CN114163481B - 一种含铂类药物纳米囊泡及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含铂类药物纳米囊泡及其制备方法与应用。包括铜基金属有机框架和包裹在铜基金属有机框架内的铂类药物前体，所述铜基金属有机框架表面修饰有长循环脂质体。该含铂类药物纳米囊泡对局部***调控和血小板阻断抑制三阴性乳腺癌增殖和转移有协同作用，抑瘤率为80.9％，肺转移抑制率高达88.4％，其稳定性和分散性较好，药物泄露率低，增强了体内长循环效果，对生物体的毒副作用小。

Description

一种含铂类药物纳米囊泡及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药配制品领域，具体地涉及一种含铂类药物纳米囊泡及其制备方法与应用。
背景技术
三阴性乳腺癌(Triple-negative breast cancer,TNBC)是***受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体(HER-2)均阴性的乳腺癌。众所周知ER、PR、HER2的表达是目前临床乳腺癌治疗的靶点，但TNBC患者因为缺少这些靶点，不能从传统的内分泌治疗及靶向治疗中获益，治疗方法几乎只有化疗。尽管三阴性乳腺癌对化疗具有一定敏感性，然而经过常规化疗治疗后预后仍较差。研究表明，Ⅲ-Ⅳ期三阴性乳腺癌患者5年生存率仅为13％。TNBC与生俱来的高侵袭性特点，使其转移率几乎无法避免，研究表明转移是造成TNBC患者死亡的主要原因，然而，现阶段缺乏有效的TNBC转移治疗方法，如何有效抑制TNBC转移已成为目前乳腺癌治疗领域的难题之一。
***在乳腺癌的转移过程中起着重要的作用，尤其是17β-***(E2)。E2可促进MCF-7的迁移和上皮间质转化；此外，E2还可介导快速的非基因效应，通过加速肿瘤组织的血管生长，促进基质金属蛋白酶表达等多种机制，促进TNBC的增殖和转移，然而目前肿瘤***水平的调节仍面临巨大挑战，限制了TNBC的治疗。
血小板来源于骨髓成熟的巨核细胞，它是一种胞浆脱落下来的小块胞质，没有细胞核，其在体内主要发挥凝血和止血功能。研究发现，血小板可在瘤内的非血管部位聚集，进而加重肿瘤细胞诱导的血小板活化，活化的血小板可分泌TGF-β，促进肿瘤细胞发生上皮-间质转化(EMT)，驱动肿瘤细胞的转移。此外，一旦肿瘤细胞内渗侵入血液，激活的血小板会与肿瘤细胞结合形成复合物，保护其免受循环***中免疫细胞的攻击。而研究发现一氧化氮(NO)可显著抑制血小板的激活。它通过与血小板中的可溶性鸟甘酸环化酶(sGC)结合后，使其激活，激活的sGC在Mg2+存在下产生大量的cGMP，然后依赖cGMP途径抑制血小板的活化。这使NO成为一种很有前景的方法来抑制血小板活化诱导的肿瘤转移。
纳米药物递送***(nano-DDS)是新型药物递送***，其是将药物包埋在纳米粒中，具有缓控释、靶向等诸多优点，可以实现肿瘤的精确靶向，但现有的纳米递送***对于三阴性乳腺癌存在治疗效果差、尤其在抑制三阴性乳腺癌转移方面效果不佳等问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明目的是提供一种含铂类药物纳米囊泡，以解决上述纳米递送***对三阴性乳腺癌治疗效果差、在抑制三阴性乳腺癌转移方面效果不佳的问题。
本发明另一目的是提供一种含铂类药物纳米囊泡的制备方法。
本发明又一目的是提供上述含铂类药物纳米囊泡的应用。
本发明一方面，提供一种铂类药物前体，其分子结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0003393826210000021
本发明另一方面，提供一种铂类药物前体的制备方法，包括以下步骤：
S1：将顺铂与H2O2进行羟基化反应，得到羟基化顺铂；
S2：将步骤S1得到的羟基化顺铂和Fmoc-Pbf-精氨酸反应，得到铂类药物前体。
优选的，步骤S1中，具体方法为：将顺铂溶于H2O2中搅拌、静置得到；
步骤S2中，具体方法为：将Fmoc-Pbf-精氨酸溶于二氯甲烷溶液，加入羟基化顺铂和4-二甲胺基吡啶，置于冰浴内至澄清，加入N,N-二环己基碳二亚胺，室温回流过滤得到。
