CN114195885B - 一种单克隆抗体组合物提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物制药领域,具体涉及一种单克隆抗体组合物提纯方法,包括如下步骤:S1、通过介孔二氧化硅微球对单克隆抗体组合物进行处理,除去组合物中的脂类物质,得到中间物;S2、通过硫酸铵两步法或辛酸‑硫酸铵两步法中的任意一种对中间物进行进一步分离,得到单克隆抗体;其中,单克隆抗体组合物中包括水、脂肪、杂质蛋白和单克隆抗体。上述技术方案可以先通过介孔二氧化硅微球有效出去单克隆抗体组合物中的脂肪类杂质,得到的最终单克隆抗体具有较高的纯度,且损失较小。
Description
技术领域
本申请涉及生物制药领域,更具体地说,它涉及一种单克隆抗体组合物提纯方法。
背景技术
单克隆抗体自研发以来,在生物制药、生物检测等相关领域具有重大的运用。单克隆抗体的制备方法一般如下:通过抗原对小鼠进行免疫,免疫后取小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合,得到杂交瘤细胞,筛选杂交瘤细胞中阳性较高的杂交瘤细胞株进行亚克隆培养,经过多次筛选后,得到阳性水平最高的杂交瘤细胞,再将其种植于小鼠腹腔内,最后对腹水进行分离纯化,得到单克隆抗体。
腹水分离方法目前种类较多,常用的有硫酸铵两步法或辛酸-硫酸铵,其原理在于通过抗体和杂质蛋白的等电点不同,控制硫酸铵的浓度或体系的pH使不同的组分分别析出,进而实现分离。这两种方法操作简单,物料来源较为便宜,适用于工业化生产,在单克隆抗体最大产能只有公斤级的今天,对上述方法进行进一步研究具有重要的意义。但是腹水中除了杂质蛋白以外,还有部分脂类物质,该类物质与抗体之间分离较为困难,有时也会干扰杂质蛋白和抗体的分离。
发明内容
为了减少腹水中的脂质成分对抗体分离的影响,本申请提供一种单克隆抗体组合物提纯方法。
本申请中提供的单克隆抗体组合物提纯方法具体采用如下技术方案:
一种单克隆抗体组合物提纯方法,包括如下步骤:
S1、通过介孔二氧化硅微球对单克隆抗体组合物进行处理,除去组合物中的脂类物质,得到中间物;
S2、通过硫酸铵两步法或辛酸-硫酸铵两步法中的任意一种对中间物进行进一步分离,得到单克隆抗体;
其中,单克隆抗体组合物中包括水、脂肪、杂质蛋白和单克隆抗体。
抗体组合物可以是经过培养的小鼠腹水,也可以是其他含有脂质、杂质蛋白甚至细胞外泌体和囊泡的混合组分,其成分较为复杂。通过介孔二氧化硅进行处理,可以有效地除去抗体组合物中的脂质,进而提高后续的纯化效果。
介孔二氧化硅的表面具有较多介孔结构,介孔的结构一般具有2~50nm的孔径,在该尺寸下,对于抗体的吸附能力较弱,而对脂质成分的吸附能力较强,其可以在有效除去脂质成分的情况下,对抗体没有明显影响,因此在实际生产中具有广阔的运用前景。
可选的,所述介孔二氧化硅微球为空心介孔二氧化硅,平均粒径为50~100nm。
空心介孔二氧化硅具有更好的吸附性,由于二氧化硅具有中性的电荷结构,因此其更加不容易吸附抗体组分,对抗体提纯效果较好且损失较少。
可选的,步骤S1具体如下:将介孔二氧化硅微球和单克隆抗体组合物进行混合,混合时间为5~10min,温度为20~37℃,随后通过离心将吸附有脂肪的介孔二氧化硅微球进行分离。
选用上述参数整体具有较好的吸附性和较少的抗体损失,属于优化的参数。
可选的,所述介孔二氧化硅微球中包覆有顺磁核结构。
采用了顺磁核核介孔二氧化硅壳形成的核壳结构介孔二氧化硅颗粒,其在吸附体系中的脂质后,可以通过磁吸附的方式进行分离,分离较为方便,且分离过程中抗体的损失较少。顺磁核可以为四氧化三铁纳米颗粒,也可以是
可选的,顺磁核的平均直径为50~100nm。
在5~40nm粒径范围内的顺磁颗粒在包覆后,整体具有较好的稳定性,且介孔层的尺寸可以较好地吸附脂质,不易脱附,分离也较为容易。
可选的,在步骤S1中,先将介孔二氧化硅微球和单克隆抗体组合物进行混合,混合时间为15~30min,混合温度为20~37℃,随后通过磁吸分离吸附有脂肪的介孔二氧化硅微球。
在上述技术方案中,可以充分地对脂质进行吸附,有助于更好地对单克隆抗体组合物进行提纯。
可选的,在步骤S1中,将介孔二氧化硅微球和单克隆抗体混合后,进行震荡处理,震荡频率100~200转/分,震荡幅度10~20mm。
通过震荡,有助于减少抗体在介孔二氧化硅微球表面的吸附,震荡过程中,由于发生了更加充分的接触,因此更容易发生热力学平衡状态,而在热力学平衡状态中,脂质的吸附具有更高的优先级,因此有助于进一步减少抗体的损失。
可选的,在步骤S1中,加入非离子表面活性剂,非离子表面活性剂的质量为介孔二氧化硅微球质量的0.5~1倍。
