CN114177964B - 一种平面单层微小液滴阵列的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制备领域，具体讲，涉及一种平面单层微小液滴阵列的制备方法及其应用。制备方法包括以下步骤：在容器内先填装下层油，再填装上层油；下层油的密度大于上层油，下层油和上层油不互溶，形成具有液‑液界面的混合油相；使用液滴生成器生成微小液滴：液滴生成器所使用的油相与混合油相中的下层油的成分相同；将生成的微小液滴从液滴生成器出口转移至容器的混合油相中，微小液滴在液‑液界面自发形成平面单层微小液滴阵列。本发明提供了一种利于不同大小、不同包含物的液滴形成平面单层微小液滴阵列的方法，微小液滴在液‑液界面水平方向展开成二维阵列，三明治***有助于维持液滴的稳定性，同时为基于单个液滴的分析提供关键技术支撑。

Description

一种平面单层微小液滴阵列的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物制备领域，具体讲，涉及一种平面单层微小液滴阵列的制备方法及其应用。
背景技术
基于液滴的微流体分析使化学和生物实验能够低消耗、高通量以及高效率实施，而且，液滴为各类分析实验提供了大量的并行且均一的反应器，使每个反应器内的反应在互不干扰的情况下独立进行。近年来，基于液滴的微流控技术在DNA检测、单细胞分析、RNA测序、小分子标志物识别、临床诊断和蛋白质药物等方面都取得了良好的应用效果。尤其是在核酸定量分析中，基于液滴的数字定量技术具有很大的应用潜力。将核酸检测的所有试剂(酶、引物、模板、探针等)包裹在一个个独立的液滴内，每个液滴内包含0个或1个模板，经过特定的温度孵育，每个液滴内同步进行核酸扩增反应。通过检测荧光染料或探针发出的信号来判别有无扩增，包含模板的液滴发出可检测的信号，无模板的液滴不产生可检测的信号。最终核酸的起始添加量可以通过泊松分布计算。
以往的研究中，制备微小液滴的方法可以通过t剪切、流体聚焦、离心阶梯乳化、压力喷射等方式产生。然而，单分散的平面单层的液滴分布对后期的数据统计、分析至关重要。现有的方法通常借助一个具有有限高度的微流体芯片来限制液滴的排列，然而，这种方法需要一个带有液滴收集腔的芯片或容器，液滴被限制在芯片内更容易发生液滴融合和破裂，而且，这种方法不利于液滴的回收，在很大程度上限制了其可以应用的范围，并且增加了微流体芯片制作的成本。基于界面交叉乳化的液滴生成技术虽然可以在96孔板底部生成平面单层的液滴阵列，但这种方式适用于较大的液滴，此外液滴沉降速度慢且与液滴体积关系很大，而更小的液滴对于许多生化分析是更加有利的。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提供一种平面单层微小液滴阵列的制备方法。
本发明的第二发明目的在于提供该平面单层微小液滴阵列的制备方法制备得到的产品。
本发明的第三发明目的在于提供该平面单层微小液滴阵列的制备方法的应用。
为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种平面单层微小液滴阵列的制备方法，包括以下步骤：
S1、填装混合油相：在容器内先填装下层油，再填装上层油；所述下层油的密度大于所述上层油，所述下层油和所述上层油不互溶，形成具有液-液界面的混合油相；
S2、使用液滴生成器生成微小液滴：所述液滴生成器所使用的油相与混合油相中的所述下层油的成分相同；
S3、转移微小液滴：将生成的所述微小液滴从液滴生成器出口转移至所述容器的所述混合油相中，所述微小液滴在所述液-液界面自发形成所述平面单层微小液滴阵列。
可选的，所述下层油选自氟化油，优选HFE-7500；
所述上层油选自矿物油和有机溶剂的混合物，所述有机溶剂的密度为0.6～1g/mL，密度的测定温度为25℃；
所述有机溶剂优选液态烷烃，更优选正C4～C16烷中的至少一种，更进一步优选正十四烷；
更优选的，所述上层油和所述下层油的体积比为16：1～1：10；优选为5：1～5，更优选为5：2～3。
可选的，所述上层油选自矿物油与正十四烷按1：1～5：3体积比混合的混合物；
