CN104606127A - 靶向egfr的载铂类药物白蛋白纳米粒及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及一种靶向识别肿瘤细胞EGFR受体的铂类药物白蛋白纳米制剂。本发明以白蛋白负载铂类药物、以药用聚乙二醇(PEG)为分散交联剂、以氨基化EGFR核酸适配体作为靶向修饰分子，制成可溶性白蛋白纳米(Apt-PtNPs)制剂。该纳米粒可与肿瘤细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)特异性结合并发生细胞内吞，从而降低铂类药物的毒副作用，达到减毒增效的目的，并能够通过促使EGFR蛋白磷酸化抑制EGFR表达，进而发挥协同铂类药物抗肿瘤效果。可用于抗肿瘤药物的制备，尤其在***和卵巢癌的治疗研究中证明，该纳米粒靶向性好，杀伤作用强，在肿瘤基因治疗与化疗药物联合治疗中具有很好的应用前景。

Description

靶向EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒及其制备与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种特异靶向人表皮生长因子受体(EGFR)的载铂类药物白蛋白纳米粒、制备方法及其用途。

(二)背景技术

***是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的第二位最常见的恶性肿瘤，在中国女性中发病率居第一位。全世界每年有20多万妇女死于***。据29个省、市、自治区的调查表明，我国***死亡率占总癌症死亡率的第四位，占女性癌症的第二位。发病年龄以40岁到50岁为最多。卵巢癌是妇科肿瘤中恶性程度最高的疾病，居妇科恶性肿瘤死亡率首位，严重威胁着女性的生殖健康。卵巢癌发病隐匿，极易发生侵袭和远处转移，约70％～80％的卵巢癌患者诊断时即属于III/IV期，其五年生存率仅为30％左右。***和卵巢癌的治疗以彻底的肿瘤减灭术为主，但由于其转移方式多表现为腹腔内散在的广泛种植，故依靠手术彻底切除肿瘤尚不可能，残存的散在肿瘤结节，必须依靠手术后的化疗。最常用的是以铂类为主的一线联合化疗方案，但因化疗药物缺乏选择性且具有毒性反应，它在杀死肿瘤细胞的同时往往也杀死了正常的细胞，导致患者出现骨髓抑制、肾功能不全、消化道反应、心脏传导障碍等情况，生活质量严重下降，一些患者甚至因化疗引起的感染及出血等并发症而死亡，致使药物利用度有限，使用剂量受限。此外，还有一些年老体弱或有心、肝、肾功能不全的患者无法耐受化疗的毒性反应而不能进行化疗，导致卵巢癌迅速进展而死亡。因此，需要一种有效的靶向给药***使药物到达肿瘤区。这种***不仅可以提高药物在肿瘤区的浓度，更有效地杀伤肿瘤细胞，，而且可以减小对正常细胞、组织的损害。纳米粒作为靶向性制剂载体已成为国内外研究的热点，通过载药纳米粒载体将治疗药物靶向地导向病灶部位，可以达到靶向给药的目的，而又对非靶组织、器官、细胞的影响很少。近年来的研究发现，将纳米粒与具有特异肿瘤靶向的活性分子或特殊基团相连，可使之具备肿瘤特异靶向功能，从而在很大程度上提高了肿瘤细胞内的药物浓度。

核酸适配体(Aptamer)是一段DNA(脱氧核糖核酸)或者RNA(核糖核酸)序列，是利用体外筛选技术——指数富集的配体***进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。具有高特异性与亲和性“靶向配基”的筛选，是制约主动靶向给药***研究的瓶颈。以往修饰肿瘤药物的“靶向配基”是抗体、多肽和叶酸等分子，但这些配基修饰的靶向药物在实际应用中均存在着难以克服的缺陷。单克隆抗体潜在的免疫原性和制备的困难大大限制了其临床的应用和产业化的进程；叶酸等小分子虽然有诸多优点，但要求病变组织细胞过多表达叶酸受体，靶向作用才得以实现，而核酸适体却具有以下优点：高亲和力、强特异性，靶标普适性，成本低廉、筛选制备计数成熟、无免疫原性、受体范围广泛。

