胶束的液体胶体可包含盐的组合。在一些实施方案中，液体胶体包含钙盐、磷酸盐和柠檬酸盐。在一些情况下，液体胶体中钙盐、磷酸盐和柠檬酸盐的比例可为3:2:1至约6:4:1。液体胶体中钙盐、磷酸盐和柠檬酸盐的比例可为约3:1:1、3:2:1、3:3:1、4:2:1、4:3:1、4:4:1、5:2:1、5:2:2、5:3:1、5:4:1、5:5:1、5:3:2、5:4:2、6:1:1、6:2:1、6:3:1或6:4:1。
在液体胶体中形成胶束可能需要将酪蛋白溶解在溶剂(诸如水)中。可在酪蛋白溶解于溶剂中后添加盐。备选地，可将盐和酪蛋白同时添加到溶液中。在胶束形成期间可多于一次地添加盐。例如，可以以规律的间隔或在连续滴定过程中向包含酪蛋白的溶液中添加钙盐、磷酸盐和柠檬酸盐并混合，直到生成所需质量的胶束液体胶体。在一个示例中，可以以规律的间隔添加盐，直到胶体达到所需的吸光度。在胶束形成过程期间在不同时间可添加不同的盐。例如，可在添加磷酸盐和柠檬酸盐之前添加钙盐，或者可在添加钙盐和磷酸盐之前添加柠檬酸盐，或者可在添加钙盐和柠檬酸盐之前添加磷酸盐。
可将附加的组分添加到液体胶体中，从而液体胶体随后呈奶样并用于凝乳和/或奶酪或酸奶的形成。在一些实施方案中，将脂肪添加到液体胶体中。在一些情况下，脂肪可基本上不含动物源性脂肪。本文所用的脂肪可包括植物基脂肪，诸如芥花油、葵花籽油、椰子油或其组合。液体胶体中脂肪的浓度可为约0％至约5％。脂肪的浓度可为至少0.5％或约1％。脂肪的浓度可为至多5％。脂肪的浓度可为约0％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％。脂肪的浓度可为0至0.5％、0.5％至1％、1％至3％、1％至4％或1％至5％。脂肪的浓度可为至多2％、3％、4％或5％。
本文所述的液体胶体还可包含糖。本文所用的糖可包括植物基二糖和/或寡糖。糖的示例包括蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、阿洛酮糖、塔格糖、木糖和***糖。
可通过在30℃至45℃的温度下混合不同的组分而生成具有附加组分的液体胶体。例如，可在约30℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃或45℃的温度下将具有一种或多种重组蛋白质(诸如α和κ酪蛋白的组合)的液体胶体与脂肪和/或糖混合。
II.凝乳/奶酪、酸奶形成和组分
胶束(诸如α和κ酪蛋白的胶束)可能存在于液体胶体中，其中大部分胶束仍悬浮在液体中。在一些实施方案中，对液体胶体进行处理以形成凝固胶体。在一些情况下，该处理是诸如通过添加酸或用微生物酸化来降低液体胶体的pH以生成凝固胶体。
可将脂肪添加到液体胶体中以生成凝固胶体或凝乳，从而在最终的奶酪产品中脂肪的浓度为约0％至约50％，通常超过0％。例如，由液体胶体制作的奶酪产品中脂肪的浓度为约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。由液体胶体制作的奶酪产品中脂肪的浓度可为1％至50％。由液体胶体制作的奶酪产品中脂肪的浓度可为至少1％。由液体胶体制作的奶酪产品中脂肪的浓度可为至多50％。由液体胶体制作的奶酪产品中脂肪的浓度可为1％至5％、1％至10％、1％至15％、1％至20％、1％至25％、1％至30％、1％至35％、1％至40％、1％至45％、1％至50％、5％至10％、5％至15％、5％至20％、5％至25％、5％至30％、5％至35％、5％至40％、5％至45％、5％至50％、10％至15％、10％至20％、10％至25％、10％至30％、10％至35％、10％至40％、10％至45％、10％至50％、15％至20％、15％至25％、15％至30％、15％至35％、15％至40％、15％至45％、15％至50％、20％至25％、20％至30％、20％至35％、20％至40％、20％至45％、20％至50％、25％至30％、25％至35％、25％至40％、25％至45％、25％至50％、30％至35％、30％至40％、30％至45％、30％至50％、35％至40％、35％至45％、35％至50％、40％至45％、40％至50％或45％至50％。由液体胶体制作的奶酪产品中脂肪的浓度可为1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。由液体胶体制作的奶酪产品中脂肪的浓度可为至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。由液体胶体制作的奶酪/酸奶产品中脂肪的浓度可为至多1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。
可使用超声处理或高压均化过程将脂肪乳化在液体胶体(例如，包含由α和κ酪蛋白和盐形成的胶束)中。可使用诸如大豆卵磷脂或黄原胶等乳化剂以确保稳定的乳液。
可在约4至约6的最终pH下生成凝固胶体。可在约4至约6的pH下生成凝固胶体。可在至少4的最终pH下生成凝固胶体。可在至多6的最终pH下生成凝固胶体。可在4至4.5、4至5、4至5.1、4至5.2、4至5.5、4至6、4.5至5、4.5至5.1、4.5至5.2、4.5至5.5、4.5至6、5至5.1、5至5.2、5至5.5、5至6、5.1至5.2、5.1至5.5、5.1至6、5.2至5.5、5.2至6或5.5至6的最终pH下生成凝固胶体。可在约4、约4.5、约5、约5.1、约5.2、约5.5或约6的最终pH下生成凝固胶体。可在至少4、4.5、5、5.1、5.2或5.5的最终pH下生成凝固胶体。可在至多4.5、5、5.1、5.2、5.5或6的最终pH下生成凝固胶体。用于降低液体胶体的pH并达到本文所述的最终pH或最终pH范围的处理可包括添加酸，诸如柠檬酸、乳酸或醋(乙酸)。用于降低液体胶体的pH并达到本文所述的最终pH或最终pH范围的处理可包括添加酸化微生物，诸如乳酸菌。示例性的酸化微生物包括乳球菌、链球菌、乳杆菌及其混合物。在一些情况下，将酸和酸化微生物添加到液体胶体中以产生凝固胶体。在一些情况下，在该步骤还添加老化和催熟用的微生物(诸如细菌或真菌)。
在一些情况下，酸化后，可添加凝乳剂以形成凝结的凝乳(凝固凝乳基质)，然后可将其用于制作奶酪。液体胶体(诸如牛奶以及本文所述的液体胶体)中的胶束在胶体悬浮液中是稳定的并且相互排斥。在凝乳剂或乳凝块酶(milk-clotting enzyme)的存在下，当酸化时，胶束失去稳定并相互吸引，从而凝固。在凝乳剂或乳凝块酶的存在下，形成交联的凝固凝乳基质。用于凝乳形成的凝乳剂可包括凝乳酶、胃蛋白酶A、毛霉凝乳酶(mucorpepsin)、enthothiapepsin或其等效物。凝乳剂可来源于植物、乳制品产品或者是重组的。
在一些实施方案中，对凝结的凝乳进行进一步处理以形成奶酪或奶酪样产品。在一些情况下，诸如马苏里拉奶酪产品，可将凝结的凝乳加热并拉伸。在其他实施方案中，可将凝结的凝乳老化，诸如用于布里、卡蒙贝尔、菲达、哈罗米、高达、艾丹姆、切达、曼彻格、瑞士、科尔比、门斯特、蓝纹奶酪或帕尔玛型奶酪或奶酪样产品。
