CN114177220A - 人参与连翘的组合物及其抗病毒等药用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包括人参组分和连翘组分的组合物、制备方法,及其抗病毒、解热、抗炎,以及提高免疫力的应用。该组合物见效快、毒副作用小、是一种安全、高效、稳定、制备工艺简单的抗病毒药物和保健食品,适于工业化生产,易于推广。本发明为预防和治疗多种病毒性疾病、解热、抗炎,以及提高免疫力提供了一种新的药物、保健食品及原料。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域,具体而言,本发明涉及一种人参与连翘提取物的组合物、制备方法,及其抗病毒、解热、抗炎,以及提高免疫力的应用。
背景技术
人参是属于五加科人参属的植物,在中国,韩国,日本被广泛应用,已有2000多年历史,以预防疾病和延长寿命为主要使用目的。据《神农本草经》记载,人参有:‘补五脏,安神经,定魂魄,止惊悸,除邪气,名目益智,久服轻身延年’的作用。现代医学研究表明人参的主要功效和作用有:对于神经中枢***的作用,抗癌抗肿瘤作用,免疫功能调节作用,抗糖尿病的作用,增强肝功能作用,心脑血管障碍改善,抗动脉硬化作用,血压调节作用,以及更年期障碍和抗骨质疏松作用,抗疲劳,抗氧化,抑制衰老等。
人参皂苷作为人参的主要有效成分,被广泛研究和使用,其中以20(R)-人参皂苷Rg3最为引人瞩目,其作为人参的主要有效成分,安全性良好,已经被制成抗肿瘤口服制剂应用于临床,作为注射剂被深入研究。
连翘为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物连翘(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)的干燥果实,主要分布于我国河南、山西、陕西、山东等地,此外,湖北、河北、四川、甘肃亦有分布。常用于治疗急性风热感冒、痈肿疮毒、***结核、***等症[1]。连翘的主要成分为连翘苷(phillyrin)和连翘苷元,连翘苷元又称人参皂苷Rg3((+)-phillygeninin),两种成分的结构式如下。
连翘主要成分为连翘苷,具有抗病毒、抗菌、抗氧化、清除自由基等药理作用。连翘脂素,亦为连翘的主要活性成分之一,具有抗氧化、降低血脂、清除自由基、抑菌、抗肿瘤、抗炎等作用。
现有研究中多以人参药材或人参总皂苷、连翘药材或连翘脂素等单一成分的药理作用进行研究,而未见有人以人参连翘作为药对,进行抗病毒、解热、抗炎,以及提高免疫力的药理作用研究。本发明人通过大量的现代科学研究,采用先进的分离纯化技术从人参和连翘药材中提取其有效成分人参与连翘提取物,并对人参与连翘提取及其相应的药物制剂进行了抗病毒、解热、抗炎,以及提高免疫力的应用研究,将它们应用于药物制剂及保健食品中具有广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的缺陷,提供一种新的人参与连翘的组合物、制备方法,及其抗病毒、解热、抗炎,以及提高免疫力的应用。本发明的人参与连翘的组合物在抗病毒、解热、抗炎,以及提高免疫力的性能和功效强,为研制此类疾病的新药提供了新的途径,即在治疗、调理和缓解此类疾病的药物或保健食品中的新应用提供了新的思路。
为实现上述目的,本发明一方面提供一种人参与连翘的组合物、制备方法,及其应用。
其中,所述人参与连翘组合物中人参组分与连翘组分的重量份配比为2~98:2~98,优选为80:20或20:80,进一步优选为90:,6或6:90,更进一步优选为98:2或2:98。
特别是,所述的人参-连翘药组合物中,人参组分中的人参皂苷Rg3的含量≥0.03%,优选为≥10%,进一步优选为≥50%,更进一步优选为≥80%,再更进一步优选为≥90%,再更进一步优选为≥99%;连翘组分中的连翘苷的含量≥0.15%,优选为≥15%,进一步优选为≥60%,更进一步优选为≥80%,再更进一步优选为≥90%,再更进一步优选为≥99%。
优选本发明第一方面的组合物是用于抗病毒、解热、抗炎和/或提高免疫力的组合物,其包括人参皂苷和连翘苷。更优选地,其中,人参皂苷是人参总皂苷、人参二醇类皂苷、人参皂苷Rg3或20(R)-人参皂苷Rg3。
进一步地,优选该组合物还进一步包括连翘酯素。
优选本发明第一方面的组合物由人参提取物和连翘提取物组成。优选其中,提取物是醇提取物或水提取物,例如,本发明第一方面的组合物可以由人参醇提取物和连翘醇提取物组成,本发明第一方面的组合物也可以由人参水提取物和连翘水提取物组成。醇可以是甲醇或乙醇或其水溶液,优选是乙醇或其水溶液。在醇的水溶液中,醇的浓度可以是50~100%(V/V),优选是60~95%(V/V),如为70~90%(V/V)。优选其中,提取所用的人参和提取所用的连翘的重量份配比为2~50:50~98。在本发明的具体实施方式中,提取的步骤可以包括:将人参和/或连翘在醇或水中浸泡后加热,保留滤液,并任选进行或重复多次(如2-5次)将滤渣加醇或水加热并保留滤液的步骤,然后干燥滤液。
也优选本发明第一方面的组合物还包括三七、芦荟、甘草、首乌、银杏、黑芝麻提取物、生姜提取物、葡萄子提取物、石榴子提取物、植物精油、熊果苷、维生素C及其衍生物或维生素E及其衍生物中的一种或多种。
本发明第二方面提供用于抗病毒、解热、抗炎和/或提高免疫力的制剂,其包括本发明第一方面的组合物和药学上或保健品或食品中可接受的载体。优选地,本发明提供抗病毒、解热、抗炎和/或提高免疫力的药物或保健品,其含有人参组分和连翘组分。优选其中,所述人参组分与连翘组分的重量份配比为2~98:2~98,优选为80:20或20:80,进一步优选为90:6或6:90,更进一步优选为98:2或2:98。特别是,所述药物或保健品由人参与连翘的组合物组分和药学上可接受的载体组成。
其中,所述人参与连翘的组合物中人参组分与连翘组分的总重量与药学上可接受的载体的重量之比为1:1~1:100,优选为1:10,进一步优选为1:5,更进一步优选为1:2,再更进一步优选为1:1。
特别是,所述人参与连翘的组合物的重量与所述药物或保健品的总重量之比为0.01~50:100,优选为0.1~50:100,进一步优选为1~50:100。
特别是,所述人参组分与连翘组分还可以添加药学上可接受的载体与食品添加剂。
药学上可接受的载体通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》(Handbook ofPharmaceutical excipients,第2版,由A.Wade和P.J.Weller编辑;American Phar-maceutical Association出版,Washington and The Pharmaceutical Press,London,1994)等工具书中找到。食品添加剂是有意识地一般以少量添加于食品,以改善食品的外观、风味、组织结构或贮存性质的非营养物质。有关食品添加剂可在中国食品安全国家标准《食品添加剂使用标准》中找到。食品添加剂是有意识地一般以少量添加于食品,以改善食品的外观、风味、组织结构或贮存性质的非营养物质。有关食品添加剂可在中国食品安全国家标准《食品添加剂使用标准》中找到。
尤其是,所述的载体包括赋形剂,如淀粉、水等;润滑剂,如硬脂酸镁等;崩解剂,如微晶纤维素等;填充剂,如乳糖等;粘结剂,如预胶化淀粉、糊精等;甜味剂;抗氧化剂;防腐剂、矫味剂、着色剂、香料等。
特别是,所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。
特别是,所述保健食品以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在,或者以乳制品、糖果、饮料、饼干、茶叶及相关制品、酒等食品形式存在。
特别是,所述药物或保健品中还包括三七、芦荟、甘草、首乌、银杏、黑芝麻提取物、生姜提取物、葡萄子提取物、石榴子提取物、植物精油、熊果苷、维生素C及其衍生物或维生素E及其衍生物中的一种或多种。
其中,所述人参与连翘组合物中,人参组分与连翘组分的存在形式以中药材组成、或采用溶剂加热提取方法制备而成的人参-连翘提取组合物、或人参-连翘提取组合物与环糊精或其衍生物组合而成人参-连翘-环糊精组合物、或人参皂苷-连翘苷类、人参皂苷与连翘苷类与环糊精或其衍生物组合而成人参皂苷-连翘苷类-环糊精组合物。
特别是,所述的人参-连翘提取组合物选择人参-连翘醇提取物、人参-连翘水提取物;所述人参皂苷为人参总皂苷、人参二醇类皂苷、20(R)-人参皂苷Rg3;所述连翘苷类为连翘苷-连翘脂素组合物、连翘苷。
特别是,所述的人参-连翘-环糊精组合物,其特征是选择人参-连翘提取组合物与α-、β-或γ-环糊精或其衍生物相混合而成的混合物,或人参-连翘提取组合物与α-、β-或γ-环糊精或其衍生物经物理、化学方法处理形成的复合物。
特别是,所述的人参皂苷-连翘苷类-环糊精组合物,其特征是选择人参皂苷-连翘苷类与α-、β-或γ-环糊精或其衍生物相混合而成的混合物,或人参皂苷-连翘苷类与α-、β-或γ-环糊精或其衍生物经物理、化学方法处理形成的复合物。
其中,所述复合物中中药组分与环糊精或环糊精的衍生物的重量之比为1:1-100。
特别是,所述环糊精为α-或β-、γ-环糊精;所述环糊精衍生物为羟乙基β-环糊精、2,6-二甲基β-环糊精、2,3,6-三甲基β-环糊精、2,6-二乙基β-环糊精、2,3,6-三乙基β-环糊精、麦芽糖基β-环糊精或磺丁醚β-环糊精、对甲基苯磺酰氯(p-TsCl)取代的β-环糊精、6-位取代的β-CD对甲基苯磺酸酯(β-环糊精-6-OTs)、2-氧羟丙基-β-环糊精、2-位单取代的对甲基苯磺酸酯(β-环糊精-2-OTs)、β-环糊精对甲基苯磺酸酯(Tosyl-β-CD)、β-环糊精的星形大分子PCL-(Tos)7-β-CD。