在上述技术方案中,通过加入非离子表面活性剂,可以提高介孔二氧化硅微球在体系中的分散性,且对于后续的抗体沉降没有明显的影响。
可选的,在步骤S1中,还加入柠檬酸,柠檬酸的加入质量为介孔二氧化硅微球质量的0.02~0.1倍。
柠檬酸的加入一方面提供一定的抗氧化性,减少单克隆抗体在提纯过程中的损失,同时,少量的柠檬酸的加入并不会对后续分离产生不良影响。另外,柠檬酸可以进一步提高介孔二氧化硅微球对脂质的吸附性能,提高分离效果。
可选的,在步骤S1中,加入缓冲溶液,并控制pH值为6.8~7.4,缓冲溶液的加入后,控制步骤S1中,介孔二氧化硅微球的质量浓度为2~10mg/mL。
在上述技术方案中,通过缓冲溶液调整整体pH值,一方面可以提高分离过程中体系的稳定性,另一方面控制pH值后,有助于减少抗体的析出,减少抗体因吸附或团聚造成的损失。
综上所述,本申请至少包括如下一种有益效果:
1、在本申请中,通过添加介孔二氧化硅微球,利用介孔二氧化硅微球对脂质的吸附能力,分离单克隆抗体组合物中的脂质,进而提高单克隆抗体分离后的纯度,适用于单克隆抗体的工业化生产。
2、在本申请进一步设置中,选用空心介孔二氧化硅,对脂质的吸附性能较好,分离较为彻底,后续残留脂质较少,所需的处理时间较少。
3、在本申请的另一种方案中,选用核壳结构的介孔二氧化硅,以顺磁材料为核,进而可以实现磁吸附分离,分离较为方便。
4、在本申请中,可以添加非离子表面活性剂和柠檬酸,进一步提高分离效果。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
在以下实施例和对比例中,部分原料的来源如表1所示。
表1、部分物料资料表
在以下实施例中,所用的单克隆抗体通过如下步骤进行制备。
1、对小鼠进行免疫反应。
将CA125抗原(1mg/mL)与弗氏完全佐剂(见表1)按1:1的体积通过注射器混匀,并乳化完全,选择6-8周龄的BALB/c雌鼠进行首次皮下免疫,免疫4只小鼠,每只小鼠注射100ul乳化后的抗原。再次免疫用CA125抗原(1mg/mL)与弗氏不完全佐剂按1:1的体积通过注射器混匀,并乳化完全免疫小鼠,每隔15天免疫一次,皮下和腹腔交替进行,免疫3次后,加强免疫,在第3天进行细胞融合。
2、脾细胞和骨髓瘤细胞融合
2.1饲养细胞制备:将未经免疫反应的小鼠摘眼球放血处死,浸泡于75﹪酒精中消毒5min,固定于泡沫板上,剪开小鼠腹外皮肤,暴露其腹膜,在腹腔中注入37℃预热的DMEM无血清培养基5ml,轻揉小鼠腹腔1分钟,悬浮腹腔细胞,吸出腹腔液;剪开小鼠胸腔取胸腺研磨后过滤收集悬液,与腹腔液合并离心,沉淀物用HAT完全培养液重悬,得到饲养细胞悬液。
2.2小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养:把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10﹪FBS的DMEM培养基(配方见表1)进行传代培养,细胞融合前保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0处于对数生长期,并在前一天换液以保证生长状态良好用于细胞融合。
2.3脾细胞制备:取经上述免疫的BALB/c雌鼠处死,泡75%的酒精中消毒5min后剖腹,无菌取出脾脏。用DMEM无血清培养基(配方见表1)洗一次,置平皿中不锈钢筛网上,用注射器针芯研磨成细胞悬液,铜网过滤后离心,弃上清用无血清培养液重复离心一次,待用。
2.4脾细胞与骨髓瘤细胞融合:将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合均匀,离心洗涤细胞,去除上清液,置于37℃水浴预热1min,加入1ml 37℃预温的PEG 4000,90s内加完,然后静止1min。在1min内加入1ml DMEM无血清培养液,之后直接将上述体系加入到DMEM无血清培养液终止PEG作用;离心,弃上清;然后用HAT选择培养基(见表1)重悬沉淀并加入饲养细胞悬液,接种到96孔细胞培养板中,铺板12块,置于37℃,5﹪CO2培养箱中培养。HAT选择培养液维持培养一周后,改用HT培养基(见表1),再维持培养一周,改用DMEM培养基,继续对融合细胞保持培养。
3、杂交瘤细胞的筛选
3.1初筛
融合细胞隔7天后半换液一次,观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况,在细胞生长到细胞团簇(在16倍物镜和10倍目镜下观察,细胞大小占满1/3视野)时,吸取融合细胞培养上清液,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。
