CN114174528A - 判别方法、荧光测定装置和检查剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够根据酶活性简便地判别牙周病的病原菌的基因型的判别方法、荧光测定装置和检查剂。判别方法判别牙周病的病原菌的基因型，向液体试样照射激发光，根据从液体试样发出的荧光的强度来判别基因型，其中，液体试样包含牙周病的病原菌的菌体或菌体提取物、和荧光标记病原菌的酶反应的底物而成的试剂，且被调整为pH7.0以上且pH8.5以下进行了酶反应。荧光测定装置具有：照射机构，向液体试样照射激发光；检测机构，检测从液体试样发出的荧光；判别机构，根据检测出的荧光的强度判别基因型。检查剂用于判别牙周病的病原菌的基因型，包含荧光标记病原菌的酶反应的底物而成的试剂和溶解试剂的pH缓冲液，pH缓冲液为pH7.0以上且pH8.5以下。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于判别牙周病的病原菌的基因型的判别方法、荧光测定装置和检查剂。
背景技术
在人体的口腔内，存在着几百种的口腔内细菌。这些口腔内细菌中的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、福赛坦氏菌(Tannerella forsythia)这3种被分类为与牙周病的相关性高的红色复合体(Redcomplex)。
牙周病是由口腔内细菌引起的炎症疾病，其不仅对牙周组织产生影响，而且被指出除了心肌梗塞、糖尿病等以外，还与动脉硬化等全身性疾病相关。以往，牙周病的诊断采用使用探针来检查牙周袋的深度或有无出血的探测检查、用于观察牙槽骨等的X射线检查等。另外，如专利文献1、2所记载的那样，还开发出一种用于检查病原菌的存在的体外诊断用的检查剂。
在细菌学、临床的领域中，认为在被分类为红色复合体的3种细菌之中，对牙周病的重症化、即牙槽骨吸收的进展产生重大影响的是牙龈卟啉单胞菌(Pg菌)。在Pg菌的菌体的表面具有菌毛，已知菌毛等菌体表面的成分与Pg菌在口腔内的黏附与定殖有很大相关。
作为编码Pg菌的菌毛蛋白的基因，有编码菌毛蛋白的亚基的fimA基因。已确认fimA基因表现出基因多态性，且被分类为I～V型(1～5型)的5种。以往，已报道了Pg菌在口腔内的黏附能力与定殖能力或致病性有可能会按fimA基因的基因型而不同。
例如，在非专利文献1中报道了，具有健康的牙周组织的成人的fimA基因的I型的保有率为约70％，V型的保有率为约30％，其他的小于10％左右，另一方面，成人的牙周炎患者的II型(2型)的保有率为约小于60％，IV型(4型)的保有率为约小于20％，其他的小于10％左右。报道了从进展后的牙周炎患者检测到的Pg菌的90％以上为II型。
[现有技术文件]
[专利文献]
专利文献1：日本发明专利公开公报特开2010-130924号
专利文献2：日本发明专利公开公报特表2007-519923号[非专利文献]
非专利文献1：天野敦雄，“Porphyromonas gingivalis菌毛的黏附能力与基因多态性的牙周致病性的关系”，日本牙周病学会会刊，2003年，45卷，4号，p.357-363
发明内容
[发明所要解决的技术问题]
存在如下启示，即，牙周病的病原菌的基因型有可能如Pg菌的fimA基因那样，对牙周病的病理产生相互不同的影响。据此，在对牙周病进行诊断、治疗与预防时，如果能够判别构成患者的口腔菌群的基因型，就有可能能够适当地评价牙周病的病理或者预测重症化的可能性。
以往，作为判别基因型的方法，采用利用RT-PCR等的分子生物学的方法。但是，分子生物学的方法在操作上费时费力，难以简便地实施。另外，分子生物学的方法一方面能够间接地测量基因的拷贝数或细胞数，但另一方面，无法测量实际使牙周病进展的酶活性。
被分类为红色复合体的Pg菌产生作为一种蛋白酶的牙龈素等，这些酶会引起如菌群失调这样的菌群紊乱，或者会促进炎症反应，从而认为其会使牙周病进展。因此，需要一种与以往的分子生物学的方法相比能够简便地进行，更切合牙周病的病理的、根据直接的指标来进行判别的基因型的判别手段。
因此，本发明的目的在于，提供一种能够根据酶活性来简便地判别牙周病的病原菌的基因型的判别方法、荧光测定装置和检查剂。
[用于解决技术问题的技术方案]
为了解决所述技术问題，本发明所涉及的判别方法为判别牙周病的病原菌的基因型的判别方法，向液体试样照射激发光，根据从所述液体试样发出的荧光的强度来判别所述基因型，其中，所述液体试样包含牙周病的病原菌和荧光标记所述病原菌的酶反应的底物而成的试剂，且被调整为pH7.0以上且pH8.5以下进行了酶反应。
另外，本发明所涉及的荧光测定装置为判别牙周病的病原菌的基因型的荧光测定装置，其具有照射机构、检测机构和判别机构，其中，所述照射机构用于向液体试样照射激发光，所述液体试样包含牙周病的病原菌和荧光标记所述病原菌的酶反应的底物而成的试剂，且被调整为pH7.0以上且pH8.5以下进行了酶反应；所述检测机构用于检测从所述液体试样发出的荧光；所述判别机构根据检测出的荧光的强度来判别所述基因型。
另外，本发明所涉及的检查剂为判别牙周病的病原菌的基因型的检查剂，其包含试剂和pH缓冲液，其中，所述试剂为荧光标记所述病原菌的酶反应的底物而成；所述pH缓冲液溶解所述试剂，所述pH缓冲液为pH7.0以上且pH8.5以下。
[发明效果]
根据本发明，能够提供一种根据酶活性来简便地判别牙周病的病原菌的基因型的判别方法、荧光测定装置和检查剂。
附图说明
图1是表示本发明的实施方式所涉及的判别方法的流程的流程图。
图2A是表示使菌体酶反应而成的液体试样(pH7.0)的荧光测定结果的图。
图2B是表示使菌体酶反应而成的液体试样(pH7.5)的荧光测定结果的图。
图2C是表示使菌体酶反应而成的液体试样(pH8.0)的荧光测定结果的图。
图2D是表示使菌体酶反应而成的液体试样(pH8.5)的荧光测定结果的图。
图2E是表示使性质与牙龈素类似的酶以改变温度的方式酶反应而成的液体试样的荧光测定结果的图。
图3A是表示使菌体酶反应而成的液体试样的按pH值的荧光测定结果的图。
图3B是表示使菌体酶反应而成的液体试样的按菌株的荧光测定结果的图。
图4A是表示使菌体提取物酶反应而成的液体试样(pH7.0)的荧光测定结果的图。
图4B是表示使菌体提取物酶反应而成的液体试样(pH7.5)的荧光测定结果的图。
图4C是表示使菌体提取物酶反应而成的液体试样(pH8.0)的荧光测定结果的图。
图4D是表示使菌体提取物酶反应而成的液体试样(pH8.5)的荧光测定结果的图。
图5是表示使菌体提取物酶反应而成的液体试样的按pH值的荧光测定结果的图。
图6A是表示使菌体以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH7.0)的荧光测定结果的图。
图6B是表示使菌体以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH7.5)的荧光测定结果的图。
图6C是表示使菌体以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH7.8)的荧光测定结果的图。
图6D是表示使菌体以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH8.0)的荧光测定结果的图。
图6E是表示使菌体以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH8.5)的荧光测定结果的图。
图7A是表示使菌体提取物以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH7.0)的荧光测定结果的图。
图7B是表示使菌体提取物以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH7.5)的荧光测定结果的图。
图7C是表示使菌体提取物以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH7.8)的荧光测定结果的图。
图7D是表示使菌体提取物以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH8.0)的荧光测定结果的图。
图7E是表示使菌体提取物以改变温度的方式酶反应而成的液体试样(pH8.5)的荧光测定结果的图。
图8是说明使用菌体来判别牙周病的病原菌的基因型的原理的图。
图9是说明使用菌体提取物来判别牙周病的病原菌的基因型的原理的图。
图10是表示本发明的实施方式所涉及的荧光测定装置的结构的图。
图11是表示荧光测定装置所具有的控制装置的概略结构的图。
图12是表示由荧光测定装置实现的判别方法的流程的流程图。
图13是表示由荧光测定装置实现的判别基因型的处理的流程的流程图。
具体实施方式
<判别方法与检查剂>
首先，一边参照附图一边说明本发明的一实施方式所涉及的判别方法和检查剂。
本实施方式所涉及的判别方法为判别牙周病的病原菌的基因型的方法。在该判别方法中，判别所采集的试样中的牙周病的病原菌在已知的基因多态性之中属于哪种基因型。基因型的判别根据已确认与各基因型的相关关系的酶活性来进行。酶活性通过使用检查剂，利用荧光测定法来进行评价，其中，所述检查剂使用了荧光标记后的酶反应的底物。
作为基因型的判别对象的牙周病的病原菌，可列举出牙龈卟啉单胞菌(Pg菌)。作为判别的基因型，可列举出作为多态性的编码菌毛蛋白的fimA基因的I型(1型)、II型(2型)、III型(3型)、IV型(4型)、V型(5型)。作为fimA基因的亚型的Ib型属于I型。
在本实施方式所涉及的判别方法中，向包含荧光标记后的酶反应的底物(荧光标记底物)的液态的检查剂添加基因型未知的牙周病的病原菌的菌体或者其菌体提取物(待测物)，制备荧光测定用的液体试样。荧光标记底物为牙周病的病原菌所产生的分解酶的底物，通过酶反应解离荧光发色团。由于解离后的荧光发色团在被照射激发光时会发出荧光，因此从液体试样发出的荧光的强度成为酶活性的指标。
在待测物的酶活性与基因型存在相关关系的情况下，能够根据通过荧光测定求得的酶活性，将待测物分类为基因型的某一种。如果在使按基因型的酶活性的差异变得明确这样的条件下，使其酶反应，则从液体试样发出的荧光的强度差会变大，因此能够明确地判别待测物的基因型。
为了判别基因型，用于制备荧光测定用的液体试样的待测物为基因型未知的牙周病的病原菌的菌体或者其菌体提取物。作为待测物，例如可以直接使用从受试者的口腔采集到的牙垢、牙龈浸出液等，或者也可以将其作为悬浊液或悬浊液的上清来使用。一般而言，在人体等的口腔菌群中，牙周病的病原菌的某一基因型以优势的状态存在。因此，从某一受试者所采集的待测菌可以被分类为处于优势的状态的某一种基因型。
荧光测定用的液体试样可以通过在包含荧光标记底物的液态的检查剂中添加牙垢、牙龈浸出液等所含的菌体来制备，也可以通过添加从菌体提取的菌体提取物来制备。此外，菌体提取物只要包含与荧光标记底物反应的分解酶即可，其可以包含对菌体进行细胞破坏处理等而从残渣分离出的提取物、以及菌体向细胞外分泌/产生的分泌物中的任一种。
图1是表示本发明的实施方式所涉及的判别方法的流程的流程图。
如图1所示，本实施方式所涉及的判别方法包括酶反应工序S10、荧光测定工序S20和基因型判别工序S30。
在酶反应工序S10中，向含有荧光标记底物(试剂)和pH缓冲液的液态的检查剂中添加基因型未知的牙周病的病原菌的菌体、或者其菌体提取物(待测物)，使酶反应开始。荧光标记底物为由荧光发色团荧光标记牙周病的病原菌的酶反应的底物而成的物质。添加待测物而开始酶反应的液态的检查剂成为荧光测定法的测定对象的液体试样。
