CN114058495A - 一种工业级非对称液滴发生装置及数字核酸扩增检测*** - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种工业级非对称液滴发生装置及数字核酸扩增检测***。工业级非对称液滴发生装置，包括上层水相单元和下层油相单元，上层水相单元固定在下层油相单元上，上层水相单元设有上大下小的引流管，在外力的作用下，引流管内的上层水相进入到下层油相中，形成尺寸均一的油包水液滴。引流管由毛细管经端部拉锥而成。数字核酸扩增检测***，包括：高重复率非对称液滴发生装置，用于产生大量均一性的液滴；核酸扩增控温装置，用于在所述的液滴发生装置生成的液滴中进行核酸扩增反应；和产物信号采集装置，用于采集液滴中核酸扩增反应后的产物信号。本发明具有成本可控、重复率高等显著优点。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，主要涉及一种工业级非对称液滴发生装置及数字核酸扩增检测***。
背景技术
液滴（Microdroplet）作为微小反应器，能够大大加快生化反应速率，在分析检测、化学传感、医疗检测、化学合成等领域被广泛应用。传统液滴生成的方法往往基于芯片微流控，这种液滴生成的装置通常需要昂贵的芯片制作以及精密的蠕动泵来调节水油两相的流速从而控制液滴的生成尺寸。使用泵的主要问题：操作不便、成本高昂、易浪费试剂。
数字化核酸检测技术在生物检测、化学传感、医疗诊断等领域发挥具有巨大的作用。作为第三代核酸扩增方法，通过利用微液滴的技术理念将样品分配到上千万个单位中，以此将样品稀释至单分子水平。每个液滴中含有核酸或者不含核酸，经过扩增后，含有核酸的液滴有荧光信号，荧光液滴在数量上符合泊松分布。通过计数统计，可实现目标核酸等的样品的绝对定量检测。因此微液滴发生装置对于数字PCR技术至关重要。
近年来提出的液滴生成装置中，CN112522374A “低成本广适应离心式数字液滴发生方法及装置”提出了一种操作简单、低成本、适应广泛的离心式液滴发生装置。然而，此装置中使用的高分子聚合物如PDMS胶等对尺寸均匀的微米管进行密封，该操作可能会引起以下问题：（1）高分子聚合物若未密封严实，易导致上层水相经过高分子聚合物与内移液枪吸头之间的缝隙进入到下层油相中，这时的微米管则不是唯一通向下层油相的通道，导致生成的液滴不均一；（2）高分子聚合物在密封时若处理不当，可能会将极细的微米管堵住，上层水相不能被离心到下层油相中，这使得均一液滴的离出率降低；（3）高分子聚合物在与微米管密封时，微米管的上端与高分子聚合物凝固后的上层若不控制在同一个水平面上，这就会出现微量级的上层水相无法完全被离心入下层油相中，导致样品的浪费。
以上各种原因导致发明CN112522374A或类似技术的重复率不足，无法达到工业化生产标准。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种工业级非对称液滴发生装置及数字核酸扩增检测***，利用非对称结构引流，而非两端同样大小的对称结构生成液滴，实现很高的重复率。
一种工业级非对称液滴发生装置，包括上层水相单元和下层油相单元，上层水相单元固定在下层油相单元上，上层水相单元设有上大下小的引流管，在外力的作用下，引流管内的上层水相进入到下层油相中，形成尺寸均一的油包水液滴。
所述的引流管由毛细管经端部拉锥而成。
所述的毛细管的锥部尖端通过刀片在显微镜下进行切割。
所述的外力为离心力。
所述的下层油相单元采用塑料离心管。
所述的上层水相单元包括固定架和引流管，固定架用于固定引流管，所述中的固定架包括一个或者多个嵌套的移液枪吸头。
所述的固定架中的移液枪吸头，口径通过平切或者附加O型橡胶圈，便于固定引流管，或者便于上层水相单元固定于下层油相单元。
所述的液滴发生装置，通过控制引流管的内径和开口大小调节生成液滴的尺寸。
所述的液滴发生装置，应用于核酸dPCR和dLamp扩增，实现数字化核酸检测。
一种基于所述的液滴发生装置的数字核酸扩增检测***，包括：高重复率非对称液滴发生装置，用于产生大量均一性的液滴；核酸扩增控温装置，用于在所述的液滴发生装置生成的液滴中进行核酸扩增反应；和产物信号采集装置，用于采集液滴中核酸扩增反应后的产物信号。
本发明的有益效果：
本发明突破现有的液滴发生装置中，油包水液滴生产所需要的微流控芯片，生产成本高，使用困难等瓶颈，达到使用常规离心设备或类似技术即可实现形成大量优质液滴的目的。
本发明通过对毛细管尖端进行拉锥处理，采用非对称空心引流结构，构建了一种可以工业级量产的液滴生成装置，具有成本可控、重复率高、操作简单等特点。
另外，本发明工业级非对称液滴发生装置与核酸扩增相结合，微量的水相溶液在几分钟内即可快速产生高通量的均一油包水液滴，实现数字化PCR核酸定量检测。