本发明第三方面提供本发明第一方面的组合物的制备方法,其包括人参皂苷和连翘苷以及任选的连翘酯素的混合步骤;或者,其包括人参与连翘以及任选的中药材采用溶剂加热提取的步骤。前者可以是基本纯的化合物的混合方法。
在本发明的具体实施方式中,所述人参-连翘醇提取物按照如下步骤制备而成:
1)将药材人参、连翘分别与提取溶剂混合均匀后,进行浸泡处理;
2)分别对浸泡后的人参、连翘与提取溶剂混合物进行加热提取,过滤并收集提取液;
3)将收集的提取液汇集,浓缩处理,制成浸膏后进行干燥处理,即得。
特别是,步骤1)所述浸泡处理时间为30-60min,优选为30min。
尤其是,人参药材与提取溶剂的重量份配比为1:8-12,优选为1:10。
特别是,所述提取溶剂为体积百分比浓度≥50%的乙醇溶液,优选为50-75%的乙醇溶液。
其中,步骤2)中所述加热提取次数为2-3次,优选为3次。
特别是,每次加热提取过程中,所述人参、连翘药材与提取溶剂的重量份配比为1:8-12,优选为1:8;每次加热提取的温度为60-80℃,优选为70℃;加热提取时间为0.5-2h,优选为1h。
其中,步骤3)中所述浓缩处理过程中浓缩温度65-85℃,优选为80℃;浓缩后的浸膏的相对密度为1.05-1.15,优选为1.1;所述干燥处理过程中温度为70-90℃,优选为85℃。
其中,所述人参-连翘水提取物按照如下步骤制备而成:
1)将药材人参、连翘分别与水混合均匀后,进行浸泡处理;
2)分别对浸泡后的人参、连翘与水的混合物进行煎煮提取,过滤并收集提取液;
3)将收集的提取液汇集,浓缩处理,制成浸膏后进行干燥处理,即得。
特别是,步骤1)所述浸泡处理时间为30-60min,优选为30min。
尤其是,人参、连翘药材与水的重量份配比为1:8-12,优选为1:10。
其中,步骤2)中所述煎煮提取次数为2-3次,优选为3次。
特别是,每次煎煮提取过程中,所述人参药材与水的重量份配比为1:8-12,优选为1:8;每次煎煮提取的温度为90-100℃,优选为90-95℃;加热提取时间为0.5-2h,优选为1h。
其中,步骤3)中所述浓缩处理过程中浓缩温度70-95℃,优选为80℃;浓缩后的浸膏的相对密度为1.05-1.15,优选为1.1;所述干燥处理过程中温度为70-95℃,优选为85℃。
其中,所述人参总皂苷按照如下步骤制备而成:
1)将药材人参与提取溶剂混合均匀后,进行浸泡处理;
2)对浸泡后的人参与提取溶剂混合物进行加热提取,过滤并收集提取液;
3)将收集的人参提取液采用大孔树脂柱进行分离处理,收集、合并洗脱液,得到人参树脂柱洗脱液;
4)对人参树脂柱洗脱液进行浓缩、干燥处理,即得。
特别是,步骤1)所述浸泡处理时间为30-60min,优选为30min。
尤其是,人参药材与提取溶剂的重量份配比为1:8-12,优选为1:10。
特别是,所述提取溶剂为体积百分比浓度≥50%的乙醇溶液,优选为50-75%的乙醇溶液。
其中,步骤2)中所述加热提取次数为2-3次,优选为3次。
特别是,每次加热提取过程中,所述人参药材与提取溶剂的重量份配比为1:8-12,优选为1:8;每次加热提取的温度为60-80℃,优选为70℃;加热提取时间为0.5-2h,优选为1h。
特别是,还包括将步骤2)收集是人参提取液进行浓缩处理,制成人参浓缩液后再进行所述的大孔树脂柱分离处理。
尤其是,浓缩处理后获得的人参浓缩液每毫升含有生药人参1-3.5g,即相当于1-3.5g生药/ml,优选为2.5g生药/ml。
其中,步骤3)中所述大孔树脂柱层析处理包括以下顺序进行的步骤:3A)将人参提取液注入大孔树脂柱,接着采用水为洗脱剂进行洗脱;3B)采用体积百分比浓度为30%-50%的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱并收集乙醇洗脱液,获得人参树脂洗脱液。
特别是,大孔树脂柱层析过程中,人参提取液中人参的重量与大孔树脂体积之比为1:0.8-2.5,优选为1:1。
尤其是,大孔树脂柱分离处理过程中,大孔树脂柱的柱直径与树脂的柱高之比为1:5-10,优选为1:5-7,进一步优选为1:5.5-5.9。
其中,步骤3)中所述的大孔吸附树脂选择X-5、AB-8、NK-2、NKA-2、NK-9、D3520、D101、WLD中的一种,优选为D101。
特别是,步骤3A)中水的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-4:1,优选为4:1;步骤3B)中体积百分比浓度为30%-50%的乙醇溶液的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-8:1,优选为4-8:1,进一步优选为8:1。
尤其是,步骤3B)中洗脱剂乙醇溶液的体积百分比浓度为50%。
其中,步骤4)中浓缩处理过程中浓缩温度65-90℃,优选为80℃;所述干燥处理过程中温度为75-95℃,优选为85℃。
特别是,所述人参总皂苷含量为20-50%(检测方法按照国家标准:GB/T19506-2009附录B的方法进行)。
其中,所述人参二醇类皂苷按照如下步骤制备而成:
1)将药材人参与提取溶剂混合均匀后,进行浸泡处理;
2)对浸泡后的人参与提取溶剂混合物进行加热提取,过滤并收集提取液;
3)将收集的人参提取液采用大孔树脂柱进行第一次大孔树脂层析分离处理,收集、合并洗脱液,得到人参树脂柱第一洗脱液;
4)将人参树脂柱第一洗脱液采用大孔树脂柱进行第二次大孔树脂层析分离处理,收集、合并洗脱液,得到人参树脂柱第二洗脱液;
5)对人参树脂第二洗脱液进行浓缩、干燥处理,即得。
特别是,步骤1)所述浸泡处理时间为30-60min,优选为30min。
尤其是,人参药材与提取溶剂的重量份配比为1:8-12,优选为1:10。
特别是,所述提取溶剂为体积百分比浓度≥50%的乙醇溶液,优选为50-75%的乙醇溶液。
其中,步骤2)中所述加热提取次数为2-3次,优选为3次。
特别是,每次加热提取过程中,所述人参药材与提取溶剂的重量份配比为1:8-12,优选为1:8;每次加热提取的温度为60-80℃,优选为70℃;加热提取时间为0.5-2h,优选为1h。
特别是,还包括步骤2A),即将步骤2)收集的人参提取液进行浓缩处理,制成人参浓缩液后再进行所述的第一次大孔树脂柱层析分离处理。
尤其是,浓缩处理后获得的人参浓缩液每毫升含有生药人参1-3.5g,即相当于1-3.5g生药/ml,优选为2.5g生药/ml。
其中,步骤3)中所述第一次大孔树脂柱层析处理包括以下顺序进行的步骤:3A)将人参提取液注入大孔树脂柱,接着采用水为洗脱剂进行洗脱;3B)采用体积百分比浓度为30%-50%的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱并收集乙醇洗脱液,获得人参-大孔树脂第一洗脱液。
特别是,大孔树脂柱层析过程中,人参提取液中人参的重量与大孔树脂体积之比为1:0.8-2.5,优选为1:1。
尤其是,大孔树脂柱分离处理过程中,大孔树脂柱的柱直径与树脂的柱高之比为1:5-10,优选为1:5-7,进一步优选为1:5.5-5.9。
其中,步骤3)中所述的大孔吸附树脂选择X-5、AB-8、NK-2、NKA-2、NK-9、D3520、D101、WLD中的一种,优选为D101。
特别是,步骤3A)中水的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-4:1,优选为4:1;3B)中体积百分比浓度为30-50%的乙醇溶液的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-8:1,优选为4-8:1,进一步优选为8:1。
尤其是,步骤3B)中洗脱剂乙醇溶液的体积百分比浓度为50%。
特别是,还包括将步骤3)收集的人参树脂第一洗脱液进行浓缩处理,制成人参树脂第一浓缩液后再进行所述的第二次大孔树脂柱层析分离处理。
尤其是,浓缩处理后获得的人参浓缩液每毫升含有生药人参3.5-6g,即相当于3.5-6g生药/ml,优选为5.0g生药/ml。
特别是,步骤4)中所述第二次大孔树脂柱层析处理包括以下顺序进行的步骤:4A)将人参树脂柱第一洗脱液注入大孔树脂柱,接着采用体积百分比浓度为50~60%的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱;4B)采用体积百分比浓度为70~80%的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱并收集乙醇洗脱液,获得人参树脂第二洗脱液。
特别是,步骤4)第二次大孔树脂柱层析过程中,人参树脂柱第一洗脱液中人参的重量与大孔树脂体积之比为1:0.8-2.5,优选为1:1。
尤其是,大孔树脂柱分离处理过程中,大孔树脂柱的柱直径与树脂的柱高之比为1:5-10,优选为1:5-7,进一步优选为1:5.5-5.9。
其中,步骤4)中所述的大孔吸附树脂选择HPD-200、D203、XAD-4、HPD-100中的一种,优选为HPD-100。
特别是,步骤4A)中体积百分比浓度为50~60%的乙醇溶液的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-4:1,优选为4:1;步骤4B)中质量百分比浓度为70~80%的乙醇溶液的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-8:1,优选为4-8:1,进一步优选为8:1。
其中,步骤5)中所述浓缩处理过程中浓缩温度65-95℃,优选为80℃;所述干燥处理过程中温度为70-95℃,优选为85℃。
特别是,所述人参二醇类皂苷含量为30-70%检测方法按照国家标准:GB/T19506-2009附录B的方法进行)。
其中,所述的20(R)-人参皂苷Rg3含量为1%~98%;优选为30~80%,进一步优选为60%。
特别是,所述的20(R)-人参皂苷Rg3含量≥1%,优选为≥30%,进一步优选为≥60%,更进一步优选为≥80%,再更进一步优选为≥98%。