本发明又一方面，提供一种含铂类药物纳米囊泡，包括铜基金属有机框架和包裹在铜基金属有机框架内的铂类药物前体，所述铂类药物前体的分子结构式如上述式1所示，所述铜基金属有机框架表面修饰有长循环脂质体。
其中，按质量比，铜基金属有机框架:铂类药物前体:长循环脂质体为1-0.5:1:2-1。
其中，所述铜基金属有机框架为MIL-53-Cu；
优选地，所述长循环脂质体为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、磷脂酰胆碱-聚乙二醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇中的一种或几种。
本发明的另一方面，提供所述的一种含铂类药物纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：
S1：将铜基金属有机框架与铂类药物前体混合，搅拌，得到铂类药物前体纳米粒；
S2：将长循环脂质体与步骤S1制备的铂类药物前体纳米粒混合，搅拌，得到含铂类药物纳米囊泡。
优选地，步骤S1中，搅拌时间为8-12h，搅拌速度为500-600rpm；步骤S2中，搅拌时间为4-8h，搅拌速度为500-600rpm。
本发明再一方面，提供所述一种铂类药物前体、一种含铂类药物纳米囊泡在制备抗肿瘤药物中的应用。
其中，所述肿瘤为乳腺癌，优选地，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
本发明的实施例中还提供了一种铜基金属有机框架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将表面活性剂、助剂溶解，搅拌，制备胶束溶液；
(2)将铜离子、有机配体加入到步骤(1)中的胶束溶液中，加热，得到铜基金属有机框架。
其中，步骤(1)中，所述表面活性剂为双(2－乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠，溶解浓度为8-10g/L；所述助剂为正丁醇，溶解浓度为1.5-2.0％(V/V)；
其中，步骤(2)中，所述铜离子以铜盐的形式加入，所述铜盐包括醋酸铜、氯化铜、硝酸铜、硫酸铜中的一种或几种；所述有机配体为没食子酸；所述铜离子:有机配体摩尔比为1:1-1:3；加热温度为70-80℃，加热时间为11-13h。
本发明的有益效果是：
(1)本发明中铜基金属有机框架作为药物储库，将铂类药物前体包埋在框架内，可有效避免游离前药在血液循环过程中产生的毒副作用，对生物体的毒副作用小。长循环脂质体具有亲水作用，修饰在有机金属框架表面，通过调节含铂类药物纳米囊泡的电位，可有效延长制剂在体内的血液循环时间，减少其被内皮***清除，体内长循环时间长。
(2)本发明的含铂类药物纳米囊泡具有高渗透长滞留效应(EPR效应)，可以使药物在肿瘤组织中的聚集。
(3)本发明通过pH/GSH级联反应设计保证了药物在肿瘤部位的特异性控释。含铂类药物纳米囊泡中所采用的MOF骨架可在肿瘤酸性溶酶体环境下降解，导致Cu2+和铂类药物前体在特异性位点的释放；铜离子催化***氧化，降低肿瘤原位***水平，抑制MMP-2的表达，从而通过ERK/CANP途径抑制TNBC转移；前药可响应胞浆中的谷胱甘肽(GSH)而发生解离，释放出活性化疗药物顺铂(Pt)和L-精氨酸(L-Arg)，顺铂在NOX酶诱导下生成H2O2，进而氧化L-Arg，产生NO，阻断血小板激活介导的肿瘤的上皮细胞-间充质转化(EMT)，起到协同局部***调控和血小板阻断的作用。
(4)该纳米囊泡粒径约为190±20nm，粒径均一，具有良好的分散性。CPAD纳米粒的电位约为-33.1mV，该负电位可有效延长制剂在体内的循环时间，减少其被内皮***清除，体内长循环时间长。其粒径和电位在7天内没有发生明显的变化，具有良好的稳定性。
(5)本发明合成方法简单，材料易得，成本低。
综上，本发明的纳米囊泡通过EPR效应在肿瘤组织聚集，然后协同局部***调控和血小板阻断抑制三阴性乳腺癌增殖和转移，抑瘤率达80.9％，肺转移抑制率达88.4％，实现纳米递送***在治疗三阴性乳腺癌中的应用。
附图说明
图1为前药Pt-Arg的核磁共振氢谱；
图2为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡的TEM图(a)，EDS-Mapping图(b)，粒径图(c)及电位图(d)；
