CN101591646B - 一种治疗人***的树突状细胞疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗人***的树突状细胞疫苗。本发明疫苗的活性成分是修饰的树突状细胞;所述修饰的树突状细胞是将复制缺陷型重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1转入树突状细胞中得到的。本发明的树突状细胞疫苗不需要多肽或蛋白质的脉冲,避免了在脉冲过程中加入RNA而导致的降解。然后用LPS使树突状细胞成熟并回输体内,对荷瘤的个体产生强烈的免疫反应,突破机体对肿瘤细胞或病毒感染细胞的免疫耐受,在小鼠肿瘤模型的治疗性实验中,具有良好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗人***的树突状细胞疫苗。
背景技术
1995年6月,国际癌症研究中心(IRAC)公布的研究结果证实人类***瘤病毒(human papillomavirus,HPV)与***有非常密切的因果关系。HPV至少存在100个型别,可分为低危型(如HPV6、11等)和高危型(如HPV16、18、31、33、45和58等)。高危型HPVs的持续性感染,其中一部分可导致宿主细胞发生宫颈上皮内瘤样病变(CIN)、***以及其它肿瘤,而HPV16、18是主要高危型别,在HPVs所致的***中占70%左右。高危型HPVs的基因组编码早期蛋白E1、E2、E4-7和晚期衣壳蛋白L1、L2,但不编码E3和E8蛋白。早期蛋白主要涉及病毒基因组的复制、转录调节和诱导宿主细胞发生转化,晚期蛋白L1具有自我组装成病毒样颗粒(virus-likeparticle,VLP)的特性。2006年6月,FDA批准***预防性疫苗上市,该疫苗利用L1蛋白能形成VLP,在人和动物体内产生中和性抗体,这是继HBV之后的癌症预防性疫苗。从长远来看,将会减少***的发生。目前临床上***的传统治疗方法疗效不佳,***患者化疗有效率一般小于20%,放疗或手术后约四成复发,且预后极差(5年生存率仅3.2%-13%,只能姑息治疗)。目前公认治疗后残余的HPV病毒颗粒或DNA可能是其高复发的主要原因之一。研究证明该疫苗不能治疗***及被HPVs感染的患者,因此研发治疗***的药物或疫苗是非常必要的,也是***研究的热点。
***的发生是一个渐进的过程,主要是由于癌蛋白E6和E7分别与p53和RB相互作用后,基因组在E2区断裂,并整合到宿主细胞染色体上,这一过程使抑癌基因功能受损、DNA修复发生障碍、细胞凋亡减少、最终导致细胞永生化;染色体的突变、杂合子的缺失、原癌基因和端粒酶的激活在HPV诱导的***的致病机制中起重要作用。HPV感染的CIN和***患者体内普遍存在免疫缺陷、病人外周血活化T淋巴细胞及T淋巴细胞总数下降、CD4+T淋巴细胞数量明显减少、MHC表达下降、NK细胞活性下降和癌细胞转移播散的现象。Langerhan细胞数目减少使它递呈病毒抗原-HLA给CD4+的功能受损。调节性T细胞的存在,有证据表明HPV16持续性感染的患者体内循环的CD4+CD25hiCTLA4+FoxP3+调节性T细胞增加,***患者宫颈病变处有CD4+CD25hiCTLA4+FoxP3+调节性T细胞的浸润,说明***患者存在对HPVs感染的免疫耐受。因此,***治疗性疫苗的关键是如何增强宿主对HPVs感染的细胞免疫和粘膜免疫反应,打破免疫耐受。
此外,HPV是一个多型别的病毒,且缺乏群抗原决定簇,必须要开发多价疫苗才能真正起到防治效果。不同地区HPV感染型别构成比存在差异。大多数地区是HPV16和18型,少数地区如西非以HPV45型占优势,在南美则以HPV39型和HPV59型多见。HPV58型在非洲、北美、南美洲、东南亚及欧洲均较为罕见,在***中的感染率只有2%;而在中国台湾和香港的***患者中,感染率却相对较高,尤其在香港的***患者中,HPV58的检出率直追HPV16,高达33.3%。Huang等在对中国上海部分***患者肿瘤组织的研究中发现,HPV阳性标本中,HPV52和58的检出率达48%,而通常认为的主要致癌的HPV16和18型的阳性率仅为42%。最近陕西等地的统计报导,***患者中HPV58检出率亦高达近20%。由于多价疫苗开发不仅受载体容量及生产成本等限制,不常见亚型的保护效果也很难证实,目前国外研究仍以1-2价最常见病毒类型疫苗为主,国内对HPV58型感染亦未足够重视。迄今国际上进入临床试验阶段的HPV候选疫苗中没有一个是针对58亚型的(包括Merck公司的HPV四价疫苗),这极可能导致相当长时间内进口疫苗在我国不适用。因此,自主开发针对我国国情的HPV疫苗迫在眉睫。
***的致病因子为外源性高危型HPVs的感染,其早期蛋白E6和E7为癌蛋白,其持续表达为肿瘤细胞转化和维持恶性特征所必需,是理想的药物和治疗性疫苗作用的靶位。治疗性疫苗主要以E6和E7作为靶蛋白,其目的是诱导机体产生特异性细胞免疫反应,清除已感染的HPV,治疗由感染引起的癌前病变和肿瘤。但高危型HPV的E6和E7是公认的致癌因子,在HPV相关的永生化和致瘤性中起着重要作用。E7蛋白能失活肿瘤抑制蛋白Rb,并有激活端粒酶、活化周期素E和A的作用;E6可通过E6AP-泛素途径降解P53蛋白,使P53蛋白控制的G1/S节点失去控制,导致细胞染色体不稳定和基因突变增加,使外源DNA整合到染色体中的机率大大升高;同时还可以作用于凋亡相关蛋白抑制细胞凋亡、激活端粒酶、维持端粒长度使细胞永生化。所以,必须去除E6和E7的转化活性方能用于疫苗构建。
研究表明,E6的N端主要与蛋白的稳定性有关,N端发生缺失突变会显著影响蛋白在体外的半衰期。E6的两个锌指区都是病毒转化活性和引起蛋白反式激活所必需的,均与蛋白间的相互作用有关。许多资料证实,E6的C端含有大多数的抗原表位。Nakagawa等详细研究了HPV18型E6蛋白各位点与HEK293细胞转化和p53失活的关系,发现除锌指结构外,L-52突变对其影响也非常显著。
E7蛋白为全长105个氨基酸残基的酸性蛋白,是HPV18的主要转化蛋白。E7蛋白分为3个功能区:1区和2区与腺病毒ElA的第1、2保守区高度同源;3区为锌指区。2区中的“L-X-E-X-C”被认为是结合Rb的关键位点。研究表明,该位点突变可明显降低E7蛋白对猴CA-1细胞系的转化活性,但并不影响人角化细胞的永生化,而锌指区的突变则可完全破坏E7蛋白的转化和永生化能力。E7蛋白可能是二聚体的形式存在,此二聚体以“Cys-X-X-Cys”基序与Zine结合,1个锌指突变会减弱其与Zine的结合能力、缩短半衰期、降低稳定性、丧失其转化性;而2个锌指突变则彻底失去其与Zine结合的能力、引起半衰期的严重缩短、完全丧失其转化性,并有可能丧失抗原性。此外,有研究报导对HPV16型E7蛋白进行T20V突变,可以提高其所诱导的CTL反应,但不影响E6和E7蛋白的功能活性。
近10年来HPV疫苗研究非常活跃,合成多肽疫苗、蛋白质疫苗与DNA疫苗一样,免疫功效较差,即使辅以各种佐剂,仍不能完全预防同型HPV感染或使已生成肿瘤消退,多肽疫苗的应用还受MHC-1类分子限制,短期内难有大的进展。相比之下,具有长期、大规模人类接种史的病毒载体疫苗才是目前发展中国家可行性最强的HPV疫苗策略。其中腺病毒载体不但外源基因表达水平高,引起免疫反应强而持久,制备方法成熟,免疫途径方便,还能诱发有效粘膜免疫的病毒载体,已取代逆转录病毒成为当前应用最广泛的载体。加之近年来复制缺陷腺病毒不断重组改良,其使用安全性已大大增强,用以开发HPV疫苗的条件进一步成熟。
增强宿主的免疫反应、突破机体对肿瘤的自身耐受是成功研发***治疗性疫苗的重要一环。专业的APCs网络控制免疫和耐受,通过提供前炎性细胞因子和加工处理抗原并递呈给T细胞,介导对病毒感染和癌细胞的先天性和获得性免疫反应。在组织中能捕获病原体编码的抗原的DCs被病原体诱导的炎性反应激活,DCs的激活分为两期,即成熟期和执行功能期,使装载抗原的DCs迁移到外周***激活T细胞是一个基本步骤(Gliboa E.DC-based cancer vaccines.J.Clin.Invest.2007;117:1195-1203.)。肿瘤不同于感染性病原体,不产生有助于DCs激活的有效的炎症反应,结果是其免疫反应非常弱且无效。对于肿瘤患者,免疫治疗的主要目的在于克服这种缺陷,提供使DCs成熟的条件,使之成为有免疫刺激功能的APCs。