其中,所述的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物含量为1%~98%;优选为30~80%,进一步优选为60%。
特别是,所述的20(R)-人参皂苷Rg3衍生物含量≥1%,优选为≥30%,进一步优选为≥60%,更进一步优选为≥80%,再更进一步优选为≥98%。
其中,所述连翘苷类按照如下方法提取制备而成:
1)采用溶剂对连翘叶或连翘进行加热回流提取2~3次,每次2~4小时;
2)提取液浓缩后静置,析出沉淀,获得连翘脂素和连翘苷混合物粗品;
3)将连翘脂素和连翘苷混合物粗品采用溶剂溶解后,静置,析出结晶,获得连翘苷类混合物;
4)用溶剂对连翘脂素和连翘苷混合物进行重结晶处理,得到连翘苷类提取物。
特别是,步骤1)、3)、4)中所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、含水甲醇或含水乙醇。
尤其是,所述含水甲醇的质量百分比浓度为70-95%;所述含水乙醇的质量百分比浓度为70-95%。
其中,步骤2)中静置的温度为室温,优选为10-35℃,进一步优选为20-25℃;静置时间为1-48h;步骤2)中提取液浓缩后的体积与原提取液的体积之比为0.1-0.5:1。
特别是,步骤4)中所述重结晶处理的温度为室温,优选为10-35℃,进一步优选为20-25℃。
本发明第四方面提供本发明第三方面的制剂的制备方法,其包括本发明第一方面的组合物和药学上或保健品或食品中可接受的载体混合的步骤。
优选本发明第四方面的方法包括本发明第一方面的组合物与环糊精或其衍生物(如,α-、β-或γ-环糊精或其衍生物)混合的步骤。也优选本发明第四方面的方法包括本发明第一方面的组合物与环糊精或其衍生物(如,α-、β-或γ-环糊精或其衍生物)经物理、化学方法处理形成复合物的步骤。
本发明第五方面提供本发明第一方面的组合物在制备用于抗病毒、解热、抗炎和/或提高免疫力的药物或保健食品中的应用。相应地,本发明提供了用于抗病毒、解热、抗炎和/或提高免疫力的方法,其包括向有需要的个体施用治疗有效量的本发明第一方面的组合物。优选地,个体可以是哺乳动物,优选是人。
除非另外说明,本文所用的术语“治疗有效量”为需要产生有效作用的药物的用量;“治疗有效量”是可以调整和变化的,最终由医务人员确定,其所考虑的因素包括给药途径和制剂的性质、接受者的体重、年龄等一般情况以及所治疗疾病的性质和严重程度。
与现有技术相比,本发明具有如下的明显优点:
本发明人参与连翘的组合物的制备方法简便、适于工业化生产,组合物具有明显的抗病毒、解热、抗炎,以及提高免疫力的作用,且作用效果显著优于单独使用人参、连翘的效果,为人参与连翘药材的应用开拓了一个新的领域。
1、本发明人参与连翘的组合物组方配伍科学,配方独特,功效确切,安全性高,质量可控;
2、本发明组合物发掘了新的药用价值,系列试验研究证明其具有抗病毒、解热、抗炎,以及提高免疫力的功效,其作用效果显著优于人参、连翘单独用药的效果,人参、连翘按照特定比例组合使用,具有协同增效的作用;
3、本发明组合物制备方法简单,工艺条件温和,成本低廉,费用低;
4、本发明组合物功效显著,见效快、毒副作用小、安全性好,能够长期服用,具有良好的药用前景;
5、本发明产品原料来源丰富、价廉、临床使用安全,制备工艺简单,可制成各种剂型,且服量小,使用方便,因此易于推广。
6、本发明人参与连翘的组合物既可采用单体成分定量配制而成,也可通过提取制备成人参与连翘的组合物,或上述人参与连翘的组合物与一种α-或β-、γ-环糊精或环糊精的衍生物组合而成配方成组合物,还可采用人参与连翘的组合物与其他活性成分(例如与蒲公英提取物、板蓝根提取物、金银花提取物、知母提取物、玄参提取物、夏枯草提取物、芦根提取物、淡竹叶提取物、栀子提取物、川贝提取物、苦丁茶提取物、鱼腥草提取物中的一种或多种)共同组方,制备抗病毒、解热、抗炎,以及提高免疫力的复方药物。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述配方的有益效果。这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的配方思路、用途范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1-4人参-连翘的组合物的制备(药材原粉)
分别取人参和连翘的两种药材粉末,两者可以按表1的重量比混合制备成人参与连翘的组合物。人参和连翘两种药材为符合中国药典标准的合格药材。
表1实施例1-4的人参与连翘的组合物的原料配比表
实施例5人参-连翘的组合物醇提取物的制备
1、第一次提取处理
向中药多功能提取罐内中加入粉碎后的人参(300g)、连翘(300g)分别与体积百分比浓度为70%的乙醇溶液(3000g)混合均匀,浸泡30min后,开启多功能提取罐电源,加热,分别对人参和连翘药材进行第一次加热提取处理,在温度保持70℃下恒温提取1小时后过滤,得到第一次提取液和第一药渣;其中,人参、连翘分别与提取溶剂(乙醇溶液)的重量配比为1:10。
本发明中人参、连翘分别与提取溶剂的重量配比除了为1:10之外,其他配比如1:8-12均适用于本发明;浸泡时间除了30min之外,其他浸泡时间≥30min均适用于本发明,优先为30-60min;提取溶剂除了体积百分比浓度为70%的乙醇溶液之外,其他体积百分比浓度≥50%的乙醇溶液均适用于本发明,优选浓度为50-75%的乙醇溶液、无水乙醇;提取温度60-80℃、加热提取时间0.5-2h均适用于本发明。
2、第二次提取处理
向第一药渣中加入体积百分比浓度为70%的乙醇溶液,加热,对人参、连翘药材分别进行第二次加热提取处理,在温度保持70℃下恒温提取1小时后过滤,得到第二次提取液和第二滤渣;其中,人参、连翘分别与提取溶剂的重量配比为1:10。
3、第三次提取处理
向第二药渣中加入体积百分比浓度为70%的乙醇溶液,加热,对人参、连翘药材分别进行第三次加热提取处理,在温度保持70℃下恒温提取1小时后过滤,得到第三次提取液;其中,人参、连翘分别与提取溶剂的重量配比为1:10。
本发明实施例中人参、连翘的醇提取物进行第二、第三次提取过程中使用的提取溶剂除了体积百分比浓度为70%的乙醇溶液之外,其他体积百分比浓度≥50%的乙醇溶液均适用于本发明,优选浓度为50-75%的乙醇溶液、无水乙醇;提取温度60-80℃均适用于本发明;加热提取时间0.5-2h均适用于本发明。
本发明实施例中人参、连翘的醇提取物制备过程中加热提取次数为3次,提取次数为2-3次均适用于本发明。
4、浓缩、干燥处理
将3次过滤得到的第一、二、三次提取液按2:98的重量比混合后置于旋转蒸发器中在温度80℃下进行蒸发浓缩处理,得到相对密度为1.1的浸膏,然后置于烘箱中于85℃下干燥至恒重,即得人参与连翘的组合物醇提取物。
人参与连翘的组合物醇提取物为浅棕黄色粉末,有特殊气味,溶于乙醇。
本发明的人参与连翘的组合物醇提取物浓缩处理过程中,浓缩温度65-85℃、浓缩后的浸膏的相对密度为1.05-1.15均适用于本发明;干燥过程中温度70-90℃均适用于本发明。采用本发明方法制备的人参醇提取物中人参总皂苷含量为2-5%。
实施例6人参-连翘的组合物水提取物的制备
1、浸泡处理
将粉碎后的人参(300g)、连翘(300g)、提取溶剂自来水(3000g)分别置于中药多功能提取罐内,混合均匀,并进行浸泡处理,其中浸泡时间为30min;人参、连翘分别与提取溶剂水的重量配比为1:10。
本发明人参、连翘水提取物的制备过程中,浸泡时间≥30min均适用于本发明,优先为30-60min;人参与提取溶剂水的重量配比除了为1:10之外,其他配比如1:8-12均适用于本发明。
2、第一次提取处理
浸泡30min后,开启多功能提取罐电源,加热,分别对人参、连翘药材进行第一次煎煮提取处理,在温度保持95℃下恒温提取1小时后过滤,得到第一次提取液和第一药渣;
3、第二次提取处理
向第一药渣中加入自来水,加热,分别对人参、连翘药材进行第二次煎煮提取处理,在温度保持90℃下恒温提取1小时后过滤,得到第二次提取液和第二滤渣;其中,人参与提取溶剂的重量配比为1:10。
4、第三次提取处理
向第二药渣中加入自来水,加热,分别对人参、连翘药材进行第三次煎煮提取处理,在温度保持90℃下恒温提取1小时后过滤,得到第三次提取液;其中,人参、连翘分别与提取溶剂的重量配比为1:10。
本发明实施例中人参、连翘水提取物进行第一、二、三次提取过程中人参药材与提取溶剂水的重量配比除了为1:10之外,其他配比如1:8-12均适用于本发明;提取温度90-100℃均适用于本发明,优选为90-95℃;加热提取时间0.5-2h均适用于本发明,优选为1h。
本发明实施例中人参、连翘水提取物制备过程中加热提取次数为3次,提取次数为2-3次均适用于本发明。
5、浓缩、干燥处理
将3次过滤得到的第一、二、三次提取液按2:98的重量比混合后置于旋转蒸发器中在温度80℃下进行蒸发浓缩处理,得到相对密度为1.1的浸膏,然后置于烘箱中于85℃下干燥至恒重,即得人参水提取物。
人参与连翘组合物水提取物为浅棕黄色粉末,有特殊气味,水溶性良好。
本发明的人参与连翘组合物水提取物的浓缩处理过程中,浓缩温度70-95℃、浓缩后的浸膏的相对密度为1.05-1.15适用于本发明;干燥温度70-95℃均适用于本发明。
实施例7人参总皂苷的制备
1、第一次提取处理:与实施例5相同。
2、第二次提取处理:与实施例5相同。
3、第三次提取处理:与实施例5相同。
4、浓缩处理
将3次过滤得到的第一、二、三次提取液合并后置于旋转蒸发器中在温度80℃下进行浓缩处理,得到人参浓缩液(120ml),相当于2.5g生药/ml的人参溶液。
本发明浓缩处理过程中人参浓缩液浓度除了每毫升浓缩液相当于2.5g生药之外,其他每毫升浓缩液相当于1-3.5g生药(即1-3.5g生药/ml)也适用于本发明。
5、大孔树脂柱层析