图3为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡的稳定性数据；
图4为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡的铜离子释放(a)和前药Pt-Arg的释放(b)；
图5为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡的铜离子消耗***实验分组(a)和过氧化氢的生成(b)；
图6为不同Pt-Arg浓度下NO的产生(a)和不同H2O2浓度下NO的产生(b)；
图7为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡作用后4T1细胞内的E2含量(a)，4-OHE2含量(b)；Capn4和MMP-2的蛋白含量(c)及相应的灰度分析(d)；
图8为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡作用后血小板的聚集抑制；
图9为本发明制备的不同浓度含铂类药物纳米囊泡作用后4T1细胞的存活率；
图10为本发明制备的不同浓度含铂类药物纳米囊泡作用后4T1细胞的凋亡情况；
图11为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡治疗后，小鼠肺部Bouin's染色图片及相应的H&E切片；
图12为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡治疗后，小鼠肺部的肺转移结节统计。
图13为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡给药期间，小鼠肿瘤体积的变化；
图14为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡治疗后，小鼠的肿瘤组织质量；
图15为本发明制备的含铂类药物纳米囊泡治疗后，小鼠的肿瘤组织H&E切片和TUNEL荧光染色切片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均可通过正规渠道商业购买得到的常规产品。
4T1细胞株购自武汉尚码生物科技有限公司，细胞凋亡试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；仪器BH-2型荧光显微镜，德国徕卡公司产品；Accuri C6型流式细胞仪，美国BD公司产品。
实施例1含铂类药物的纳米囊泡的制备
(1)铜基MOF(Cu-MOF)的制备：称取0.22g的双(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)，置于50mL圆底烧瓶中，加入25mL超纯水，室温下搅拌超声使其充分溶解，浓度为8.8g/L，然后在磁力搅拌的条件下加入400μL的正丁醇，浓度为1.6％(V/V)，形成透明的胶束溶液，将其放置于油浴锅中加热至75℃。然后向混合溶液中依次加入0.1M醋酸铜溶液200μL(溶剂:N,N-二甲基甲酰胺)的和0.1M没食子酸溶液200μL(溶剂:N,N-二甲基甲酰胺)，继续反应12h。待反应液降至室温后，加入无水乙醇使其沉淀，将所得沉淀液于12000rpm条件下离心10min，并用乙醇和超纯水洗两遍得到铜基MOF(缩写为:Cu-GA)；
(2)GSH响应前药顺铂-精氨酸(Pt-Arg)的制备：称取20mg顺铂(Pt)溶于1mL的30％H2O2溶液中，于50℃条件下搅拌1h后，室温静置24h，经离心、真空干燥后，得到羟基化顺铂(CDDPOH，化学名为二氯二羟基二氨合铂)。
称取5g L-Arg中加入含有7.5gNaHCO3的水中(29.6mL)，随后将5mL氯苄氧羰基(Z-Cl)滴加到上述水溶液中，室温反应8h，过滤，***洗涤，得到物质CBZ-L-精氨酸(Z-L-Arg-OH，化学名为N-苄氧羰基-L-精氨酸)。