DCs含有Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs),TLR信号通过激活丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子-κB(NF-κB)使DCs成熟,DCs介导各种细胞因子的表达。SOCS1在DCs中表达,SOCS1作为一个假底物抑制剂介导JAK2的降解,抑制STAT(signal transducer and activator of transcription)信号,是诸如IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-12和IL-15等细胞因子的重要负调节因子(Kubo M,Hanada T and Yoshimura A.Suppressors of cytokine signaling andimmunity.Nat.Immunol.2003;4:169-176;Alexander WS and Hilton DJ.The role ofsuppressors of cytokine signaling(SOCS)proteins in regulation of the immuneresponse.Annu.Rev.Immunol.2004;22:503-529)。SOCS1基因敲除的新生小鼠死于不可控制的大量产生的IFN-γ(Marine JC,Topham DJ,McKay C,Wang D,ParganasE,Stravopodis D,Yoshimura A,Ihle JN.SOCS1 deficiency causes alymphocyte-dependent perinatal lethality.Cell.1999;98:609-616;Alexander WS,StarrR,Fenner JE,Scott CL,Handman E,Sprigg NS,Corbin JE,Cornish AL,Darwiche R,Owczarek CM,Kay TW,Nicola NA,Hertzog PJ,Metcalf D,Hilton DJ.SOCS1 is acritical inhibitor of interferon gamma signaling and prevents the potentially fatal neonatalactions of this cytokine.Cell.1999;98:597-608)。有研究用RNAi技术使SOCS1沉默,处理后的DCs能使已建立黑色素瘤的小鼠肿瘤的生长受到抑制(Shen L,Evel-kablerK,Strube R and Chen SY.Silencing of SOCS1 enhances antigen presentation bydendritic cells and antigen-specific anti-tumor immunity.Nature Biotechnology.2004;22(12):1546-1553;Evel-kabler K,Song XT,Aldrich M,Huang XF and Chen SY.SOCS1 restricts dendritic cell’s ability to break self tolerance and induce antitumorimmunity by regulating aIL-12 production and signaling.J.Clin.Invest.2006;116:90-100),表明SOCS1可以作为靶标进行肿瘤的基因治疗,有利于突破机体对肿瘤的免疫耐受。
SOCS1的作用的原理为:抑制抑制因子或抑制免疫减弱因子。实现这个目标有不同的方法,如化学合成RNAi、质粒转染、多肽或其相应的抗体。但抗体及质粒转染如何进入细胞的问题,多肽和化学合成的RNAi存在稳定性问题,其中合成的RNAi还存在对细胞的毒性问题,而复制缺陷型的腺病毒能有效地解决这个问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1。
本发明所提供的复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1是能够表达如下双链RNA的复制缺陷型重组腺病毒,所述双链RNA的正义链的序列如序列表中序列11所示;所述双链RNA的反义链的序列如序列表中序列12所示。
所述双链RNA的编码shRNA的一条链的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列9所示,所述双链RNA的编码shRNA的互补链的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列10所示。
所述复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1是用Adeno-X表达***制备得到的。
上述复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1按照如下方法制备:
1)将所述双链RNA的编码DNA***Adeno-X表达***的RNAi-ReadypSIRN-Shuttle的多克隆位点,得到重组表达载体RNAi-SOCS1-pShuttle;
2)用PI-Sce I与I-Ceu I双酶切所述重组表达载体RNAi-SOCS1-pShuttle,将得到的含有所述双链RNA的编码DNA的酶切片段与Adeno-X表达***的Adeno-X病毒DNA连接,将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到重组腺病毒DNA,再将该重组腺病毒DNA转染HEK293细胞,得到复制缺陷型重组腺病毒。
本发明的另一个目的是提供一种修饰的树突状细胞。
本发明所提供的修饰的树突状细胞是用复制缺陷型重组腺病毒
rAd-HPV16,18,58mE67和上述复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染树突状细胞得到的;
所述重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67是将转录融合三基因片段***复制缺陷型腺病毒表达载体得到重组腺病毒载体,再将该重组腺病毒载体导入细胞中得到重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67;
所述转录融合三基因片段包括HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67以及连接三者的短核苷酸片段;
所述HPV16mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列6;所述HPV18mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列7;所述HPV58mE67编码的氨基酸序列是序列表中序列8;所述连接HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67的短核苷酸片段为核糖体内部进入位点。
所述HPV16mE67的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列1;所述HPV18mE67的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列2;所述HPV58mE67的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列3;所述核糖体内部进入位点的脱氧核糖核苷酸序列是序列表中序列4。
所述转录融合三基因片段的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列5。
本发明的第三个目的是提供一种治疗人***的重组树突状细胞疫苗。
本发明所提供的治疗人***的重组树突状细胞疫苗,它的活性成分是上述重组树突状细胞细胞。
含有复制缺陷型重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和上述复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1的重组菌也属于本发明的保护范围。
上述修饰的树突状细胞或重组菌可用于制备预防和/或治疗人***疫苗。