将人参浓缩液上样于大孔树脂柱上,进行大孔树脂柱分离处理,其中,大孔吸附树脂选择D101型大孔吸附树脂,树脂柱内树脂的体积(300ml)与人参重量(干重)之比为1:1(即如果人参干重1公斤,大孔树脂的体积是1L;如果药材干重1g,则大孔树脂的体积为1ml),待浓缩后的上清液完全流入树脂柱后,先用4倍柱体积的水洗涤,弃去洗脱液;接着用8倍柱体积的体积百分比浓度为50%的乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,得人参-大孔树脂洗脱液;
本发明人参浓缩液进行大孔树脂柱层析过程中人参提取液中人参的重量与大孔树脂体积之比为1:0.8-2.5均适用于本发明;大孔吸附树脂除了D101之外,其他X-5、AB-8、NK-2、NKA-2、NK-9、D3520、D101、WLD均适用于本发明;水洗脱过程中,水的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-4:1适用于本发明;洗脱剂为乙醇溶液时,乙醇溶液的体积百分比浓度除了50%之外,其他30%-50%均适用;乙醇溶液的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-4:1适用于本发明。
6、浓缩、干燥处理
将人参-大孔树脂洗脱液置于旋转蒸发器中在温度80℃下进行减压浓缩处理,回收溶剂,浓缩残留物置于干燥箱内于85℃下进行干燥处理,得人参总皂苷2.6g。
人参总皂苷为浅棕黄色粉末,有特殊气味。采用GB/T19506-2009附录B方法测量制得的人参总皂苷的含量,含有人参总皂苷32%。
本发明的人参-大孔树脂洗脱液的浓缩处理过程中,浓缩温度65-90℃均适用于本发明;干燥温度75-95℃均适用于本发明。采用本发明方法制备的人参总皂苷含量为20-50%。
实施例8人参二醇类皂苷的制备
1、第一次提取处理:与实施例5相同。
2、第二次提取处理:与实施例5相同。
3、第三次提取处理:与实施例5相同。
4、浓缩处理:与实施例5相同。
5、第一次大孔树脂柱层析
与实施例5相同,获得人参-大孔树脂第一洗脱液。
6、第二次大孔树脂柱层析
将人参-大孔树脂第一洗脱液置于旋转蒸发器中在温度80℃下进行浓缩处理,得到人参-大孔树脂第一浓缩液(60ml),相当于5.0g生药/ml的人参溶液;
将人参-大孔树脂第一浓缩液上样于大孔树脂柱上,进行大孔树脂柱分离处理,其中,大孔吸附树脂选择HPD-100型大孔吸附树脂,树脂柱内树脂的体积(300ml)与人参重量(干重)之比为1:1(即如果人参干重1公斤,大孔树脂的体积是1L;如果药材干重1g,则大孔树脂的体积为1ml),待浓缩后的上清液完全流入树脂柱后,先用4倍柱体积的体积百分比浓度为60%的乙醇溶液洗涤,弃去洗脱液;接着用8倍柱体积的体积百分比浓度为80%的乙醇溶液洗脱,收集洗脱液,得人参-大孔树脂第二洗脱液。
本发明浓缩处理过程中人参浓缩液浓度除了每毫升浓缩液相当于5.0g生药之外,其他每毫升浓缩液相当于3.5-6g生药(即3.5-6g生药/ml)也适用于本发明。
本发明人参-大孔树脂第一浓缩液进行大孔树脂柱层析过程中人参-大孔树脂第一浓缩液中人参的重量与大孔树脂体积之比为1:0.8-2.5均适用于本发明;大孔吸附树脂除了HPD-100之外,其他HPD-200、D203、XAD-4均适用于本发明;60%的乙醇溶液洗脱过程中,60%的乙醇溶液的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-4:1适用于本发明;80%的乙醇溶液洗脱过程中,80%的乙醇溶液的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-4:1适用于本发明。
7、浓缩、干燥处理
将人参-大孔树脂第二洗脱液置于旋转蒸发器中在温度80℃下进行减压浓缩处理,回收溶剂,浓缩残留物置于干燥箱内于85℃下进行干燥处理,得人参二醇类总皂苷0.7g。
人参二醇类皂苷为浅黄色粉末,有特殊气味。水溶性良好。采用2010年版中国药典一部附录Ⅵ高效液相色谱法测得制得的人参二醇类皂苷的含量,含有人参二醇类皂苷59%。
本发明的人参-大孔树脂洗脱液的浓缩处理过程中,浓缩温度65-95℃均适用于本发明;干燥温度70-95℃均适用于本发明。采用本发明方法制备的人参二醇类皂苷中人参二醇皂苷含量为30-70%。
实施例9连翘苷和连翘脂素组合物的制备
干燥的连翘叶1kg,加入95%(m/m)乙醇10kg,加热回流提取2次,每次2小时,过滤,滤液减压浓缩至原体积的1/2,于25℃放置1h,析出沉淀;再用甲醇溶解,进行重结晶,析出沉淀;重复上述方法用甲醇重结晶,得连翘苷/连翘脂素组合物无定形粉末,采用HPLC测定连翘苷、连翘脂素的含量,分别为98%、2%。
实施例10连翘苷和连翘脂素组合物的制备
干燥的连翘1kg,加入甲醇10kg,加热回流提取3次,每次4小时,过滤,滤液减压浓缩至原体积的1/10,于20℃放置48h,析出沉淀;再用乙醇溶解,进行重结晶,析出沉淀;重复上述方法用乙醇重结晶,得连翘苷/连翘脂素组合物无定形粉末,其所含连翘苷、连翘脂素的含量分别为95%、4%。
实施例11连翘苷和连翘脂素组合物的制备
干燥的连翘叶1kg,加入70%(m/m)甲醇10kg,加热回流提取3次,每次3小时,过滤,滤液减压浓缩至原体积的1/3,于室温放置2h,析出沉淀;再用90%甲醇溶解之,进行重结晶,析出沉淀;重复上述方法用甲醇重结晶,得连翘苷/连翘脂素组合物无定形粉末,其所含连翘苷、连翘脂素的含量分别为88%、2%。
实施例12连翘苷和连翘脂素组合物的制备
干燥的连翘1kg,加入无水乙醇10kg,加热回流提取2次,每次4小时,过滤,滤液减压浓缩至原体积的1/4,于室温放置24h,析出沉淀;再用丙酮溶解之,进行重结晶,析出沉淀;重复上述方法用丙酮重结晶,得连翘苷/连翘脂素组合物无定形粉末,其所含连翘苷、连翘脂素的含量分别为90%、6%。
实施例13连翘苷和连翘脂素组合物的制备
干燥的连翘叶子1kg,加入丙酮10kg,加热回流提取3次,每次3小时,过滤,滤液减压浓缩至原体积的1/5,于室温放置10h,析出沉淀;再用70%乙醇溶解之,进行重结晶,析出沉淀;重复上述方法用70%乙醇重结晶,得连翘苷/连翘脂素组合物无定形粉末,其所含连翘苷、连翘脂素的含量分别为80%、5%。
实施例14-18人参总皂苷-连翘苷和连翘脂素组合物的制备
取实施例7制备的人参总皂苷与实施例9-13连翘苷和连翘脂素组合物分别按2:98重量比混合,得到人参总皂苷与连翘苷类组合物。
实施例19-23人参二醇类皂苷-连翘苷和连翘脂素组合物的制备
取实施例8制备的人参二醇类皂苷与实施例9-13连翘苷和连翘脂素组合物分别按2:98重量比混合,得到人参总皂苷与连翘苷类组合物。
实施例24人参总皂苷-连翘苷组合物的制备
取实施例7制备的人参总皂苷与连翘苷按2:98重量比混合,得到人参总皂苷-连翘苷组合物。
实施例25人参二醇类皂苷-连翘苷组合物的制备
取实施例7制备的人参二醇类皂苷与连翘苷按2:98重量比混合,得到人参二醇类皂苷-连翘苷类组合物。
实施例26 20(R)-人参皂苷Rg3-连翘苷组合物的制备
取20(R)-人参皂苷Rg3与连翘苷按2:98重量比混合,得到20(R)-人参皂苷Rg3与连翘苷组合物。
实施例27-40人参-连翘组合物与环糊精的组合物的制备
取实施例5、6、14-26制备的人参与连翘的组合物,以表2所述重量比、按以下方法制备组合物:(1)直接加入到环糊精溶液中,或(2)直接加入到环糊精溶液中并充分搅拌1-24h、(3)直接加入到环糊精溶液中并加热10-120分钟、(4)直接加入到环糊精溶液中并超声10-120分钟、(5)直接与环糊精粉末研磨10-120分钟、(6)使人参与连翘的组合物与所述环糊精粉末混合均匀、过筛;(7)直接加入环糊精衍生物溶液中,或(8)直接加入到环糊精衍生物溶液中并充分搅拌1-24h、(9)直接加入到环糊精衍生物溶液中并加热10-120分钟、(10)直接加入到环糊精衍生物溶液中并超声10-120分钟、(11)直接与环糊精衍生物粉末研磨10-120分钟、(12)与环糊精衍生物粉末混合均匀、过筛。
表2实施例5、6、14-24的原料配比和制备方法
实施例27-40中的辅料以选用β-环糊精为例进行举例说明,其他环糊精、环糊精衍生物均适用于本发明,例如1)β-羟丙基环糊精、2)羟乙基-β-环糊精、3)2,6-二甲基-β-环糊精、4)2,3,6-三甲基-β-环糊精、5)2,6-二乙基-β-环糊精、6)2,3,6-三乙基-β-环糊精、7)麦芽糖基-β-环糊精、8)磺丁醚-β-环糊精、9)对甲基苯磺氯(p-TsCl)取代的β-环糊精、10)6-位取代的β-CD对甲基苯磺酸酯(β-环糊精-6-OTs)、11)2-氧羟丙基-β-环糊精、12)2-位单取代的对甲基苯磺酸酯(β-环糊精-2-OTs)、13)β-环糊精对甲基苯磺酸酯(Tosyl-β-CD)j,以及14)β-环糊精的星形大分子PCL-(Tos)7-β-CD。
实施例41人参-连翘的组合物片剂的制备
按照如下配比制备人参与连翘的组合物的片剂:
按上述配比,取实施例5、6、14-40中制备的人参与连翘的组合物与淀粉混合均匀后,制成颗粒,加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成10000片。
实施例42人参-连翘的组合物颗粒剂的制备
按照如下配比制备人参与连翘的组合物的颗粒剂:
人参与连翘的组合物(两者重量比为2:98) 100g
微晶纤维素 10000g
按上述配比,取实施例5、6、14-40中制备的人参与连翘的组合物与微晶纤维素混合均匀后,制成颗粒装袋,制成10000袋。
实施例43人参-连翘的组合物胶囊剂制备
按照如下配比制备人参与连翘的组合物的胶囊剂:
人参与连翘的组合物(两者重量比为2:98) 250g
淀粉 2500g
按上述配比,取实施例5、6、14-40中制备的人参与连翘的组合物与淀粉混合均匀后装胶囊,制成10000粒。
实施例44-47人参-连翘的组合物胶囊剂制备