在一些实施例中，可用热水处理凝固胶体或凝结的凝乳以形成奶酪，诸如马苏里拉型奶酪。可在约50℃至约90℃的温度下进行热水处理。可在至少55℃的温度下进行热水处理。可在至多75℃的温度下进行热水处理。可在50℃至55℃、55℃至60℃、55℃至65℃、55℃至70℃、55℃至75℃、60℃至65℃、60℃至70℃、60℃至75℃、65℃至70℃、65℃至75℃、70℃至75℃、75℃至80℃、80℃至85℃或85℃至90℃的温度下进行热水处理。可在约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃或约90℃的温度下进行热水处理。可在至少50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或85℃的温度下进行热水处理。可在至多55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或90℃的温度下进行热水处理。在一些情况下，热水处理后，将产物拉伸成奶酪。在一些情况下，奶酪是马苏里拉样奶酪。
使用本文所述的方法形成的奶酪组合物可不包含任何动物来源的组分。使用本文所述的方法形成的奶酪组合物可不包含任何动物来源的基于乳制品的组分，诸如动物来源的乳蛋白质。使用本文所述的方法形成的奶酪组合物可不包含任何乳清蛋白。使用本文所述的方法形成的奶酪组合物可不包含任何β酪蛋白。本文所述的奶酪组合物可以是帕斯特菲拉塔样奶酪，诸如马苏里拉奶酪。也可使用本文所述的方法形成软奶酪，诸如印度奶酪、奶油奶酪和茅屋奶酪。也可使用本文所述的方法形成其他类型的奶酪，诸如陈化和熟化的奶酪，诸如布里、卡蒙贝尔、菲达、哈罗米、高达、艾丹姆、切达、曼彻格、瑞士、科尔比、门斯特、蓝纹奶酪和帕尔玛。
通过本文所述的方法制作的奶酪的质地可与使用动物源性乳制品源性蛋白质制作的相似类型奶酪(诸如由动物奶制作的奶酪)的质地相当。可使用经过培训的人类受试者组或机器(诸如质地分析仪)测试奶酪的质地。
通过本文所述的方法制作的奶酪的味道可与使用动物源性乳蛋白质制作的相似类型奶酪相当。可使用经过培训的人类受试者组测试奶酪的味道。
本文所述的奶酪组合物可具有与使用动物源性乳蛋白质制作的相似类型奶酪相当的褐变能力。本文所述的奶酪组合物可具有与使用动物源性乳蛋白质制作的相似类型奶酪相当的融化能力。
在一些实施方案中，液体胶体可用于酸奶的形成。在某些情况下，对于酸奶生产，可对液体胶体进行热处理。热处理可包括在约75℃、80℃、85℃、87℃、90℃、92℃、95℃或100℃的温度下处理液体胶体。热处理之后可以是液体胶体的冷却步骤。
在某些情况下，例如在酸奶生产中，可使用细菌培养物作为发酵剂培养物。用于酸奶生产的发酵剂细菌培养物可以是本领域已知的任何细菌培养物。例如，可培养已知用于生产酸奶的细菌(诸如德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、其他乳杆菌或双歧杆菌属细菌)并将其添加到包含一种或多种重组蛋白质的液体胶体中。细菌发酵剂培养物可用于液体胶体的酸化。可持续进行液体胶体的酸化直到达到所需的胶体稠度。例如，可持续进行细菌酸化直到液体胶体达到所需的稠度。液体胶体的细菌酸化可能导致形成具有酸奶样稠度的凝固液体胶体。
酸奶生产中液体胶体的细菌酸化可在30℃至55℃的温度下进行。在一些情况下，液体胶体的细菌酸化可在至少30℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在至多55℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在30℃至35℃、30℃至40℃、30℃至45℃、30℃至50℃、30℃至55℃、35℃至40℃、35℃至45℃、35℃至50℃、35℃至55℃、40℃至45℃、40℃至50℃、40℃至55℃、45℃至50℃、45℃至55℃或50℃至55℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在约30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在至少30℃、35℃、40℃、45℃或50℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在至多35℃、40℃、45℃、50℃或55℃的温度下进行。在一些情况下，细菌酸化可在30℃至55℃的温度下进行至少1小时。在一些情况下，细菌酸化可在30℃至55℃的温度下进行至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时或至少12小时。在一些情况下，细菌酸化可在30℃至55℃的温度下进行至多1小时。在一些情况下，细菌酸化可在30℃至55℃的温度下进行至多2小时、至多3小时、至多4小时、至多5小时、至多6小时、至多8小时、至多10小时或至多12小时。
备选地，细菌酸化可在15℃至30℃的较低温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在至少15℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在至多30℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在15℃至17℃、15℃至20℃、15℃至22℃、15℃至25℃、15℃至27℃、15℃至30℃、17℃至20℃、17℃至22℃、17℃至25℃、17℃至27℃、17℃至30℃、20℃至22℃、20℃至25℃、20℃至27℃、20℃至30℃、22℃至25℃、22℃至27℃、22℃至30℃、25℃至27℃、25℃至30℃或27℃至30℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在约15℃、17℃、20℃、22℃、25℃、27℃或30℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在至少15℃、17℃、20℃、22℃、25℃或27℃的温度下进行。液体胶体的细菌酸化可在至多17℃、20℃、22℃、25℃、27℃或30℃的温度下进行。在一些情况下，细菌酸化可在15℃至30℃的温度下进行至少10小时。在一些情况下，细菌酸化可在15℃至30℃的温度下进行至少10小时、至少12小时、至少14小时、至少16小时、至少18小时、至少20小时、至少22小时或至少24小时。在一些情况下，细菌酸化可在15℃至30℃的温度下进行至多24小时。在一些情况下，细菌酸化可在15℃至30℃的温度下进行至多12小时、至多14小时、至多16小时、至多18小时、至多20小时、至多22小时或至多24小时。
与奶酪形成类似，用于形成酸奶的凝固液体胶体可包含其他组分，诸如糖、脂肪、稳定剂和调味剂。
由液体胶体制作的酸奶产品中脂肪的浓度可为0％至12％。由液体胶体制作的酸奶产品可包含小于1％的脂肪，或在一些情况下不含脂肪。由液体胶体制作的酸奶产品中脂肪的浓度可为至多12％。由液体胶体制作的酸奶(奶酪)产品中脂肪的浓度可为1％至2％、1％至5％、1％至7％、1％至10％、1％至12％、2％至5％、2％至7％、2％至10％、2％至12％、5％至7％、5％至10％、5％至12％、7％至10％、7％至12％或10％至12％。由液体胶体制作的酸奶(奶酪)产品中脂肪的浓度可为约1％、2％、5％、7％、10％或12％。由液体胶体制作的酸奶(奶酪)产品中脂肪的浓度可为至少1％、2％、5％、7％或10％。由液体胶体制作的酸奶(奶酪)产品中脂肪的浓度可为至多2％、5％、7％、10％或12％。可使用超声处理或高压均化过程将脂肪乳化在液体胶体(例如，包含由α和κ酪蛋白和盐形成的胶束)中。可使用诸如大豆卵磷脂或黄原胶等乳化剂以确保稳定的乳液。