首个核酸适配体药物“Macugen”由美国FDA在2005年批准上市，成为核酸适配体领域的一个里程碑。美国Achemix、SomaLogic，德国NoxxonAG等多个公司正在开发核酸适配体药物和诊断试剂。肿瘤细胞靶向给药是提高肿瘤治疗效果减少毒副作用的有效途径。将药物偶联于肿瘤细胞特异性配体上是靶向给药的主要方法。核酸能特异性结合细胞并且随之内化，是理想的靶向细胞输送剂。核酸适体“靶向配基”介导或修饰的药物及药物纳米制剂，为主动靶向肿瘤细胞给药***构建开拓了新方向。

白蛋白是一类在血浆中大量存在的蛋白。药物载体研究中常见的白蛋白包括人血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白，分别可以从人血清、牛血清、蛋清中获取。人血清白蛋白是人体内最丰富的血浆蛋白，人血清白蛋白在体内具有多种作用，如：1)增加长链脂肪酸的溶解度；2)结合胆红素；3)与多种药物结合，如青霉素类、磺胺类、吲哚类、苯二氮卓类等药物。白蛋白分子中存在多种药物结合位点，对不同种类的药物均能有效负载；同时其具有水溶性高、稳定性好、可降解等特点，其生物相容性高，已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于人体，因此白蛋白是药物输送的理想载体。基于白蛋白的纳米粒子用于药物输送，可提高疏水性药物的溶解度，并改善药物的代谢动力学。通过控制纳米粒子的粒径，可提高被动靶向作用，提高药物在肿瘤处的摄取。同时，白蛋白上存在的氨基、巯基等，可以进一步修饰主动靶向基团以提高靶向性。紫杉醇-白蛋白纳米粒(nab-paclitaxel，)是第一个应用白蛋白纳米粒技术的上市药物，FDA于2005年1月批准其用于乳腺癌的治疗，SFDA于2008年批准其在中国上市。该制剂利用了肿瘤细胞摄取营养物质的途径，将白蛋白传送的营养物质替换为抗肿瘤药紫杉醇，不仅避免了表面活性剂(如聚氧乙烯蓖麻油)的使用，减少了由此带来的过敏反应，同时使药物富集于肿瘤病灶部位。

已知肿瘤的发生、发展是由细胞信号网络调控的多基因参与的极其复杂的过程，表皮生长因子受体(EGFR)信号通路在正常组织中多呈关闭状态，而在肿瘤组织中被激活开放，而且其活跃程度与肿瘤病情进展呈正相关。本发明人和国内外的许多研究均提示人***、卵巢癌组织和细胞株中均高表达EGFR。本发明人利用EGFR的核酸适配体修饰载药的白蛋白纳米粒，靶向结合细胞表面EGFR高表达的***和卵巢癌细胞，提高细胞内药物摄取量，从而使药物特异性作用于***和卵巢癌细胞，发挥药效，实现靶向治疗。

(三)发明内容

本发明的目的是针对现有临床中的问题，提供一种EGFR核酸适配体修饰的载铂类药物白蛋白纳米粒，具有特异性靶向和主动靶向性、EGFR高表达的***、卵巢癌肿瘤细胞的载铂类药物白蛋白纳米粒，使包裹的铂类药物在血液中能长效循环、对癌组织具有双重靶向性、释药速率可调，以期最大限度的提高疗效、降低其毒副作用。本发明的目的还提供一种上述EGFR核酸适配体修饰的载铂类药物白蛋白纳米粒的制备方法及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒，由白蛋白与铂类药物制成白蛋白载铂纳米粒后，再通过PEG在其表面化学交联EGFR核酸适配体(EGFR apt)制得，粒径为20～500nm，多分散指数在0.1～1之间；所述白蛋白载铂纳米粒、EGFR核酸适配体、PEG摩尔用量之比为0.01～0.1：0.1～10：0.1～10，上述为制备载铂类药物白蛋白纳米粒的主要原料，并未包括制备过程中所用的辅料和溶剂等；

所述铂类药物为下列之一：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、络铂；

所述EGFR核酸适配体长度为30～100nt，且包含如下部分连续碱基(>10nt)或者全部碱基序列：5’-NH₂-C6-UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCGUU-3’。