优选的，所述下层油中还添加有表面活性剂；更优选的，表面活性剂的添加量为0.1～5v/v％，
进一步优选的，所述表面活性剂选自生物惰性表面活性剂，优选Pico-surf或dSURF等中的至少一种。
可选的，所述下层油和所述上层油分别离心处理后，再进行填装；
优选的，所述离心处理的条件为：6000～10000rpm离心5～15min，更优选为8000rpm离心10min。
可选的，所述容器选自平底透明的容器，优选培养瓶、酶标板、培养皿或96孔板；
优选的，在S2中，在分散相入口和连续相入口分别注入水相和油相，连续相在所述液滴生成器的流道交汇处将分散相剪切为微小液滴；更优选的，所述水相选自水或以水为溶剂的溶液，所述油相选自氟化油。
可选的，在S2中，所述水相和所述油相的流速为3～4：15～25；
进一步优选的，所述氟化油选自氟化油HFE-7500。
可选的，在S2和S3中，在显微镜观察下进行所述微小液滴的生成和转移；
优选的，在S3中，所述液滴生成器的出口连接一根导管，待所述微小液滴稳定生成后，将所述导管垂直***所述容器，所述导管的出口没入所述混合油相内，进行液滴转移。
可选的，所述平面单层微小液滴阵列中的液滴直径分布为20μm～150μm。
本发明还提出上述制备方法制备得到的平面单层微小液滴阵列。
本发明还提出上述制备方法、上述平面单层微小液滴阵列在生物检测、生化分析、微生物培养、蛋白质与药物作用分析中的应用；优选的，所述生物检测包括核酸检测。
本发明至少具有以下有益的效果：
本发明提供了一种利于不同大小的液滴形成平面单层微小液滴阵列的方法，微小液滴在液-液界面水平方向展开成二维阵列，三明治***有助于维持液滴地稳定性，为基于单个液滴的分析提供关键技术支撑。本发明的制备方法为液滴的观测、统计分析提供了必要的前提，不会因液滴聚集、重叠影响后续结果分析的准确性。本发明的制备方法可以任意结合便于使用显微镜观测的平底容器，且可以任意调整液滴内的分散相，不仅仅适用于基于液滴地核酸定量分析，而且为以液滴作为反应器的生化分析提供了可利用的关键技术。
本发明的制备方法可以制备得到不同直径的液滴，液-液界面对液滴的体积不十分敏感，因此，该方法可以用于制备不同直径的液滴，为基于液滴地分析提供更灵活地应用。
附图说明
图1为微滴生成器的照片；
图2在单孔内加入混合油相形成的界面层，上层为矿物油(含正十四烷)，下层为氟化油；
图3为以水为分散相制备平面单层液滴阵列照片；
图4以柠檬黄溶液为分散相制备平面单层液滴阵列照片；
图5为实施例3的实验结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提出一种平面单层微小液滴阵列的制备方法，微小液滴在液-液界面水平方向展开成二维阵列，三明治***有助于维持液滴地稳定性。下层油与液滴生成器中的油相成分一致，起到补偿作用，维持液滴稳定性，同时上层油起到封闭体系的作用，避免微小液滴内的化学组分向环境扩散。
具体的，平面单层微小液滴阵列的制备方法包括以下步骤：
S1、填装混合油相：在容器内先填装下层油，再填装上层油；下层油的密度大于上层油，下层油和上层油不互溶，形成具有液-液界面的混合油相；
S2、使用液滴生成器生成微小液滴：液滴生成器所使用的油相与混合油相中的下层油的成分相同；
S3、转移微小液滴：将生成的微小液滴从液滴生成器出口转移至容器的混合油相中，微小液滴在所述液-液界面自发形成平面单层微小液滴阵列。
在本发明实施例中，下层油和下层油满足密度不同、且不互溶能形成液-液界面即可。
在优选实施方式中，下层油选自氟化油，优选HFE-7500；上层油选自矿物油和有机溶剂的混合物，有机溶剂的密度为0.6～1g/mL，密度的测定温度为25℃。密度为0.6～1g/mL的有机溶剂有助于降低矿物油粘度，辅助液滴快速地沉降至液-液界面。密度为0.6～1g/mL有机溶剂优选液态烷烃，液态烷烃优选正C4～C16烷中的至少一种，更优选正十四烷。两种油互不相溶且密度不同，形成清晰的液-液界面。矿物油粘度大，为帮助更小的微滴快速沉降，加入一定比例的低粘度的有机溶剂，加入的比例不大于矿物油，低粘度有机溶剂可起到降低粘度的作用。