通过本文所述的方法制作的酸奶的质地可与使用动物源性乳制品源性蛋白质制作的相似类型酸奶(诸如由动物奶制作的酸奶)的质地相当。可使用经过培训的人类受试者组或机器(诸如质地分析仪)测试酸奶的质地。
通过本文所述的方法制作的酸奶的味道可与使用动物源性乳蛋白质制作的相似类型酸奶相当。可使用经过培训的人类受试者组测试酸奶的味道。
重组表达
用于形成奶酪组合物的一种或多种蛋白质可以是重组产生的。在一些情况下，αS1、αS2和κ酪蛋白是重组产生的。
αS1和/或S2酪蛋白可具有来自任何物种的氨基酸序列。例如，重组α酪蛋白可具有牛、人、绵羊、山羊、水牛、野牛、马或骆驼α酪蛋白的氨基酸序列。可对α酪蛋白核苷酸序列进行密码子优化以提高生产效率。示例性的α酪蛋白序列在下表1中提供。重组α酪蛋白可以是α酪蛋白的非天然存在的变体。这样的变体可包含相对于天然α酪蛋白序列的一个或多个氨基酸***、缺失或取代。
这样的变体可与SEQ ID NO:1-26具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。如本文在氨基酸序列的上下文中使用的术语“序列同一性”定义为在比对序列并***空位后，候选序列中氨基酸残基与所选序列中的氨基酸残基相同的百分比，如有必要，为了实现最大百分比序列同一性，并不考虑任何保守替换作为序列同一性的部分。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
κ酪蛋白可具有来自任何物种的氨基酸序列。例如，重组κ酪蛋白可具有牛、人、绵羊、山羊、水牛、野牛、马或骆驼κ酪蛋白的氨基酸序列。可对κ酪蛋白核苷酸序列进行密码子优化以提高生产效率。示例性的κ酪蛋白氨基酸序列在下表1中提供。重组κ酪蛋白可以是κ酪蛋白的非天然存在的变体。这样的变体可包含相对于天然κ酪蛋白序列的一个或多个氨基酸***、缺失或取代。
这样的变体可与SEQ ID NO:27-40具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
重组α或κ酪蛋白在宿主细胞中重组表达。如本文所用，“宿主”或“宿主细胞”表示被选择或基因修饰为生产所需产物的任何蛋白质生产宿主。示例性的宿主包括真菌(诸如丝状真菌)以及细菌、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞。在一些情况下，可使用诸如乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌等细菌宿主细胞来生产α和/或κ酪蛋白。其他宿主细胞包括细菌宿主，诸如但不限于乳球菌属、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌、铫子短芽孢杆菌、耻垢分枝杆菌、红城红球菌和谷氨酸棒杆菌、乳杆菌属、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和集胞藻属6803。
α和κ酪蛋白可在同一宿主细胞中产生。备选地，α和κ酪蛋白可在不同的宿主细胞中产生。靶蛋白质的表达可通过整合到宿主基因组中的表达载体、质粒、核酸或其他方式来提供。例如，用于表达的载体可包括：(a)启动子元件，(b)信号肽，(c)异源酪蛋白序列，以及(d)终止子元件。在一些情况下，本文所述的一种或多种表达载体不包含β酪蛋白的蛋白质序列(SEQ ID NO：41-42)。
可用于表达酪蛋白的表达载体包括包含表达盒的那些表达载体，所述表达盒具有元件(a)、(b)、(c)和(d)。在一些实施方案中，信号肽(c)不需要被包括在载体中。在一些情况下，信号肽可以是酪蛋白天然信号序列的部分，例如，蛋白质可包含如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41中加粗显示的天然信号序列。在一些情况下，载体包含如SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39或41中示例的蛋白质序列。在一些情况下，载体可包含成熟蛋白质序列，如具有异源信号序列的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40中所示例。通常，表达盒被设计成当被整合到同源宿主微生物的基因组中时或当存在于在宿主细胞中保持的质粒或其他复制载体上时，介导转基因的转录。
为了在转化入宿主微生物中之前帮助载体扩增，载体中可包含复制起点(e)。为了帮助对用表达载体稳定转化的微生物进行选择，载体还可包括选择标志物(f)。表达载体还可包含限制酶位点(g)，其允许在转化到宿主微生物中之前将表达载体线性化以促进表达载体稳定整合到宿主基因组中。在一些实施方案中，表达载体可包含元件(b)、(e)、(f)和(g)的任何子集，包括不含元件(b)、(e)、(f)和(g)中的任一个。可将本领域技术人员已知的其他表达元件和载体元件组合用于或替代本文所述的元件。
可使用革兰氏阳性菌(诸如乳酸乳球菌和枯草芽孢杆菌)将目标蛋白质分泌到培养基中，并且可使用革兰氏阴性菌(诸如大肠杆菌)将目标蛋白质分泌到周质或培养基中。在一些实施方案中，细菌表达的蛋白质可能不具有任何翻译后修饰(PTM)，这意味着它们没有糖基化和/或可能没有磷酸化。
目标酪蛋白可通过乳酸链球菌肽诱导型表达***(由PnisA启动子调控)、乳酸诱导型表达***(由P170启动子调控)或其他类似诱导型***以及组成型表达***(由P secA启动子调节)在乳酸乳球菌中表达和产生，其中两者都在食品级选择菌株中进行，诸如使用载体pNZ8149(lacF基因增补/拯救原理)的NZ3900。功能性蛋白质的分泌可通过Usp45(SP(usp45))的信号肽来实现，它是由乳酸乳球菌分泌的主要Sec依赖性蛋白质。例如，可使用合成操纵子在乳酸乳球菌中共表达或单独表达α-S1-酪蛋白和κ酪蛋白，其中基因顺序是κ酪蛋白-αS1酪蛋白，如图3所示。
枯草芽孢杆菌设计
枯草芽孢杆菌与乳酸乳球菌不同，它具有多种细胞内和细胞外蛋白酶，可能会干扰蛋白质表达。在一些实施方案中，对枯草芽孢杆菌菌株进行修饰以减少细胞内和/或细胞外蛋白酶的类型和量，例如可使用分别具有7个(KO7)和8个(WB800N)蛋白酶缺失的菌株。
为了驱动重组蛋白质的分泌，可使用amyQ的信号肽、热纤梭菌(Clostridiumthermocellum)的α-淀粉酶。附加地，可在枯草芽孢杆菌中异源表达天然酪蛋白信号肽序列。每种酪蛋白都有自己的信号肽序列并且可用于该***。信号蛋白可能与酪蛋白交叉组合。可使用pHT01载体作为转化和表达穿梭载体，以用于在枯草芽孢杆菌中诱导型蛋白质表达。该载体基于枯草芽孢杆菌的groES-groEL操纵子之前的强σA依赖性启动子，已将其通过添加lac操纵子而转化为有效可控的(IPTG诱导型)启动子。pHT01是一种大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭载体，其向大肠杆菌给予氨苄青霉素抗性并且向枯草芽孢杆菌给予氯霉素抗性。