作为荧光标记底物，优选使用多肽的C末端为L-精氨酸(Arg)残基，在Arg残基的C末端键合有荧光发色团而成的物质。根据这样的荧光标记底物，由于Arg残基的C末端能够被Pg菌所产生的作为一种蛋白酶的牙龈素特异性消化，因此能够评价Pg菌的酶活性。
荧光标记底物只要能够被牙周病的病原菌所产生的蛋白酶识别即可，其可以具有适当的氨基酸序列。构成荧光标记底物的多肽可以由任意数量的氨基酸构成，也可以由任意种类的氨基酸构成。但是，从使酶反应、荧光测定稳定的观点等考虑，优选多肽的长度为3～4mer。
荧光标记底物的多肽的N末端可以被保护基团保护。作为保护基团，可列举出异丁氧基羰基(iBoc)、叔丁氧基羰基(Boc)、乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等。
优选荧光标记底物键合有氨基甲基香豆素(AMC)作为荧光发色团。根据AMC，在酰胺键合的状态下不发出荧光，仅在解离的状态下才发出荧光，能够获得高辉度的荧光。因此，可以通过高灵敏度的荧光测定来评价酶活性。
尤其优选使用保护基团-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(Gly-Gly-Arg-MCA)作为荧光标记底物。根据这样的荧光标记底物，容易被Pg菌所产生的牙龈素识别，通过AMC能够获得适于测量的高辉度。因此，能够更准确地评价Pg菌的酶活性。
优选荧光测定对象的液体试样为以三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)和2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪基]乙磺酸(HEPES)中的任一种作为主要成分的pH缓冲液。根据这样的pH缓冲液，由于能够维持在适于Pg菌所产生的牙龈素的pH值，因此能够准确地评价Pg菌的酶活性。
尤其优选荧光测定对象的液体试样为以三羟基甲基氨基甲烷(Tris)作为主要成分的pH缓冲液。作为以Tris作为主要成分的pH缓冲液的具体例，可列举出Tris-盐酸缓冲液、Tris-乙酸缓冲液、Tris-硼酸缓冲液、Tris-磷酸缓冲液等。根据以Tris作为主要成分的pH缓冲液，能够更准确地评价Pg菌的酶活性。
在荧光测定工序S20中，向液体试样照射激发光，对从液体试样发出的荧光的强度进行测定。液体试样为包含基因型未知的牙周病的病原菌的菌体、或者其菌体提取物(待测物)和荧光标记牙周病的病原菌的酶反应的底物而成的荧光标记底物(试剂)的溶液。荧光标记底物在牙周病的病原菌所产生的分解酶的酶反应下解离荧光发色团，因此，当照射规定波段的激发光时会发出荧光。因此，当进行荧光测定时，能够检测与待测菌的酶活性和反应时间相应的荧光强度。
向液体试样照射的激发光的波长优选为350nm以上且380nm以下，更优选为355nm以上且375nm以下，进一步优选为360nm以上且370nm以下。根据这样的波长，在构成荧光标记底物的荧光发色团为AMC的情况下，能够获得适于检测的荧光强度。
测定荧光强度的荧光的波长优选为410nm以上且475nm以下，更优选为425nm以上且465nm以下，进一步优选为430nm以上且455nm以下，尤其优选为435nm以上且450nm以下。根据这样的波长，在构成荧光标记底物的荧光发色团为AMC的情况下，能够高灵敏度地检测荧光。
此外，优选在向包含荧光标记底物的液态的检查剂中添加待测物之后，且在荧光标记底物通过酶反应完全地分解/解离之前来进行针对液体试样的荧光的检测。另外，优选在荧光因荧光寿命而衰减之前来进行针对液体试样的荧光的检测。
在基因型判别工序S30中，根据从照射激发光后的液体试样发出的荧光的强度，判别基因型未知的牙周病的病原菌(待测菌)的基因型。通过荧光测定所检测的荧光强度值间接地表示酶反应的反应率，即发生了反应的底物的比率。另外，荧光强度的经时变化量间接地表示酶的反应速度。因此，在牙周病的病原菌的酶活性与基因型存在相关关系的情况下，能够根据关于这些荧光强度的指标值来判别基因型。
在此，一边参照附图一边说明用于判别牙周病的病原菌的基因型的具体的原理与方法。
图2是表示使菌体酶反应而成的液体试样的荧光测定结果的图。图2A是在pH7.0下使其酶反应而获得的结果。图2B是在pH7.5下使其酶反应而获得的结果。图2C是在pH8.0下使其酶反应而获得的结果。图2D是在pH8.5下使其酶反应而获得的结果。图2E是表示使性质与牙龈素类似的酶以改变温度的方式酶反应而成的液体试样的荧光测定结果的图。
在图2A～图2D中，示出对Pg菌的细胞悬浊液进行离心分离而采集沉淀物，并且将添加了包含该菌体的沉淀物的液体试样调整为各pH条件，在37.5℃下使其酶反应，之后，使用荧光测定装置测定荧光强度而获得的结果。在图2E中，示出对使添加了性质与牙龈素类似的胰蛋白酶的液体试样的温度在23～45℃的范围内变化时的荧光强度进行测定而获得的结果。
图2A～图2D的横轴表示从酶反应的开始时刻起算的测定时间[分钟]，纵轴表示规定单位的荧光强度。图中的粗线为fimA基因的基因型是I型的Pg菌的结果，细线为II型的Pg菌的结果，虚线为IV型的Pg菌的结果。图中的辅助线表示荧光测定装置上的中继(切换)时期。
使用异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)作为荧光标记底物。液体试样的按基因型的样品数为3。
如图2A～图2D所示，能够获得荧光强度按fimA基因的基因型而不同的结果。各测定时间的荧光强度值表现出以下倾向，即，IV型比I型高，II型比IV型高。尤其，在调整为pH8.0、pH8.5的情况下，荧光强度值的按基因型的差异扩大。可知酶活性按牙周病的病原菌的基因型而不同，该酶活性依赖于pH。
根据图2A～图2D所示的结果可以说，对于向包含荧光标记底物的液体试样中添加菌体的方法而言，当在调整为大于pH7.5且pH8.5以下的液体试样中使其酶反应时，II型、IV型的荧光强度变高，基因型的判别精度提高。
图2E的横轴表示添加了胰蛋白酶的液体试样的温度[℃]，纵轴表示荧光强度的每1分钟的时间变化量。荧光强度的时间变化量是在酶反应开始之后经过10分钟的时间点进行荧光测定，并将其结果换算为每1分钟的变化量而获得的值。图中的标绘点分别是液体试样的温度在23℃、30℃、37℃、45℃下的平均值，误差条为它们的最大值和最小值。
使用异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)作为荧光标记底物。液体试样的按温度的样品数为3。
如图2E所示，能够确认性质与牙龈素类似的胰蛋白酶表现出温度依赖性。荧光强度的时间变化量在23℃至37℃的范围内表现出增加，另一方面，在37℃附近至45℃的范围内表现出急剧的现象。根据使用胰蛋白酶的结果，可知分解荧光标记底物的分解酶的最佳温度为37℃左右。
根据图2E所示的结果可以说，依据性质与牙龈素类似的胰蛋白酶的性质，当在调温至25℃以上且40℃以下左右，尤其调温至37±1℃左右的液体试样中使其酶反应时，由酶反应引起的荧光强度的变化变大，基因型的判别精度提高。
图3A是表示使菌体酶反应而成的液体试样的按pH的荧光测定结果的图。
在图3A中，示出对fimA基因的基因型为II型的Pg菌的细胞悬浊液进行离心分离而采集沉淀物，并且将添加了包含该菌体的沉淀物的液体试样调整为各pH条件，在37.5℃下使其酶反应，之后，使用荧光测定装置测定荧光强度而获得的结果。
图中的横轴表示从酶反应的开始时刻起算的测定时间[分钟]，纵轴表示规定单位的荧光强度。图中的粗虚线为pH7.0的结果，单点划线为pH7.5的结果，中虚线为pH7.8的结果，细虚线为pH7.9的结果，粗实线为pH8.0的结果，细实线为pH8.5的结果。
使用异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)作为荧光标记底物。液体试样的按pH的样品数为3。
如图3A所示，能够获得荧光强度根据液体试样的pH而不同的结果。各测定时间的荧光强度值、初始的荧光强度的时间变化量表现出以下倾向，即，与pH7.0相比，在pH7.8～8.5较高。可知pH7.9、pH8.0表现出尤其高的荧光强度值，并且在pH8.0附近存在极大值。
根据图3A所示的结果可以说，对于向包含荧光标记底物的液体试样中添加菌体的方法而言，当在调整为pH7.8以上且pH8.5以下，尤其调整为pH7.8以上且pH8.0以下左右的液体试样中使其酶反应时，荧光强度进一步变高，基因型的判别精度进一步提高。
图3B是表示使菌体酶反应而成的液体试样的按菌株的荧光测定结果的图。
在图3B中，示出对菌株的种类不同的各Pg菌的细胞悬浊液进行离心分离而采集沉淀物，并且将添加了包含该菌体的沉淀物的液体试样调整为规定的pH条件，在37.5℃下使其酶反应，之后，使用荧光测定装置测定荧光强度而获得的结果。
图中的横轴表示从酶反应的开始时刻起算的测定时间[分钟]，纵轴表示规定单位的荧光强度。图中的长虚线为fimA基因的基因型是I型的33277株的结果，单点划线为II型的TDC60株的结果，短虚线为IV型的W83株的结果，粗实线为II型的275株的结果，细实线为II型的268株的结果。275株和268株为从牙龈边缘下的牙垢离析而获得的分离株(参照Hiroyuki Asano et al.,Journal of Periodontology,2003,Vol.74,9,p.1355-1360)。
使用异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)作为荧光标记底物。液体试样的按菌株的样品数为1。
如图3B所示，能够获得荧光强度根据fimA基因的基因型而不同的结果。但是，针对fimA基因的基因型为II型的TDC60株、275株和268株，尽管菌株的种类不同，但显示出各测定时间的荧光强度值、荧光强度的时间变化量类似的倾向。
根据图3B所示的结果，可以说虽然Pg菌产生的分解酶的酶活性按牙周病的病原菌的基因型而不同，但是在作为同一基因型的菌株彼此之间类似，因此能够根据使用了任意的菌株的荧光强度的结果来进行基因型的判别。
图4是表示使菌体提取物酶反应而成的液体试样的荧光测定结果的图。图4A是在pH7.0下使其酶反应而获得的结果。图4B是在pH7.5下使其酶反应而获得的结果。图4C是在pH8.0下使其酶反应而获得的结果。图4D是在pH8.5下使其酶反应而获得的结果。
在图4A～图4D中，示出对Pg菌的细胞悬浊液进行离心分离而采集上清，并且将添加了作为该菌体提取物的上清的液体试样调整为各pH条件，在37.5℃下使其酶反应，之后，使用荧光测定装置测定荧光强度而获得的结果。
图4A～图4D的横轴表示从酶反应的开始时刻起算的测定时间[分钟]，纵轴表示规定单位的荧光强度。图中的粗线是fimA基因的基因型为I型的Pg菌的结果，细线为II型的Pg菌的结果，虚线为IV型的Pg菌的结果。
使用异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)作为荧光标记底物。液体试样的按基因型的样品数为3。
如图4A～图4D所示，能够获得荧光强度按fimA基因的基因型而不同的结果。各测定时间的荧光强度值表现出以下倾向，即，IV型比II型高，I型比IV型高。荧光强度的时间变化量也表现出相同的倾向。尤其，在调整为pH8.0、pH8.5的情况下，荧光强度值按基因型的差异扩大。可知酶活性按牙周病的病原菌的基因型而不同，该酶活性依赖于pH。