3.2复筛
将筛选到的阳性细胞株进一步用ELISA方法进行复筛,筛选阳性较高的杂交瘤细胞株做亚克隆培养。
3.3杂交瘤细胞株的克隆化
杂交瘤细胞株的克隆化培养按有限稀释法进行,准确计数细胞,用含20﹪FBS的DMEM培养基稀释成4个/ml的细胞悬液,然后以每孔200μl稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中,7天后观察细胞生长情况并检测细胞培养上清液的抗体水平,选择3个效价最高的单克隆,做克隆化培养,直至单克隆孔抗体检测阳性率多次达到100﹪;最终得到一株灵敏度高、特异性好的单克隆抗体杂交瘤细胞,对单克隆抗体杂交瘤细胞进行扩大培养。
4、腹水抗体培养
4.1细胞移植:提前14天用姥鲛烷对6-8周龄的BALB/c雌鼠进行预刺激,观察单克隆抗体杂交瘤细胞,确保其活细胞比例高于90%,随后将杂交瘤细胞通过DMEM培养基稀释至106个/mL,随后将上述稀释液以0.5mL/只的量注入到BALB/c雌鼠腹腔内,观察雌鼠的健康状况和腹水产生状况。
4.2腹水的采集:在注射杂交瘤细胞7~10d后(具体时间依照小鼠腹水状况而定)穿刺引流并收集雌鼠的腹水,一次穿刺完毕后,将雌鼠移回鼠笼并观察,如果健康状况下滑不明显,则可以在两天后再进行一次,移植小鼠最多进行两次穿刺,将得到的腹水分装并止于-80℃超低温冰箱中保存。
制备例1~5,介孔二氧化硅微球,通过在四氧化三铁纳米颗粒表面包覆介孔二氧化硅得到,具体制备方法如下:
取0.1g四氧化三铁纳米颗粒分散于1mL氯仿中,将0.5gCTAB溶解于20mL水溶液中,完全溶解后,将上述四氧化三铁的氯仿分散液加入并超声分散均匀,保持搅拌,升温至60℃使氯仿蒸发(蒸发时间为30min),随后将上述体系低价到含有150mL浓度为2mol/L的氢氧化钠水溶液中,并加入特定量的TEOS和乙酸乙酯,先以500rpm的速度搅拌3min,再以200rpm的速度继续反应6h,随后用磁铁分离纳米颗粒并用水和乙醇分别洗涤三次,清洗完毕后再将得到的纳米颗粒加入到200mL质量分数为5%的乙醇胺溶液中,加热至回流并反应6h,随后用磁铁分离纳米颗粒并用乙醇洗涤,烘干后得到四氧化三铁纳米颗粒。
其中,制备例1~5中,所用的四氧化三铁纳米颗粒粒径、TEOS和乙酸乙酯的用量以及最终制得的纳米颗粒平均粒径(通过动态光散射测得)如表2所示。
表2、制备例1~5中所用的物料用量
通过制备例1~5中制备得到的介孔二氧化硅微球和其他购买得到的介孔二氧化硅微球,对前述保存的腹水进行分离,得到如下实施例。
在以下实施例和对比例中,抗体的纯度通过CE-SDS进行测定,具体参数如下:毛细管总长度30.2cm,内径50μm,有效长度20cm,温度25℃;检测器为PDA检测器,检测波长为220nm。
其中,实施例1~3中,选用了同一批次的腹水,即从同一只小鼠中取得的腹水,腹水批次编号021090505
实施例1,一种单克隆抗体组合物分离方法,通过空心介孔二氧化硅对前述制备得到的腹水进行处理,具体包括如下步骤。
S1、将腹水按照1∶3的体积浓度用PBS缓冲溶液(浓度20mM,pH=7.4)稀释,再加入介孔二氧化硅纳米微球,腹水的用量为1mL,介孔二氧化硅微球的用量为20mg,加入后,在恒温摇床上进行震荡处理,震荡频率为100转/分,震荡幅度10mm,震荡时间为5min,处理温度为37℃,处理完毕后,以2000rpm离心,去掉底部沉淀,得到中间物;
S2、通过硫酸铵两步法对中间物进行进一步分离,具体操作如下:
配置饱和硫酸铵水溶液,吸取10mL上述中间物于离心管中,边加边搅拌加入饱和硫酸铵溶液5mL,置于4℃冰箱2h,,随后在10000rpm下离心30min,去掉上清液,再向沉淀中加入1mL蒸馏水和3mL饱和硫酸铵溶液,混匀后置于4℃冰箱2h,随后在10000rpm下离心30min,除去上清液,再将底部沉淀物溶解于1mLPBS缓冲溶液中,通过透析袋用100倍体积的PBS缓冲溶液在4℃下透析24h,每隔4h更换一次透析液,脂质透析液用萘氏试剂检测无黄色物质形成为止。
在实施例1中,空心介孔二氧化硅的平均粒径为100nm。
实施例2,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例1的区别在于,介孔二氧化硅微球等质量地选用普通介孔二氧化硅,平均粒径为100nm。
实施例3,一种单克隆抗体组合物的分离方法,在实施例1的基础上,用制备例3中的包覆有四氧化三铁核的介孔二氧化硅纳米颗粒,步骤S1具体调整如下:
S1、将腹水按照1∶3的体积浓度用PBS缓冲溶液(浓度20mM,pH=7.4)稀释,再加入介孔二氧化硅纳米微球,腹水的用量为1mL,介孔二氧化硅微球的用量为20mg,加入后,在恒温摇床上进行震荡处理,震荡频率为100转/分,震荡幅度10mm,震荡时间为15min,处理温度为37℃,处理完毕后,通过磁铁吸附,除去底部沉淀。
另外,对比例1~2,也与实施例1~3对同一批腹水进行了处理。
对比例1,与实施例1的区别在于,不进行步骤S1,腹水直接进行步骤S2处理。
对比例2,与实施例1的区别在于,在步骤S1中,用等质量的不含介孔的二氧化硅颗粒(平均粒径100nm)对腹水进行处理。
实施例1~3及对比例1~2中,抗体的纯度及分离得到单克隆抗体的总量如表3所示。
表3、实施例1~3及对比例1~2的实验结果
编号 | 单克隆抗体纯度(%) | 单克隆抗体含量(mg/mL) |
实施例1 | 98.0 | 6.8 |
实施例2 | 95.9 | 7.2 |
实施例3 | 97.3 | 7.3 |
对比例1 | 89.6 | 7.3 |
对比例2 | 92.0 | 7.1 |
一般情况下,认为抗体的纯度高于95%时,该单克隆抗体可以发挥较好的效果,通过上述实验结果可知,在本申请中,采用介孔二氧化硅纳米颗粒相较于不具有介孔的二氧化硅结构,有助于提高抗体的最终抗体的纯度。同时,上述两种方法中,采用中空介孔二氧化硅会存在一定量的抗体的损失,但是单克隆抗体最终的纯度较高。采用包覆四氧化三铁的介孔二氧化硅纯度略低,但是抗体的损失较小。
在实施例1的基础上,调整介孔二氧化硅的粒径和反应条件,得到实施例4~14。
实施例4~14中处理的腹水为同一批次的腹水,腹水批次编号021090507。
其中,实施例4除腹水外,其余条件与实施例1均相同。
实施例5,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例4的区别在于,空心介孔二氧化硅的平均粒径为50nm。
实施例6,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例4的区别在于,空心介孔二氧化硅的平均粒径为200nm。
实施例7,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例4的区别在于,在步骤S1中,震荡时温度为25℃,时间为8min。
实施例8,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例4的区别在于,在步骤S1中,震荡时温度为20℃,时间为10min。
实施例9,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例4的区别在于,在步骤S1中,介孔二氧化硅微球的用量为50mg,恒温摇床的震荡频率为200转/分,震荡幅度10mm,震荡时间为5min。
实施例10,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例4的区别在于,在步骤S1中,介孔二氧化硅微球的用量为100mg。
实施例11,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例4的区别在于,在步骤S1中,还加入10mg山梨醇酯-20(非离子表面活性剂)。
实施例12,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例11的区别在于,山梨醇酯-20的加入量为20mg。
实施例13,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例11的区别在于,在步骤S1中,还加入质量为0.4mg的柠檬酸。
实施例14,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例13的区别在于,柠檬酸的加入量为2mg。
实施例4~14中的单克隆抗体产量和纯度具体如表4所示。
表4、实施例4~14的实验结果
实施例4~6中,区别在于空心介孔二氧化硅的粒径,当颗粒的粒径较小时,表面效应较强,对于抗体具有一定的絮凝性,导致离心过程中抗体容易一同沉降,因此出现实施例5相较于实施例4,纯度提升而抗体含量下降的趋势。实施例6中,空心介孔二氧化硅粒径过大,分散性和吸附性均不佳,进而导致抗体的纯度有一定的损失。需要注意的是,在该批次的腹水中,抗体含量均低于实施例1~3,这是生产抗体的小鼠本身体质造成的影响,后续换用其他批次腹水时,也会有类似的现象,后面将不再加以赘述。
在实施例8~10中,在增大中空介孔二氧化硅的用量时,可以看到纯度提升而抗体的收率降低的现象,这也变相证明了二氧化硅的用量尽量控制在一定范围内为宜,增大中空介孔二氧化硅的用量尽管可以更好地吸附体系中的脂类物质和部分其他组分,但是也会造成一部分单克隆抗体的损失,需要在实际实验中加以取舍。