称取3.5g Z-L-Arg-OH溶于NaOH与丙酮混合液中，冰浴下滴加5g的Pbf-Cl，冰浴反应1h，室温反应2h，减压蒸馏，得到物质Z-L-Arg(Pbf)-OH·CHA。量取2g的Z-L-Arg(Pbf)-OH·CHA溶于50mL甲醇，加入0.2g 10％的Pd/C，于55℃氢解12h，过滤，得到物质L-Arg(Pbf)–OH。
接着称取1.8g物质L-Arg(Pbf)–OH溶于含有7.5g NaHCO3的水溶液中(29.6mL)，加入5mL二氧六环和1g Fmoc-OSu，冰浴反应30min，随后室温反应2h，析出固体分别用乙酸乙酯、水、饱和食盐水洗涤，干燥过滤，得产物Fmoc-Pbf-精氨酸(Fmoc-L-Arg(Pbf)–OH)。
将制备的Fmoc-L-Arg(Pbf)–OH加入无水二氯甲烷溶液中配置成1mmoL的溶液，随后加入1.5mmoL的CDDPOH和0.1mmoL的4-二甲胺基吡啶(DMAP)，并置于在冰浴内，当上述混合物完全澄清时，加入1.1mmoLN,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，室温回流12h，过滤，加入三氟乙酸(90％)，并用***沉析，柱层析分离产物，制得Pt-Arg前药；
(3)装载前药Pt-Arg纳米粒的制备：取步骤(1)中所得的Cu-GA8mg分散在20mL生理盐水中，加入4mg步骤(2)的Pt-Arg，室温搅拌12h后，离心收集沉淀(12000rpm×10min)，并用PBS洗3次，所得沉淀为装载前药Pt-Arg的纳米粒Cu-GA@Pt-Arg(缩写为:CPA)；
(4)CPAD纳米粒的制备：取步骤(3)中所得的CPA，将其分散在16mL含有8mg二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的生理盐水中，室温搅拌4h，离心收集沉淀(12000rpm×10min)，并用PBS洗涤3次，得到Cu-GA@Pt-Arg@DSPE-PEG纳米粒(缩写为：CPAD)。
实施例2含铂类药物的纳米囊泡的制备
(1)铜基MOF(Cu-MOF)的制备：称取0.2g的双(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)，置于50mL圆底烧瓶中，加入25mL超纯水，室温下搅拌超声使其充分溶解，浓度为8.0g/L，然后在磁力搅拌的条件下加入375μL的正丁醇，浓度为1.5％(V/V)，形成透明的胶束溶液，将其放置于油浴锅中加热至80℃，然后向混合溶液中依次加入0.1M的醋酸铜溶液200μL(溶剂：DMF)和0.2M的没食子酸溶液200μL(溶剂:DMF)，继续反应11h。待反应液降至室温后，加入无水乙醇使其沉淀，将所得沉淀液于12000rpm条件下离心10min，并用乙醇和超纯水洗两遍得到铜基MOF(缩写为:Cu-GA)；
(2)GSH响应前药顺铂-精氨酸(Pt-Arg)的制备：同实施例一；
(3)装载前药Pt-Arg纳米粒的制备：取步骤(1)中所得的Cu-MOF4mg分散在20mL生理盐水中，加入4mg步骤(2)的Pt-Arg，室温搅拌8h后，离心收集沉淀(12000rpm×10min)，并用PBS洗3次，所得沉淀为装载前药Pt-Arg的纳米粒Cu-GA@Pt-Arg(缩写为:CPA)；
(4)CPAD纳米粒的制备：取步骤(3)中所得的CPA，将其分散在16mL含有4mg磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的生理盐水中，室温搅拌6h，离心收集沉淀(12000rpm×10min)，并用PBS洗涤3次，得到Cu-GA@Pt-Arg@DSPE-PEG纳米粒(缩写为:CPAD)。
实施例3含铂类药物的纳米囊泡的制备
(1)铜基MOF(Cu-MOF)的制备：称取0.25g的双(2－乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)，置于50mL圆底烧瓶中，加入25mL超纯水，室温下搅拌超声使其充分溶解，浓度为10g/L，然后在磁力搅拌的条件下加入500μL的正丁醇，浓度为2％(V/V)，形成透明的胶束溶液，将其放置于油浴锅中加热至70℃，然后向混合溶液中依次加入0.1M的醋酸铜溶液200μL(溶剂：DMF)和0.3M没食子酸溶液200μL(溶剂：DMF)，继续反应13h。待反应液降至室温后，加入无水乙醇使其沉淀，将所得沉淀液于12000rpm条件下离心10min，并用乙醇和超纯水洗两遍得到铜基MOF(Cu-GA)纳米粒；