人参与连翘的组合物组分按表3的重量比与淀粉混合均匀后装胶囊,各制成10000粒胶囊。
表3
表中原料,可为实施例5、6、14-40中的人参-连翘的组合物,以及以人参组分、连翘组分与环糊精组成的复合物。
实施例48-51人参-连翘的组合物颗粒剂制备
人参与连翘的组合物组分按表4的重量比与微晶纤维素混合均匀后,制成颗粒装袋,制成10000袋。
表4
表中原料,可替换为实施例5、6、14-40中的人参与连翘的组合物组合物,以及以人参组分、连翘组分与环糊精组成的复合物。
实施例52人参-连翘的组合物片剂制备
按照如下配比制备人参与连翘的组合物的片剂:
按上述配比,人参与连翘的组合物与上述提取物粉末混合均匀,再与淀粉混合均匀后制成颗粒,加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成10000片。其中,本实施例中的人参与连翘的组合物可替换为实施例5、6、14-40中的人参与连翘的组合物组合物,以及以人参组分、连翘组分与环糊精组成的复合物。
实施例53人参-连翘的组合物颗粒剂制备
按照如下配比制备人参与连翘的组合物的颗粒剂:
人参与连翘的组合物(两者重量比为2:98) 250g
甘草提取物 250g
微晶纤维素 24500g
按上述配比,人参与连翘的组合物与上述提取物粉末混合均匀,再与微晶纤维素混合均匀后制成颗粒装袋,制成10000袋。其中,本实施例中的人参与连翘的组合物可替换为实施例5、6、14-40中的人参与连翘的组合物组合物,以及以人参组分、连翘组分与环糊精组成的复合物。
实施例54人参-连翘的组合物胶囊剂制备
按照如下配比制备人参与连翘的组合物的胶囊剂:
按上述配比,人参与连翘的组合物与上述提取物粉末混合均匀,再与淀粉混合均匀后装胶囊,制成10000粒。其中,本实施例中的人参与连翘的组合物可替换为实施例5、6、14-40中的人参与连翘的组合物组合物,以及以人参组分、连翘组分与环糊精组成的复合物。
实施例54人参-连翘的组合物片剂制备
按照如下配比制备人参与连翘的组合物的片剂:
按上述配比,人参与连翘的组合物与上述提取物粉末混合均匀,再与淀粉混合均匀后制成颗粒,加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压,制成10000片。其中,本实施例中的人参与连翘的组合物可替换为实施例5、6、14-40制备的人参与连翘的组合物。
实施例55人参-连翘的组合物颗粒剂制备
按照如下配比制备人参与连翘的组合物的颗粒剂:
按上述配比,人参与连翘的组合物与上述提取物粉末混合均匀,再与微晶纤维素混合均匀后制成颗粒装袋,制成10000袋。其中,本实施例中的人参与连翘的组合物可替换为实施例5、6、14-40制备的人参与连翘的组合物。
实施例56人参-连翘的组合物胶囊剂制备
按照如下配比制备人参与连翘的组合物的胶囊剂:
按上述配比,人参与连翘的组合物与上述提取物粉末混合均匀,再与淀粉混合均匀后装胶囊,制成10000粒。其中,本实施例中的人参与连翘的组合物可替换为实施例5、6、14-40制备的人参与连翘的组合物。
试验例1人参-连翘的组合物抗病毒试验
1体外抗病毒试验
1.1试验材料
(1)药物
连翘苷(含量>98%),白色粉末,大连富生天然药物开发有限公司生产,经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定,其纯度为99.5%,并用中国药品生物制品含量测定用连翘苷对照品标定和确认其含量为99.5%。
20(R)-人参皂苷Rg3(含量>98%),白色粉末,大连富生天然药物开发有限公司生产,经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定,其纯度为99.0%;并用中国药品生物制品含量测定用人参皂苷Rg3对照品标定和确认其含量为99.1%。
人参与连翘的组合物:大连富生天然药物开发有限公司生产,分别用中国药品生物制品含量测定用对照品标定,确定其中人参皂苷Rg3与连翘苷的含量。
人参-连翘的组合物醇提取物(A;实施例5),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.15%、18.6%;
人参-连翘的组合物水提取物(B;实施例6),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.17%、17.7%;
人参总皂苷-连翘苷和连翘脂素组合物(C;实施例14),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.04%、95.6%;
人参二醇类皂苷-连翘苷和连翘脂素组合物(D;实施例19),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.12%、96.6%;
20(R)-人参皂苷Rg3-连翘苷组合物(E;实施例26),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为2.0%、96.6%。
利巴韦林注射液,无色透明液体,由河南润弘股份有限公司生产,产品批号:1206261,国药准字:H19993553,100mg/ml,作为本次试验阳性对照药物。
磷酸奥司他韦,中国药品生物制品检定所。产品批号:101096-200901,100mg/支作为本次试验阳性对照药物。
上述药品均用相应试剂溶解,滤过,除菌分装,4℃备用,为本次试验待测药物。
(2)细胞株:Vero(非洲绿猴肾细胞细胞)由吉林大学基础医学院保存细胞株。
(3)病毒株:①流感病毒株、副流感病毒株、呼吸道合胞病毒(RSV)株:购于中国预防医学科学院病毒研究所;②柯萨奇病毒B3(CVB3)株:来源于美国,为本教研室保存;③柯萨奇病毒A16(CoxA16)株、肠道病毒EV71株:由日本仙台国立医院馈赠,于本教研室保存;④腺病毒(AdV)来源于白求恩医科大学一院儿科研究室;⑤单纯疱疹病毒I型(HSV-1)购于***药品生物制品检定所。
(4)主要设备与试剂:
生物安全柜:BHC-1300ⅡA/B3,AIRTECH;CO2培养箱:MCO-18AIC,SANYO;倒置显微镜:CKX41,OLYMPUS;电子分析天平:AR1140/C,DHAUS;培养基:DMEM,HyClone;胎牛血清:HyClone;胰蛋白酶:Gibco;MTT:Sigma;DMSO:天津市北联精细化学品开发有限公司。
1.2试验方法
(1)细胞准备
Vero细胞传代培养1-2d,使之成片,界线清晰,立体感及折光度强时,用胰酶消化,待细胞面出现针尖样小孔,吸尽消化液,取数毫升培养液吹散细胞,计数,用培养液(含10%胎牛血清的DMEM)稀释至约5×107个/L后,接种于96孔培养板内,待细胞长成单层。
(2)药物毒性测定
细胞毒性试验:将药物按表1-1所示浓度进行稀释,用于细胞毒性测定。
表1-1药物稀释参照表(单位:g/L)
将上述用维持液(含2%胎牛血清的DMEM)稀释好的不同浓度的药品滴加于Vero单层细胞上,每孔0.2ml,每个浓度9个复孔,另设9孔正常对照(不加药物的正常对照组)和9孔空白对照(培养液),置37℃,5%CO2培养箱中培养,每日置倒置显微镜观察CPE并记录。72h后,每孔加入MTT溶液20μL(5mg·mL-1),继续孵育4h,吸弃各孔培养液,每孔加入100μLDMSO,振荡5min,492nm测定OD值,计算细胞存活率。在SPSS 18.0统计软件中,将细胞存活率进行Probit回归分析,计算药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC0)和半数毒性浓度(TC50)。
(3)各种病毒TCID50的测定
将各种病毒进行10倍递减稀释为10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度,按序接种于单层的Vero细胞96孔培养板上,每孔100μL,每个稀释度10孔,同时设正常细胞对照组。置37℃,5%CO2中孵育2h,弃病毒液,随即每孔加细胞维持液100μL,置37℃,5%CO2中培养。第3天开始在显微镜下观察细胞病变结果,第7-8天判定结果并做好记录,以能使50%细胞孔发生阳性病变的最高稀释度作为终点,用karber法计算病毒滴度。
d:稀释度系数(倍数)的对数;Σpi:每个稀释度病变百分数的总和。)
(4)药物对病毒致细胞病变作用的影响
取已长满单层细胞的培养板,吸弃培养液,以100TCID50对应的病毒攻击量接种细胞,37℃,5%CO2培养箱吸附2h,加入特定浓度(最大无毒浓度)的各药液,每浓度10个复孔培养,200μL/孔。设利巴韦林注射液和磷酸奥司他韦为阳性药物对照组,同时设正常对照组(不加病毒不加药)和病毒对照组(加病毒但不加药物的对照组),观察药物对病毒致CPE的影响。72h后,用MTT比色法,在492nm波长下测定OD值,计算药物抗病毒有效率(ER%)。在SPSS 18.0统计软件中用ANOVA法比较各药物抗病毒有效率之间的显著性差异。
ER%=(药物处理组平均OD值-病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值)×100%
1.3试验结果
(1)各种病毒的TCID50
(2)药物毒性测定
1)药物对细胞毒性的测定
各药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC0)、半数毒性浓度(TC50)及药物抗病毒实验用浓度见表1-2。
表1-2药物细胞毒性实验结果(单位:g/L)
2)药物对病毒致细胞病变保护作用结果
药物抗各种病毒的有效率及ANOVA法单因素方差分析结果,详见表1-3、1-4。
表1-3药物抗病毒有效率(ER%)统计表1
表1-4药物抗病毒有效率(ER%)统计表2