在实施例11~12中,非离子表面活性剂的加入进一步提高了抗体的纯度,可能是非离子表面活性剂在体系中可以提高介孔二氧化硅的分散性,减少介孔纳米二氧化硅的团聚。柠檬酸同样表面出了减少抗体损失和提高抗体纯度的效果。
另外,在实施例3的基础上,设置以下实施例,调整介孔二氧化硅微球的参数及整体处理条件,得到实施例15~23。在实施例15~23中,均采用了同一批次的腹水,腹水批次编号为021100601。
实施例15,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例3的区别仅在于处理的腹水批次不同,
实施例16,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例15的区别在于,选用了制备例1中制备得到的介孔二氧化硅微球进行处理。
实施例17,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例15的区别在于,选用了制备例2中制备得到的介孔二氧化硅微球进行处理。
实施例18,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例14的区别在于,选用了制备例4中制备得到的介孔二氧化硅微球进行处理。
实施例19,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例15的区别在于,选用了制备例5中制备得到的介孔二氧化硅微球进行处理。
实施例20,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例15的区别在于,介孔二氧化硅微球的加入量为50mg。
实施例21,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例15的区别在于,介孔二氧化硅微球的加入量为100mg。
实施例22,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例15的区别在于,在步骤S1中,还加入10mg山梨醇酯-20(非离子表面活性剂)。
实施例23,一种单克隆抗体组合物分离方法,与实施例22的区别在于,在步骤S1中,在步骤S1中,还加入质量为0.4mg的柠檬酸。
实施例15~23的单克隆抗体产量和纯度具体如表5所示。
表5、实施例15~23的实验结果
编号 | 单克隆抗体纯度(%) | 单克隆抗体含量(mg/mL) |
实施例15 | 97.3 | 7.7 |
实施例16 | 97.8 | 6.9 |
实施例17 | 97.4 | 7.2 |
实施例18 | 96.7 | 7.8 |
实施例19 | 97.4 | 7.7 |
实施例20 | 97.7 | 7.5 |
实施例21 | 98.0 | 7.2 |
实施例22 | 97.9 | 7.8 |
实施例23 | 98.6 | 8.1 |
通过上述实验数据可以发现,包覆有四氧化三铁的介孔二氧化硅微球整体上与空心介孔二氧化硅微球再实验数据上具有类似的趋势,其分离可以通过磁铁吸附进行,操作较为方便,但是纯度会稍低于采用空心介孔二氧化硅微球的实施例。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.一种单克隆抗体组合物提纯方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、通过介孔二氧化硅微球对单克隆抗体组合物进行处理,除去组合物中的脂类物质,得到中间物;
S2、通过硫酸铵两步法或辛酸-硫酸铵两步法中的任意一种对中间物进行进一步分离,得到单克隆抗体;
其中,单克隆抗体组合物是经过培养的小鼠腹水;
所述介孔二氧化硅微球中包覆有顺磁核结构;
所述顺磁核的平均直径为50~100nm;
所述顺磁核结构为四氧化三铁纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种单克隆抗体组合物提纯方法,其特征在于,在步骤S1中,先将介孔二氧化硅微球和单克隆抗体组合物进行混合,混合时间为15~30min,混合温度为20~37℃,随后通过磁吸分离吸附有脂肪的介孔二氧化硅微球。
3.根据权利要求1~2中任意一项所述的一种单克隆抗体组合物提纯方法,其特征在于,在步骤S1中,将介孔二氧化硅微球和单克隆抗体混合后,进行震荡处理,震荡频率100~200转/分,震荡幅度10~20mm。