(2)GSH响应前药顺铂-精氨酸(Pt-Arg)的制备：同实施例一；
(3)装载前药Pt-Arg纳米粒的制备：取步骤(1)中所得的Cu-GA2mg分散在20mL生理盐水中，加入4mg步骤(2)的Pt-Arg，室温搅拌10h后，离心收集沉淀(12000rpm×10min)，并用PBS洗3次，所得沉淀为装载前药Pt-Arg的纳米粒Cu-GA@Pt-Arg(缩写为：CPA)；
(4)CPAD纳米粒的制备：取步骤(3)中所得的CPA，将其分散在16mL含有2mg二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇(DSPC-PEG)的生理盐水中，室温搅拌4h，离心收集沉淀(12000rpm×10min)，并用PBS洗涤3次，得到Cu-GA@Pt-Arg@DSPC-PEG纳米粒(缩写为：CPAD)。
对比例1
制备方法与实施例1的区别在于省去步骤(1)。
对比例2铜基纳米囊泡的制备
制备方法与实施例1的区别在于省去步骤(2)。
试验例1合成物质的性能检测
将实施例1合成的前药Pt-Arg通过核磁共振氢谱仪(Bruker 600MHz，DMSO-d6，δppm)进行表征。通过化学位移、偶合常数和积分曲线等重要参考数据，推测质子在碳链上的位置，分析前药的结构。结果如图1所示，结果显示：1HNMR谱图与Pt-Arg分子的结构相符，表示成功合成了前药Pt-Arg。
将实施例1合成的Cu-GA、CPD和CPAD通过DLS、TEM、Zeta进行表征，结果如图2、图3所示。
图2实验结果表明：所制得的CPAD粒径约为190±20nm，形貌似梭型的纳米棒。Cu-GA纳米粒电位约为-36.0mV，而装载前药Pt-Arg后，CPA纳米粒的电位增加至-21.4mV，进一步说明药物的成功装载。修饰DSPE-PEG后，CPAD纳米粒的电位约为-33.1mV，该负电位可有效延长制剂在体内的循环时间，减少其被内皮***清除。由此可知所制得的CPAD粒径均一，分散性好，体内长循环时间长。
图3实验结果表明：CPAD纳米粒的粒径和电位在7天内没有发生明显的变化，表明CPAD纳米粒具有良好的稳定性，以保证其在体内发挥良好的递药效应。
试验例2铜离子和前药Pt-Arg的释放
将实施例1制备的CPAD纳米颗粒分散在不同pH的磷酸盐缓冲液中(pH7.4，6.5，4.5)，使终浓度为100μg/mL，并于37℃恒温震荡保存。孵育不同时间后，离心(12000rpm×20min)收集上清，采用电感耦合等离子体质谱(Inductively Coupled Plasma-MassSpectrometry，ICP-MS)检测上清中铜离子和Pt-Arg的含量。结果如图4所示。
实验结果表明：CPAD释放铜离子和前药的速率受pH的影响，在pH 4.5条件下铜离子和前药Pt-Arg的释放量高，而在pH 7.4的条件下则释放较少。
试验例3铜离子的***调控
将实验分为5组(A-E)，分别为Cu2+，NADH，Cu2++4-OHE2，NADH+4-OHE2和Cu2++NADH+4-OHE2，其中各溶液的反应浓度分别为50μM(Cu2+)，0.1mM(NADH)和40μM(4-OHE2)，各组混合孵育24h后，使用过氧化氢试剂盒检测H2O2的生成。结果如图5所示。
实验结果表明：铜离子与4-羟***(4-OHE2)在NADH的作用下可发生反应，消耗4-OHE2，生成H2O2，从而为下调E2奠定基础。
试验例4前药产生NO的性质考察
将实施例1制备的CPAD置于pH4.5的条件下使前药Pt-Arg充分释放，然后在不同浓度的前药Pt-Arg溶液(0、2、4、6、8、10mM)中依次加入10mM GSH和10mM H2O2，37℃恒温孵育24h后，按一氧化氮试剂盒说明书进行检测，并记录450nm处的吸光度。使用相同方法检测前药H2O2浓度依赖性的NO释放，在10mM的Pt-Arg溶液中依次加入10mM GSH和不同浓度的H2O2(0、0.25、0.5、1、5、10mM)，于37℃恒温孵育24h后，使用试剂盒检测并记录450nm处的吸光度。结果如图6所示。
实验结果表明：前药可响应GSH和H2O2，生成NO，且NO的生成受Pt-Arg和H2O2浓度的影响，并随浓度的增加而增大。