根据我国HPV感染型别的分布特点,选择HPV16、18和58这三个最常见的亚型,对影响其转化活性和提高CTL反应的位点进行突变,对E6基因,选择突变其P53结合位点及其中一个锌指结构;对E7基因,选择突变其Rb结合位点和其中一个锌指,在不影响蛋白稳定性和免疫原性的前提下,彻底去除其转化活性。构建了各亚型HPV的E6和E7蛋白的融合基因,并将其转入腺病毒载体中构建成重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67。
为了突破机体对肿瘤的免疫耐受,选用诸如IFN-γ、IL-2、IL-7、IL-12和IL-15等细胞因子的负调节因子SOCS1为靶标,用RNA沉默技术(RNA silencing)使SOCS1基因沉默,然后将其转入腺病毒载体中构建成重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1。将重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1与重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67同时感染分离培养的DCs,不需要多肽或蛋白质的脉冲,避免了在脉冲过程中加入RNA而导致的降解。然后用LPS使DCs成熟,回输体内,对荷瘤的个体产生强烈的免疫反应,突破机体对肿瘤细胞或病毒感染细胞的免疫耐受,在小鼠肿瘤模型的治疗性实验中,具有良好的治疗效果。
本发明的总体方案路线图如图1所示。
附图说明
图1为实验的总体方案路线图
图2为HPV16、18和58型E6和E7基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果
图3为重组质粒pAdeno-X-HPV16,18,58mE67转染HEK293细胞8天后细胞的形态
图4为重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67转染HEK293细胞后的Western Blot检测结果
图5为重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染DCs细胞两天后细胞的形态
图6A为RT-PCR分析重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1或rAd-RNAi-mSOCS1感染DCs细胞48h后SOCS1的表达
图6B为感染重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1或rAd-RNAi-mSOCS1的DCs细胞中SOCS1 mRNA的相对比例
图7为荷瘤小鼠的存活率
图8为CTL检测结果
图9A为产IFN-γ脾细胞的染色结果
图9B为ELISPOT试剂盒分析IFN-γ的结果
图10为各组小鼠血清中IL-12的p40亚单位的水平
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,具体步骤可参见:《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列如无特别说明均由上海生工合成。
实施例1、HPV E6和E7基因的来源及其突变
HPV基因组DNA来自深圳市中医院门诊病人(年轻女性)的宫颈刮片标本,PCR扩增,测序后证实为HPV的基因组DNA。以该HPV基因组DNA为模板,分别设计HPV16、18和58型E6和E7基因的特异性引物,扩增HPV16型E6基因的特异性引物为P1和P2,扩增HPV16型E7基因的特异性引物为P3和P4,扩增HPV18型E6基因的特异性引物为P5和P6,扩增HPV18型E7基因的特异性引物为P7和P8,扩增HPV58型E6基因的特异性引物为P9和P10,扩增HPV58型E7基因的特异性引物为P11和P12(具体的引物序列如表1所示),用DNA聚合酶分别扩增HPV16、18和58型E6和E7基因,并在引物上添加相应的酶切位点,PCR反应体系如下:
dNTP Mixture10×Pyrobest Buffer IIPyrobest DNA polymeraseDNA模板上游引物(20μm)下游引物(20μm)dH2O | 10μl10μl0.5μl1μl(10ng)2.5μl2.5μl73.5μl |
总体积 | 100μl |
PCR反应条件:先95℃预变性5min;然后95℃ 1min,56℃ 1min,72℃ 1min,共32个循环,最后72℃延伸10min。
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,具体检测结果如图2所示。其中,M为DL2000 Marker,泳道1-3分别为HPV16、18和58型E6基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果;泳道4-6分别为HPV16、18和58型E7基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果。结果表明,获得大小为500bp的HPV16、18和58型E6基因和大小为300bp的HPV16、18和58型E7基因。
PCR扩增产物经纯化后分别与pMD18T simple(购自Takara公司)相连并进行测序,测序结果表明,扩增得到的HPV16、18和58型E6基因的脱氧核糖核苷酸序列与GenBank Accenssion Number EF029179、EF202153和D90400的序列一致,扩增得到的HPV16、18和58型E7基因的脱氧核糖核苷酸序列与GenBank AccenssionNumber EU430687、EF202153和D90400的序列一致。
分别对上述扩增得到的HPV16、18和58型E6和E7基因的与转化活性相关的位点以及能增强细胞免疫功能的部位进行突变,突变后的序列经测序分析证实突变成功,具体的突变方法如下:
以上述HPV16型E6基因的PCR扩增产物为模板,以PM1和PM2为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-16E6ml;再以pMD18T-16E6ml为模板,以PM3和PM4为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的PCR产物命名为HPV16mE6。以上述HPV16型E7基因的PCR扩增产物为模板,以PM5和PM6为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-16E7ml;再以pMD18T-16E7ml为模板,以PM7和PM8为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的PCR产物命名为HPV16mE7。以上述HPV18型E6基因的PCR扩增产物为模板,以PM9和PM10为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-18E6ml;再以pMD18T-18E6ml为模板,以PM11和PM12为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的PCR产物命名为HPV18mE6。以上述HPV18型E7基因的PCR扩增产物为模板,以PM13和PM14为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-18E7ml;再以pMD18T-18E7ml为模板,以PM15和PM16为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的PCR产物命名为HPV18mE7。以上述HPV58型E6基因的PCR扩增产物为模板,以PM17和PM18为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的重组质粒命名为pMD18T-58E6ml;再以pMD18T-58E6ml为模板,以PM19和PM20为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的PCR产物命名为HPV58mE6。以上述HPV58型E7基因的PCR扩增产物为模板,以PM21和PM22为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的重组质粒命名为pMD 18T-58E7ml;再以pMD18T-58E7ml为模板,以PM23和PM24为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连并进行测序,将测序结果正确的PCR产物命名为HPV58mE7。