注:与病毒对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;人参-连翘的组合物各组与连翘苷相比,#P<0.05,##P<0.01;人参-连翘的组合物各组与人参皂苷Rg3相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01;人参-连翘的组合物各组与利巴韦林相比相比,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;人参-连翘的组合物各组与磷酸奥司他韦相比,●P<0.05,●●P<0.01,●●●P<0.001。
表1-3、1-4结果显示,人参-连翘的组合物各组对8种病毒均有明显抑制作用(P<0.01或P<0.001),对流感病毒、副流感病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-I)、肠道病毒EV71及腺病毒(ADV)抗病毒的有效率均达到100%,且疗效明显优于连翘苷、人参皂苷Rg3,表明人参-连翘的组合物各组具有协同增效作用。此外,人参-连翘的组合物各组抑制流感、柯萨奇病毒A16(CoxA16)、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-I)、腺病毒(ADV)、肠道病毒EV71及柯萨奇病毒B3(CVB3)的疗效明显优于阳性药利巴韦林(P<0.01或P<0.001),抑制流感、柯萨奇病毒A16(CoxA16)、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-I)、腺病毒(ADV)、肠道病毒EV71及柯萨奇病毒B3(CVB3)的疗效上明显优于磷酸奥司他韦(P<0.05,或P<0.01、P<0.001)。
2.体内抗病毒试验
2.1实验材料
(1)实验动物
昆明种小鼠由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供,医动字第10-5219号。
(2)检测仪器、试剂
2.2实验方法
(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定
将流感病毒和副流感病毒(细胞裂解液)10倍递比稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5浓度的病毒液。取昆明种小鼠120只,流感病毒和副流感病毒组各60只,分别随机分成6组,***轻度麻醉小鼠,滴鼻感染不同稀释度病毒液0.03mL/只。同时设空白对照,用生理盐水代替病毒悬液。以死亡和生存为观察指标,每天观察,直至感染后的14天。感染24h内死亡的为非特异死亡,不予统计,Karber法计算病毒液LD50。计算公式:[其中:LD50:半数致死量;XM:病毒最高浓度稀释度的对数;d:稀释度系数(倍数)的对数;Σpi:每个稀释度病变百分数的总和]。
(2)人参-连翘的组合物抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的研究
1)试验动物及分组
取四周龄的昆明小鼠540只,进行2项试验。
先取小鼠270只,随机分成27组,每组10只,用于人参-连翘的组合物对流感和副流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的测定试验;每次试验取小鼠90只,3次重复试验。另取小鼠270只,随机分成27组,每组10只,用于人参-连翘的组合物各组对肺悬液病毒血凝滴度的测定试验;每次试验取小鼠90只,3次重复试验。
2)感染方法
在200~300mL大小的烧杯内放入一团脱脂棉,然后倒入适量的***(使脱脂棉变湿即可),把装有脱脂棉的烧杯倒扣过来,把小鼠放入进行麻醉,见小鼠极度兴奋,明显呈无力样时,将小鼠仰卧,滴鼻感染15LD50流感病毒和副流感病毒0.03ml/鼻孔,正常对照组用生理盐水代替病毒悬液。
3)给药方法及给药剂量
人参-连翘的组合物各组、人参皂苷Rg3组、连翘苷组、利巴韦林和磷酸奥司他韦对照组,分别于感染前一天开始常规灌胃给药,人参-连翘的组合物各组分别分为高、中、低剂量组,给药剂量分别为13.0、6.5、3.25mg/kg,连翘苷组给药剂量为13mg/kg、人参皂苷Rg3组给药剂量为13mg/kg、利巴韦林阳性药给药剂量为58.5mg/kg、磷酸奥司他韦给药剂量为19.5mg/kg,每天一次,连续给药5d,正常对照组、病毒对照组灌服相同体积的生理盐水。
4)观察指标
①肺指数测定
小鼠用药后第5天,先禁食水8小时,称体重后摘眼球放血处死动物,打开胸腔摘出全肺,以生理盐水洗涤两次,用滤纸吸干表面水份,电子天平称肺重,按下列公式计算计算肺指数和肺指数抑制率:
肺指数=(小鼠肺重/小鼠体重)×100%
肺指数抑制率=(感染模型组平均肺指数-实验组平均肺指数)/感染模型组平均肺指数×100%
②肺悬液病毒血凝滴度测定
分别取治疗后第5天的各组小鼠肺,低温下置匀浆器研磨成匀浆,生理盐水稀释为10%的肺组织悬液,离心取上清,倍比稀释,按0.2ml/孔滴于滴定板上,每孔加入0.2ml 1%鸡红细胞悬液,混匀,置室温30min,观察记录血凝滴度。以红细胞凝集(++)时为終点,以悬液稀释倍数表示其滴度。
2.3试验结果及分析
(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定结果
试验组昆明种小鼠分别被滴鼻感染不同浓度流感病毒、副流感病毒液30μL,感染第3天前3组(病毒浓度为10-1组、10-2组、10-3组)小鼠均出现不同程度的发病症状:耸毛、发抖、饮食减少等;第5天小鼠出现走路摇摆不定;第6天最高病毒浓度组小鼠开始出现死亡,其余各组于感染后第7天陆续出现死亡现象。观察14天结束后,统计各组小鼠死亡数目,结果见下表1-4、1-5。计算该流感病毒的LD50为稀释度10-2.9,副流感病毒的LD50为稀释度10-2.5。
表1-4流感病毒半数致死量试验结果统计
Karber法计算病毒的LD50。流感病毒的LogLD50如下:
表1-5副流感病毒半数致死量试验结果统计
Karber法计算病毒的LD50。副流感病毒的LogLD50如下:
(2)人参与连翘的组合物抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的作用结果
①肺指数测定
流感病毒和副流感病毒感染小鼠后,平均肺指数结果显示:与感染模型组比较,正常对照组、连翘苷组13.0mg/kg/d、人参皂苷Rg3组16.0mg/kg/d、人参-连翘的组合物各组的3个剂量组(低剂量组3.25mg/kg/d、中剂量组6.5mg/kg/d、高剂量组13.0mg/kg/d)、利巴韦林组及磷酸奥司他韦组的肺指数明显降低(P<0.05或P<0.01);其中,人参-连翘的组合物各组在3.25~13.0mg/kg/d浓度范围内有明显保护作用,肺指数均明显降低、对肺组织病变指数的抑制率,其疗效明显优于优于与连翘苷组、人参皂苷Rg3组(P<0.01或P<0.05),结果见表1-6、1-7。
表1-6人参-连翘的组合物对流感病毒感染小鼠肺指数的抑制率(n=3)
各试验组病毒对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;人参与连翘的组合物与连翘苷比较,#P<0.05,##P<0.01;人参与连翘的组合物与人参皂苷Rg3比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01。
表1-7人参-连翘的组合物对副流感病毒感染小鼠肺指数的抑制率(n=3)
各试验组病毒对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;人参与连翘的组合物与连翘苷比较,#P<0.05,##P<0.01;人参与连翘的组合物与人参皂苷Rg3比较,▲P<0.05。
②肺悬液病毒血凝滴度测定
流感病毒和副流感病毒感染小鼠后,感染模型组肺组织病毒血凝滴度(InX)分别为32.40和33.11,不同浓度人参-连翘的组合物各组用药治疗5天后,肺组织病毒血凝滴度均有所下降,与感染模型组比较,差异有显著性(P<0.01),且它们的不同剂量组对流感、副流感病毒血凝滴度均明显低于连翘苷组、人参皂苷Rg3组(P<0.05~P<0.001),表明组合物具有协同增效作用,其对病毒繁殖的抑制率均明显高于连翘苷组、人参皂苷Rg3组(P<0.05~P<0.001)其中,人参-连翘的组合物各组的高、中、低剂量组对流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的抑制率均显著高于连翘苷组、人参皂苷Rg3组(P<0.01~P<0.001)。上述试验结果详见表1-8、1-9。
表1-8人参-连翘的组合物对流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响(n=3)
表1-9人参与连翘的组合物对副流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响(n=3)
表1-8和1-9中,各试验组病毒对照组比较,*P<0.05,**P<0.01;人参-连翘的组合物各组与连翘苷比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;人参-连翘的组合物各组与人参皂苷Rg3比较,▲P<0.05,▲▲P<0.01,▲▲▲P<0.001。
试验例2人参与连翘的组合物解热、抗炎试验
1.1试验材料
(1)试验动物Wistar大鼠,体重120~250g,雌雄兼用,合格证号:医动字第13-1225;日本大耳白兔,雄性,体重1.5~2.0kg。合格证号:医动字第10-5115,均由长春高新医学动物实验中心供给,动物饲料由吉林大学实验动物部供给。
(2)试验药品