根据图4A～图4D所示的结果可以说，对于向包含荧光标记底物的液体试样中添加菌体提取物的方法而言，当在调整为对于大于pH7.5且pH8.5以下的液体试样中使其酶反应时，I型的荧光强度变高，基因型的判别精度提高。另外，可以说，当在调整为pH8.0附近的液体试样中使其酶反应时，I型、IV型的荧光强度变高，基因型的判别精度提高。
图5是表示使菌体提取物酶反应而成的液体试样的按pH的荧光测定结果的图。
在图5中，示出对fimA基因的基因型为I型的Pg菌的细胞悬浊液进行离心分离而采集上清，并且将添加了作为该菌体提取物的上清的液体试样调整为各pH条件，在37.5℃下使其酶反应，之后，使用荧光测定装置测定荧光强度而获得的结果。
图中的横轴表示从酶反应的开始时刻起算的测定时间[分钟]，纵轴表示规定单位的荧光强度。图中的粗虚线为pH7.0的结果，单点划线为pH7.5的结果，虚线为pH7.8的结果，粗实线为pH8.0的结果，细实线为pH8.5的结果。
使用异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)作为荧光标记底物。液体试样的按pH的样品数为3。
如图5所示，能够获得荧光强度根据液体试样的pH而不同的结果。各测定时间的荧光强度值、荧光强度的时间变化量表现出以下倾向，即，与pH7.0相比，在pH8.0～8.5较高。可知pH8.0表现出尤其大的时间变化量，并且在从pH8.0附近或pH8.0以上存在极大值。
根据图5所示的结果可以说，对于向包含荧光标记底物的液体试样中添加菌体提取物的方法而言，当在调整为pH8.0以上且pH8.5以下的液体试样中使其酶反应时，荧光强度进一步变高，基因型的判别精度进一步提高。
图6是表示使菌体以改变温度的方式酶反应而成的液体试样的荧光测定结果的图。图6A是在pH7.0下使其酶反应而获得的结果。图6B是在pH7.5下使其酶反应而获得的结果。图6C是在pH7.8下使其酶反应而获得的结果。图6D是在pH8.0下使其酶反应而获得的结果。图6E是在pH8.5下使其酶反应而获得的结果。
在图6A～图6E中，示出对各基因型的Pg菌的细胞悬浊液进行离心分离而采集沉淀物，并且将添加了包含该菌体的沉淀物的液体试样调整为各pH条件，在各温度条件下使其酶反应，之后，使用荧光测定装置测定荧光强度而获得的结果。
图6A～图6E的横轴表示液体试样的温度[℃]，纵轴表示荧光强度的每1分钟的时间变化量。荧光强度的时间变化量是在酶反应开始之后进行荧光测定，并将其结果换算为每1分钟的变化量而获得的值。图中的●的标绘点是fimA基因的基因型为I型的33277株的结果，■的标绘点为II型的TDC60株的结果，▲的标绘点为IV型的W83株的结果。
使用异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)作为荧光标记底物。液体试样的按每株的样品数为3。
如图6A所示，在pH7.0的情况下，按基因型的时间变化量值在4～15℃、45℃下表现出彼此相同程度的值。另一方面，在22～37.5℃下，I型和IV型的时间变化量值表现出彼此相同程度的值，但II型的时间变化量值比I型、IV型高。
如图6B所示，在pH7.5的情况下，按基因型的时间变化量值在4～15℃、37.5～45℃下表现出彼此相同程度的值。在22～30℃下，II型和IV型的时间变化量值比I型略高，但时间变化量值的差异不够大。
如图6C所示，在pH7.8的情况下，I型的时间变化量值表现出与4～15℃、45℃相比，在22～37.5℃下较高的倾向。IV型的时间变化量值在4～45℃下表现出大于I型的倾向，尤其，在4℃、30℃下表现出明显高于I型的值。II型的时间变化量值在4～45℃下表现出明显高于I型、IV型的值。
如图6D所示，在pH8.0的情况下，I型的时间变化量值表现出与4～30℃相比，在37.5～45℃下较低的倾向。IV型的时间变化量值在4～45℃下表现出大于I型的倾向，尤其，在15～37.5℃下表现出明显高于I型的值。II型的时间变化量值在4～45℃下表现出明显高于I型、IV型的值，在22℃下表现出显著高的极大值。
如图6E所示，在pH8.5的情况下，I型的时间变化量值表现出与4～22℃相比，在30～45℃下较低的倾向。IV型的时间变化量值在4～37.5℃下表现出大于I型的倾向，尤其，在15～37.5℃下表现出明显高于I型的值。II型的时间变化量值在4～45℃下表现出明显高于I型、IV型的值，在15～37.5℃下表现出显著高于I型、IV型的值。
根据图6A～图6E所示的结果可以说，关于包载酶的菌体，当在调整为大于pH7.5且pH8.5以下，并且调整为4～45℃的液体试样中使其酶反应时，II型的荧光强度比I型、IV型高，II型与I型、IV型的判别精度提高。另外，可以说，当在调整为大于pH7.8且pH8.5以下，并且调整为15～37.5℃的液体试样中使其酶反应时，IV型的荧光强度比I型高，IV型与I型、II型的基因型的判别精度提高。可以说在15～37.5℃下，能够高精度地进行I型、II型和V型的相互的判别。
图7是表示使菌体提取物以改变温度的方式酶反应而成的液体试样的荧光测定结果的图。图7A是在pH7.0下使其酶反应而获得的结果。图7B是在pH7.5下使其酶反应而获得的结果。图7C是在pH7.8下使其酶反应而获得的结果。图7D是在pH8.0下使其酶反应而获得的结果。图7E是在pH8.5下使其酶反应而获得的结果。
在图7A～图7E中，示出对各基因型的Pg菌的细胞悬浊液进行离心分离而采集上清，并且将添加了作为该菌体提取物的上清的液体试样调整为各pH条件，在各温度条件下使其酶反应，之后，使用荧光测定装置测定荧光强度而获得的结果。
图7A～图7E的横轴表示液体试样的温度[℃]，纵轴表示荧光强度的每1分钟的时间变化量。荧光强度的时间变化量是在酶反应开始之后进行荧光测定，并将其结换算为每1分钟的变化量而获得的值。图中的●的标绘点是fimA基因的基因型为I型的33277株的结果，■的标绘点为II型的TDC60株的结果，▲的标绘点为IV型的W83株的结果。
使用异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)作为荧光标记底物。液体试样的按每株的样品数为3。
如图7A所示，在pH7.0的情况下，按基因型的时间变化量值在4～22℃、37.5℃下表现出彼此相同程度的值。另一方面，在30℃、45℃下，IV型和II型的时间变化量值表现出彼此相同程度的值，但I型的时间变化量值比IV型、II型高。
如图7B所示，在pH7.5的情况下，IV型的时间变化量值在22～37.5℃下表现出大于II型的倾向，尤其，在30℃下表现出明显高于II型的值。I型的时间变化量值在15～45℃下表现出明显高于IV型、II型的值。
如图7C所示，在pH7.8的情况下，II型的时间变化量值表现出与4℃、45℃相比，在15～37.5℃下较高的倾向。IV型的时间变化量值在22～37.5℃下表现出大于II型的倾向，尤其，在37.5℃下表现出明显高于II型的值。I型的时间变化量值在15～45℃下表现出明显高于IV型、II型的值，在30～37.5℃下显著高于IV型、II型。
如图7D所示，在pH8.0的情况下，II型的时间变化量值表现出与4～37.5℃相比，在45℃下较低的倾向。IV型的时间变化量值在22～37.5℃下表现出大于II型的倾向，尤其，在30～37.5℃下表现出明显高于II型的值。I型的时间变化量值在15～37.5℃下表现出明显高于IV型、II型的值，在22～37.5℃下显著高于IV型、II型。
如图7E所示，在pH8.5的情况下，II型和IV型的时间变化量值在4～45℃下表现出彼此相同程度的值。I型的时间变化量值在4～45℃下表现出明显高于IV型、II型的值，在37.5℃下尤其比IV型、II型高。
根据图7A～图7E所示的结果可以说，关于酶产生的菌体提取物，当在调整为大于pH7.5且pH8.5以下，并且调整为15～45℃的液体试样中使其酶反应时，I型的荧光强度比IV型、II型高，I型与IV型、II型的判别精度提高。另外，可以说，当在调整为pH7.5以上且pH8.0以下，并且调整为30～37.5℃的液体试样中使其酶反应时，IV型的荧光强度比II型高，IV型与I型、II型的基因型的判别精度提高。
图8是说明使用菌体来判别牙周病的病原菌的基因型的原理的图。
图8的横轴表示从酶反应的开始时刻起算的时间，纵轴表示荧光强度。图中的单点划线示出包含基因型未知的牙周病的病原菌的菌体(待测物)的液体试样的荧光强度的具体例。
另外，图中的粗实线示出由基因型为I型的Pg菌所获得的荧光强度的代表值的具体例，细实线示出由基因型为II型的Pg菌所获得的荧光强度的代表值的具体例，虚线示出由基因型为IV型的Pg菌所获得的荧光强度的代表值的具体例。
如图8所示，当对包含基因型已知的牙周病的病原菌的菌体的液体试样进行荧光测定时，在牙周病的病原菌的酶活性或酶的细胞外产生能力、分泌能力等根据基因型而不同的情况下，检测出按基因型而不同的荧光强度。当对基因型已知的多个液体试样进行荧光测定，并对其结果进行回归分析等时，如图中曲线(I型线、II型线、IV型线)所示，能够获得每个基因型的测定值组的代表值。荧光强度的测定值表示在距各曲线(I型线、II型线、IV型线)规定距离的范围内分散的分布，形成按基因型划分而成的测定值组(聚类)(参照图中的阴影区域)。
另一方面，当对包含基因型未知的牙周病的病原菌的菌体的液体试样进行荧光测定时，如图中单点划线所示，能够获得接近于某一基因型的代表值的曲线(I型线、II型线、IV型线)的测定结果。在图8中，示出接近于II型线的测定结果。从受试者采集到的待测物为某一基因型为优势的状态，酶活性或酶的细胞外产生能力、分泌能力的程度与某一基因型的上述能力相类似，因此能够获得这样的测定结果。
因此，若在酶反应开始之后经过了规定的反应时间时(例如，时间T1)，对液体试样的荧光强度进行测定，按相同的反应时间比较包含基因型未知的牙周病的病原菌的菌体的液体试样的荧光强度值(例如，荧光强度I0)与包含基因型已知的牙周病的病原菌的菌体的液体试样的荧光强度值(例如，荧光强度I2、I4或图中的阴影区域的边界线)，则能够判别待测物的基因型。
在这样的判别法的情况下，在进行包含基因型未知的待测物的试验区与包含基因型已知的牙周病的病原菌的菌体的对照区的比较时，虽然需要使酶反应的反应条件、荧光测定的测定***一致，但通过单纯地比较荧光强度值就能够判别基因型。
或者，若在酶反应开始之后，按规定的时间间隔而随着时间经过(例如，时间T1附近的微小区间)来测定液体试样的荧光强度，求得作为荧光强度的时间微分的经时变化量(斜率)，比较包含基因型未知的牙周病的病原菌的菌体的液体试样的荧光强度的经时变化量(例如，在T1-I0的交点的切线的斜率)与包含基因型已知的牙周病的病原菌的菌体的液体试样的荧光强度的经时变化量(例如，在T1-I2的交点的切线的斜率、在T1-I4的交点的切线的斜率或图中的阴影区域的边界线的切线的斜率)，则能够判别待测物的基因型。
在这样的判别法的情况下，虽然需要计算经时变化量(斜率)，但不一定需要使其酶反应的反应时间一致，并且，荧光测定的结果不易产生测定***误差，因此能够进行准确的比较。此外，荧光强度的经时变化量(斜率)可以按相同的反应时间进行比较，也可以在酶反应中的最大值彼此间进行比较。
图9是说明使用菌体提取物来判别牙周病的病原菌的基因型的原理的图。
图9的横轴表示从酶反应的开始时刻起算的时间，纵轴表示荧光强度。图中的单点划线示出包含从基因型未知的牙周病的病原菌所提取的菌体提取物(待测物)的液体试样的荧光强度的具体例。