优选的，所述PEG为氨基化水溶性PEG分子，分子量在200～5000之间。

所述载铂类药物白蛋白纳米粒中还可添加药学上可接受的辅料，所述辅料为下列之一或其中两种以上的混合物：维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸或L-异亮氨酸。

一种制备所述特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒的方法，所述方法包括：

(1)将浓度10～30％(w/w)的人血清白蛋白与0.5～10mg/ml的铂类药物溶液按照其中人血清白蛋白与铂类药物比例为1mg：2～80mg比例充分混合，室温搅拌0.5～1小时，搅拌过程中加入等体积无水乙醇，再加入终浓度0.1％(w/w)的戊二醛，搅拌12～24小时后，4℃下12000rpm离心30min，弃上清，离心后产物重新分散于分散介质中，制得白蛋白载铂纳米粒溶液；所述分散介质为下列之一：水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、5％(w/w)葡萄糖溶液或生理盐水；

(2)取步骤(1)制得白蛋白载铂纳米粒溶液，加入碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，磁力搅拌下充分活化反应10～30min，再加入0.1～10mg/ml的氨基化EGFR适配体分子和0.1～10mg/ml的氨基化PEG分子，室温反应2小时后，取反应液，加入到超滤管中，4000～10000rpm下离心5～15min，除去碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺和未包裹游离的铂类药物，制得所述特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒；所述白蛋白载铂纳米粒(以铂类药物含量摩尔量计算)、EGFR核酸适配体、PEG、碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺摩尔用量之比为0.01～0.1：0.1～10：0.1～10：0.5～1：0.5～10。

优选的，所述铂类药物为顺铂，步骤(1)中分散介质为生理盐水。

所述分散介质中还可添加药学上可接受的辅料，所述辅料为下列之一或其中两种以上的混合物：维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸或L-异亮氨酸。

所述载铂类药物白蛋白纳米粒是氨基化EGFR apt与白蛋白纳米粒表面的羧基进行连接，在纳米粒中包裹铂类药物。白蛋白载体具有良好的生物相容性及降解性，安全无毒。本发明提供的EGFR apt修饰的载铂类药物白蛋白纳米粒，粒径在20～500nm；优选20～200nm之间；所述的纳米粒粒径为多数分散指数PDI在0.25～1之间；再加上EGFR靶向和PEG化，可以有效减少网状内皮***(RES)吞噬，延长循环时间，提高药物制剂的靶向性。所述的PEG化表示在白蛋白分子上化学交联氨基化PEG分子。

本发明还涉及所述的载铂类药物白蛋白纳米粒在制备治疗EGFR蛋白高表达的肿瘤的药物中的应用。

具体的，所述载铂类药物白蛋白纳米粒可用于制备治疗***或卵巢癌的药物。

优选的，所述铂类药物的给药剂量(以铂类药物含量计)为0.01～20mg/kg/每次，给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程给药剂量为0.3～600mg/kg。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的靶向EGFR载铂类药物白蛋白纳米粒制备工艺简单，稳定性好，能够特异识别EGFR高表达肿瘤细胞，抑制肿瘤增值，促进肿瘤细胞凋亡，在抗肿瘤尤其是***和卵巢癌临床治疗中具有重要应用前景。

(四)附图说明

图1为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂理化性质表征图；

图2为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂药物释放曲线；

图3为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂特异识别HELA细胞共聚焦显微镜图；

图4为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂体外抗卵巢癌效果；

图5为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂诱导肿瘤细胞凋亡和坏死效果；

图6为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂体内抗肿瘤活性；

图7为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂体内给药对各内脏器官细胞毒性结果；

图8为靶向EGFR铂类药物白蛋白纳米制剂体内给药后铂类药物组织分布图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：靶向EGFR载顺铂药物白蛋白纳米制剂制备

25％(w/w)人血清白蛋白水溶液2mL与0.5mg/ml顺铂水溶液4mL充分混合，加入6mL无水乙醇，室温搅拌2h，2h后加入终浓度0.01％(w/w)的戊二醛，室温搅拌过夜。4℃下12000rpm离心30min，弃上清，重新分散于10mL生理盐水中，制备得到载顺铂白蛋白纳米粒子溶液。