其中,HPV16mE6是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第57位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G),第110位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G);HPV16mE7是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第22位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G),第91位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G);HPV18mE6是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第52位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G),第68位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G),HPV18mE7是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第27位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G),第98位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G);HPV58mE6是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第50位的亮氨酸(L)突变为甘氨酸(G),第66位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G);HPV58mE7是将其编码的氨基酸序列的自氨基末端第第26位的谷氨酰胺(E)突变为甘氨酸(G),第92位的半胱氨酸(C)突变为甘氨酸(G)。
表1引物设计
注:表中斜体字部分为酶切位点,带下划线部分为突变位点。
实施例2、融合基因的获得及mE67基因转化活性去除情况检测
一、融合基因的获得
用T-Vector载体(购自Takara公司)分别将上述实施例1获得的野生型HPV16的E6和E7基因、HPV18的E6和E7基因、HPV58的E6和E7基因以及突变后的HPV16的mE6和mE7基因、HPV18的mE6和mE7基因、HPV58的mE6和mE7基因相连接,产生融合基因HPV16E67、HPV18E67、HPV58E67、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67,具体的连接方法如下:将HPV16E6、HPV16mE6用引物P1、P2进行PCR扩增,HPV16E7、HPV16mE7用引物P3、P4进行PCR扩增,电泳产物分别用HindIII进行酶切,回收酶切产物,将HPV16E6与HPV16E7,HPV16mE6与HPV16mE7经HindIII酶切后的产物用T4连接酶进行连接,然后以连接产物为模板,以P1和P4为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连,将得到的含有融合基因的载体分别命名为T-HPV16E67和T-HPV16mE67;同样的方法,将HPV18E6、HPV18mE6用引物P5、P6进行PCR扩增,HPV18E7、HPV18mE7用引物P7、P8进行PCR扩增,电泳产物分别用SalI进行酶切,回收酶切产物,将HPV18E6与HPV18E7,HPV18mE6与HPV18mE7经SalI酶切后的产物用T4连接酶进行连接,然后以连接产物为模板,以引物P5和P8为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连,将得到的含有融合基因的载体分别命名为T-HPV18E67和T-HPV18mE67;将HPV58E6、HPV58mE6用引物P9、P10进行PCR扩增,HPV16E7、HPV16mE7用引物P11、P12进行PCR扩增,电泳产物分别用EcoRI进行酶切,回收酶切产物,将HPV58E6与HPV58E7,HPV58mE6与HPV58mE7经EcoRI酶切后的产物用T4连接酶进行连接,然后以连接产物为模板,以引物P9和P12为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物与pMD18T simple相连,将得到的含有融合基因的载体分别命名为T-HPV58E67和T-HPV58mE67。
对T-HPV16mE67、T-HPV18mE67和T-HPV58mE67质粒进行测序,结果表明HPV16mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示,其编码的氨基酸序列如序列表中序列6所示;HPV18mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示,其编码的氨基酸序列如序列表中序列7所示;HPV58mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示,其编码的氨基酸序列如序列表中序列8所示。
二、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67基因转化活性去除情况检测
1、转基因细胞的获得
将上述步骤一获得的融合基因HPV16E67、HPV18E67、HPV58E67、HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67用NheI和BamHI酶切后,分别连入真核表达质粒pIRES2-EGFP(购自BD公司)的NheI和BamHI酶切位点间,得到含有融合基因HPV16E67的重组表达载体pIRES2-HPV16E67,含有融合基因HPV18E67的重组表达载体pIRES2-HPV18E67,含有融合基因HPV58E67的重组表达载体pIRES2-HPV58E67,含有融合基因HPV16mE67的重组表达载体pIRES2-HPV16mE67,含有融合基因HPV18mE67的重组表达载体pIRES2-HPV18mE67和含有融合基因HPV58mE67的重组表达载体pIRES2-HPV58mE67。将上述构建的重组表达载体用脂质体法(详见LipofectaminTM2000试剂盒说明)分别转染Balb/c 3T3细胞,经G418筛选,得到含有相应基因的细胞克隆。同时以未转入任何真核表达质粒的Balb/c 3T3细胞作为对照,用以观察去转化活性情况。
2、常规体外细胞培养,观察其接触抑制情况
将质粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67、pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67和pIRES2-HPV58mE67分别转染Balb/c 3T3细胞,经G418筛选,得到含有相应基因的细胞克隆。培养上述转基因细胞3天后,进行光镜观察,结果发现,转入质粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67的细胞呈融合状并重叠生长,提示失去生长接触抑制,而转入质粒pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67、pIRES2-HPV58mE67的细胞始终存在接触抑制现象。
3、软琼脂培养
在直径为35mm的塑料培养皿上铺一层0.35%的琼脂,每个培养皿中分别接种5×104个对数生长期的上述步骤1获得的转基因的Balb/c 3T3细胞和未转入任何真核表达载体的Balb/c 3T3细胞,每种处理5个重复,37℃5%CO2常规培养3周,倒置显微镜下观察集落形成情况。结果表明,在软琼脂培养基上培养2-3周后,转入质粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67的细胞呈集落性生长,而转入质粒pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67、pIRES2-HPV58mE67的细胞和未转基因的Balb/c 3T3细胞一样,均未见50个细胞以上的集落形成。