更优选的，所述上层油和所述下层油的体积比为16：1～1：10；优选为5：1～5，更优选为5：2～3。在本发明实施例中，为了形成液-液界面，下层油相的体积应该足够铺满容器底部，上层油液面不超过容器高度。
在本发明实施例的优选技术方案中，下层油中还添加有表面活性剂，表面活性剂用于降低下层油的表面张力，并利于保持液滴稳定，防止内容物破裂，且不与内容物发生化学反应。优选生物惰性表面活性剂；可选自Pico-surf或dSURF等中的至少一种；表面活性剂的添加量为0.1～5v/v％，为了节约成本，实施例中表面活性剂添加至2v/v％。
在一个具体的实施方式中，下层油为含2v/v％表面活性剂dSURF氟化油20～80μL，上层油为含37.5v/v％正十四烷的矿物油50～200μL，两种油互不相溶且密度不同，形成清晰的液-液界面。
在本发明实施例的优选技术方案中，将下层油和上层油分别离心处理后，再进行填装；目的是除杂除气泡，保证精密度。具体的，离心处理的条件根据原料的纯度和气泡多少而定，具体可采用：6000～10000rpm离心5～15min，更优选为8000rpm离心10min。
在本发明实施例的优选技术方案中，容器选自平底透明的容器，便于用显微镜观察，具体可选自平底烧杯、酶标板、培养皿或96孔板；并优选96孔板。
在本发明实施例的优选技术方案中，在S2中，使用液滴生成器生成微小液滴，利用流体聚焦的原理，在液滴生成器的分散相入口和连续相入口分别注入水相和油相，连续相在液滴生成器的流道交汇处将分散相剪切为微小液滴。所采用的液滴生成器为现有设备，从而不需要使用具有有限高度的微流体芯片，各种能生成液滴的均可以使用。水相和油相的流速为3～4：15～25；水相和油相的流速的作用为调节液滴大小和生成的速率。不同直径的微小液滴可以通过改变流速或通过调整液滴生成器通道宽度来获得。本发明实施例的液-液界面对液滴的体积不十分敏感，因此，本发明实施例的方法可以用于制备不同体积的液滴，为基于液滴地分析提供更灵活地应用。
在本发明实施例的优选技术方案中，在S2中，水相选自水或以水为溶剂的溶液，油相与混合油相中的下层油的成分相同；即当下层油选自氟化油时，油相也选用氟化油，并优选HFE-7500。S2中的***组装方式为：将水相和氟化油分别填装入精密注射器中，并固定于高精密微流体输入泵的控制台；注射器与液滴生成器通过导管连接，液滴生成器出口连接一段导管；液滴生成器置于荧光倒置显微镜载物台并固定，调整视野使其位于液滴生成器的流道交汇处，具体可采用5倍物镜来观察液滴。组装后，开启输入泵，调整水相与油相的流速，待看到液滴在流道交汇处稳定生成，进行S3。导管为PTFE导管。
在S3中，液滴生成器的出口连接一根导管，待微小液滴稳定生成后，将导管垂直***容器，导管的出口没入混合油相内，在界面张力的作用下，液滴被拉入两种油相的界面层，自发铺展为平面的二维阵列。
平面单层微小液滴阵列中的液滴直径分布为20μm～150μm。液滴直径较均一时，单分散液滴的效果最佳。
本发明实施例还涉及上述制备方法制备得到的平面单层微小液滴阵列。
本发明实施例还涉及上述制备方法、上述平面单层微小液滴阵列在生物检测、生化分析、微生物培养、蛋白质与药物作用分析中的应用；生物检测包括核酸检测，例如恒温扩增。
实验例中所用的原料和设备为：
微滴生成器(如图1所示)和微流体配件(武汉简米智控科技有限公司，中国)；
高精密微流体输入泵(含光微纳，中国)；
矿物油(M8410，Sigma-ALdrich，USA)；
氟化油HFE-7500(3M)；
正十四烷、96孔板和其他试验材料(南天生物，中国)；
Lyo-Ready LAMP mix(MDX097，Meridian Bioscience，USA)；
SYBR-Green I(SY1020，Solarbio，中国)；
dLAMP引物(生工生物，上海，中国)；
细菌基因组DNA提取试剂盒(DP2001，百泰克，中国)。
实施例1
1、96孔板中混合油相填装
1.1上层油制备：氟化油7500在离心机8000rpm离心10min，去除溶解在油相内的气体以及杂质。
1.2下层油制备：矿物油与正十四烷按5：3比例混合，离心机8000rpm离心10min，脱气、去除杂质。