另外，图中的粗实线示出由基因型为II型的Pg菌所获得的荧光强度的代表值的具体例，细实线示出由基因型为I型的Pg菌所获得的荧光强度的代表值的具体例，虚线示出由基因型为IV型的Pg菌所获得的荧光强度的代表值的具体例。
如图9所示，当对包含从基因型已知的牙周病的病原菌提取出的菌体提取物的液体试样进行荧光测定时，在牙周病的病原菌的酶活性根据基因型而不同的情况下，与使用菌体的情况(参照图8)相同，检测出按基因型而不同的荧光强度。但是，在使用菌体提取物的情况下，由于酶的细胞外产生能力、分泌能力等的影响变小，因此，每个基因型的荧光强度的测定值表现出与使用菌体的情况不同的倾向。
另一方面，当对包含从基因型未知的牙周病的病原菌提取出的菌体提取物的液体试样进行荧光测定时，如图中单点划线所示，能够获得接近于某一基因型的代表值的曲线(I型线、II型线、IV型线)的测定结果。在使用菌体提取物的情况下，I型的荧光强度与II型的荧光强度相对于使用菌体的情况成为相反的关系，因此，荧光强度的测定值越小则越接近于II型的曲线，荧光强度的测定值越大则越接近于I型的曲线。
因此，与使用菌体的情况(参照图8)相同，在使用菌体提取物的情况下，若在酶反应开始之后经过了规定的反应时间时(例如，时间T1)，对液体试样的荧光强度进行测定，按相同的反应时间比较包含从基因型未知的牙周病的病原菌提取出的菌体提取物的液体试样的荧光强度值(例如，荧光强度I0)与包含从基因型已知的牙周病的病原菌提取出的菌体提取物的液体试样的荧光强度值(例如，荧光强度I2、I4或图中的阴影区域的边界线)，则能够判别待测物的基因型。
另外，若在酶反应开始之后按规定的时间间隔而随着时间的经过(例如，时间T1附近的微小区间)来测定液体试样的荧光强度，求得作为荧光强度的时间微分的经时变化量(斜率)，比较包含从基因型未知的牙周病的病原菌提取出的菌体提取物的液体试样的荧光强度的经时变化量(例如，在T1-I0的交点的切线的斜率)与包含从基因型已知的牙周病的病原菌提取出的菌体提取物的液体试样的荧光强度的经时变化量(例如，在T1-I2的交点的切线的斜率、在T1-I4的交点的切线的斜率或图中的阴影区域的边界线的切线的斜率)，则能够判别待测物的基因型。
例如，基因型判别工序S30中的基因型的判别能够通过以下的方法来进行：制备试验区的液体试样和对照区的液体试样，将试验区的液体试样的荧光测定结果与对照区的液体试样的荧光测定结果相互进行比较，其中，试验区的液体试样由包含基因型未知的牙周病的病原菌或其菌体提取物(待测物)的液体试样构成，对照区的液体试样由包含基因型已知的牙周病的病原菌或其菌体提取物的液体试样构成。此外，将试验区的液体试样与对照区的液体试样的pH值、温度、牙周病的病原菌或菌体提取物的待测量、荧光标记底物的浓度等调整为彼此实质上相同的条件并且使其酶反应，之后，取得荧光测定结果用于进行判别。
对照区可以由1个以上的任意数量的液体试样构成，但优选由多个液体试样构成。对照区可以包含以下液体试样：包含基因型已知的牙周病的病原菌或其菌体提取物的液体试样，以及包含基因型未知的牙周病的病原菌或其菌体提取物的液体试样。但是，从可靠地判别基因型的观点考虑，优选对照区仅由包含基因型已知的牙周病的病原菌或其菌体提取物的液体试样构成。
对照区可以包含一种基因型的菌体或其菌体提取物作为基因型已知的牙周病的病原菌或其菌体提取物，也可以包含多种基因型的菌体或其菌体提取物来作为基因型已知的牙周病的病原菌或其菌体提取物。例如，在对照区仅包含I型的情况下，可以判别待测菌是否为I型。在对照区包含I～V型的情况下，可以判别待测物为哪种基因型。
可以使用事先由荧光测定法判别了基因型的菌株的菌体或其菌体提取物、通常能够通过分售等取得的保藏株/分离株的菌体或其菌体提取物等，作为基因型已知的牙周病的病原菌或其菌体提取物，来准备对照区。
作为保藏株/分离株的具体例，可列举出fimA基因为I型的ATCC_33277株、ATCC_BAA-1703(FDC381)株、II型的JCM_19600(TDC60)株、275株(HG184株)、268株、III型的ATCC_49417(RB22D-1)株、IV型的ATCC_BAA-308(W83)株、ATCC_53978(W50)株、V型的HNA99株等。
优选在荧光测定之前，将荧光测定对象的液体试样调整为大于pH7.5且pH8.5以下来使其酶反应。液体试样的pH值优选为pH7.8以上。另外，液体试样的pH值优选为pH8.4以下，更优选为pH8.3以下，进一步优选为pH8.2以下，更进一步优选为pH8.1以下。若调整为这样的pH值，则能够更准确地判别Pg菌的fimA基因的基因型。
优选荧光测定对象的液体试样在调整为规定的温度的恒温控制下来进行荧光测定。液体试样的温度优选为4℃以上且45℃以下。在使用菌体提取物的情况下，优选液体试样的温度为25℃以上，更优选为30℃以上，进一步优选为34℃以上，更进一步优选为36℃以上。另外，优选为40℃以下，更优选为39℃以下，进一步优选为38℃以下。另一方面，在使用菌体的情况下，优选液体试样的温度为4℃以上，更优选为10℃以上，进一步优选为15℃以上，更进一步优选为18℃以上，再进一步优选为21℃以上。另外，优选为37℃以下，更优选为30℃以下，进一步优选为26℃以下，更进一步优选为23℃以下。若控制在这样温度，则能够准确地判别Pg菌的fimA基因的基因型。
具体而言，试验区的荧光测定结果与对照区的荧光测定荧光结果的比较可以通过以下这样来进行，即，对测定试验区而获得的包含基因型未知的牙周病的病原菌或者菌体提取物(待测物)的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与测定对照区而获得的包含基因型已知的牙周病的病原菌或者菌体提取物的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量进行比较。在进行比较时，对荧光强度值彼此或荧光强度的经时变化量彼此进行比较。
对试验区的荧光测定结果与对照区的荧光测定结果进行比较的结果，当测定试验区而获得的包含基因型未知的牙周病的病原菌或者菌体提取物(待测物)的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与测定对照区而获得的包含基因型已知的牙周病的病原菌或者菌体提取物的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量彼此相同或者近似时，可以判定为试验区中的该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因与对照区中的该液体试样的基因型已知的牙周病的病原菌的fimA基因为相同的基因型。
另一方面，对试验区的荧光测定结果与对照区的荧光测定结果进行比较的结果，当测定试验区而获得的包含基因型未知的牙周病的病原菌或者菌体提取物(待测物)的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与测定对照区而获得的包含基因型已知的牙周病的病原菌或菌体提取物的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量不相同且不近似时，可以判定为试验区中的该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因与对照区中的该液体试样的基因型已知的牙周病的病原菌的fimA基因为不同的基因型。
试验区的荧光测定结果与对照区的荧光测定结果的比较例如可以通过测定值本身的比较或平均值等代表值的比较来进行。例如，对测定试验区而获得的测定值与测定对照区而获得的平均值等代表值进行比较，当试验区的测定值与对照区的代表值之差相对于对照区的代表值在±30％的范围内时，可以判断为该荧光测定结果彼此近似。
或者，基因型判别工序S30中的基因型的判别也能够通过以下的方法来进行：制备由包含了判别对象的液体试样的多个液体试样组成的试样组，并且对试样组中的液体试样的荧光测定结果相互进行比较，其中，所述判别对象的液体试样包含基因型未知的牙周病的病原菌或菌体提取物(待测物)。此外，将判别对象的液体试样与除此以外的液体试样的pH值、温度、牙周病的病原菌或菌体提取物的待测量、荧光标记底物的浓度等调整为彼此实质上相同的条件并且使其酶反应，之后，取得荧光测定结果并将其用于判别。
试样组可以由2个以上的任意数量的液体试样构成，但优选由多个液体试样构成。试样组只要包含以下判别对象的液体试样即可，该判别对象的液体试样包含基因型未知的牙周病的病原菌或菌体提取物(待测物)，试样组可以仅由包含基因型未知的牙周病的病原菌或菌体提取物的液体试样构成，也可以由包含基因型未知的牙周病的病原菌或菌体提取物的液体试样与包含基因型已知的牙周病的病原菌或菌体提取物的液体试样的组合构成。
优选试样组包含多个基因型的菌株或菌体提取物来作为基因型已知的牙周病的病原菌或菌体提取物。例如，在对照区包含I～V型的情况下，荧光测定结果产生荧光强度的时间变化的倾向按基因型而不同的5种测定值组(聚类)。因此，关于待测物的荧光测定结果，通过判定与这些测定值组的类似度，能够判别待测物为哪种基因型。
优选在荧光测定之前，将荧光测定对象的液体试样调整为大于pH7.5且pH8.5以下来使其酶反应。液体试样的pH值优选为pH7.8以上。另外，液体试样的pH值优选为pH8.4以下，更优选为pH8.3以下，进一步优选为pH8.2以下，更进一步优选为pH8.1以下。若调整为这样的pH值，则能够更准确地判别Pg菌的fimA基因的基因型。
优选荧光测定对象的液体试样在调整为规定的温度的恒温控制下来进行荧光测定。液体试样的温度优选为4℃以上且45℃以下。在使用菌体提取物的情况下，液体试样的温度优选为25℃以上，更优选为30℃以上，进一步优选为34℃以上，更进一步优选为36℃以上。另外，优选为40℃以下，更优选为39℃以下，进一步优选为38℃以下。另一方面，在使用菌体的情况下，液体试样的温度优选为4℃以上，更优选为10℃以上，进一步优选为15℃以上，更进一步优选为18℃以上，再进一步优选为21℃以上。另外，优选为37℃以下，更优选为30℃以下，进一步优选为26℃以下，更进一步优选为23℃以下。若控制为这样的温度，则能够准确地判别Pg菌的fimA基因的基因型。
具体而言，试样组中的荧光测定结果的比较可以通过以下这样来进行，即，对试样组中的包含基因型未知的牙周病的病原菌或者菌体提取物(待测物)的判别对象的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与获得的试样组中的多个液体试样的荧光强度值或者荧光强度的经时变化量的测定值组进行比较。在进行比较时，对荧光强度值彼此或荧光强度的经时变化量彼此进行比较。
在将菌体用于制备液体试样的情况下，对试样组中的荧光测定结果(测定值组)进行比较的结果，当测定试样组中的基因型未知的判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量，被分类为测定试样组中的多个液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量的测定值组中排在前面第一位的测定值组时，可以判定为该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为II型。另一方面，在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，可以判定为被分类为排在前面第一位的测定值组的该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为I型。