可表达酪蛋白的无标签和有标签的变化形式，由此在不分泌信号肽的情况下将小肽标签诸如His或StrepII标签、序列或融合蛋白诸如GST、MBP或SUMO置于酪蛋白的N端或C端。鉴于κ、α-S1和αS2酪蛋白的二级结构，在κ酪蛋白的N端处加标签可能破坏性较小，因此α-S1酪蛋白可能在两个末端处都加有标签。然而，可使用其他标签。
表1：序列
实施方案
实施例
以下说明性实施例代表本文所述的组合物和方法的实施方案，并不意味着以任何方式进行限制。
实施例1：在乳酸乳球菌中通过乳酸链球菌肽诱导型***(NICE)表达酪蛋白
构建体设计、克隆和转化
牛κ酪蛋白(变体B)和牛α-S1-酪蛋白(变体C)蛋白质编码序列(不含天然信号肽)经过密码子优化以在乳酸乳球菌中表达，并构建合成操纵子以用于在乳酸链球菌肽诱导型启动子下共表达和分泌这两种蛋白质。使用来自天然分泌乳球菌蛋白Usp45的信号肽序列来驱动蛋白质分泌。然后通过限制性消化兼容位点将合成操纵子克隆到大肠杆菌定制载体中，并通过Sanger测序确认，然后通过限制性消化和连接而将其亚克隆到乳酸链球菌肽诱导型pNZ8149载体中。通过电穿孔而将载体转化到相容的乳酸乳球菌NZ3900菌株中，并使用补充有乳糖的完全限定培养基(CDM)进行选择。通过菌落PCR来确认阳性克隆，并取3个阳性克隆进行蛋白质表达诱导和分析。
蛋白质表达和分析
使各个菌落在30℃下在液体培养基中生长，并蛋白质产生是用乳酸链球菌肽诱导2.5小时(对照样品未被诱导)。然后通过离心来收获细胞，并通过考马斯凝胶染色(SDS-PAGE)和化学发光(针对κ-酪蛋白和α-S1-酪蛋白的蛋白质印迹法，LSBio初级抗体)来分析TCA沉淀的上清液和裂解的细胞团粒。通过考马斯染色蛋白质凝胶和蛋白质印迹在测试的转化体中检测乳酸乳球菌中的κ-酪蛋白表达。
实施例2：在乳酸乳球菌中通过pH诱导型***表达
与上述构建体类似，用P170启动子(一种用于乳酸乳球菌的pH/乳酸诱导型启动子)代替乳酸链球菌肽启动子，为α、β和κ酪蛋白构建酪蛋白构建体。这些构建体中的每一个均包含分泌信号肽。
通过蛋白质印迹来检测在乳酸乳球菌中分泌的α-s1和κ酪蛋白。α-S1-酪蛋白的蛋白质产物在细胞内积累。α-S1-酪蛋白分泌不佳，而κ酪蛋白显示产生的蛋白质几乎完全分泌。
实施例3：在枯草芽孢杆菌中表达
构建体设计、克隆和转化
对在C末端加His标签的牛α-S1-酪蛋白(变体C)蛋白质编码序列(不含天然信号肽)进行密码子优化以用于在枯草芽孢杆菌中表达。在有和没有amyQ、解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(据报道其可有效分泌重组蛋白质)的密码子优化信号肽的情况下构建构建体。通过大肠杆菌经由Gibson克隆将构建体克隆到转化和表达IPTG诱导型载体pHT01中，并通过Sanger测序确认。pHT01是一种大肠杆菌/枯草芽孢杆菌穿梭载体，其向大肠杆菌给予氨苄青霉素抗性并且向枯草芽孢杆菌给予氯霉素抗性。将阳性克隆进一步转化到化学感受态枯草芽孢杆菌WB800N中。通过菌落PCR确认阳性克隆，并取3个阳性克隆进行蛋白质表达诱导和分析。
蛋白质表达和分析
使各个菌落在37℃下在液体培养基中生长，并蛋白质产生是用IPTG诱导1小时、2小时和6小时(对照样品未被诱导)。然后通过离心来收获细胞，并通过考马斯凝胶染色(SDS-PAGE)和化学发光(针对His标签和α-S1-酪蛋白的蛋白质印迹)来分析TCA沉淀的上清液和裂解的细胞团粒。
蛋白质印迹显示在枯草芽孢杆菌中α-S1-酪蛋白的表达。
实施例4：在大肠杆菌中表达
构建体设计、克隆和转化
将针对大肠杆菌进行密码子优化的牛α-S1-酪蛋白(变体C)蛋白质编码序列(不含天然信号肽)克隆到IPTG诱导型市售pET载体中。以仅将蛋白质编码序列留在可读框中的方式通过DNA片段和载体的Gibson反应进行克隆。将Gibson反应转化到感受态细胞中并通过Sanger测序确认。然后将载体转化到化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞或其衍生物(例如，BL21-pLysS)中，并筛选几个单菌落进行表达。
蛋白质表达、分析和纯化
使各个菌落在37C下在液体培养基中生长，并且蛋白质产生是用IPTG诱导4小时。然后通过离心来收获细胞，并通过考马斯凝胶染色(SDS-PAGE)和化学发光(针对α-S1-酪蛋白的蛋白质印迹)来分析裂解的细胞团粒。对于蛋白质纯化，通过离心来去除不溶性部分，然后在室温下用硫酸铵沉淀可溶性部分并通过离心来分离团粒。将团粒重新悬浮在尿素中，然后用磷酸二钠进行透析。通过离心来去除不溶性蛋白质，并通过用乙醇和乙酸铵沉淀然后离心来去除剩余的污染物。用离心过滤装置将所得α-S1-酪蛋白溶液浓缩，然后用磷酸二钠进行透析。通过考马斯染色凝胶来分析纯化的产物，与上述类似。
α-S1-酪蛋白在大肠杆菌的细胞内表达，通过考马斯染色蛋白质凝胶进行成功检测并纯化。
实施例5：使用胶束酪蛋白的奶酪制作过程
在本实施例中，由胶束酪蛋白粉末制作帕斯特菲拉塔奶酪样物质。胶束酪蛋白在工业中通常通过将脱脂奶超滤以分离酪蛋白胶束并通过喷雾干燥技术将酪蛋白胶束粉化而获得。在奶酪制作过程中，与水和糖混合的胶束酪蛋白通过细菌发酵或添加酸和粗制凝乳酶(rennet)(凝乳酶)而与奶表现相似，并产生奶样奶酪，将其专门制成马苏里拉样奶酪(图4A)。
以类似的方式，使用胶束酪蛋白(购自Milk Specialties Global)，通过多种方法制作马苏里拉样物质：14g-28g胶束酪蛋白粉、1000ml水、含有粗制凝乳酶和柠檬酸的马苏里拉样奶酪；14g-28g胶束酪蛋白粉、1000ml水、仅含柠檬酸的马苏里拉样奶酪；14g-28g胶束酪蛋白粉、1000ml水、20-55g植物基糖、含有粗制凝乳酶和乳酸菌的马苏里拉样奶酪；14g-28g胶束酪蛋白粉、稳定乳液中的1-4％植物基脂肪(含有和不含乳化剂)、20-55g植物基糖、含有粗制凝乳酶和柠檬酸的马苏里拉样奶酪；14g-28g胶束酪蛋白粉、稳定乳液中的1-4％植物基脂肪(含有和不含乳化剂)、20-55g植物基糖、仅含柠檬酸的马苏里拉样奶酪；14g-28g胶束酪蛋白粉、稳定乳液中的1-4％植物基脂肪(含有和不含乳化剂)、20-55g植物基糖、含有粗制凝乳酶和乳酸菌的马苏里拉样奶酪。
在另一个实施例中，使用嗜温细菌发酵剂培养物对补充有乳糖(5％)的胶束酪蛋白液体胶体(2.8％)进行酸化，同时使用脱脂奶作为对照。当添加凝乳剂时，将胶束酪蛋白胶体和奶酸化至pH约5.7，酸化的胶体保持不受扰动直到凝乳沉降(图4B)。然后将凝乳通过奶酪布沥干，浸入热水中并拉伸成马苏里拉样奶酪球。样品硬实度的质地分析仪评估如图4C所示(三个重复样品的平均值与标准偏差)。实施例6：使用胶束酪蛋白制作的马苏里拉样奶酪的配方和特性
在本实施例中，将胶束酪蛋白(最终w/v 3.3％)、大豆卵磷脂(最终w/v 0.1％)、融化椰子油(最终w/v 1％)和融化人造黄油(最终w/v 1％)一起配混成糊状物。将糊状物与40℃Milli-Q水混合并搅拌掺入，然后混入麦芽糖(最终w/v 2.5％)。用高剪切混合器混合配混物直至掺入脂肪。将液体冷却至33℃并在剧烈搅拌下添加柠檬酸溶液(最终w/v0.15％)，然后混入粗制凝乳酶溶液(最终v/v 0.0036％)并使该混合物得以静置15-30分钟。将凝乳用内衬奶酪布的筛子沥干，然后浸入热水(>60℃)中，拉伸和折叠几次，然后将其成型为马苏里拉样球。