试验例5 CPAD对细胞E2及MMP-2水平的调控
取对数生长期的4T1细胞，使用无酚红1640+10％CS-FBS培养24h后，弃去上清，并用无菌PBS清洗三次，再用不含血清的无酚红1640继续培养24h，以耗尽细胞的内源性激素，待细胞密度为80％左右，将其消化离心后收集沉淀，铺板并置于培养箱中过夜培养，按实验分组分别加入PBS、10-9mol/L E2、和CPAD+10-9mol/L E2(Pt-Arg：1μg/mL)，继续培养24h后，弃去上清并用PBS洗涤三次，离心收集细胞沉淀，使用ELISA试剂盒和Western Blot检测胞内E2、4-OHE2的含量，及MMP-2的蛋白表达。结果如图7所示。
实验结果表明：CPAD能有效下调胞内的E2和4-OHE2含量，降低MMP-2的表达，说明铜离子可发挥***的调控作用。
试验例6 CPAD对肿瘤细胞诱导血小板聚集的抑制作用
收集血小板，并使用DIL膜性荧光染料染色20min，离心并用PBS洗涤3次，除去游离的荧光染料，待用。将3×1054T1细胞接种于共聚焦培养皿上，随后置于37℃，5％CO2条件下培养24h后，按实验分组依次加入：Pla和CPAD+Pla(Platelets:4×106；Pt-Arg：1μg/mL)，继续培养8h后，弃去含药培养基并用PBS洗涤3次，Hoechst33342孵育10min，PBS洗涤三次后，使用激光共聚焦显微镜观察血小板的聚集并拍照记录。结果如图8所示。
实验结果表明：CPAD由于能产生NO，可显著抑制肿瘤细胞引起的血小板激活和聚集。
试验例7 CPAD对肿瘤细胞的抑制作用
4T1细胞用10％血清的培养基置于细胞培养箱(5％CO2、37℃)中培养，待细胞生长至90％左右进行胰酶消化，离心后重悬细胞，按照8000/孔的细胞密度接种于96孔细胞板中，24h后，将其分为对照组和实验组，对照组细胞不做任何处理，实验组细胞分别加入不同浓度梯度的实施例1制备的CPAD、对比例1制备的药物、对比例2制备的药物，实验重复3次。
用CCK-8法检测CPAD对于细胞的增殖抑制能力。加入不同的制剂和药物后，继续培养24h，弃去培养基并加入CCK-8溶液，37℃孵育1-4h，酶标仪检测450nm处的吸光度，评估CPAD的细胞增殖抑制能力，实验结果如图9。用流式细胞术检测不同制剂处理对于细胞凋亡的影响，制剂作用24h，使用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化，离心收集培养基及细胞，采用凋亡试剂盒及流式细胞仪检测细胞的凋亡率，实验结果如图10。实验结果见表1和表2。
表1 CCK-8法检测50μg/mL CPAD对细胞的抑制作用
分组 实施例1 对比例1 对比例2 对照组
抑制率 80.9％ 55.4％ 32.6％ 0.0％
表2流式细胞术检测CPAD对细胞的凋亡作用
分组 实施例1 对比例1 对比例2 对照组
凋亡率 60.09％ 24.02％ 11.98％ 0.145％
实验结果表明：实施例1制备的纳米药物对乳腺癌细胞的抑制率，明显高于对比例1(未加铜基金属有机框架)和对比例2(未加铂类药物前体)。说明铜基金属有机框架和铂类药物前体在抑制肿瘤细胞上具有协同作用。
试验例8 CPAD对肺转移的抑制作用
(1)建立动物模型：将4T1细胞培养，待其生长状态良好时，消化离心后计数并调整细胞悬液的细胞浓度为2×107个/mL。对BALB/c雌性小鼠进行腹腔注射麻醉后，使用1mL无菌注射器将50μL细胞悬液注射到小鼠第三对乳腺脂肪垫处，随后正常饲养，并每日观察小鼠精神状况和肿瘤生长情况，同时用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，根据公式计算肿瘤体积，当肿瘤体积至300mm3左右时，将老鼠随机分为4组(A/B/C/D组)，每组5只，开始进行给药治疗。A组：实施例1的CPAD；B组：对比例1；C组：对比例2；D组：生理盐水组。
(2)前药的工作浓度为1mg/kg/只，隔天给药，共给药7次，并在第0、2、4、6、8、10、12、14天量取肿瘤体积，如图13所示。治疗结束后，脱臼法处死实验小鼠，分别收集各组肺组织、肿瘤组织。对肺组织进行Bouin's固定液染色，同时进行H&E染色切片分析，结果如图11所示。并统计肺转移灶，结果如图12所示。称取肿瘤的质量，如图14所示，然后对肿瘤组织进行H&E切片和TUNEL荧光染色切片，如图15所示。CPAD对肺转移的抑制作用结果见表3。