本发明可对样品如核酸、细胞、蛋白、纳米颗粒等进行封装分配，进而结合核酸扩增完成检测等应用。
附图说明
图1为本发明液滴发生装置的结构示意图。
图2为本发明液滴发生装置中毛细管的锥形非对称结构放大图。
图3为本发明液滴发生装置中锥形毛细管尖端结构放大图。
图4为本发明液滴发生装置生成的均一液滴示意图。
图5为本发明液滴发生装置使用的锥形毛细管尖端外径与生成均一液滴外径的关系图。
图6为本发明液滴发生装置用于新冠病毒核酸Lamp扩增的实验图。
图7为新冠病毒荧光定量PCR扩增与其他数字PCR扩增实验图。
图8为本发明液滴发生装置用于新冠病毒核酸PCR扩增的实验图。
附图标记说明：引流管1、上层水相单元2、固定架3、离心管4、下层油相单元5。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图对本发明做进一步阐述。
实施例1
本发明构建了一种工业级非对称液滴发生装置。
该装置可使用生化实验室常见的微量移液枪头（或规模生产类似的结构）和离心管进行组装，将锥形的毛细管固定在微量移液枪头中，在高速离心作用下，微量级的上层水相进入到下层油相中生成尺寸均一、高质量的油包水液滴，并且通过调节锥形毛细管尖端的外径可改变生成的油包水液滴的尺寸。
如图1所示，该装置包括上层水相单元2和下层油相单元5两部分单元，所述的上层水相单元包括固定架3和引流管1（此处为毛细管），固定架3用于固定引流管1，所述中的固定架3包括一个或者多个嵌套的移液枪吸头。上层水相单元由三种微量移液枪头和毛细管组装而成，最外层的移液枪头由1000μl的移液枪头在枪头凸起处切割改装而成，中间层的移液枪头由200μl的移液枪头在枪头凸起处切割改装而成并使用O形项圈固定在最外层移液枪头内侧，最内侧的移液枪头由10μl的移液枪头在距最下端0.5cm处切割改装而成，三种不同规格的微量移液枪头相互嵌套，内径为690μm毛细管则刚好被固定在最内侧的微量移液枪头中。下层油相单元5则由1.5ml离心管4组成。上层水相单元2中最外层的移液枪头可以固定在下层油相体系的1.5ml离心管中，共同置于实验室常见离心机中进行油包水液滴的生成。本例中，移液枪头的型号如下，1000μl移液枪头：Axygen T-1000-B；200μl移液枪头：Axygen T-200-Y；10μl移液枪头：Axygen T-300。离心管可以使用普通的离心管，与上层水相的移液枪头匹配即可。对于本领域技术人员来说，显然可以使用生化实验室常见的其它微量移液枪头，或者采用市场上类似的结构和产品。
该装置中使用的毛细管为普通内径均一的毛细管，经过如微电极拉针仪等方法对尖端进行拉锥，使尖端形成一个锥形结构。这一结构的使用显著提高了尺寸均一、高质量油包水液滴的生成率。本例中使用的毛细管内径为690μm（外径1200μm），长度10cm，使用毛细管拉针仪等仪器对其进行拉针后，毛细管的尖端形成锥形结构（图2），但由于在拉针仪使用的过程中，拉针使用的温度过高而往往导致在形成锥形结构后尖端位置会出现部分塌陷，导致尖端被密封。因此，毛细管经过拉锥后，使用刀片等在显微镜下对毛细管尖端进行切割确定尖端的外径，以确保离心出来的液滴尺寸可以控制。例如：尖端外径为10μm的毛细管（图3），经过离心处理后，即可得到直径为50μm左右的均一液滴（图4）。
本发明中的装置在上层水相上样时使用如微量上样针等仪器直接将样品加入到毛细管内部，完全避免了因密封不严出现漏液问题而导致生成不均匀的液滴；同时也确保了注射进入毛细管内部的上层水相可以完全被离心生成液滴，提高了液滴生成的数量，同时也避免了试剂的浪费。例如，10μl的上层水相可产生7万个以上的均一液滴。
本发明中的装置与CN112522374A的液滴发生装置分别各制作10个，其均一液滴的成功生成率结果由下表1可知，CN112522374A的液滴发生装置只有1个成功生成了均一的液滴，其成功率为10%，而本发明的装置有8个装置成功生成了均一的液滴，其成功率为80%。若排除切坏器件，重复率为100%。
本发明的装置可以通过调节锥形毛细管尖端的外径改变生成的油包水液滴的尺寸。本发明切割了52个不同尖端外径的锥形毛细管进行均一液滴的生成，除尖端外径不同外，其余条件均保持一致。由此得到的锥形毛细管尖端外径与生成均一液滴直径的关系如图5所示。锥形毛细管尖端外径范围为1.833-17.277μm，生成均一液滴的直径范围为15.169-52.038μm。
本发明装置可使用生化实验室中常见的微量移液枪头（或规模生产类似的结构）、离心管和锥形毛细管进行组装，与CN112522374A 的离心式液滴发生装置相比（表1），本发明使用锥形毛细管提高了均一液滴的离出率、提高了液滴的生成数量以及避免了微量级上层水相的浪费。
表1
实施例2
本发明构建的工业级非对称液滴发生装置与核酸lamp结合，实现数字化lamp核酸检测。
样品的选择：新冠病毒阳性标准样品。利用RNA-free-water稀释至1-100 cp/μl。