在质地分析仪TX.TA上使用应力松弛测试探测制作的马苏里拉样奶酪的质地剖面，并与由2％脂肪的商店购买的奶制作的马苏里拉进行比较。图5A显示由上述配方中的胶束酪蛋白制作的马苏里拉样奶酪的质地剖面与由2％奶制作的马苏里拉的质地非常接近。
通过三角测试评估融化在“比萨饼”(自制面***，不含酱汁并且含有少量樱桃番茄、罗勒和橄榄油)上的由胶束酪蛋白制作的马苏里拉样奶酪对比商店购买的新鲜马苏里拉，如图5B所示。在三角测试中，给品尝者提供三种样品，其中两种相同，而一种不同。要求所述品尝者品尝所有三种样品并找出反常样品。猜对的几率是三分之一(33.33％)，因此如果正确回答的比率明显更高，则可得出结论，两种样品之间存在明显差异。如果回答正确率不显著大于33.33％，则可得出结论，两种样本之间没有可辨别的差异。
将样品以随机顺序呈现给品尝者，一半品尝者收到两个胶束酪蛋白马苏里拉比萨和一个商店购买的马苏里拉比萨，另一半收到相反的结果。样品仅由三位数代码标识。
在19位品尝者中，有6位正确识别反常样品，这意味着回答正确率为31.6％。这表明在比萨饼上融化时，胶束酪蛋白马苏里拉样奶酪和商店购买的马苏里拉奶酪之间没有显著差异。
实施例6：使用α、β和κ酪蛋白重构酪蛋白胶束/液体胶体
以冻干粉末形式从Sigma-Aldrich购买α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白部分。
在胶束/液体胶体形成实验中使用的蛋白质的量为1.4％(0.5倍奶浓度的酪蛋白)、2.8％(1倍奶浓度的酪蛋白)或3.2％(1倍奶浓度的总蛋白质，w/v)。除非另有说明，否则对于具有所有3种酪蛋白的实验，总蛋白质(按质量计)的15％是κ-酪蛋白，总蛋白质的30％是β-酪蛋白，总蛋白质的55％是α-酪蛋白。由此给出表2所示每个条件的以下量。
表2：蛋白质浓度
| 蛋白质％(总)(w/v) | α酪蛋白(mg/ml) | β酪蛋白(mg/ml) | κ酪蛋白(mg/ml) |
| 1.4 | 7.7 | 4.2 | 2.1 |
| 2.8 | 15.4 | 8.4 | 4.2 |
| 3.2 | 17.6 | 9.6 | 4.8 |
将α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白依次添加到水中并搅拌直至完全溶解。在一些实验中，还将混合物在室温下温育过夜。
加盐诱导胶束
使α、β和κ酪蛋白经受一系列盐组合以诱导胶束，其中将钙、磷酸盐和柠檬酸盐的比例保持在3:2:1或6:4:1，并且其中对于1.4％的总酪蛋白，钙浓度为14-24mM。使用DLS、吸光度和奶酪制作来评估所得溶液。
表3：1.4％总蛋白质浓度的最终盐浓度(mM)
将经过滤(220nm)的钙(CaCl2，除非另有说明)、磷酸盐(K2HPO4除非另有说明)和柠檬酸盐(柠檬酸三钾，除非另外说明)按照固定的添加时间表在五次添加中滴定到酪蛋白溶液中，达到表3中的最终浓度。首次添加仅包含部分钙，其他次添加为等部分的所有三种盐。使用动态光散射(DLS)仪器测量粒度
为了提供更好的测量精度，通常将样品在经过滤(220nm)的milliQ水中稀释至0.14％(或1.4mg/mL)或更低的浓度。使用Entegris Nicomp或Malvern Zetaseizer仪器测量样品。在Nicomp上，在90°检测角度下重复测量三次，并使用Nicomp分析软件来分析数据。在Zetasizer上，在173°检测角度下重复测量三次，并使用Zetasizer的小峰分析模式来分析数据。圆环图(图6)显示了实验的粒度数据，其中胶束是由1.4％蛋白质浓度的各酪蛋白重建的。对于任何主要的光散射颗粒群，仪器都会报告高斯样峰。峰的平均值给出了颗粒(胶束)直径(纳米(nm))，峰的强度给出了与报告的其他峰相比的相对散射。圆环图还报告了峰平均值-粒度(nm)-作为圆环图切片上的数字，以及它们的强度-作为圆环图(角度)部分的切片比例的相对量。圆环图显示了三次重复测量的平均粒度和平均强度。在牛奶中，酪蛋白胶束是检测到的主要颗粒，其尺寸通常为150至300nm，最大值通常高达500nm，伴随有检测到尺寸为30至80nm的亚胶束颗粒。
实施例7：使用重构胶束/液体胶体的凝乳和奶酪制作
以小规模(几毫升)在24孔板中制作奶酪。记录初始pH，并以增量方式滴定6.65％柠檬酸溶液，直至达到目标pH 5.1-5.2。以重构液体胶体体积的1.36％添加0.15％粗制凝乳酶溶液并轻轻混合。将样品静置大约30分钟，或直到形成凝乳。然后用移液管将凝乳移入微管中并离心2分钟以分离凝乳。排出分离出的液体，将凝乳通过浸入热水(>60℃)中而进行拉伸。将奶酪拉伸至光滑均匀，然后将其制成球并称重。对于较大的体积，除了离心步骤外，该过程遵循相同的方案。反而，使用内衬奶酪布的网过滤器沥干凝乳。
对于含有脂肪、糖和附加组分的全配方奶酪，将含有诱导胶束的液体胶体在水浴中加热至40℃。将脂肪融化并与糖配混，直到糖被包裹起来。如果使用乳化剂，也将其添加到脂肪/糖配混物中。然后将加热的蛋白质液体胶体倒入脂肪/糖混合物中并使用高剪切混合器进行配混。混合时间取决于样品体积，但范围为1-5分钟。然后使混合物在5000psi下通过Avestin Emulsiflex C-5均质器1次。然后如上所述进行酸化和凝乳化。
图7A和图7B示出了由包含胶束组合物A至F的来自实施例6的液体胶体形成的凝乳和奶酪。
实施例8：在模拟奶超滤液(SMUF)“乳清”中制作凝乳和奶酪
使用具有不同盐条件A至F的液体胶体组合物和附加的组合物G(不含盐)进行实施例7的上述凝乳和奶酪制作方案。结果总结在下表4中。
表4：凝乳和奶酪制作结果
实施例9：使用α酪蛋白和κ酪蛋白重构酪蛋白胶束/液体胶体，制作凝乳和奶酪
这些实验中的α-酪蛋白和κ酪蛋白是从Sigma-Aldrich购买的冻干粉末。在胶束/液体胶体形成实验中使用的蛋白质的标准量为1.4％(0.5倍奶浓度的酪蛋白)、2.8％(1倍奶浓度的酪蛋白)或3.2％(1倍奶浓度的总蛋白质，w/v)，也如表5所示。除非另有说明，否则总蛋白质(按质量计)的15％是κ酪蛋白，而总蛋白质的85％是α酪蛋白。
表5：蛋白质浓度
| 蛋白质％(总)(w/v) | [α酪蛋白](mg/ml) | [κ酪蛋白](mg/ml) |
| 1.4 | 11.9 | 2.1 |
| 2.8 | 23.8 | 4.2 |
| 3.2 | 27.2 | 4.8 |
对于1.4％蛋白质液体胶体，将α-酪蛋白和κ-酪蛋白依次添加到水中并搅拌直至完全溶解。在一些实验中，将混合物在室温下温育过夜。然后将钙、磷酸盐和柠檬酸盐滴定至表3中的最终浓度。盐添加时间表和随后的粒度测量方法与实施例6中所述类似地进行。粒度测量结果如图8所示，圆环图的标注与实施例6中所述的相同。粒度数据显示每种条件之间仅有微小变化，没有显示任何主要聚集。
胶束/液体胶体重构和奶酪制作也使用表6中的盐条件在如表7所示的2.8％和3.2％的最终蛋白质浓度下进行测试。初始pH为约6.0，最终pH为约5.2。为了制作奶酪，按照实施例7添加柠檬酸和粗制凝乳酶。
表6：最终盐浓度(mM)和蛋白质浓度(％)
| 1.4％蛋白质 | 2.8％蛋白质 | 3.2％蛋白质 | |