1.3在96孔板的实验孔内，每孔依次加入60μL氟化油，在覆盖150μL矿物油(含正十四烷37.5v/v％)。96孔板的实验孔包含一种密度较轻的上层油相，一种密度较重的下层油相，以后位于界面层的单分散液滴。两种油相互不相溶，形成液-液界面，如图2。
2、以水为分散相制备单分散平面单层液滴
2.1***组装：将无菌去离子水和氟化油分别填装入1mL精密注射器中，并固定于高精密微流体输入泵的控制台；注射器与液滴生成器通过PTFE导管连接，且液滴生成器出口连接一段PTFE导管；液滴生成器置于荧光倒置显微镜载物台并固定，调整视野使其位于液滴生成器的流道交汇处，这里采用5倍物镜来观察液滴；
2.2液滴生成：开启输入泵，调整分散相(水相)与连续相(油相)流速为0.4：2.5，待看到液滴在流道交汇处稳定生成，此时可将液滴生成器出口处连接的PTFE导管垂直***96孔板内，导管口没入矿物油中；在界面张力的作用下，液滴被拉入两种油相的界面层并铺展为平面的二维阵列；
2.3结果观察：将注入液滴的96孔板放置在荧光倒置显微镜上观察，所有的液滴铺展为平面单层的液滴阵列，液滴直径约为78μm。为了更好的观察到圆孔内部的所有液滴，这里采用5倍物镜，如图3所示。
实施例2
1、96孔板中混合油相填装实施例1。
2、以柠檬黄溶液为分散相制备单分散平面单层液滴
2.1***组装：将柠檬黄溶液和氟化油分别填装入1mL精密注射器中，并固定于高精密微流体输入泵的控制台；注射器与液滴生成器通过PTFE导管连接，且液滴生成器出口连接一段PTFE导管；液滴生成器置于荧光倒置显微镜载物台并固定，调整视野使其位于液滴生成器的流道交汇处，这里采用5倍物镜来观察液滴；
2.2液滴生成：开启输入泵，调整分散相(柠檬黄溶液)与连续相(油相)流速为4：15，待看到液滴在流道交汇处稳定生成，此时可将液滴生成器出口处连接的PTFE导管垂直***96孔板内，导管口没入矿物油中；在界面张力的作用下，液滴被拉入两种油相的界面层并铺展为平面的二维阵列；将注入液滴的96孔板放置在荧光倒置显微镜上观察，所有的液滴铺展为平面单层的液滴阵列，液滴直径约为83μm。为了更好的观察到圆孔内部的所有液滴，这里采用5倍物镜，如图4(彩色照片时为微小液滴为浅黄色)。
实施例3
1、金黄色葡萄球菌核酸扩增液制备：
1.1核酸标准品提取：过夜培养的金黄色葡萄球菌培养物，经细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。
1.2扩增液制备：每25μL扩增液中包含Lyo-Ready LAMP mix 6.25μL，SYBR-GreenI(10×)2.5μL，硫酸镁(随Lyo-Ready LAMP mix配置)4μL，引物混合物1.4μL，模板2μL，其余体积用ddH2O补足，混匀。
引物序列来参考文献“基于可视化环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌(郭建平，万佳佳，陆兆新，等，食品科学)”。
1.3 96孔板的各孔依次填装同实施例1。
2、单分散平面单层液滴阵列在沙门氏菌数字定量检测
2.1***组装：液滴生成器置于荧光倒置显微镜载物台并固定，调整视野使其位于液滴生成器的流道交汇处，这里采用5倍物镜来观察液滴生成的过程；注射器与液滴生成器通过PTFE导管连接，且液滴生成器出口连接一段PTFE导管；将核酸扩增液和微滴生成油分别填装入1mL精密注射器中，并固定于高精密微流体输入泵的控制台；
2.2液滴生成开启输入泵，调整水相(核酸扩增液)与油相流速为3：25，待看到液滴在流道交汇处稳定生成，此时可将液滴生成器出口处连接的PTFE导管垂直***96孔板内，导管口没入矿物油中；在界面张力的作用下，液滴被拉入两种油相的界面层并铺展为平面的二维阵列；将注入液滴的96孔板放置在荧光倒置显微镜上观察，确认所有的液滴铺展为平面单层的液滴阵列，液滴直径约为40μm。
2.3恒温孵育：用光学透明的薄膜盖板将96孔板各孔覆盖，并用凡士林密封孔边缘，之后，将96孔板放置在恒温箱，40℃保持40min。
2.4统计分析：