实验结果表明：CPAD组治疗后能显著阻止肺转移，使肿瘤体积增速减慢，治疗后肿瘤的质量明显小于对比例1和对比例2，对肿瘤细胞的损伤和凋亡作用优于对比例1和对比例2。
表3 CPAD对肺转移的抑制作用
组别 实施例1 对比例1 对比例2 对照组
肺转移抑制率 88.4％ 22.1％ 26.9％ 0％(5/5)
进一步的实验表明，实施例2、3制备的药物制剂与实施例1制备的药物制剂具有相似的效果。
本发明的含铂类药物纳米囊泡的作用机制为：其可在酸性条件下特异性释放铜离子和前药Pt-Arg，铜离子催化***氧化，降低肿瘤原位***水平，从而通过ERK/CANP途径抑制TNBC转移。Cu2+可与E2的胞内代谢产物4-OHE2反应，从而消耗肿瘤组织的***水平，抑制MMP-2的表达。同时，释放的Pt-Arg前药在肿瘤组织GSH的激活下产生游离的Pt和L-Arg，Pt在NOX酶诱导下生成H2O2，进而氧化L-Arg产生NO，产生的NO可以原位阻断肿瘤细胞诱导的血小板激活，从而阻断活化血小板引发的肿瘤组织EMT转化。铜离子和前药P协同作用于TNBC的抗转移治疗。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种铂类药物前体，其特征在于，其分子结构式如式I所示：
Figure FDA0004223344340000011
2.一种权利要求1所述的铂类药物前体的制备方法，包括以下步骤：
S1：将顺铂与H2O2进行羟基化反应，得到羟基化顺铂；
S2：将步骤S1得到的羟基化顺铂和Fmoc-Pbf-精氨酸反应，得到铂类药物前体；
步骤S1中，具体方法为：将顺铂溶于H2O2中搅拌、静置得到；
步骤S2中，具体方法为：将Fmoc-Pbf-精氨酸溶于二氯甲烷溶液，加入羟基化顺铂和4-二甲胺基吡啶，置于冰浴内至澄清，加入N,N-二环己基碳二亚胺，室温回流过滤得到。
3.一种含铂类药物纳米囊泡，其特征在于：包括铜基金属有机框架和包裹在铜基金属有机框架内的铂类药物前体，所述铂类药物前体的分子结构式如权利要求1中式Ⅰ所示，所述铜基金属有机框架表面修饰有长循环脂质体；
其中，所述含铂类药物纳米囊泡的制备方法包括以下步骤：
S1：将铜基金属有机框架与铂类药物前体混合，搅拌，得到铂类药物前体纳米粒；
S2：将长循环脂质体与步骤S1制备的铂类药物前体纳米粒混合，搅拌，得到含铂类药物纳米囊泡；
按质量比，铜基金属有机框架:铂类药物前体:长循环脂质体为1-0.5:1:2-1；
所述长循环脂质体为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、磷脂酰胆碱-聚乙二醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇中的一种或几种；
所述铜基金属有机框架的制备方法包括以下步骤：
(1)将表面活性剂、助剂溶解，搅拌，制备胶束溶液；
(2)将铜离子、有机配体加入到步骤(1)中的胶束溶液中，加热，得到铜基金属有机框架；
其中，步骤(1)中，所述表面活性剂为双(2－乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠，溶解浓度为8-10g/L；所述助剂为正丁醇，溶解浓度为1.5-2.0％V/V；
步骤(2)中，所述铜离子以铜盐的形式加入，所述铜盐为醋酸铜、氯化铜、硝酸铜、硫酸铜中的一种或几种；所述有机配体为没食子酸；所述铜离子:有机配体摩尔比为1:1-1:3；加热温度为70-80℃，加热时间为11-13h。
4.根据权利要求3所述的一种含铂类药物纳米囊泡，其特征在于：步骤S1中，搅拌时间为8-12h，搅拌速度为500-600rpm；步骤S2中，搅拌时间为4-8h，搅拌速度为500-600rpm。
5.权利要求1所述的一种铂类药物前体、权利要求3所述一种含铂类药物纳米囊泡在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
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