| 钙(CaCl2) | 18.5 | 30.85 | 30.85 |
| 磷酸盐(K2PO4) | 12.4 | 16.5 | 16.5 |
| 柠檬酸盐(柠檬酸三钾) | 6.16 | 8.2 | 8.2 |
表7：凝乳和奶酪制作结果
用于品尝和质地分析的规模化α酪蛋白+κ酪蛋白奶酪(完整配方)
该实验以30mL规模进行，使用酪蛋白酸钠(购自Sigma-Aldrich)作为对照。在两种蛋白质混合物(α和κ酪蛋白，相对于酪蛋白酸钠)中诱导胶束，然后用于下表8中所示的完整配方。
表8：奶酪组合物
使用上述组合物(表8)制作凝乳和奶酪，其中蛋白质是α+κ酪蛋白或作为对照的酪蛋白酸钠。初始pH为约6.0，最终pH为约5.1-5.2。按照实施例7添加柠檬酸和粗制凝乳酶。结果如表9所示。
表9：凝乳和奶酪制作结果
| 酪蛋白酸钠 | α酪蛋白+κ酪蛋白 | |
| 凝乳特性 | 破碎凝乳，一些蛋白质崩溃 | 完整凝乳 |
| 拉伸性 | 良好 | 良好 |
| 奶酪重量 | 1.17 | 1.76 |
| 奶酪产量 | 1.73 | 2.6 |
α+κ酪蛋白产生更多的奶酪和质量更好的凝乳，但质地与酪蛋白酸钠奶酪相似。酪蛋白酸钠奶酪具有强烈的异味，而α+κ奶酪则没有异味。在质地分析仪上一式三份测量两种奶酪，结果如图9A和9B所示。虽然来自α+κ酪蛋白的奶酪质地更硬，但总体而言它与酪蛋白酸钠奶酪非常相似。这表明α+κ酪蛋白可形成胶束/液体胶体、乳制品凝乳和乳制品奶酪，而β酪蛋白对于这些功能不是必需的。
实施例10：使用(去磷酸化/低磷酸化)α酪蛋白和κ酪蛋白重构酪蛋白胶束/液体胶体，制作凝乳和奶酪
用于该实验的蛋白质是去磷酸化的α酪蛋白和κ酪蛋白(均来自Sigma-Aldrich)。通过Neutral-Urea-Triton PAGE评估该α酪蛋白(作为去磷酸化α酪蛋白销售)的磷酸化状态，Neutral-Urea-Triton PAGE是一种用于解析各蛋白质的磷酸种类的既定方法。该***使用尿素作为变性剂，并在中性pH下运行。该评估表明，去磷酸化α酪蛋白的大部分蛋白质平均剩余1-2个磷酸，少量蛋白质具有较高的磷酸化水平。因此，这种蛋白质是低磷酸化的，这意味着与奶α酪蛋白相比，它具有显著降低的磷酸化(以1-2个磷酸为主相对于以8-9个磷酸为主)。
以如上表5所示的量使用低磷酸化α酪蛋白和κ酪蛋白，并通过将它们依次添加到水中并搅拌直至完全溶解而重构为胶束/液体胶体。然后如实施例7和8中所述处理混合物并在类似的盐条件和蛋白质浓度下进行评价。
如实施例6中所述测量粒度。使用如实施例7和8所述的方法进行凝乳和奶酪制作。低磷酸化α+κ显示出比α+κ更低的单体到胶束转化效率，如浊度(A400)降低所见。与α和κ或α、β和κ相比时，低磷酸化α+κ通常会产生稍微松散的胶束，但仍处于奶的天然胶束尺寸范围内(150-500nm)。低磷酸化α+κ没有表现出任何主要聚集。
低磷酸化α+κ液体胶体经由酸化和粗制凝乳酶的奶酪制作结果如图10所示，以及图11所示奶酪球的更近视觉比较。
低磷酸化α和κ胶束/液体胶体也在实施例9所述的盐条件下在较高蛋白质浓度下进行评价。这些条件下的粒度如图12所示。两种浓度的蛋白质(2.8％和3.2％)得到完整凝乳，顶部有一些液体并且凝乳易于拉伸。对于2.8％样品，奶酪重量为0.0467克，产量为1.07g奶酪/克蛋白质。对于3.2％样品，奶酪重量为0.0899克，产量为2.06g奶酪/克蛋白质。对于2.8％样品，A575为0.054，对于3.2％样品，A575为0.038。两个样品都没有表现出任何聚集。
实施例11：使用α酪蛋白和κ酪蛋白(去糖基化)重构酪蛋白胶束/液体胶体，制作凝乳和奶酪
去糖基化κ酪蛋白由冻干的κ酪蛋白(Sigma-Aldrich)生成。这是通过三氟甲磺酸(TFMS)实现的，它选择性地对蛋白质进行去糖基化，而没有明显的蛋白质降解(Sojar和Bahl,1987,A chemical method for the deglycosylation of proteins,Archives ofBiochemistry and Biophysics；Electricwala等人,A Rapid and Improved ChemicalMethod for Deglycosylation of Glycoproteins,Sigma Aldrich)。
使用ProQ Emerald300糖蛋白染色试剂盒来检测κ酪蛋白的糖基化，并确认去糖基化成功。结果表明，酪蛋白进行去糖基化反应后糖蛋白信号被消除(>95％)，这意味着κ酪蛋白被成功去糖基化。
使用1.4％蛋白质方案(如实施例6和9所述)作为起点进行胶束/液体胶体重构实验，测试2倍和3倍κ酪蛋白浓度，同时保持α酪蛋白浓度不变。将去糖基化κ酪蛋白储存在柠檬酸中，并在将κ酪蛋白和α酪蛋白混合后，通过化学计量添加NaOH来中和柠檬酸。然后根据固定的添加时间表所需的总柠檬酸盐同时减少添加的柠檬酸盐量。
胶束/液体胶体形成后，目测每个样品，如图13所示，并通过525nm处的吸光度来测定浊度，如下表10所示。如实施例6所述测量的胶束峰的平均粒度如图14所示。误差棒表示三次重复测量的标准偏差。
表10：浊度结果
在如实施例8中所述进行酸化和凝乳化以形成奶酪之后，对不同的样品进行目测(图15)并测定1ml液体胶体的产量(图16)。除1倍去糖基化κ酪蛋白(蛋白质从溶液中析出)外，所有样品都形成良好的凝乳，凝胶强度足以倒置而不变形。所有这些条件下的凝乳都具有良好的拉伸性和良好的融化性。
实施例12：使用(去磷酸化/低磷酸化)α酪蛋白和(去糖基化)κ酪蛋白重构酪蛋白胶束/液体胶体，制作凝乳和奶酪
本实施例的方法与实施例11中使用的方法相同，不同之处在于使用低磷酸化α酪蛋白代替α酪蛋白，并且仅测试1倍和2倍κ酪蛋白条件。胶束/液体胶体形成后，测定浊度(A525)，结果如下表所示。
表11：浊度结果
胶束峰的平均粒度如图17所示。误差棒表示三次重复测量的标准偏差。在每种条件下形成的1ml胶束的凝乳产量相对相似，并且所有条件下的凝乳都具有良好的拉伸性和良好的融化性。
实施例13：使用重组α-S1-酪蛋白(去磷酸化)和κ酪蛋白重构酪蛋白胶束/液体胶体，制作凝乳和奶酪
使用重组α-S1-酪蛋白和κ酪蛋白(Sigma-Aldrich)形成胶束/液体胶体。使用1.4％蛋白质，以及1倍或2倍κ酪蛋白。使用以下盐：27mM氯化钙、22mM磷酸二钠、10mM柠檬酸三钠。用含有α-S1-酪蛋白、κ酪蛋白、柠檬酸三钠和一半磷酸二钠的溶液开始反应。氯化钙和另一半磷酸二钠总共添加九次，其中首次添加仅包含部分钙，其他次添加为等部分的钙和磷酸盐。
不同条件下的浊度如表12所示。
表12：浊度结果(A525)
| 1倍κ酪蛋白 | 2倍κ酪蛋白 | |
| 重组α-s1-酪蛋白、κ酪蛋白 | 2.81 | 2.68 |
胶束峰的平均粒度如图18所示。误差棒表示三次重复测量的标准偏差。每种条件的奶酪产量如图19所示。
当被拉伸时凝乳具有表13中所示的特性。
表13：凝乳拉伸特性
| 1倍κ酪蛋白 | 2倍κ酪蛋白 | |
| 重组α-s1-酪蛋白、κ酪蛋白 | 平滑拉伸，略僵硬 | 平滑拉伸，略僵硬 |
实施例14：使用重组α-S1-酪蛋白(去磷酸化)和κ酪蛋白(去糖基化)重构酪蛋白胶束/液体胶体，制作凝乳和奶酪