取载顺铂白蛋白纳米粒子溶液2mL，加入各100μM的EDC和NHS，磁力搅拌下充分活化反应20min，再加入1mg/ml的EGFR核酸适配体(序列为：5’-NH₂-

C6-UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCGUU-3’)溶液1mL和5mg/ml的氨基化PEG分子(分子量4000Da)1mL，反应2小时后，取反应液，加入到超滤管中，8000rpm下离心10min，除去EDC/NHS以及未包裹游离的顺铂，制备得到靶向EGFR载顺铂药物白蛋白纳米粒，其形态规整呈圆形，分散性好，平均粒径为20nm，zeta电位为+12.1mv，包封率为90.5％，见图1。

实施例2：载顺铂高分子纳米粒的体外缓释性实验

取一定量的载顺铂纳米粒装入预先处理好的透析袋(MWCO，3500)中，置于装有18mlPBS(pH＝7.4)的锥形瓶中，37℃，120rpm/min恒温振荡透析，在预定的间隔时间点取出透析液2ml，同时补充2ml 37℃的PBS溶液，电感耦合等离子体发射光谱仪测定透析液中铂的含量。计算不同时间的药物累积释放量，并绘制药物体外释放曲线。结果如图2所示，由图可见，载顺铂纳米粒能够在体外中性环境下，达到负载铂类药物缓慢释放的效果。

实施例3：***HELA细胞对顺铂白蛋白纳米粒的体外摄取实验

10％FCS DMEM培养基常规培养人***HELA细胞，内含1％(v/v)青霉素-链霉素(100U/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)，于37℃培养箱内(5％CO₂)孵育，取对数生长期细胞进行实验。将HELA细胞接种在24孔板中，每孔细胞的密度为3×10⁴/ml，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养过夜。避光操作下，分别在不同孔中加入含荧光标记EGFR适配体的靶向性纳米粒，37℃细胞培养箱中继续培养1h。吸出培养液，37℃PBS洗涤3次。于共聚焦荧光显微镜下观察细胞对纳米粒的摄入情况，结果见图3。

从图3中可以观察到细胞对靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒的特异性摄取作用明显高于单独EGFR适配体分子组。

实施例4：靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒体外抑制卵巢癌细胞增殖的效果

取对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞，制成5×10⁴个/ml悬液，以0.1ml/孔铺96孔板，37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养过夜。吸出培养液，将所制备的靶向或非靶向载顺铂纳米粒用培养液调整到不同浓度，分别加入到96孔板中(另设空白对照和阴性对照)，每个浓度设5个复孔。为评估二甲亚砜(DMSO)对实验的影响，另设3个DMSO组(浓度为0.45％、0.2％、1％分别与2.25、1、0.5mg/ml的材料浓度中DMSO含量一致)。培养24h、48h后，加MTT 10μl/孔继续培养2h，在酶标仪上于490nm波长处测定OD值。

计算细胞存活率：细胞的存活率(％)＝实验组OD值/阴性组OD值×100％。靶向EGFR或非靶向EGFR载顺铂白蛋白纳米粒对于SKOV3细胞均具有明显的杀伤作用，且随着浓度的提高及时间延长抑制作用逐渐增强，其中靶向性载顺铂纳米粒对SKOV3的增殖抑制作用最强，见图4。通过细胞凋亡试剂盒使用流式细胞检测仪检测用药后细胞凋亡和坏死指数，如图5所示，可见靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒具有显著的诱导细胞凋亡和坏死效果。

实施例5：靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒体外抑制***细胞增殖的效果

4-6周龄雌性裸鼠25只，随机分为5组体，分别为生理盐水对照组，EGFR适配体对照组(80μg/剂量)，顺铂对照组(80μg/剂量)，顺铂白蛋白纳米制剂组(80μg顺铂/剂量)，靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒制剂组(80μg/剂量)，每只裸鼠右前肢肋下接种1×10⁶***HELA细胞，待皮下肿瘤长至200mm³时，尾静脉开始分组给药。每周给药2次，每周测量一次肿瘤尺寸大小，给药28天后，解剖，分离肿瘤组织和各内脏器官，测定肿瘤肿瘤、肿瘤组织及内脏器官病理切片。体内抗肿瘤效果如图6，肿瘤组织和内脏器官病理切片如图7。

