CN114153061B - 一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法，所述方法包括：将光源发出的光束整形滤波成预设参数的光束，利用光束加载不同焦距的菲涅尔透镜相位进行相位调制；光束通过扫描振镜形成光片，用于激发样本产生荧光信号；通过相机收集分析激发光传播过程中的光强变化，改变空间光调制器上加载的不同焦距的菲涅尔透镜相位区域占比，实现激发光轴向强度调制，补偿样本深处由于吸收导致的光强衰减问题。本发明减少了光片在样本传播过程中的能量衰减，提高了样本深处成像的空间分辨率，降低了图像背景噪音，提高了对比度。

Description

一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法
技术领域
本发明涉及生物医学显微成像技术领域，尤其涉及一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法。
背景技术
光片荧光显微成像技术(Light Sheet Fluorescence Microscopy,LSFM)是目前兼顾分辨率与成像深度，最接近光学显微镜性能优化理想目标的新技术，该技术利用一定厚度的激光光片激发样本内部的造影剂发光，然后在垂直于光片平面的方向收集荧光信号。得益于此，相较于传统的显微成像手段，光片成像具有高空间分辨能力、大视场及快速三维成像等优异特性，在脑科学、类器官等多个生命科学研究领域都有巨大的应用潜力。
在过去的十多年中，光片照明成像技术迎来快速发展时期，并不断与其他先进的光学成像理念相结合。光片成像领域既需要薄光片保证成像的轴向分辨率，又需要长光片保证成像的视场，但是二者存在着矛盾。在众多产生光片的方法中，柱透镜产生的高斯光片是最简单的，但是高斯型光束的截面半径轨迹为双曲线，瑞利长度很短，这就意味着其厚度保持相对薄的区域十分有限。此后，随着扫描振镜引入光片成像领域，越来越多的光片显微***通过f-theta透镜将入射光束扫描生成激发光片，这种生成方式可以更容易地将无衍射光束诸如贝塞尔光束、艾里光束与光片成像结合起来，同时，利用动态扫描来生成光片的模式使得照明更加均匀。
尽管采用了扫描的无衍射光束可以优化光片的轴向分辨率与视场，但两者间的矛盾依然存在。随着激发光路的不断优化，在激发端加装可调透镜***沿着光束传播方向移动高斯光束的焦点位置，形成拼接光片成为了可行的技术手段。目前，产生轴向拼接光片方法有使用可变透镜***轴向扫描光束焦点生成、多层分束器改变轴向焦点位置生成、空间光调制器相位调制使光束沿轴向聚焦于不同位置生成等。
尽管使用这些方法有效扩展了视场，但是在实际生物组织成像过程中，样本大多是由水和脂肪等组成的高吸收介质，对光有强烈的吸收作用，这就造成了光片在样本传播过程中能量严重衰减，最终导致样本深处成像的空间分辨率低，图像背景噪音高，对比度差等问题，所以当前光片成像领域仍然面临着激发光在吸收介质中的光强衰减得不到补偿的问题。
另一方面，简单地依靠提高激发光功率来补偿介质的吸收会造成组织浅层额外的光损伤，不能将光强重新分配。
发明内容
本发明提供了一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法，本发明解决了现有光片成像领域仍然面临着激发光在吸收介质中的光强衰减得不到补偿的问题，减少了光片在样本传播过程中的能量衰减，提高了样本深处成像的空间分辨率，降低了图像背景噪音，提高了对比度，详见下文描述：
一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法，所述方法包括：
将光源发出的光束整形滤波成预设参数的光束，利用光束加载不同焦距的菲涅尔透镜相位进行相位调制；
光束通过扫描振镜形成光片，用于激发样本产生荧光信号；
通过相机收集分析激发光传播过程中的光强变化，改变空间光调制器上加载的不同焦距的菲涅尔透镜相位区域占比，实现激发光轴向强度调制，补偿样本深处由于吸收导致的光强衰减问题。
其中，所述预设参数的光束在进入空间光调制器之前生成，或在空间光调制器上调制生成，
所述空间光调制器通过相位调制同时完成生成预设光束及分区域加载菲涅尔透镜相位的任务，最终由空间光调制器产生轴向强度可调的拼接复杂光束，并经过振镜扫描形成光片。
进一步地，所述方法还包括：将空间光调制器调制的圆形区域细分为密集的扇形区域，根据焦点个数确定相位变化的周期。
在一种实施方式中，光束由空间光调制器相位生成，最终相位为极坐标周期形式的扇形分区域菲涅尔透镜相位；
不同扇形区域面积分配对应不同焦点处光强分配，使用预设的光强沿轴向均匀分布的光片初次成像获得激发光片在样本中传播的光强衰减图像。
其中，所述预设参数的光束为：高斯光束、贝塞尔光束、艾里光束、旋转艾里光束，所述空间光调制器的不同扇形区域生成的光束聚焦在轴向不同位置，分区域加载不同焦距的菲涅尔透镜相位即实现不同光束的拼接。