使用荧光倒置显微镜拍摄所有的阳性液滴，如图5，并可计算阳性液滴的比例以及计算起始靶标的浓度。
本申请虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本申请构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本申请的保护范围应当以本申请权利要求所界定的范围为准。

Claims (14)

1.一种平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、填装混合油相：在容器内先填装下层油，再填装上层油；所述下层油选自氟化油，所述上层油选自矿物油和有机溶剂的混合物，所述有机溶剂为正十四烷，所述下层油中还添加有表面活性剂，所述下层油的密度大于所述上层油，所述下层油和所述上层油不互溶，形成具有液-液界面的混合油相；
S2、使用液滴生成器生成微小液滴：所述液滴生成器所使用的油相与混合油相中的所述下层油的成分相同，在分散相入口和连续相入口分别注入水相和油相，连续相在所述液滴生成器的流道交汇处将分散相剪切为微小液滴；所述水相选自水或以水为溶剂的溶液，所述油相选自氟化油；
S3、转移微小液滴：将生成的所述微小液滴从液滴生成器出口转移至所述容器的所述混合油相中，所述微小液滴在所述液-液界面自发形成所述平面单层微小液滴阵列，在显微镜观察下进行所述微小液滴的生成和转移；所述液滴生成器的出口连接一根导管，待所述微小液滴稳定生成后，将所述导管垂直***所述容器，所述导管的出口没入所述混合油相内，进行液滴转移。
2.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述氟化油选自氟化油HFE-7500。
3.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述上层油选自矿物油与正十四烷按1：1～5：3体积比混合的混合物。
4.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述上层油和所述下层油的体积比为16：1～1：10。
5.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述上层油和所述下层油的体积比为5：1～5。
6.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述上层油和所述下层油的体积比为5：2～3。
7.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂的添加量为0.1～5v/v％。
8.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述下层油和所述上层油分别离心处理后，再进行填装。
9.根据权利要求8所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述离心处理的条件为：6000～10000rpm离心5～15min。
10.根据权利要求9所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述离心处理的条件为：8000rpm离心10min。
11.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述容器选自平底透明的容器。
12.根据权利要求11所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述容器为培养瓶、酶标板、培养皿或96孔板。
13.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，在S2中，所述水相和所述油相的流速为3～4：15～25。
14.根据权利要求1所述的平面单层微小液滴阵列的制备方法，其特征在于，所述平面单层微小液滴阵列中的液滴直径分布为20μm～150μm。
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