结果表明靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒具有最优异的体内抗肿瘤效果，并且具有很好的生物安全性，对内脏器官没有显示明显的细胞毒性。

铂类药物组织分布测定：取其心、肝、脾、肾、(以上均为整个器官)分散在1至3mL PBS或者生理盐水漂洗一下，可以直接用剪子将器官剪碎再装入15mL离心管中。加入浓硝酸6ml左右，盖子拧紧，静置过夜。第二天，将脏器放入水浴锅中，80℃煮煮沸，4000转/min离心10min，立即将上清取出，送样测电感耦合等离子体质谱(ICP)。铂类药物在动物各器官组织中生物分布图如图8。

结果表明，靶向EGFR顺铂白蛋白纳米粒给药组顺铂药物在肿瘤组织中蓄积量最高，而在心、肝、脾、肾各组织中残留量则最低，显示了其优异的体内靶向抗肿瘤活性。

Claims (8)

1.一种特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒，由白蛋白与铂类药物制成白蛋白载铂纳米粒后，再通过PEG在其表面化学交联EGFR核酸适配体制得，粒径为20～500nm，多分散指数在0.1～1之间；所述白蛋白载铂纳米粒、EGFR核酸适配体、PEG摩尔用量之比为0.01～0.1：0.01～10：0.01～10；

所述铂类药物为下列之一：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、络铂等铂类化合物。

所述EGFR核酸适配体序列包含如下序列：

5’-NH₂-C6-UGCCGCUAUAAUGCACGGAUUUAAUCGCCGUAGAAAAGCAUGUCAAAGCCGUU-3’。

2.如权利要求1所述的载铂类药物白蛋白纳米粒，其特征在于所述PEG为氨基化水溶性PEG分子，分子量在200～5000之间。

3.制备权利要求1所述特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒的方法，所述方法包括：

(1)将浓度10～30％的人血清白蛋白与0.5～10mg/ml的铂类药物溶液按照其中人血清白蛋白与铂类药物比例为1mg：2～80mg比例充分混合，室温搅拌0.5～2小时，搅拌过程中加入等体积无水乙醇，再加入终浓度0.01％的戊二醛，搅拌12～24小时后，4℃下12000rpm离心30min，弃上清，离心后产物重新分散于分散介质中，制得白蛋白载铂纳米粒溶液；所述分散介质为下列之一：水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、5％葡萄糖溶液或生理盐水；

(2)取步骤(1)制得白蛋白载铂纳米粒溶液，加入碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌下充分活化反应10～30min，再加入0.1～10mg/ml的氨基化EGFR适配体分子和0.1～10mg/ml的氨基化PEG分子，室温反应2小时后，取反应液，加入到超滤管中，4000～10000rpm下离心5～15min，除去碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺和未包裹游离的铂类药物，制得所述特异靶向人表皮生长因子受体EGFR的载铂类药物白蛋白纳米粒；所述白蛋白载铂纳米粒、EGFR核酸适配体、PEG、碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺摩尔用量之比为0.01～0.1：0.1～10：0.1～10：0.5～1：0.5～10。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述分散介质中还添加有药学上可接受的辅料，所述辅料为下列之一或其中两种以上的混合物：维生素E、维生素C、反丁烯二酸、苹果酸、没食子酸丙酯、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、L-半胱氨酸或L-异亮氨酸。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述铂类药物为顺铂，步骤(1)中分散介质为生理盐水。

6.权利要求1所述的载铂类药物白蛋白纳米粒在制备治疗EGFR蛋白高表达的肿瘤的药物中的应用。

7.权利要求6所述的应用，其特征在于所述载铂类药物白蛋白纳米粒用于制备治疗***或卵巢癌的药物。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述铂类药物的给药剂量为0.01～20mg/kg/每次，给药方案为每天给药或间隔给药，每一疗程给药剂量为0.3～600mg/kg。