如图8中点的阴影、图9中斑点的阴影所示，排在前面第一位的测定值组成为所有基因型中荧光强度的最大值被分类的测定值组。同样，关于荧光强度的经时变化量(斜率)，排在前面第一位的测定值组也成为最大值被分类的测定值组。因此，在将菌体用于制备液体试样，且试样组中包含II型和I型或IV型的情况下，排在前面第一位的测定值组成为II型。另一方面，在将菌体提取物用于制备液体试样，且试样组中包含I型和IV型或II型的情况下，排在前面第一位的测定值组成为I型。
另外，在将菌体用于制备液体试样的情况下、或将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，与试样组中的荧光测定结果(测定值组)进行比较的结果，当测定试样组中的基因型未知的判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量，被分类为测定试样组中的多个液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量的测定值组中排在前面第二位的测定值组时，可以判定为该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为IV型。
如图8、图9中斜线的阴影所示，排在前面第二位的测定值组成为在所有基因型中仅在荧光强度的最大值被分类的测定值组之下的测定值组。同样，关于荧光强度的经时变化量(斜率)，排在前面第二位的测定值组也成为仅在最大值被分类的测定值组之下的测定值组。因此，在将菌体用于制备液体试样，且试样组中包含II型和IV型或I型的情况下，排在前面第二位的测定值组成为IV型。另外，在将菌体提取物用于制备液体试样，且试样组中包含I型和IV型或II型的情况下，排在前面第二位的测定值组成为IV型。
另外，在将菌体用于制备液体试样的情况下，与试样组中的荧光测定结果(测定值组)进行比较的结果，当测定试样组中的基因型未知的判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量，被分类为测定试样组中的多个液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量的测定值组中排在最后的测定值组时，可以判定为该液体试样的牙周病的病原菌(待测菌)的fimA基因为I型。另一方面，在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，可以判定为被分类为排在最后的测定值组的该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为II型。
如图8中斑点的阴影、图9中点的阴影所示，排在最后的测定值组成为在所有基因型中，荧光强度的最小值被分类的测定值组。同样，关于荧光强度的经时变化量(斜率)，排在最后的测定值组也成为最小值被分类的测定值组。因此，在将菌体用于制备液体试样，且试样组中包含I型和II型或IV型的情况下，排在最后的测定值组成为I型。另一方面，在将菌体提取物用于制备液体试样，且试样组中包含II型和IV型或I型的情况下，排在最后的测定值组成为II型。
试样组中的荧光测定结果的比较例如可以根据通过测定获得的结果彼此的类似度来进行。例如，对测定试验区而获得的测定值与测定对照区而获得的测定值进行比较，当试验区的测定值相对于对照区的测定值组在预先设定的规定的类似度的范围内时，可以评价为该荧光测定结果彼此近似。
对照区的测定值组可以在预先按基因型分类(聚类)的状态下与试验区的测定值进行比较。按基因型的分类可以使用将每个基因型的测定值按规定的阈值进行分类的方法、沃德法、类平均法、最长距离法、最短距离法等各种的计算方法。荧光测定结果的比较可以使用欧几里得距离等各种数学上的距离来进行。
根据以上的本实施方式所涉及的判别方法，在牙周病的病原菌的酶活性与牙周病的病原菌的基因型存在相关关系的情况下，能够根据通过荧光测定法求得的酶活性，来判别牙周病的病原菌的基因型。与以往的通常的分子生物学的方法不同，由于在判别中反映了使牙周病进展的酶活性，因此能够进行更切合实际的病理的基因型的判别。另外，在将菌体用于制备液体试样的情况下，可以将从受试者的口腔采集到的试样直接用于荧光测定用的液体试样，因此能够简便地进行基因型的判别。
尤其，在将菌体用于制备液体试样的情况下，若在荧光测定之前，调整为大于pH7.5且pH8.5以下而使其酶反应，则II型或IV型的荧光强度变高，因此能够提高与II型或IV型以外的基因型进行的判别的精度。另外，在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，若在荧光测定之前，调整为pH7.5以上且pH8.0以下而使其酶反应，则IV型或I型的荧光强度变高，因此能够提高与IV型或I型以外的基因型进行的判别的精度。可以预先将用于判别牙周病的病原菌的基因型的检查剂调整为像这样的pH值。I型的Pg菌在具有健康的牙周组织的成人中的保有率较高，另一方面，II型或IV型的Pg菌在成人的牙周炎患者中的保有率较高，因此能够更准确地判断牙周病目前的病理、重症化的可能性。
另外，制备液体试样也可以使用牙垢、牙龈浸出液等中所包含的菌体和从菌体提取出的菌体提取物中的任一种。可以确认酶活性相对于温度条件的行为表现出按基因型且按待测物的形态而不同的倾向。在菌体内包载酶等的囊泡(vesicle)从菌体的游离性或菌体对其的保持力有可能会按基因型而不同。但是，通过按待测物的形态来调整酶反应的条件，能够进行高精度的判别。
<荧光测定装置>
接下来，一边参照附图一边说明本发明的一实施方式所涉及的荧光测定装置。
图10是表示本发明的实施方式所涉及的荧光测定装置的结构的图。
如图10所示，本实施方式所涉及的荧光测定装置100具有光源(照射机构)1、试样架2、光学透镜3a、3b、滤波器4、检测元件(检测机构)5、放大器6、模拟处理器7、A/D转换器8、控制装置(判别机构)9、试样容器10、输入机构11、显示机构12、pH测定机构13、温度测定机构14和调温装置15。
本实施方式所涉及的荧光测定装置100为能够判别牙周病的病原菌的基因型的荧光测定装置。在该荧光测定装置100中，判别液体试样Sa所包含的牙周病的病原菌或其菌体提取物(待测物)在已知的多态性基因中属于哪种基因型。基因型的判别根据已确认与各基因型的相关关系的酶活性来进行。酶活性可以通过使用检查剂，利用荧光测定法来进行评价，其中，所述检查剂使用了荧光标记后的酶反应的底物。
作为成为基因型的判别对象的牙周病的病原菌(待测菌)，与所述的实施方式所涉及的判别方法同样地，可列举出牙龈卟啉单胞菌(Pg菌)。作为判别的基因型，可列举出作为多态性的fimA基因的I型(1型)、II型(2型)、III型(3型)、IV型(4型)、V型(5型)。
作为待测菌，与所述的实施方式所涉及的判别方法同样地，可以直接使用从受试者的口腔采集到的牙垢、牙龈浸出液等，或者也可以将其作为悬浊液、悬浊液的上清来使用。作为荧光测定对象的液体试样，可以使用液体试样Sa，该液体试样Sa包含牙周病的病原菌或其菌体提取物和荧光标记牙周病的病原菌的酶反应的底物而成的荧光标记底物(试剂)。
光源1为用于产生激发光的装置。当在液体试样Sa中由牙周病的病原菌引起酶反应时，荧光发色团从荧光标记底物解离。当向液体试样Sa照射由光源1所产生的激发光时，从液体试样Sa发出由荧光发色团所发出的荧光。
作为光源1，优选使用特定的激发波长被单色化的单色光源，例如发光二极管(light emitting diode：LED)、激光光源等。但是，作为光源1，也可以与分光器等光学***一起具有氙灯、汞灯、卤素灯等其他的光源。
光源1所发出的激发光优选在350nm以上且380nm以下的波长具有最大峰值，更优选在355nm以上且375nm以下的波长具有最大峰值，进一步优选在360nm以上且370nm以下的波长具有最大峰值。若为这样的谱图，则在构成荧光标记底物的荧光发色团为AMC的情况下，能够获得适于检测的荧光强度。
试样架2设置于未图示的测定室内，将试样容器10支承为能够照射激发光和射出荧光的状态。在进行荧光测定时，装有液体试样Sa的试样容器10被固定于试样架2。从侧方向被试样架2支承的试样容器10照射激发光。
检测元件5为用于检测由液体试样Sa所发出的荧光的装置。从液体试样Sa发出的荧光从试样容器10射出，并通过光学透镜3a到达滤波器4。滤波器4将噪音、低灵敏度的波段去除，仅使特定波段的荧光透过。透过滤波器4后的荧光通过光学透镜3b向检测元件5射入，从而转换为电信号。
可以使用光电二极管、光电管、光电倍增管等各种检测元件作为检测元件5。可以使用光学滤波器、分色镜等作为滤波器4。优选透过410nm以上且475nm以下的波长，屏蔽除此以外的波长的滤波器作为滤波器4。若为这样的特性，则在构成荧光标记底物的荧光发色团为AMC的情况下，能够高灵敏度地检测荧光。
由检测元件5转换得到的荧光的电信号被放大器6放大之后，通过具有低通滤波器等的模拟处理器7被实施去除噪音处理等。之后，荧光的电信号被A/D转换器8转换为数字信号，并被输入至控制装置9。
优选在荧光测定之前，将荧光测定对象的液体试样Sa调整为大于pH7.5且pH8.5以下来使其酶反应。优选液体试样的pH值为pH7.8以上。另外，优选液体试样的pH值为pH8.4以下，更优选为pH8.3以下，进一步优选为pH8.2以下，更进一步优选为pH8.1以下。若调整为这样的pH值，则能够更准确地判别Pg菌的fimA基因的基因型。
液体试样Sa的pH值可以通过pH测定机构13来进行测定。例如可以将玻璃电极式、膜电极式等pH计***试样容器10中使用来作为pH测定机构13。根据pH测定机构13，在进行荧光测定时，能够测定液体试样Sa的pH值，因此在pH值不在规定的范围内的情况下能够进行应对，或是中止荧光测定，或是废弃不准确的荧光测定结果。
优选荧光测定对象的液体试样Sa在调整为规定的温度的恒温控制下来进行荧光测定。优选液体试样的温度为4℃以上且45℃以下。在使用菌体提取物的情况下，优选液体试样的温度为25℃以上，更优选为30℃以上，进一步优选为34℃以上，更进一步优选为36℃以上。另外，优选为40℃以下，更优选为39℃以下，进一步优选为38℃以下。另一方面，在使用菌体的情况下，优选液体试样的温度为4℃以上，更优选为10℃以上，进一步优选为15℃以上，更进一步优选为18℃以上，再进一步优选为21℃以上。另外，优选为37℃以下，更优选为30℃以下，进一步优选为26℃以下，更进一步优选为23℃以下。若控制为这样的温度，则能够准确地判别Pg菌的fimA基因的基因型。
液体试样Sa的温度能够通过温度测定机构14来进行测定。例如可以将热敏电阻、热电偶、测温电阻体等***试样容器10中使用来作为温度测定机构14。根据温度测定机构14，在进行荧光测定时，能够在线监视液体试样Sa的温度，对调温装置15进行反馈控制。
调温装置15为用于对试样容器10中的液体试样Sa进行调温的装置。可以在试样容器10的周围，例如下方或侧方的试样架2上设置PTC(Positive Temperature Coefficient)加热器、珀耳帖元件、恒温介质循环体系等作为调温装置15。根据调温装置15，能够将液体试样Sa调温为适于酶反应的温度，从而准确地评价酶活性。
此外，在图10所示的判别装置100中，使用格栅状的试样容器10，但也可以使用微型管作为试样容器10。作为微型管，可列举出能够用于反应、提取、培养、离心分离等各种操作，容积1～2mL左右的塑料制、玻璃制等的容器。