4.根据权利要求1~2中任意一项所述的一种单克隆抗体提纯方法,其特征在于,在步骤S1中,加入非离子表面活性剂,非离子表面活性剂的质量为介孔二氧化硅微球质量的0.5~1倍。
5.根据权利要求4中任意一项所述的一种单克隆抗体组合物提纯方法,其特征在于,在步骤S1中,还加入柠檬酸,柠檬酸的加入质量为介孔二氧化硅微球质量的0.02~0.1倍。
6.根据权利要求1~2中任意一项所述的一种单克隆抗体组合物提纯方法,其特征在于,在步骤S1中,加入缓冲溶液,并控制pH值为6.8~7.4,缓冲溶液的加入后,控制步骤S1中,介孔二氧化硅微球的质量浓度为2~10mg/mL。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002193999A (ja) * | 2000-12-22 | 2002-07-10 | Kotoku Seibutsu Kagi Kofun Yugenkoshi | 鳥類の卵の卵黄抗体の分離及び浄化方法と得られた卵黄抗体の使用方法 |
CN101256864A (zh) * | 2008-01-07 | 2008-09-03 | 吉林大学 | 一种超顺磁性介孔二氧化硅复合球及其制备方法 |
CN103012828A (zh) * | 2013-01-21 | 2013-04-03 | 苏州知益微球科技有限公司 | 一种聚合物氧化铁微球的制备方法 |
CN103319594A (zh) * | 2013-06-13 | 2013-09-25 | 武汉明皓生物科技有限公司 | 含有单克隆抗体AntiDaintain的癌症诊断试剂盒及其用途 |
CN111495415A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-08-07 | 陈艮 | 一种CdS-g-C3N4异质结光催化产氢催化剂及其制法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3024640A1 (en) * | 2012-11-06 | 2014-05-15 | Sigrid Therapeutics Ab | A porous silica material for use as a pharmaceutical or dietary active ingredient |
-
2022
- 2022-01-12 CN CN202210032656.6A patent/CN114195885B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002193999A (ja) * | 2000-12-22 | 2002-07-10 | Kotoku Seibutsu Kagi Kofun Yugenkoshi | 鳥類の卵の卵黄抗体の分離及び浄化方法と得られた卵黄抗体の使用方法 |
CN101256864A (zh) * | 2008-01-07 | 2008-09-03 | 吉林大学 | 一种超顺磁性介孔二氧化硅复合球及其制备方法 |
CN103012828A (zh) * | 2013-01-21 | 2013-04-03 | 苏州知益微球科技有限公司 | 一种聚合物氧化铁微球的制备方法 |
CN103319594A (zh) * | 2013-06-13 | 2013-09-25 | 武汉明皓生物科技有限公司 | 含有单克隆抗体AntiDaintain的癌症诊断试剂盒及其用途 |
CN111495415A (zh) * | 2020-06-09 | 2020-08-07 | 陈艮 | 一种CdS-g-C3N4异质结光催化产氢催化剂及其制法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Fe3O4磁性复合功能微球制备及蛋白分离和光催化应用研究;侯雪梅;《中国优秀博士学位论文数据库》(第01期);第1-134页 * |
Ibrahim Yildiz等.Applications of magnetic nanoparticles in biomedical separation and purification.《Nanotechnol Rev》.2015,第5卷(第3期),第331-340页. * |
单分散介孔SiO2微球对蛋白质的快速吸附和分离;翟峥等;《第五届全国化学工程与生物化工年会》;第207页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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