连翘苷(含量>98%),白色粉末,大连富生天然药物开发有限公司生产,经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定,其纯度为99.5%,并用中国药品生物制品含量测定用连翘苷对照品标定和确认其含量为99.5%。
20(R)-人参皂苷Rg3(含量>98%),白色粉末,大连富生天然药物开发有限公司生产,经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定,其纯度为99.0%;并用中国药品生物制品含量测定用人参皂苷Rg3对照品标定和确认其含量为99.1%。
人参与连翘的组合物:大连富生天然药物开发有限公司生产,分别用中国药品生物制品含量测定用对照品标定,确定其中人参皂苷Rg3与连翘苷的含量。
人参-连翘的组合物醇提取物(A;实施例5),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.15%、18.6%;
人参-连翘的组合物水提取物(B;实施例6),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.17%、17.7%;
人参总皂苷-连翘苷和连翘脂素组合物(C;实施例14),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.04%、95.6%;
人参二醇类皂苷-连翘苷和连翘脂素组合物(D;实施例19),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.12%、96.6%;
20(R)-人参皂苷Rg3-连翘苷组合物(E;实施例26),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为2.0%、96.6%。
1.2主要仪器与试剂
YLS-7A大鼠足趾肿胀测量仪:山东省医学科学院设备站;722可见分光光度计:上海光谱仪器有限公司生产;便携式数字测温仪:型号WSC-411P,上海浦东三厂;毛果芸香碱:天津市人民制药厂,批号:20130112;组胺:上海生化所,批号:20130115;5-羟色胺:上海生化所,批号:20130623;伊文思蓝:上海化学试剂采购供应站,批号:20130217;扑尔敏片:长春经济开发区药业有限公司,批号:20130801;角叉菜胶:吉林省药物研究所,批号:20130502;扑热息痛片:辽源市百康药业有限责任公司,批号:20130512;阿司匹林片:白城万达药业有限公司,批号:20130305;啤酒酵母:北京奥博星生物技术责任有限公司,批号:2013020;伤寒、副伤寒疫苗:长春生物制品研究所,批号:20130216。
1.3统计处理
统计分析采用两样本比较的秩和检验、X2检验及t检验。
2.1人参与连翘的组合物对大鼠足跖部汗液分泌影响胡试验(着色法)
(1)材料与方法
本试验根据大鼠足跖部肉垫上有汗腺分布,其汗液分泌的多少可利用碘与淀粉遇汗液即可产生紫色反应的机理,观测汗液分泌的变化。
试验取Wistar大鼠500只,雌雄各半,体重120~150g。按体重、性别随机分为50组,即:对照(0.5%羧甲基纤维素)组,连翘苷组、人参皂苷Rg3组、人参-连翘的组合物各组的低、中、高剂量组(分别为2.5、5、10mg/kg)及阳性药毛果芸香碱(35mg/kg)组,每组10只,每次试验10组,共5个时间段的试验(1、5、10、15、20min)。将大鼠置入自制的大鼠固定袋内,暴露双后肢。用棉签蘸取无水乙醇将其右足跖部污物轻轻擦洗干净。除毛果芸香碱溶液皮下注射外,其余各组均采用灌胃方式给药。给药后1h(毛果芸香碱组于给药后30min),先将各组大鼠右足跖原有的和由于挣扎时所致的汗液用干棉签轻轻拭干,涂上和田-高垣氏试剂A液(取碘2g溶于100ml无水乙醇),待充分干燥后,再薄薄涂上和田-高垣氏试剂B液(取可溶性淀粉50g、蓖麻油100ml均匀混合)。分别于涂B液后1、5、10、15及20min用放大镜仔细观察深紫色着色点(即汗点)出现的颜色和数量。试验结束后,按两样本比较的秩和检验进行统计学处理,比较各组间的差异。
(2)结果
与对照组比较,人参-连翘的组合物各组的中、高剂量组(5、10mg/kg)于涂B液后10、15及20min对大鼠足跖部汗液分泌均有明显促进作用(p<0.05),人参-连翘的组合物各组的2.5mg/kg组于涂B液后15及20min对大鼠足跖部汗液分泌均有明显促进作用(p<0.05),它们的发汗作用与阳性药毛果芸香碱相当,且具有缓缓促进大鼠足跖部汗液分泌的作用特点。人参与连翘的组合物高剂量组于涂B液后10、15、20min后对大鼠足跖部汗液分泌的促进作用明显优于连翘苷和人参皂苷Rg3(p<0.05),人参-连翘的组合物各组中剂量组于涂B液后10、15min后对大鼠足跖部汗液分泌的促进作用明显优于连翘苷和人参皂苷Rg3(p<0.05),人参-连翘的组合物各组低剂量组于涂B液后15min后对大鼠足跖部汗液分泌的促进作用明显优于连翘苷和人参皂苷Rg3(p<0.05)。上述试验结果,表明人参-连翘的组合物各组促进大鼠足跖部汗液分泌的作用明显优于连翘苷和人参皂苷Rg3,详见2-1、2-2、2-3、2-4、2-5。
表2-1人参与连翘的组合物对正常大鼠足跖部汗液分泌的影响(着色法)
表2-2人参与连翘的组合物对正常大鼠足跖部汗液分泌的影响(着色法)
表2-3人参与连翘的组合物对正常大鼠足跖部汗液分泌的影响(着色法)
表2-4人参与连翘的组合物对正常大鼠足跖部汗液分泌的影响(着色法)
表2-5人参与连翘的组合物对正常大鼠足跖部汗液分泌的影响(着色法)
汗点等级评定标准:“-”大鼠足跖肉垫表面无汗点;“+”大鼠足跖肉垫表面偶见汗点,汗点面积约占足跖表面的10%以下;“++”大鼠足跖肉垫表面散在分布汗点,汗点面积约占足跖表面的11-40%;“+++”大鼠足跖肉垫表面多处分布汗点,汗点面积约占足跖表面的41-70%;“++++”大鼠足跖肉垫表面均匀分布汗点,汗点面积约占足跖表面的71%以上。
各试验组病毒对照组比较,*P<0.05;人参与连翘的组合物与连翘苷比较,#P<0.05;人参与连翘的组合物与人参皂苷Rg3比较,▲P<0.05。
2.2人参与连翘的组合物对大鼠足跖部汗液分泌的影响(组织形态观察法)
(1)材料与方法
本试验根据大鼠汗腺兴奋时,除汗液分泌增加外,汗腺上皮细胞内的形态也随之改变。光学显微镜下可见汗腺上皮细胞空胞数目增多、扩大。这种扩大的空泡在电子显微镜下则是汗腺上皮细胞内线粒体肿胀、破裂,融合和分泌小泡扩大,通过对大鼠足跖部汗腺上皮组织形态学观察,即可了解汗腺的分泌活动。
试验取Wistar大鼠300只,雌雄各半,体重120~160g。按体重、性别随机分为30组,即:对照组(0.5%羧甲基纤维素)人参皂苷Rg3、连翘苷、人参-连翘的组合物各组分别分为低、中、高(2.5、5、10mg/kg)剂量组及阳性药毛果芸香碱(35mg/kg)组,每组10只,每组试验3次。除毛果芸香碱溶液皮下注射给药外,其余各组均采用灌胃方式给药。对照组给予0.5%羧甲基纤维素1h后、阳性药组给予毛果芸香碱30min后,以及连翘苷、人参皂苷Rg3、人参与连翘的组合物均给药后1h,于齐踝关节处瞬时截断右后肢,随即取下右足跖部肉垫,置10%甲醛溶液中,按常规方法固定、脱水、包埋、切片、HE染色,光学显微镜下观察各组大鼠足跖部汗腺上皮细胞内变化,主要观察空泡发生率,并通过X2检验进行统计学处理,比较各组间的差异。上述试验重复3次。
空泡发生百分率=空泡汗腺数/观察汗腺数×100%
(2)结果
与对照组比较,人参-连翘的组合物各组的2.5、5、10mg/kg组对大鼠足跖部汗液分泌均有极显著的促进作用(p<0.001);其中,它们的低、中、高剂量组(2.5、5、10mg/kg)的疗效显著优于连翘苷及人参皂苷Rg3(p<0.001或p<0.01),表明人参与连翘的组合物具有协同增效作用。试验结果详见表2-6;
表2-6人参与连翘的组合物对大鼠足跖部汗液分泌的影响(组织形态观察法,n=3)
与对照组比较,**p<0.01,***p<0.001;人参-连翘的组合物各组与连翘苷比较,##p<0.01,###p<0.001;人参-连翘的组合物各组与人参皂苷Rg3比较,▲▲p<0.01,▲▲▲p<0.001;
2.3人参与连翘的组合物对啤酒酵母致大鼠发热的影响
(1)材料与方法
雄性Wistar大鼠,体重180~200g。试验前分别用WSC-411P型便携式数字测温仪测量正常肛温2次(每次间隔一定时间),取两次测量的平均值作为大鼠的正常体温。然后选体温在36.5~38℃的大鼠300只,按体重随机分为30组:模型组(0.5%羧甲基纤维素),人参-连翘的组合物各组分别分为低、中、高(2.5、5、10mg/kg)剂量组、连翘苷组(13mg/kg)、人参皂苷Rg3组(13mg/kg)及阳性药扑热息痛(100mg/kg)组,每组10只,每组重复试验3次。各组大鼠均背部皮下注射10%鲜啤酒酵母混悬液10mL/kg致热。给10%鲜啤酒酵母混悬液6.0h后,人参皂苷Rg3和连翘苷的组合物及扑热息痛均灌胃给药,模型组灌胃等体积0.5%羧甲基纤维素。分别于给药后1、2、3及4h测量肛温。观察体温变化情况,并通过解热百分率进行组间t检验处理,比较各组间的差异。上述试验共重复3次。
(2)结果
各组大鼠皮下注射10%鲜啤酒酵母混悬液6h后,体温升高均在1.5℃左右,与致热前比较差异显著(p<0.001),表明啤酒酵母致大鼠发热模型建立成功。与模型组比较,人参-连翘的组合物各组的中、高剂量组于药后1、2、3及4h,以及低剂量组于药后2、3及4h对啤酒酵母混悬液所致大鼠发热均有明显的降温作用(p<0.05~p<0.001);同时,人参-连翘的组合物各组的不同剂量组的降温疗效极显著优于连翘苷组、人参皂苷Rg3组(p<0.001或p<0.01),表明它们具有明显协同增效作用。上述试验结果见表2-7。
2.4人参与连翘的组合物对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀影响
(1)材料与方法