4、裸鼠体内致瘤实验
取Balb/c小鼠(购自广州中医药大学实验动物中心),每只小鼠皮下接种5×106个上述步骤1的获得的转基因和未转基因的Balb/c 3T3细胞,每种细胞接种5只小鼠,观察小鼠皮下成瘤情况。结果表明,接种40天后,用转入质粒pIRES2-HPV16mE67、pIRES2-HPV18mE67、pIRES2-HPV58mE67的Balb/c 3T3细胞接种的小鼠和用未转基因的Balb/c 3T3细胞接种的小鼠无一成瘤,而用转入质粒pIRES2-HPV16E67、pIRES2-HPV18E67、pIRES2-HPV58E67的Balb/c 3T3细胞接种的小鼠有80%皮下成瘤,瘤的平均直径为2.5mm。
软琼脂培养和裸鼠体内致瘤实验证明,突变后的三个亚型的mE67基因已经失去E6和E7基因的转化活性,为疫苗的安全使用提供了保障。
实施例3、重组腺病毒质粒pAdeno-X-HPV16,18,58mE67的构建
将上述实施例2构建的HPV16mE67基因经NheI和BamHI酶切后与用同样酶切的载体pCDNA 3.1(+)相连,产生重组质粒pCDNA3.1(+)16mE67;以质粒pIRES2-EGFP(购自BD公司)为模版,用P13、P14为引物进行PCR扩增,产物分离纯化后得到663bp的IRES2片段,对IRES2片段进行测序,其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。将该IRES2片段用BamHI和EcoRI双酶切后连入质粒pCDNA3.1(+)16mE67的BamHI和EcoRI酶切位点间,得到重组表达载体pCDNA3.1(+)16mE67-IRES2。将上述实施例2构建的HPV18mE67基因经EcoRI和XhoI酶切后与用同样酶切的载体pCDNA 3.1(+)相连,产生重组质粒pCDNA3.1(+)18mE67;以质粒pIRES2-EGFP(购自BD公司)为模版,用P13、P14’为引物进行PCR扩增,将PCR扩增产物用BamHI和XhoI双酶切后连入质粒pCDNA3.1(+)18mE67的BamHI和XhoI酶切位点,得到重组表达载体pCDNA3.1(+)18mE67-IRES2。然后用EcoRI和XhoI双酶切该pCDNA3.1(+)18mE67-IRES2质粒,回收1471bp的小片段,并将其连入上述pCDNA3.1(+)16mE67-IRES2的EcoRI和XhoI位点间,将产生的重组表达载体命名为pCDNA 3.1(+)-Kozak 16mE67-IRES2-18mE67-IRES2。将上述实施例2构建的HPV58mE67基因用P9、P12’为引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经XhoI和NotI双酶切后,与用同样酶切的载体pCDNA3.1(-)(Invitrogen公司)相连,产生重组质粒pCDNA3.1(-)58mE67,然后用NheI和XhoI双酶切上述pCDNA 3.1(+)-Kozak16mE67-IRES2-18mE67-IRES2质粒,回收2915bp的小片段,并将其连入上述pCDNA3.1(-)58mE67的NheI和XhoI位点间,将产生的重组表达载体命名为pCDNA3.1(-)16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。
用NheI和NotI双酶切重组表达载体pCDNA3.1(-)
16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67,得到3.7kb的融合基因
16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。对该融合基因进行测序,测序结果表明,
16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所示。
融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67中均去除了HPV16mE6、HPV18mE6和HPV58mE6的E6终止密码子和HPV16mE7、HPV18mE7和HPV58mE7的E7起始密码子,而保留了E6起始密码子和E7终止密码子。以上操作均按常规分子生物学操作规程及Takara MutanBEST Kit(Takara公司)说明进行。
将重组表达载体pCDNA3.1(-)16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67经NheI和NotI双酶切后***穿梭质粒pShuttle2(购自BD公司)的NheI和NotI酶切位点间,得到重组表达载体pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67。将重组表达载体pShuttle2-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67用PI-Sce I和I-Ceu I双酶切(NewEngland Lab公司),酶切体系如下:
试剂 | 体积 |
PI-Sce I(1units/μl)I-Ceu I(5units/μl)重组表达载体pShuttle-16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67(500ng/μl)10×Double Digest Buffer10×BSAdH2O | 2μl0.5μl2μl3μl3μl5μl |
总体积 | 30μl |
将酶切体系混匀后置37℃水浴中精确酶切3h,回收并纯化酶切产物。将回收的酶切产物用Takara ligation Mixture连入Adeno-X表达***(购自BD公司)中的Adeno-X病毒DNA中,置PCR仪中16℃连接过夜。将连接产物用Swa I酶切消化(SwaI酶切位点位于PI-Sce I与I-Ceu I之间),以去除未能与Adeno-X病毒DNA连接的基因片段。再次回收酶切产物,将融合基因16mE67-IRES2-18mE67-IRES2-58mE67与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载体命名为Adeno-X-HPV16,18,58mE67。
用重组腺病毒载体Adeno-X-HPV16,18,58mE67转化大肠杆菌DH5α,Amp抗性平板挑选阳性克隆,分别以表1中的P3和P4、P7和P8、P11和P12为引物进行PCR扩增。提取重组腺病毒载体Adeno-X-HPV16,18,58mE67的DNA,将所得的重组质粒命名为pAdeno-X-HPV16,18,58mE67。对重组质粒pAdeno-X-HPV16,18,58mE67进行PCR扩增、酶切鉴定,将酶切鉴定正确的重组质粒送上海博亚测序。Pac I酶切pAdeno-X-HPV16,18,58mE67用于转染HEK293细胞。
实施例4、重组缺陷性腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67的制备与滴度的测定
一、重组缺陷性腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67的制备
用线性化后的重组质粒pAdeno-X-HPV16,18,58mE67转染HEK293细胞,培养转染后的细胞至细胞出现明显的病态效应(cytopathic effect,CPE)。转染8天后,细胞的具体形态如图3所示。其中,A为转染重组质粒pAdeno-X-HPV16,18,58mE67的HEK293细胞的形态,B为正常HEK293细胞的形态。
重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67的制备按照Adeno-XTM Expression SystemUser Manual进行,具体过程如下:
(1)用PBS洗涤上述出现明显病态效应的HEK293细胞2次,直接将HEK293细胞吹打下来(不用胰酶),1,500rpm室温下离心5min;500μl PBS重悬细胞;
(2)-20℃和37℃水浴反复冻融细胞3次,每次融化后短时间混匀细胞悬液;
(3)12000rpm室温离心10min,收集含病毒的上清,加入10%甘油,过滤除菌后作为重组病毒原液置-70℃冻存备用;
(4)培养HEK293细胞,待细胞铺满瓶底50-70%时,加入步骤(3)制备的病毒原液250μl,继续培养;