在使用微型管作为试样容器10的情况下，能够将装有液体试样Sa的开盖状态的微型管安装于试样架。可以使激发光从侧壁面射入这样的微型管。能够使从液体试样Sa发出的荧光向开盖状态的微型管的上方射出来进行检测，而不是使其向试样架的侧方射出。
根据这样的方式，微型管的侧壁成为激发光的光波导，并且荧光向开盖状态的微型管的上方射出，因此能够简化光学体系。另外，能够将用于各种操作的微型管直接用于荧光测定。因此，能够将少量的液体试样Sa作为测定对象，使用简单结构的荧光测定装置，廉价且简便地进行荧光测定。
图11是表示荧光测定装置所具有的控制装置的概略结构的图。
如图11所示，荧光测定装置100所具有的控制装置9具有测定结果数据获取部90、测定结果数据处理部91、测定结果数据比较部92、测定条件数据获取部93、控制部94、存储部95、显示控制部96和温度控制部97。
控制装置9控制荧光测定装置100的运转，并且进行对液体试样Sa所含的牙周病的病原菌、菌体提取物的基因型进行判别的处理。控制装置9能够由CPU(Central ProcessingUnit：中央处理器)等运算装置、ROM(Read Only Memory：只读存储器)、RAM(Random AccessMemory：随机存取存储器)、硬盘等存储装置等构成。
在控制装置9上，通过未图示的输入接口连接有输入机构11、具有检测元件5的荧光测定部、pH测定机构14和温度测定机构15。另外，在控制装置9上，通过未图示的输出接口连接有显示机构12、调温装置15。控制装置9所具有的各器件经由未图示的总线而相互连接。
输入机构11为用于操作荧光测定装置100的装置。输入机构11例如能够由键盘、鼠标、触摸板等各种装置构成。
显示机构12为显示基因型的判别的结果的装置。显示机构12例如能够由液晶显示器、等离子显示器、有机EL显示器等各种装置构成。
在荧光测定装置100中，能够通过比较包含基因型未知的牙周病的病原菌或菌体提取物(待测物)的液体试样的荧光强度值或者荧光强度的经时变化量与预先设定的阈值的方法，来进行液体试样Sa所含的牙周病的病原菌、菌体提取物的基因型的判别。在进行比较时，对荧光强度值与对应于荧光强度值的阈值、或者荧光强度的经时变化量与对应于荧光强度的经时变化量的阈值进行比较。
测定结果数据获取部90获取从具有检测元件5的荧光测定部输入的测定结果数据。测定结果数据为检测液体试样Sa所获得的荧光的荧光强度、从酶反应的开始时刻起算的检测时间等数据。测定结果数据被输出至测定结果数据处理部91、存储部95。
测定结果数据处理部91根据测定结果数据计算出用于判别基因型的荧光强度数据。荧光强度数据为规定的检测时间的荧光强度值、规定的检测时间的荧光强度的经时变化量(斜率)等数据。荧光强度数据也可以为规定的检测时间范围内的荧光强度值的平均值、规定的检测时间范围内的荧光强度的经时变化量(斜率)的平均值或最大值等。荧光强度数据被输出至测定结果数据比较部92、存储部95。
测定结果数据比较部92将荧光强度数据与存储于存储部95的阈值进行比较。测定结果数据比较部92判定针对液体试样Sa所生成的荧光强度数据是否大于阈值，从而判别液体试样Sa所含的牙周病的病原菌、菌体提取物的基因型。表示判别结果的数据被输出至显示控制部97。
测定条件数据获取部93获取从pH测定机构13、温度测定机构14输入的测定条件数据。测定条件数据为由pH测定机构13以规定的时间间隔所测得的液体试样Sa的pH值、由温度测定机构14以规定的时间间隔所测得的液体试样Sa的温度的数据。测定条件数据被输出至控制部95、温度控制部97。
控制部94根据规定的程序、用户经由输入机构11的输入，对荧光测定装置100所具有的各器件的动作、判别牙周病的病原菌的基因型的处理、显示判别结果的处理等进行控制。
存储部95存储用于执行荧光测定装置100所具有的各器件的动作、判别牙周病的病原菌的基因型的处理、显示判别结果的处理等的程序、或用于判别基因型的阈值等数据。
例如，能够使用基因型已知的牙周病的病原菌、菌体提取物预先进行荧光测定，根据作为其测定结果所获得的测定结果数据求得荧光强度数据，并且将其预先存储于存储部95。另外，能够根据多个荧光强度数据设定每个基因型的阈值，并且将其预先存储于存储部95。
阈值的设定能够使用例如回归分析、标准偏差分类、自然分类、多项分类等各种的分析法。为了不受成为评价对象的分解酶以外的酶活性的影响，也可以预先校正阈值。
显示控制部96对显示于显示机构12的图像的生成、显示进行控制。显示控制部96生成关于荧光测定装置100的运转状态、荧光测定的结果、对基因型的判别结果的图像，并且将其输出至显示机构12。
温度控制部97进行调温装置15的温度控制。温度控制部97根据由温度测定机构15所测定出的液体试样Sa的温度，对调温装置15进行反馈控制，从而将液体试样Sa的温度维持在适于酶反应的温度。
图12是表示由荧光测定装置实现的判别方法的流程的流程图。
如图12所示，在荧光测定装置100中，能够将包含基因型未知的牙周病的病原菌或其菌体提取物(待测物)的液体试样Sa作为测定对象来进行荧光测定，并且向用户显示根据其测定数据所解析的基因型的判别结果。
如图12所示，在荧光测定装置100运转时，首先，向控制装置9输入荧光测定的测定条件(步骤S300)。作为测定条件，可列举出用于制备液体试样的待测物的种类、用于荧光测定的荧光波长、待机时间、检测时间、用于判别基因型的荧光强度数据的种类，例如规定的检测时间的荧光强度值、规定的检测时间的荧光强度的经时变化量(斜率)等的种类等。
接下来，开始包含基因型未知的牙周病的病原菌或其菌体提取物(待测物)的液体试样Sa的荧光测定，进行激发光的照射和荧光的检测(步骤S310)。然后，获取由检测元件5所检测到的作为荧光的电信号的测定结果数据(步骤S320)。
在步骤S320中，在将规定的检测时间的荧光强度值用于判别基因型的情况下，将该时间的荧光强度值作为测定结果数据收集于测定结果数据获取部90。另外，在将荧光强度的经时变化量(斜率)用于判别基因***的情况下，将按规定的时间间隔且随着时间经过的荧光强度值作为测定结果数据收集于测定结果数据获取部90。另外，在使用平均值、最大值的情况下，收集规定的时间范围的荧光强度值。
接下来，根据测定结果数据计算出用于判别基因型的荧光强度数据(步骤S330)。荧光强度数据作为规定的检测时间的荧光强度值、规定的检测时间范围内的荧光强度值的平均值、规定的检测时间的荧光强度的经时变化量(斜率)、规定的检测时间范围内的荧光强度的经时变化量(斜率)的平均值或最大值等，收集于测定结果数据处理部91。
接下来，进行对基因型未知的牙周病的病原菌或其菌体提取物(待测物)的基因型进行判别的处理(步骤S340)。然后，由显示控制部96将表示基因型的判别结果的图像显示于显示机构12(步骤S350)。之后，结束荧光测定装置100的运转。
作为基因型的判别结果，能够使显示机构12显示液体试样Sa所含的基因型未知的牙周病的病原菌或菌体提取物属于已知的哪种基因型的意思、不属于已知的哪种基因型的意思、不能判别的意思等。判别结果可以由语言、记号、颜色等任一方式来显示，也可以与表示判别准确度的百分比等一起显示。
图13是表示由荧光测定装置实现的判别基因型的处理的流程的流程图。
如图13所示，对基因型未知的牙周病的病原菌或菌体提取物的基因型进行判别的处理(步骤S340)是通过在测定结果数据比较部92中，将作为荧光强度值或荧光强度的经时变化量的数据的荧光强度数据与存储于存储部95的阈值进行比较来进行的处理。
首先，在测定结果数据比较部92中，输入针对包含基因型未知的牙周病的病原菌或其菌体提取物(待测物)的液体试样所获得的荧光强度数据(步骤S341)。
接下来，将包含基因型未知的牙周病的病原菌或其菌体提取物(待测物)的液体试样的荧光强度数据、即荧光强度值或荧光强度的经时变化量与预先设定的第1阈值进行比较(步骤S342)。
与第1阈值进行比较的结果，当基因型未知的液体试样的荧光强度数据、即荧光强度值或荧光强度的经时变化量大于第1阈值时(步骤S342：是)，处理进入步骤S343。
接下来，将包含基因型未知的牙周病的病原菌(待测菌)的液体试样的荧光强度数据、即荧光强度值或荧光强度的经时变化量与预先设定的第2阈值进行比较(步骤S343)。
第1阈值或第2阈值能够如下这样来设定：使用基因型已知的牙周病的病原菌或菌体提取物事先进行荧光测定，按照判别对象的基因型、酶反应的条件，基于荧光强度与反应时间的相关关系设定任意值，作为第1阈值或第2阈值。例如，能够设定对图8或图9中的阴影的区域彼此进行划分这样的、区分I型与IV型的边界值、区分IV型与II型的边界值等。
在将菌体用于制备液体试样的情况下，例如能够根据包含fimA基因的基因型为I型的牙周病的病原菌的菌体的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方，来设定第1阈值。例如，能够针对pH值、温度、牙周病的病原菌的待测量、荧光标记底物的浓度等与判别对象的液体试样Sa实质上为相同条件的液体试样，事先获取多个荧光测定结果，根据荧光强度的时间变化的结果来设定边界值，该边界值在针对I型收集到的荧光测定结果的最大值以下，且小于针对IV型收集到的荧光测定结果的最小值。在将菌体用于制备液体试样的情况下，根据第1阈值，能够区分I型与IV型或II型。
另一方面，在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，例如能够根据包含fimA基因的基因型为II型的牙周病的病原菌的菌体提取物的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方，来设定第1阈值。在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，根据第1阈值，能够区分II型与IV型或I型。
在将菌体用于制备液体试样的情况下，能够根据包含fimA基因的基因型为IV型的牙周病的病原菌的菌体的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为II型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方，来设定第2阈值。例如，能够针对pH值、温度、牙周病的病原菌的待测量、荧光标记底物的浓度等与判别对象的液体试样Sa实质上为相同条件的液体试样，事先获取多个荧光测定结果，根据荧光强度的时间变化的结果来设定边界值，该边界值在针对IV型收集到的荧光测定结果的最大值以下，且小于针对II型收集到的荧光测定结果的最小值。在将菌体用于制备液体试样的情况下，根据第2阈值，能够区分II型与IV型或I型。
另一方面，在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，例如能够根据包含fimA基因的基因型为IV型的牙周病的病原菌的菌体提取物的液体试样的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为I型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方，来设定第2阈值。在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，根据第2阈值，能够区分I型与IV型或II型。