取体重120~150g的雄性Wistar大鼠220只,按体重随机分为22组,即:空白对照(0.5%羧甲基纤维素钠)组,人参-连翘的组合物各组分为低、中、高(2.5、5及10mg/kg)剂量组、连翘苷组、20(R)-人参皂苷Rg3组及阳性药阿司匹林(200mg/kg)组,每组10只。实验各组均采用舌下静脉注射方式给药。实验前用毛细管放大测量法测定各组大鼠右后足的正常体积。为避免误差,应固定测量位置,给药前后均由1人操作。取两次测量的平均值作为给药前大鼠右后足的正常体积。给药后立即在大鼠右后肢足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1ml致炎。测定致炎后15、30、60、120、180、240、300及360min的右后足跖体积。并通过大鼠致炎前后足跖体积的差值百分率(肿胀率)进行组间t检验处理,比较各组间的差异。
结果
与空白对照组比较,人参-连翘的组合物各组的高剂量组(10mg/kg)给药后于15min至360min内、中剂量组(5mg/kg)、低剂量组(2.5mg/kg)均于给药后30min至360min内均对角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀均有明显的抑制作用(p<0.05或p<0.01),其疗效明显优于连翘苷10mg/kg组及20(R)-人参皂苷Rg310mg/kg组(p<0.05或p<0.01),且上述组合物的各剂量组在给药后60min、240min的疗效皆极显著优于20(R)-人参皂苷Rg3组(p<0.01)。以上试验结果表明,人参-连翘的组合物各组中连翘苷与20(R)-人参皂苷Rg3组合使用具有明显的协同增效作用,详见表2-8。
试验例3人参与连翘的组合物对小鼠提高免疫功能作用的探讨
1实验材料
1.1药物与试剂
连翘苷(含量>98%),白色粉末,大连富生天然药物开发有限公司生产,经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定,其纯度为99.5%,并用中国药品生物制品含量测定用连翘苷对照品标定和确认其含量为99.5%。
20(R)-人参皂苷Rg3(含量>98%),白色粉末,大连富生天然药物开发有限公司生产,经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定,其纯度为99.0%;并用中国药品生物制品含量测定用人参皂苷Rg3对照品标定和确认其含量为99.1%。
人参与连翘的组合物:大连富生天然药物开发有限公司生产,分别用中国药品生物制品含量测定用对照品标定,确定其中人参皂苷Rg3与连翘苷的含量。
人参-连翘的组合物醇提取物(A;实施例5),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.15%、18.6%;
人参-连翘的组合物水提取物(B;实施例6),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.17%、17.7%;
人参总皂苷-连翘苷和连翘脂素组合物(C;实施例14),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.04%、95.6%;
人参二醇类皂苷-连翘苷和连翘脂素组合物(D;实施例19),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为0.12%、96.6%;
20(R)-人参皂苷Rg3-连翘苷组合物(E;实施例26),人参皂苷Rg3与连翘苷的含量分别为2.0%、96.6%。
阳性对照药:匹多莫德口服溶液(江苏吴中医药集团有限公司苏州制药厂,规格:10ml:400mg,批号2014091211);
1.2实验动物
昆明种小鼠,6-8W龄,体重18-22g,购自大连医科大学实验动物中心,质量合格证号:SCXK(13)2013-0003。
2实验方法
2.1分组及给药
取上述健康雄性小鼠152只,适应环境4d后按体重随机分成19组:阴性对照组,阳性药对照组,连翘苷组,20(R)-人参皂苷Rg3组,人参-连翘的组合物各组分为高、中、低剂量组。阳性对照组给匹多莫德(50mg/kg),连翘苷(144mg/kg),20(R)-人参皂苷Rg3(144mg/kg),人参-连翘的组合物各组低剂量组(36mg/kg),中剂量组(72mg/kg),高剂量组(144mg/kg),灌胃,各组每日给药1次,连续给药30d,阴性对照组给予同体积水。
2.2实验及实验结果
2.2.1 ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化试验
末次给药后1h,各组动物无菌取脾,制备脾细胞悬液。将脾细胞悬液稀释到3×106个/mL的浓度后,将分成2份,将每一份脾细胞悬液分别置两个24孔培养板中,每孔1mL,一孔加入75μL ConA液(a),另一孔作为对照(b),37℃培养72h。培养结束前4h加入噻唑兰(MTT)。培养结束后加入酸性异丙醇,充分混匀后在570nm处测定各溶液的吸光度值(ABS)。计算增殖力(增殖力=ABSa-ABSb)。受试样品各剂量组与阴性对照组进行比较。实验结果见表1。
2.2.2 NK细胞活性测定
末次给药后1h,各组动物无菌取脾,制备脾细胞悬液。用灭菌注射用水裂解红细胞后,加入1%冰醋酸稀释细胞悬液。调整脾细胞悬液的浓度为2×107个/mL后,加入96孔板中培养。每个动物分成:反应孔(脾细胞悬液和YAC-1细胞悬液100μL,效靶比为50:1);自然释放孔(YAC-1细胞悬液和培养液各100μL);最大释放孔(YAC-1细胞悬液和1%NP40各100μL)。以上各项均做3个平行管。96孔板在37℃,5%CO2培养箱中培养4h,加入LDH基质液和1moL/LHCl后,合并各平行孔的溶液,在490nm处测定吸光度(ABS)。计算NK细胞活性。NK细胞活性(%)=(ABS反应孔-ABS自然释放孔)/(ABS最大释放孔-ABS自然释放孔)。实验结果见表1。
表1人参与连翘的组合物对NK细胞活性以及ConA诱导淋巴细胞增殖能力的影响(x±s)
3试验结果
ConA刺激T淋巴细胞后使得母细胞发生增殖反应,其活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶将MTT分解为兰紫色结晶后,光密度值增大则表示细胞增强作用。由表1中可以看出,人参-连翘的组合物各组高、中、低剂量组的光密度差值均高于阴性对照组的光密度差值,表明该样品具有促进脾细胞增殖的作用。
NK细胞对细胞进行杀伤后,活细胞胞浆内的LDH释放到细胞外时,LDH可使乳酸锂脱氢,进而使NAD还原成NADH,NADH经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基-氯化四氮唑(INT),INT接受H+被还原成***甲臜类化合物,经酶标仪测定光密度值。由表1中可以看出,人参-连翘的组合物各组的高、中、低剂量组的NK细胞活性均明显高于阴性对照组,表明该样品具有提高NK细胞活性的作用。
上述试验结果表明:人参-连翘的组合物各组不同剂量均具有促进脾细胞增殖的作用和提高NK细胞活性的作用;而且人参-连翘组合使用,具有协同增效作用,具有显著促进脾细胞增殖的作用和显著提高NK细胞活性的作用,能显著提高免疫功能。
Claims (10)
1.用于抗病毒、解热、抗炎和/或提高免疫力的组合物,其包括人参组分和连翘组分。
2.权利要求1所述的组合物,其中,人参组分包括人参药材、人参提取物、人参总皂苷、人参二醇类皂苷、人参皂苷Rg3或20(R)-人参皂苷Rg3;连翘组分包括连翘(叶)药材、连翘(叶)提取物、连翘苷,进一步还包括连翘脂素。
3.权利要求1或2所述的组合物,提取物是醇提取物或水提取物。
4.权利要求1所述的组合物,其中,人参组分与连翘组分的重量份配比为2~98:98~2。
5.权利要求1所述的组合物,其还包括三七、芦荟、甘草、首乌、银杏、黑芝麻提取物、生姜提取物、葡萄子提取物、石榴子提取物、植物精油、熊果苷、维生素C及其衍生物或维生素E及其衍生物中的一种或多种。
6.用于抗病毒、解热、抗炎和/或提高免疫力的制剂,其包括权利要求1-5之一所述的组合物和药学上可接受的载体。
7.权利要求6所述的制剂,其中,权利要求1-5之一所述的组合物和药学上或保健品或食品中可接受的载体的重量之比为1:1~1:100;或者,药学上或保健品或食品中可接受的载体是环糊精,如α-、β-或γ-环糊精或其衍生物;或者,所述制剂是药物制剂,优选其以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在;或者所述制剂是保健食品,优选其以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在,或者以乳制品、糖果、饮料、饼干、茶叶及相关制品或酒等食品形式存在。
8.权利要求1-5之一所述的组合物的制备方法,其包括人参组分和连翘组分的混合步骤;或者,其包括人参与连翘以及任选的中药材采用溶剂加热提取的步骤。
9.权利要求6或7所述的制剂的制备方法,其包括权利要求1-5之一所述的组合物和药学上或保健品或食品中可接受的载体混合的步骤;优选地,其包括权利要求1-5之一所述的组合物与环糊精或其衍生物(如,α-、β-或γ-环糊精或其衍生物)混合的步骤,或者其包括其包括权利要求1-5之一所述的组合物与环糊精或其衍生物(如,α-、β-或γ-环糊精或其衍生物)经物理、化学方法处理形成复合物的步骤。
10.权利要求1-5之一所述的组合物在制备用于抗病毒、解热、抗炎和/或提高免疫力的药物或保健食品中的应用。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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