(5)观察细胞的病态效应,待50%以上的细胞从培养板底浮起时,重复上述(1)-(3)步骤制备重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67,-20℃存放,以备测定病毒滴度或进一步制备高滴度病毒用。
二、重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67的滴度测定
因HEK293细胞能表达腺病毒活化的早期蛋白E1和E3,重组质粒pAdeno-X-HPV16,18,58mE67能够在HEK293细胞中进行包装并释放到培养基中,用超高速离心机回收上述步骤一制备的重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67,然后用腺病毒滴定试剂盒测定重组腺病毒的滴度。
三、荧光显微镜观察
重组质粒pAdeno-X-HPV16,18mE67-EGFP(其构建过程同pAdeno-X-HPV16,18,58mE67,用EGFP取代重组质粒pAdeno-X-HPV16,18,58mE67中的HPV58mE67基因)转染HEK293细胞48h后开始,定时观察HEK293细胞表达绿色荧光的情况,估算HPV58mE67的表达强度。结果表明HPV58mE67在HEK293细胞中能表达。
四、Western blot检测
用上述步骤二纯化的感染复数(MOI)为5∶1的重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67感染COS-7细胞,一天后收集细胞,RIPA裂解细胞提取蛋白,分别以小鼠抗人HPV16,18E6单抗(购自Chemicon公司)、HPV16E7单抗(购自Neomarker公司)、HPV18E7单抗(购自GeneTex公司)和HPV58单抗(购自Santa Cruz公司)为一抗,Western blot检测HPV16mE67、HPV18mE67和HPV58mE67的表达。
Western blot检测结果如图4所示。其中,泳道1、3、5和7表示未转染腺病毒的COS-7细胞的Western blot检测结果;泳道2、4、6和8分别表示转染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67的COS-7细胞用不同抗体检测的Western blot检测结果。结果表明HPV16mE67和HPV18mE67有较高的表达,但HPV58mE67的表达量较HPV16mE67和HPV18mE67的表达量少,可能存在表达的极性问题。
实施例5、SOCS1 shRNA的设计和重组表达载体RNAi-SOCS1-pShuttle和RNAi-mSOCS1-pShuttle的构建
SOCS1 shRNA的设计登录上海吉玛生物公司网站进行,SOCS1 shRNA的一条链为shRNA-SOCS1(F):
5’-GATCCCTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTCAGGTAGTTTTTTG-3’(自5’末端第6位至第58位是序列表中序列9);SOCS1shRNA的互补链为shRNA-SOCS1(R):5’-AATTCAAAAAACTACCTGAGTTCCTTCCCCTCTCTTGAAGGGGAAGGAACTCAGGTAGG-3’(自5’末端第6位至第58位是序列表中序列10);mSOCS1 shRNA的一条链为shRNA-mSOCS1(F):
5’-GATCCACTATCTAAGTTACTACCCCTTCAAGAGAGGGGTAGTAACTTAGATAGTTTTTTTG-3’,mSOCS1 shRNA的互补链为shRNA-mSOCS1(R):
5’-AATTCAAAAAAACTATCTAAGTTACTACCCCTCTCTTGAAGGGGTAGTAACTTAGATAGTG-3’,中间画线部分为环序列,TTTTTT为转录终止区,再在每条链两端引入BamHI和EcoRI的粘性末端。
将合成的shRNA-SOCS1和shRNA-mSOCS1的正义链和反义链分别退火成为双链DNA,20μl复性反应体系为:正义链1μl、反义链1μl、20×SSC(sigma公司,Cat.S6639)1μl,水17μl。反应条件为:95℃加热2min,72℃ 2min,34℃ 2min。室温下冷却1h,分别稀释至终浓度为40ng/μl。上述shRNA-SOCS1编码的双链RNA的正义链为5’-CUACCUGAGUUCCUUCCCC-3’(序列表中序列11),反义链为5’-GGGGAAGGAACUCAGGUAG-3’(序列表中序列12)。
将上述稀释后的双链DNA(shRNA-SOCS1和shRNA-mSOCS1)分别与经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切的载体RNAi-Ready pSIREN-Shuttle(购自BD公司)用T4 DNA连接酶进行连接,将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,Amp抗性平板筛选阳性克隆,摇菌,提质粒,BamH I和EcoRI双酶切及测序鉴定,将获得的序列及***位置均正确的含有抑制基因表达的小干扰RNA编码基因的重组RNAi载体分别命名为RNAi-SOCS1-pShuttle和RNAi-mSOCS1-pShuttle。
实施例6、重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和rAd-RNAi-mSOCS1的构建
一、重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和rAd-RNAi-mSOCS1的构建
将重组表达载体RNAi-SOCS1-pShuttle和RNAi-mSOCS1-pShuttle分别用PI-SceI和I-Ceu I(购自BD Clontech公司)进行双酶切,回收酶切产物,用Takara ligationMixture分别连入Adeno-X表达***(购自BD Clontech公司)中的Adeno-X病毒DNA中,置PCR仪中16℃连接过夜。将连接产物用Swa I酶切消化(Swa I酶切位点位于PI-Sce I与I-Ceu I之间),以去除未能与Adeno-X病毒DNA连接的基因片段。再次回收酶切产物,将shRNA-SOCS1与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载体命名为Adeno-X-RNAi-SOCS1,将shRNA-mSOCS1与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载体命名为Adeno-X-RNAi-mSOCS1。
用重组腺病毒载体Adeno-X-RNAi-SOCS1和Adeno-X-RNAi-mSOCS1分别转化大肠杆菌DH5α,Amp抗性平板挑选阳性克隆。分别提取重组腺病毒载体Adeno-X-RNAi-SOCS1和Adeno-X-RNAi-mSOCS1的DNA,将所得的重组质粒分别命名为pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1。对重组质粒pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1进行PCR扩增、酶切鉴定,将酶切鉴定正确的重组质粒送上海博亚测序。Pac I酶切pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1用于转染HEK293细胞。
用线性化后的重组质粒pAdeno-X-RNAi-SOCS1和pAdeno-X-RNAi-mSOCS1分别转染HEK293细胞,培养转染后的细胞至细胞出现明显的病态效应(cytopathiceffect,CPE)。
重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和rAd-RNAi-mSOCS1的制备按照Adeno-XTMExpression System User Manual进行,具体过程如下:
(1)用PBS洗涤上述出现明显病态效应的HEK293细胞2次,直接将HEK293细胞吹打下来(不用胰酶),1,500rpm室温下离心5min;500μl PBS重悬细胞;
(2)-20℃和37℃水浴反复冻融细胞3次,每次融化后短时间混匀细胞悬液;