在将菌体用于制备液体试样的情况下，与阈值进行比较的结果，当基因型未知的液体试样的荧光强度数据、即荧光强度值或荧光强度的经时变化量大于第1阈值，且为第2阈值以下时(步骤S342：是、步骤S343：否)，能够判定为该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为I型、II型以外的基因型。即，若在待测菌不包含III型、V型以外的基因型的情况下，则能够判定为其是IV型。另外，在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，能够判定为该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为II型、I型以外的基因型。即，若在待测菌不包含III型、V型以外的基因型的情况下，则能够判定为其是IV型。
另外，在将菌体用于制备液体试样的情况下，与阈值进行比较的结果，当基因型未知的液体试样的荧光强度数据、即荧光强度值或荧光强度的经时变化量大于第2阈值时(步骤S342：是、步骤S343：是)，能够判定为该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为I型、IV型以外的基因型。即，若在待测菌不包含III型、V型以外的基因型的情况下，则能够判定为其是II型。另外，在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，能够判定为该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为II型、IV型以外的基因型。即，若在待测菌不包含III型、V型以外的基因型的情况下，则能够判定为其是I型。
另一方面，在将菌体用于制备液体试样的情况下，与阈值进行比较的结果，当基因型未知的液体试样的荧光强度数据、即荧光强度值或荧光强度的经时变化量为第1阈值以下时(步骤S342：否)，能够判定为该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为II型、IV型以外的基因型。即，若在待测菌不包含III型、V型以外的基因型的情况下，则能够判定为其是I型。另外，在将菌体提取物用于制备液体试样的情况下，能够判定为该液体试样的牙周病的病原菌的fimA基因为IV型、I型以外的基因型。即，若在待测菌不包含III型、V型以外的基因型的情况下，则能够判定为其是II型。
根据以上的本实施方式所涉及的荧光测定装置，在牙周病的病原菌的酶活性与牙周病的病原菌的基因型存在相关关系的情况下，能够根据通过荧光测定法求得的酶活性，来判别牙周病的病原菌的基因型。与以往通常的分子生物学的方法不同，由于在判别中反映了使牙周病进展的酶活性，因此能够进行更切合实际的病理的基因型的判别。另外，可以将从受试者的口腔采集到的试样直接用于荧光测定用的液体试样，因此能够简便地进行基因型的判别。
尤其，荧光测定装置能够具有存储了第1阈值、第2阈值的存储部，因此能够与技巧、操作无关，稳定且重现性良好地判别牙周病的病原菌的基因型。通过仅准备用于判别牙周病的病原菌的基因型的检查剂，就能够自动地判别从牙周病的病原菌的受试者的口腔采集到的试样，因此，能够高效地判断牙周病目前的病理、重症化的可能性。
以上，说明了本发明，但本发明并不限定于所述实施方式，能够在不脱离本发明的主旨的范围内进行各种变更。例如，本发明并不一定限定于具有所述实施方式所具有的所有结构。可以将某一实施方式的一部分结构替换为其他的结构，或是对实施方式的一部分结构追加其他的方式，或是省略某一实施方式的一部分结构。
例如，所述荧光测定装置100只要能够测定液体试样Sa的荧光强度即可，其可以具有适当的光学***、信号处理***。基因型的判别除了通过第1阈值或第2阈值之外，还可以通过与所述判别方法相同的方法等那样，对关于荧光强度的指标值的类似度进行比较的其他的方法来进行。
[附图标记说明]
1：光源(照射机构)；2：试样架；3a：光学透镜；3b：光学透镜；4：滤波器；5：检测元件(检测机构)；6：放大器；7：模拟处理器；8：A/D转换器；9：控制装置(判别机构)；10：试样容器；11：输入机构；12：显示机构；13：pH测定机构；14：温度测定机构；15：调温装置；90：测定结果数据获取部；91：测定结果数据处理部；92：测定结果数据比较部；93：测定条件数据获取部；94：控制部；95：存储部；96：显示控制部；97：温度控制部；100：荧光测定装置。
Claims (32)
1.一种判别方法，其判别牙周病的病原菌的基因型，其特征在于，
向液体试样照射激发光，根据从所述液体试样发出的荧光的强度来判别所述基因型，
其中，所述液体试样包含牙周病的病原菌的菌体或菌体提取物、和荧光标记所述病原菌的酶反应的底物而成的试剂，且被调整为pH7.0以上且pH8.5以下进行了酶反应。
2.根据权利要求1所述的判别方法，其特征在于，
所述病原菌为牙龈卟啉单胞菌，
所述基因型为编码菌毛蛋白的具有多态性的fimA基因的基因型。
3.根据权利要求2所述的判别方法，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体或菌体提取物的试验区的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体或菌体提取物，并且被调整为与所述试验区的液体试样相同的pH值的对照区的液体试样，
在所述基因型的判别中，当测定所述试验区而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与测定所述对照区而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量彼此相同或者近似时，判定为所述试验区中的该液体试样的所述病原菌的fimA基因是与基因型已知的所述病原菌的fimA基因相同的基因型。
4.根据权利要求2所述的判别方法，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体或基因型未知的所述病原菌的菌体，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
在所述基因型的判别中，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量被分类为，测定所述多个液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量的测定值组中排在前面第一位的测定值组时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为II型。
5.根据权利要求2所述的判别方法，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体或基因型未知的所述病原菌的菌体，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
在所述基因型的判别中，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量被分类为，测定所述多个液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量的测定值组中排在前面第二位的测定值组时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为IV型。
6.根据权利要求2所述的判别方法，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体或基因型未知的所述病原菌的菌体，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
在所述基因型的判别中，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量被分类为，测定所述多个液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量的测定值组中排在最后的测定值组时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为I型。
7.根据权利要求2所述的判别方法，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体提取物的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体提取物或基因型未知的所述病原菌的菌体提取物，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
在所述基因型的判别中，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量被分类为，测定所述多个液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量的测定值组中排在前面第一位的测定值组时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为I型。
8.根据权利要求2所述的判别方法，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体提取物的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体提取物或基因型未知的所述病原菌的菌体提取物，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
在所述基因型的判别中，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量被分类为，测定所述多个液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量的测定值组中排在前面第二位的测定值组时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为IV型。
9.根据权利要求2所述的判别方法，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体提取物的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体提取物或基因型未知的所述病原菌的菌体提取物，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
在所述基因型的判别中，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量被分类为，测定所述多个液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量的测定值组中排在最后的测定值组时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为II型。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的判别方法，其特征在于，
所述试剂为异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的判别方法，其特征在于，