使用重组α-S1-酪蛋白和去糖基化κ酪蛋白(按照实施例11)形成胶束/液体胶体。使用1.4％蛋白质，以及1倍或2倍κ酪蛋白。使用以下盐：27mM氯化钙、22mM磷酸二钠和10mM柠檬酸三钠。用含有α-S1-酪蛋白、去糖基化κ酪蛋白、柠檬酸三钠和一半磷酸二钠的溶液开始反应。如实施例13中所述形成胶束。不同条件下的浊度如表14所示。
表14：浊度结果(A525)
| 1倍κ酪蛋白 | 2倍κ酪蛋白 | |
| 重组α-s1-酪蛋白、去糖基化κ酪蛋白 | 2.70 | 2.54 |
胶束峰的平均粒度如图20所示。误差棒表示三次重复测量的标准偏差。每种条件的奶酪产量如图21所示。当被拉伸时凝乳具有表15中所示的特性。
表15：凝乳拉伸特性
| 1倍κ酪蛋白 | 2倍κ酪蛋白 | |
| 重组α-s1-酪蛋白、去糖基化κ酪蛋白 | 有弹性，有粘性 | 有弹性，有粘性 |
Claims (75)
1.一种包含凝固胶体的奶酪组合物，
其中所述凝固胶体包含以胶束形式缔合的α酪蛋白和κ酪蛋白，
其中所述α酪蛋白和所述κ酪蛋白中的至少一种是重组产生的；并且
其中所述奶酪组合物不包含β酪蛋白。
2.根据权利要求1所述的奶酪组合物，其中所述重组产生的酪蛋白由细菌宿主细胞产生。
3.根据权利要求1或2所述的奶酪组合物，其中所述α酪蛋白和所述κ酪蛋白均是重组产生的。
4.根据权利要求3所述的奶酪组合物，其中所述重组产生的α酪蛋白和κ酪蛋白由一种或多种细菌宿主细胞产生。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的奶酪组合物，其中与天然α酪蛋白相比，所述α酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的翻译后修饰。
6.根据权利要求5所述奶酪组合物，其中与天然α酪蛋白相比，所述α酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的磷酸化。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的奶酪组合物，其中与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的翻译后修饰。
8.根据权利要求7所述的奶酪组合物，其中与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的糖基化。
9.根据权利要求7或8所述奶酪组合物，其中与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的磷酸化。
10.根据权利要求2或4所述的奶酪组合物，其中所述细菌宿主细胞选自乳球菌属、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌、铫子短芽孢杆菌、耻垢分枝杆菌、红城红球菌和谷氨酸棒杆菌、乳杆菌属、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、集胞藻属6803和大肠杆菌。
11.根据权利要求10所述的奶酪组合物，其中所述细菌宿主细胞分泌所述重组产生的酪蛋白。
12.根据权利要求10所述的奶酪组合物，其中所述细菌宿主细胞在细胞内保留所述重组酪蛋白。
13.根据权利要求10或11所述的奶酪组合物，其中在所述细菌宿主细胞中所述重组产生的蛋白质的产生受诱导型启动子调控。
14.根据权利要求10或11所述的奶酪组合物，其中在所述细菌宿主细胞中所述重组产生的蛋白质的产生受组成型启动子调控。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的奶酪组合物，其中所述α酪蛋白与所述κ酪蛋白的比例为1:1至约15:1。
16.根据权利要求15所述的奶酪组合物，其中所述α酪蛋白与所述κ酪蛋白的比例为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1。
17.根据权利要求1-15中任一项所述的奶酪组合物，其中所述α酪蛋白是αS1或αS2。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的奶酪组合物，其中所述α酪蛋白具有包含SEQ IDNO.1-26之一的氨基酸序列或其具有至少80％序列同源性的变体。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的奶酪组合物，其中所述κ酪蛋白具有包含SEQ IDNO.27-40之一的氨基酸序列或其具有至少80％序列同源性的变体。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪组合物包含尺寸约150nm至约500nm或约100nm至约500nm的所述胶束形式的群体。
21.根据权利要求20所述的奶酪组合物，其中所述胶束形式的所述群体的部分被设置尺寸为小于100nm或为约10nm至100nm。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的奶酪组合物，还包含选自钙盐、柠檬酸盐和磷酸盐中的至少一种盐。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪缺乏任何附加的乳制品源性蛋白质。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪缺乏任何动物源性乳蛋白质。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪具有约0％至约50％的脂肪含量，并且所述脂肪来源于植物基来源。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪具有约0％至约10％的糖含量，并且所述糖来源于植物基来源。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪在加热时能够融化和褐变。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪选自帕斯特菲拉塔样奶酪、印度奶酪、奶油奶酪和茅屋奶酪。
29.根据权利要求1-27中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪是选自切达、瑞士、布里、卡蒙贝尔、菲达、哈罗米、高达、艾丹姆、切达、曼彻格、瑞士、科尔比、门斯特、蓝纹奶酪或帕尔玛中的陈化或熟化奶酪。
30.根据权利要求27所述的组合物，其中所述奶酪是马苏里拉。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪的保水性为40-65％。
32.根据权利要求1-30中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪的质地可与动物源性乳制品奶酪相当。
33.根据权利要求1-30中任一项所述的奶酪组合物，其中所述奶酪的硬度可与动物源性乳制品奶酪相当。
34.一种可食用组合物的生产方法，包括：
在以下条件下组合重组α酪蛋白、重组κ酪蛋白和至少一种盐，其中所述α酪蛋白和所述κ酪蛋白在液体胶体中形成胶束形式，其中所述胶束形式不包含β酪蛋白；以及