反转录：逆转录操作使用上海康为世纪生物科技股份有限公司的HiFiScriptcDNA Synthesis Kit 试剂盒，操作步骤按照说明书进行操作，反转录得到的DNA于-20℃保存,长期保存于-80℃。Lamp体系：Lamp反应采哈尔滨新海基因检测有限公司用新冠恒温荧光探针法核酸检测试剂盒，25 μl的lamp体系内包括：5 μl新冠病毒DNA阳性标准品，试剂盒内的10 μl nCoV-2 3IsoAmp Solution A和10 μl nCoV-2 3IsoAmp Solution B。微液滴生成：同实施例1，在本发明中的装置上层水相上样时采用如微量上样针等仪器直接将配置好的lamp体系样品加入到毛细管内部。下层油相体系则由（内含表面活性剂EM180的十六烷酸异丙酯）1.5ml离心管组成。上层水相体系中最外层的移液枪头可以固定在下层油相体系的1.5ml离心管中，共同置于实验室常见离心机中(6000 rcf, 3 min)进行油包水液滴的生成。
Lamp扩增：将生成的液滴转移至PCR管中并放置于荧光定量PCR仪中，设置程序65℃ 10s，65℃ 50s为循环单元,循环35次。
结果检测：lamp扩增结束后，用移液管尖端小心地将微滴转移到玻璃盖玻片或 48孔板上用于荧光显微镜观察。结果如图6所示。
此外利用同一样品（1-100 cp/μl新冠病毒DNA）分别采用荧光定量PCR***检测和市面上的商业化数字PCR***（DropDx-2044数字PCR***）进行检测，结果如图7所示。
实施例3
本发明构建的工业级非对称液滴发生装置与核酸PCR扩增结合，微量的水相溶液在几分钟内即可快速产生高通量的均一油包水液滴，实现数字化PCR核酸检测。
样品的选择：新冠病毒阳性标准DNA样品。
PCR体系：20 μl PCR体系内包括：10 μl SYBR Green I PCR Mix，2 μl新冠病毒DNA阳性标准品，1 μl上游和下游引物，5 μl甘油以及1 μl ddH2O。
微液滴生成：同实例1，在本发明中的装置上层水相上样时采用如微量上样针等仪器直接将配置好的PCR体系样品加入到毛细管内部。下层油相体系则由（含有ePCR液滴发生油）1.5ml离心管组成。上层水相体系中最外层的移液枪头可以固定在下层油相体系的1.5ml离心管中，共同置于实验室常见离心机中(5000 rcf, 3 min)进行油包水液滴的生成。
PCR扩增：将生成的液滴转移至PCR管中并放置于荧光定量PCR仪中，然后进行PCR反应,反应程序为:94℃, 3 min; 10min;95℃，20 s , 60℃ 30 s, 72℃ 30s，20 cycle;72℃，3 min。
结果检测：PCR扩增结束后，用移液管尖端小心地将微滴转移到玻璃盖玻片或 48孔板上用于荧光显微镜观察。结果如图8所示。
上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施方案仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.一种工业级非对称液滴发生装置，其特征在于：
包括上层水相单元和下层油相单元，上层水相单元固定在下层油相单元上，上层水相单元设有上大下小的引流管，在外力的作用下，引流管内的上层水相进入到下层油相中，形成尺寸均一的油包水液滴。
2.根据权利要求1所述的液滴发生装置，其特征在于：所述的引流管由毛细管经端部拉锥而成。
3.根据权利要求2所述的液滴发生装置，其特征在于：所述的毛细管的锥部尖端通过刀片在显微镜下进行切割。
4.根据权利要求1所述的液滴发生装置，其特征在于：所述的外力为离心力。
5.根据权利要求1所述的液滴发生装置，其特征在于：所述的下层油相单元采用塑料离心管。
6.根据权利要求1所述的液滴发生装置，其特征在于：所述的上层水相单元包括固定架和引流管，固定架用于固定引流管，所述中的固定架包括一个或者多个嵌套的移液枪吸头。
7.根据权利要求6所述的液滴发生装置，其特征在于：所述的固定架中的移液枪吸头，口径通过平切或者附加O型橡胶圈，便于固定引流管，或者便于上层水相单元固定于下层油相单元。
8.根据权利要求1所述的液滴发生装置，其特征在于：通过控制引流管的内径和开口大小调节生成液滴的尺寸。
9.根据权利要求1所述的液滴发生装置，其特征在于：应用于核酸dPCR和dLamp扩增，实现数字化核酸检测。
10.一种基于根据权利要求1所述的液滴发生装置的数字核酸扩增检测***，其特征在于：包括：
高重复率非对称液滴发生装置，用于产生大量均一性的液滴；
核酸扩增控温装置，用于在所述的液滴发生装置生成的液滴中进行核酸扩增反应；和
产物信号采集装置，用于采集液滴中核酸扩增反应后的产物信号。
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