(3)12000rpm室温离心10min,收集含病毒的上清,加入10%甘油,过滤除菌后作为重组病毒原液置-70℃冻存备用;
(4)培养HEK293细胞,待细胞铺满瓶底50-70%时,加入步骤(3)制备的病毒原液250μl,继续培养;
(5)观察细胞的病态效应,待50%以上的细胞从培养板底浮起时,重复上述(1)-(3)步骤制备重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和rAd-RNAi-mSOCS1,-20℃存放,以备测定病毒滴度或进一步制备高滴度病毒用。
二、重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和rAd-RNAi-mSOCS1的滴度测定
用超高速离心机回收上述步骤一制备的重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和rAd-RNAi-mSOCS1,然后用腺病毒滴定试剂盒测定重组腺病毒的滴度。结果表明,重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1的滴度为2.8×107pfu/ml,重组腺病毒rAd-siDNA-mSOCS1的滴度为2.5×107pfu/ml。
实施例7、RT-PCR分析DCs细胞中SOCS1的表达
将培养的DCs细胞(Evel-kabler K,Song XT,Aldrich M,Huang XF and Chen SY.SOCS1 restricts dendritic cell’s ability to break self tolerance and induce antitumorimmunity by regulating aIL-12 production and signaling.J.Clin.Invest.2006;116:90-100)简单地说,小鼠BM用灭菌的PBS冲洗其后肢的骨髓,用0.83%氯化铵除去红细胞,然后用无血清的RPMI-1640洗三次,每次2分钟,低速离心5分钟,最后用含血清的RPMI-1640在12孔板中培养,并且补充重组小鼠GM-CSF(20ng/ml;PeproTech),IL-4(20ng/ml;PeproTech)。在培养后的第二天和第四天,弃去上清,换上含小鼠GM-CSF(20ng/ml;PeproTech),IL-4(20ng/ml;PeproTech)的培养液继续培养。所有培养物均在37℃ 5%湿化的CO2培养箱培养,未贴壁的粒细胞在48小时后除去,补充新鲜的培养基。培养7天后,用FACS检测超过80%的细胞表达DC-特异性的标记。)用PBS洗涤两次后,分别提取其总RNA,然后将其反转录成cDNA并以此cDNA为模板,以SOCS1-F:5’-CCAGCCCCTGGCGACACT-3’和SOCS1-R:TGCGGCGCGCGGCGCCGCCACG-3’为引物,进行实时定量PCR反应。以GADPH作为内参,扩增GADPH的引物为GADPH-F:5’-ATCACTGCCACCCAGAAGAC-3’和GADPH-R:5’-ATGAGGTCCACCACCCTGTT-3’。同时用不含反转录酶的样品作为对照,以确保RNA中不含DNA。
以不同感染复数(MOI)的重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1和rAd-RNAi-mSOCS1分别感染培养的DCs细胞,以检测不同MOI的重组腺病毒使DCs细胞中的SOCS1的表达受到抑制的情况。结果如图7A所示。其中,泳道1为未感染重组腺病毒的DCs细胞中SOCS1的表达,泳道2为感染复数(MOI)为100的重组腺病毒rAd-RNAi-mSOCS1感染DCs细胞48h后SOCS1的表达,泳道3为感染复数(MOI)为50的重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染DCs细胞48h后SOCS1的表达,泳道4为感染复数(MOI)为100的重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染DCs细胞48h后SOCS1的表达。上述各组细胞中mRNA的相对比例(参照GADPH)如图7B所示。结果表明,当MOI为100时,感染重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞中SOCS1的表达受抑制现象最明显,而用不同MOI的重组腺病毒rAd-RNAi-mSOCS1感染的DCs细胞中SOCS1的表达则没有明显的变化,表明重组腺病毒rAd-RNAi-mSOCS1不能抑制DCs细胞中SOCS1的表达。
重组腺病毒感染DCs细胞两天后,细胞的形态如图5所示。其中,A为未感染病毒的DCs细胞,B为感染重组腺病毒rAd-RNAi-mSOCS1的DCs细胞,C为感染重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞,D为图A中的一个细胞,形态清楚,具有典型的DCs特征。结果表明,由于腺病毒为复制缺陷型腺病毒,所以用该复制缺陷型腺病毒制备的重组腺病毒感染DCs细胞2天后未出现细胞病变,可以作为修饰的树突状细胞使用。
实施例8、重组腺病毒感染DCs细胞及DCs细胞的成熟
将400ul DCs细胞以1×106个细胞/孔的量接种在12孔培养板中。将MOI为100的重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1以1∶1的体积比混合后感染上述DCs细胞,将MOI为100的重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-mSOCS1以1∶1的体积比混合后感染上述DCs细胞。感染8-12小时后,用PBS洗涤细胞2-3次,然后在含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的RPMI-1640完全培养基上继续培养,用100ng/ml的LPS刺激上述细胞24h后用PBS洗3次,然后将转入重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞,转入重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-mSOCS1的DCs细胞分别稀释成浓度为1×104个细胞/200ul,准备回输到小鼠体内。
实施例9、动物实验
雌性C57BL/6(H-2b)小鼠,周龄为3-5周,购自广州中医药大学实验动物中心,在无特殊病原体的笼子里喂养。
一、抑制肿瘤生长
将培养的TC-1细胞(上海肯强生物仪器有限公司)用PBS洗3次后,调整细胞密度为1×106/ml,每只小鼠皮下接种200μl上述TC-1细胞,接种12天后,用手能触摸到肿瘤,估计肿瘤的直径大小为125mm。将已成瘤的小鼠随机分成注射未感染重组腺病毒的DCs细胞组(即PBS组)、注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞组、注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-mSOCS1的DCs细胞组,每组10只小鼠。PBS组每只小鼠从后脚垫注射0.2ml用PBS稀释的1×104个成熟的DCs细胞;注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞组,每只小鼠从后脚垫注射0.2ml 1×104个感染了重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的成熟的DCs细胞;注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-mSOCS1的DCs细胞组,每只小鼠从后脚垫注射0.2ml 1×104个感染了重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-mSOCS1的成熟的DCs细胞。7天后在上述各组小鼠的腹膜内注射5μg LPS(Sigma公司),观察小鼠的肿瘤生长情况。