使所述液体胶体经受第一条件以形成凝固体。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一条件是添加酸或用微生物酸化所述液体胶体。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述方法还包括使所述凝固体经受热水处理并任选地拉伸，以形成菲拉塔型奶酪。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述方法还包括使所述凝固体经受凝乳剂以形成凝结的凝乳。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述凝乳剂是微生物源性凝乳酶。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述方法还包括使所述凝结的凝乳老化和熟化以形成奶酪样组合物。
40.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述方法还包括使所述凝结的凝乳经受热水处理并任选地拉伸，以形成菲拉塔型奶酪。
41.根据权利要求34-40中任一项所述的方法，其中所述可食用组合物不包含β酪蛋白。
42.根据权利要求34-41中任一项所述的方法，其中所述可食用组合物不包含任何附加的乳制品源性蛋白质。
43.根据权利要求34-41中任一项所述的方法，其中所述可食用组合物不包含任何动物源性乳蛋白质。
44.根据权利要求34-43中任一项所述的方法，其中重组产生的α酪蛋白和κ酪蛋白由一种或多种细菌宿主细胞产生。
45.根据权利要求34-44中任一项所述的方法，其中与天然α酪蛋白相比，所述α酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的磷酸化。
46.根据权利要求34-45中任一项所述的方法，其中与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的糖基化。
47.根据权利要求34-46中任一项所述的方法，其中与天然κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的磷酸化。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述细菌宿主细胞选自乳球菌属、乳酸乳球菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌、铫子短芽孢杆菌、耻垢分枝杆菌、红城红球菌和谷氨酸棒杆菌、乳杆菌属、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、集胞藻属6803和大肠杆菌。
49.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中一种或多种细菌宿主细胞分泌所述重组产生的α酪蛋白和κ酪蛋白。
50.根据权利要求44-48中任一项所述的方法，其中一种或多种细菌宿主细胞在细胞内保留所述重组产生的α酪蛋白和κ酪蛋白。
51.根据权利要求44-50中任一项所述的方法，其中α酪蛋白和κ酪蛋白中的一者或两者的产生受诱导型启动子调控。
52.根据权利要求44-50中任一项所述的方法，其中α酪蛋白和κ酪蛋白中的一者或两者的产生受组成型启动子调控。
53.根据权利要求34-52中任一项所述的方法，其中在所述胶束形式中所述α酪蛋白与所述κ酪蛋白的比例为约1:1至约15:1。
54.根据权利要求53所述的方法，其中在所述胶束形式中所述α酪蛋白与所述κ酪蛋白的比例为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1。
55.根据权利要求34-54中任一项所述的方法，其中所述α酪蛋白是αs1或αs2。
56.根据权利要求34-55中任一项所述的方法，其中所述α酪蛋白包含选自SEQ IDNO.1-26的氨基酸序列或其具有至少80％序列同源性的变体。
57.根据权利要求34-55中任一项所述的方法，其中所述κ酪蛋白包含选自SEQ IDNO.27-40的氨基酸序列或其具有至少80％序列同源性的变体。
58.根据权利要求34-57中任一项所述的方法，其中所述液体胶体包含尺寸约150nm至约500nm或约100nm至约500nm的所述胶束形式的群体。
59.根据权利要求34-58中任一项所述的方法，其中所述胶束形式的所述群体的部分被设置尺寸为小于100nm或为约10nm至100nm。
60.根据权利要求34-59中任一项所述的方法，其中所述盐是钙盐。
61.根据权利要求60所述的方法，其中形成所述液体胶体的步骤还包括添加磷酸盐和/或柠檬酸盐。
62.一种通过根据权利要求34或41-61中任一项所述的方法形成的凝固组合物。
63.一种通过根据权利要求33或37-62中任一项所述的方法形成的凝结的凝乳组合物。
64.一种通过根据权利要求34-63中任一项所述的方法形成的奶酪样组合物。
65.根据权利要求1-33中任一项所述的或者通过根据权利要求34-64中任一项所述的方法形成的奶酪样组合物，其中所述α酪蛋白包含牛、人、绵羊、山羊、水牛、野牛、马或骆驼α酪蛋白的氨基酸序列。
66.根据权利要求1-33中任一项所述的或者通过根据权利要求34-64中任一项所述的方法形成的奶酪组合物，其中所述κ酪蛋白包含牛、人、绵羊、山羊、水牛、野牛、马或骆驼κ酪蛋白的氨基酸序列。
67.根据权利要求34所述的方法，其中凝乳化凝固时间为1分钟至6小时。
68.一种包含胶束形式的液体胶体，其中所述胶束形式包含重组α酪蛋白、重组κ酪蛋白和至少一种盐，并且其中所述α酪蛋白、所述κ酪蛋白或其组合完全缺乏或具有显著减少的翻译后修饰。
69.根据权利要求68所述的液体胶体，其中(a)与动物源性α酪蛋白相比，所述α酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的磷酸化，或(b)与动物源性κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的糖基化，或(c)与动物源性κ酪蛋白相比，所述κ酪蛋白完全缺乏或具有显著减少的磷酸化，或(a)、(b)和(c)的任何组合。
70.根据权利要求68或69所述的液体胶体，其中所述胶束形式不包含β酪蛋白。
71.一种由根据权利要求68-70中任一项所述的液体胶体形成的酸奶组合物。
72.根据权利要求34或35所述的方法，还包括将所述液体胶体加热然后冷却，以及用微生物酸化所述液体胶体。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述微生物包括德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、乳杆菌或双歧杆菌中的一种或多种。
74.根据权利要求70所述的或者通过根据权利要求72-73中任一项所述方法形成的酸奶组合物，其中所述α酪蛋白包含牛、人、绵羊、山羊、水牛、野牛、马或骆驼α酪蛋白的氨基酸序列。
75.根据权利要求70所述的或者通过根据权利要求72-73中任一项所述方法形成的酸奶组合物，其中所述κ酪蛋白包含牛、人、绵羊、山羊、水牛、野牛、马或骆驼κ酪蛋白的氨基酸序列。
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