所述激发光的波长为355nm以上且375nm以下。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的判别方法，其特征在于，
所述荧光的波长为430nm以上且455nm以下。
13.根据权利要求1至9中任一项所述的判别方法，其特征在于，
所述液体试样为pH缓冲液，
所述pH缓冲液以三羟基甲基氨基甲烷(Tris)作为主要成分。
14.根据权利要求1至9中任一项所述的判别方法，其特征在于，
所述液体试样的温度为4℃以上且45℃以下。
15.一种荧光测定装置，其判别牙周病的病原菌的基因型，其特征在于，
具有照射机构、检测机构和判别机构，其中，
所述照射机构用于向液体试样照射激发光，所述液体试样包含牙周病的病原菌的菌体或菌体提取物、和荧光标记所述病原菌的酶反应的底物而成的试剂，且被调整为pH7.0以上且pH8.5以下进行了酶反应；
所述检测机构用于检测从所述液体试样发出的荧光；
所述判别机构根据检测出的荧光的强度来判别所述基因型。
16.根据权利要求15所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述病原菌为牙龈卟啉单胞菌，
所述基因型为编码菌毛蛋白的具有多态性的fimA基因的基因型。
17.根据权利要求16所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体或菌体提取物的试验区的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体或菌体提取物，并且被调整为与所述试验区的液体试样相同的pH值的对照区的液体试样，
所述判别机构具有存储部和数据比较部，其中，
所述存储部用于存储测定所述对照区而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量；
当测定所述试验区而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与测定所述对照区而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量彼此相同或者近似时，所述数据比较部判定为所述试验区中的该液体试样的所述病原菌的fimA基因是与基因型已知的所述病原菌的fimA基因相同的基因型。
18.根据权利要求16所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
所述判别机构具有存储部和数据比较部，其中，
所述存储部存储有第1阈值；
所述数据比较部将测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与预先设定的第1阈值进行比较，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量为所述第1阈值以下时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为I型，
所述第1阈值为根据测定包含fimA基因的基因型为I型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方而设定的值。
19.根据权利要求16所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
所述判别机构具有存储部和数据比较部，其中，
所述存储部存储有第1阈值和第2阈值；
所述数据比较部将测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与预先设定的第1阈值和第2阈值进行比较，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量大于所述第1阈值且为所述第2阈值以下时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为IV型，
所述第1阈值为根据测定包含fimA基因的基因型为I型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方而设定的值，
所述第2阈值为根据测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为II型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方而设定的值。
20.根据权利要求16所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
所述判别机构具有存储部和数据比较部，其中，
所述存储部存储有第2阈值；
所述数据比较部将测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与预先设定的第2阈值进行比较，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量大于所述第2阈值时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为II型，
所述第2阈值为根据测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为II型的所述病原菌的菌体的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方而设定的值。
21.根据权利要求16所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体提取物的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体菌体提取物，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
所述判别机构具有存储部和数据比较部，其中，
所述存储部存储有第1阈值；
所述数据比较部将测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与预先设定的第1阈值进行比较，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量为所述第1阈值以下时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为II型，
所述第1阈值为根据测定包含fimA基因的基因型为II型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方而设定的值。
22.根据权利要求16所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体提取物的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体提取物，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
所述判别机构具有存储部和数据比较部，其中，
所述存储部存储有第1阈值和第2阈值；
所述数据比较部将测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与预先所设定的第1阈值和第2阈值进行比较，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量大于所述第1阈值且为所述第2阈值以下时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为IV型，
所述第1阈值为根据测定包含fimA基因的基因型为II型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方而设定的值，
所述第2阈值为根据测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为I型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方而设定的值。
23.根据权利要求16所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述液体试样为包含基因型未知的所述病原菌的菌体提取物的判别对象的液体试样、以及
包含基因型已知的所述病原菌的菌体提取物，并且被调整为与所述判别对象的液体试样相同的pH值的多个液体试样，
所述判别机构具有存储部和数据比较部，其中，
所述存储部存储有第2阈值；
所述数据比较部将测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量与预先设定的第2阈值进行比较，当测定所述判别对象的液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量大于所述第2阈值时，判定为该液体试样的所述病原菌的fimA基因为I型，
所述第2阈值为根据测定包含fimA基因的基因型为IV型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量、以及测定包含fimA基因的基因型为I型的所述病原菌的菌体提取物的所述液体试样而获得的荧光强度值或荧光强度的经时变化量中的至少一方而设定的值。
24.根据权利要求15至23中任一项所述的荧光测定装置，其特征在于，
具有显示机构，该显示机构用于显示所述基因型的判别结果。
25.根据权利要求15至23中任一项所述的荧光测定装置，其特征在于，
具有pH测定机构，该pH测定机构用于测定所述液体试样的pH值。
26.根据权利要求15至23中任一项所述的荧光测定装置，其特征在于，
具有温度控制机构，该温度控制机构用于调节所述液体试样的温度。
27.根据权利要求15至23中任一项所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述试剂为异丁氧基羰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-精氨酰基-4-甲基香豆基-7-酰胺(iBoc-Gly-Gly-Arg-MCA)。
28.根据权利要求15至23中任一项所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述激发光的波长为355nm以上且375nm以下。
29.根据权利要求15至23中任一项所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述荧光的波长为430nm以上且455nm以下。
30.根据权利要求15至23中任一项所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述液体试样为pH缓冲液，
所述pH缓冲液以三羟基甲基氨基甲烷(Tris)作为主要成分。
31.根据权利要求15至23中任一项所述的荧光测定装置，其特征在于，
所述液体试样的温度为4℃以上且45℃以下。
32.一种检查剂，其判别牙周病的病原菌的基因型，其特征在于，
包含试剂和pH缓冲液，其中，
所述试剂为荧光标记所述病原菌的酶反应的底物而成；所述pH缓冲液溶解所述试剂，
所述pH缓冲液为pH7.0以上且pH8.5以下。
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