每周免疫上述各组小鼠一次,连续免疫2周,每两天用游标卡尺测量肿瘤的长和宽并统计小鼠的存活率,肿瘤体积的大小按照宽2×长/2计算。当肿瘤大小达到2500mm3时,断颈处死小鼠。小鼠的存活率结果如图7所示。结果表明:PBS组小鼠在18-24天内肿瘤大小达到2500mm3;注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-mSOCS1的DCs细胞组的小鼠,在52-64天内肿瘤大小达到2500mm3;注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞组的小鼠肿瘤未见明显生长,从第一次免疫起22天内,60%的小鼠触摸不到肿瘤。以上结果说明,注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞组的小鼠肿瘤生长明显被抑制。
二、CTL反应
将上述步骤一的成瘤小鼠随机分成PBS组、注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞组、注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-mSOCS1的DCs细胞组,每组10只小鼠,每周免疫上述各组小鼠一次,连续免疫2周,各组的免疫原和免疫剂量均同步骤一。当肿瘤大小达到2500mm3时,断颈处死小鼠并取其脾细胞作CTL反应。具体的实验过程如下:
将各组小鼠脾的单细胞悬浮培养在RPMI1640(GIBCO/BRL)中,补充10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠(GIBCO/BRL)、50μM 2-巯基乙醇和50μg/ml的硫酸庆大霉素(GIBCO/BRL)。用1μg/ml合成多肽E7.49-57(上海生工生物工程技术服务有限公司)分别刺激上述各组小鼠脾的单细胞7天,7天后分析各组细胞的裂解活性。以激活的脾细胞作为效应细胞,以TC-1细胞作为靶细胞,将上述效应细胞和靶细胞按照100∶1、33∶1和11∶1的体积比混合并接种到96孔板中,混合细胞在37℃条件下5% CO2培养箱中培养4小时,然后用离心机((Beckman Coulter Canada,Mississauga,ON)以200xg离心5min。从每个孔收集100ul培养上清,用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)的活性。为了检测自发的LDH活性,设培养孔中只有靶细胞没有效应细胞作为对照,检测最大释放的乳酸脱氢酶(LDH)的活性。培养孔中加Triton X-100(1%质量百分含量)表示最大释放活性。乳酸脱氢酶活性的计算公式为:(LDHtest-LDHspont)/(LDHtotal-LDHspont)]×100(Shan,B.E.,J.S.Hao,Q.X..Li,andM.Tagawa.Antitumor Activity and Immune Enhancement of Murine Interleukin-23Expressed in Murine Colon Carcinoma Cells Cellular&Molecular Immunology.2006;3(1),47-52)。公式中LDHtest、LDHspont和LDHtotal分别代表试验孔、自发释放孔和最大释放孔。实验设三次重复,具体结果如图8所示。注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞组、注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-mSOCS1的DCs细胞组效应细胞对靶细胞的裂解率分别达81%和67%,而PBS组不到30%。结果表明,注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞组能产生强烈的CTL反应。
由于IL-12受到SOCS1的调控,因此IL-12被称作是NK细胞刺激因子或细胞毒淋巴细胞成熟因子,是介导先天免疫及细胞免疫的重要细胞因子,具有强大的抗肿瘤及抗转移活性。目前,IL-12用于肿瘤和传染性疾病治疗的II期临床试验。IL-12在体外对于肿瘤细胞并没有直接的作用,但能激活T细胞及NK细胞,刺激CD4+T细胞向Th1表型分化,Th1细胞产生的细胞因子可激活CTL和巨噬细胞。IL-12是血管形成的强力抑制剂,通过诱导IFN-γ分泌以及产生IP10而抑制血管形成,进而抑制体内肿瘤生长。用IL-12检测试剂盒(购自eBioscience公司)检测上述各组小鼠血清中IL-12的p40亚单位,结果如图10所示。结果表明,注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞组小鼠血清中IL-12的浓度最高,与其他组相比具有显著性差异(p<0.05)。
三、ELISPOT分析抗原特异的T细胞
用ELISPOT试剂盒(购自eBioscience公司)检测从被免疫的小鼠脾中收集的激活的抗原特异的细胞毒T细胞。具体实验过程如下:
用纯化的抗小鼠IFN-γ抗体(购自eBioscience公司)包被96孔硝酸纤维板,4℃孵育过夜,然后用RMPI-1640完全培养基封闭。加入100μl含106个上述步骤二获得的各组小鼠脾细胞到96孔板中,细胞作系列稀释(10倍稀释),用1μg/ml的E7.49-57或R187多肽(上海生工生物工程技术服务有限公司)刺激或不刺激上述各组脾细胞(RAHYNIVTF对应于HPV16E7氨基酸的49-57,R187(FLLTRILTI)对应于HbsAg aa183-191)。用PMA(5ng/ml,Sigma公司)作为阳性对照,用R187或培养基作为阴性对照。培养板在37℃条件下5%CO2培养箱中孵育过夜。第二天用检测抗体(生物素标记的抗小鼠IFN-γ抗体)(购自eBioscience公司,试剂盒已提供)在室温下孵育2小时,洗掉没有结合的抗体;再加入Streptavidin-HRP(购自eBioscience公司,试剂盒已提供),室温下孵育1小时,洗去没有结合的检测酶复合物。培养板用AEC底物染色20分钟,空气中干燥过夜,用放大镜对染色点计数,产IFN-γ脾细胞的染色结果如图9A所示(左图为阴性对照组,右图为实验组),ELISPOT试剂盒分析各组DCs细胞中IFN-γ的表达结果如图9B所示。结果表明,注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-SOCS1的DCs细胞组、注射感染重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和rAd-RNAi-mSOCS1的DCs细胞组均能产生IFN-γ的T细胞。
序列表
Claims (3)
1.一种修饰的树突状细胞,是将复制缺陷型重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67和复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1感染树突状细胞得到的;
所述重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67是将转录融合三基因片段***复制缺陷型腺病毒表达载体得到重组腺病毒载体,再将该重组腺病毒载体导入细胞中得到重组腺病毒rAd-HPV16,18,58mE67;
所述转录融合三基因片段的脱氧核糖核苷酸序列为序列表中序列5;
所述复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1按照如下方法制备:
1)将双链RNA的编码DNA***Adeno-X表达***的RNAi-Ready-pSIREN-shuttle的多克隆位点,得到重组表达载体RNAi-SOCS1-pShuttle;
2)用PI-Sce I与I-Ceu I双酶切所述重组表达载体RNAi-SOCS1-pShuttle,将得到的含有所述双链RNA的编码DNA的酶切片段与Adeno-X表达***的Adeno-X病毒DNA连接,将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,得到重组腺病毒DNA,再将该重组腺病毒DNA转染HEK293细胞,得到复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1;
所述双链RNA的正义链的序列如序列表中序列11所示;所述双链RNA的反义链的序列如序列表中序列12所示。
2.一种治疗人***的修饰的树突状细胞疫苗,它的活性成分是权利要求1所述的修饰的树突状细胞。
3.权利要求1所述的修饰的树突状细胞在制备预防和/或治疗人***疫苗中的应用。
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