在一种实施方式中，所述方法根据成像结果得到光片沿传播方向的光强衰减参数，找到不同区域的光强图像沿轴向衰减比值，根据朗伯比尔定律拟合出生物样本介质中光强的指数衰减曲线，构造针对当前生物样本的光强衰减模型。
进一步地，所述方法根据不同样本模型的衰减参数，确定不同轴向焦点位置处的补偿后光强占比，重新分配空间光调制器上密集的扇形区域，按照不同焦点需要的能量占比调整不同焦点所占扇形面积，可控制拼接光片轴向光强分布的作用。
本发明提供的技术方案的有益效果是：
1)本发明提供的方法适用性强，除传统的高斯光束外，可以将贝塞尔光束、艾里光束等复杂光束进行轴向拼接；
2)本发明提供的方法可针对不同生物组织样本，匹配其对光片的衰减影响，能够满足不同生物样本的不同成像需求；另一方面，有别于简单地依靠提高激发光功率来补偿介质的吸收，本发明实际上是将输入的光强沿轴向进行重新分配，不会造成组织浅层额外的光损伤；
3)本发明提供的方法操作简单，根据均匀拼接光片得到的样本中不同轴向位置的衰减信息，调整空间光调制器液晶面板上加载的图案即可实现；
4)本发明最终加载到空间光调制器上的相位图案为对应焦点个数的扇形区域周期性排列，使输入的原始光束均匀分配并调制生成轴向拼接光束；
5)本发明与空间光调制器的其他功能并不冲突，只需将分区域不同焦距的菲涅尔透镜相位叠加在已有的相位调制区域即可，例如，依然可以使用空间光调制器生成调制光束、叠加闪耀光栅等操作，与本发明的光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法并不冲突。
本发明提出的轴向强度可调拼接方法在解决上述问题的同时也实现了在光片显微成像领域的进一步应用。
附图说明
图1为本发明提供的基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接的实现装置的结构示意图；
图2为本发明提供的基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法的流程图；
图3为本发明提供的拼接方法加载相位与生成的扫描光片xz方向的示意图；
图4为本发明提供的拼接方法生成的强度补偿光片荧光微粒成像XZ方向结果的示意图。
附图中，各标号所代表的部件列表如下：
1：光源； 2：第一λ/2玻片；
3：偏振分光镜； 4：光阑；
5：第二λ/2波片； 6：第一透镜；
7：针孔； 8：第二透镜；
9：空间光调制器； 10：第三透镜；
11：第四透镜； 12：振镜；
13：第五透镜； 14：第六透镜；
15：反光镜； 16：第七透镜；
17：第八透镜； 18：照明物镜；
19：成像物镜； 20：筒镜；
21：滤光片； 22：相机。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。
针对上述光片成像技术在实际生物组织成像过程中的问题，即生物样本大多是由水和脂肪等组成的高吸收介质，对光有强烈的吸收作用，这就造成了光片在样本传播过程中能量严重衰减，本发明实施例提供了一种适用于多种光束的激发光轴向强度可调拼接方法，可针对不同组织的对光强的吸收情况，重新分配轴向光强以抵消衰减造成的影响，提升样本深处的成像质量，实现了在光片显微成像领域的进一步应用。
本发明实施例提供了一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法，可以充分利用当前已经形成的光路，基本不改变原始光路设置，仅仅需要在光路中添加空间光调制器，对输入光束进行相位调制即可，且输入光束不局限高斯光束，可以使用光学元件生成各种类型光束，均适用本发明提供的激发光轴向强度可调拼接方法。
实施例1
一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法，参见图1-图4，该方法包括以下步骤：
101：将光源发出的光束整形滤波成预设参数的光束；
即可以通过激光扩束***、空间滤波***等整形装置产生一路预设参数的光束。
实际应用时，预设参数的光束可以在进入空间光调制器之前生成，也可以在空间光调制器上调制生成，此时空间光调制器可以通过相位调制同时完成生成预设光束及分区域加载菲涅尔透镜相位的任务，最终可完全由空间光调制器产生轴向强度可调的拼接复杂光束，并经过振镜扫描形成光片。将空间光调制器调制的圆形区域细分为密集的扇形区域，根据需要的焦点个数确定相位变化的周期。
102：利用光束加载不同焦距的菲涅尔透镜相位进行相位调制；
即加载分区域的不同焦距的菲涅尔透镜相位，不同调制区域的激光沿轴向聚焦于不同位置，实现激光拼接。工作时，调制后的拼接光束再次经过光学***整形，经振镜扫描形成光学切片，振镜处理后续光路透镜的前焦点，组成f-theta振镜***，生成均匀光片，同时在物镜的输入平面，振动只改变光束的入射角。
其中，叠加的菲涅尔透镜相位实际是等同于透镜光学元件，引入不同焦距的菲涅尔透镜相位相当于使正常传播的光束，经过凸透镜汇聚使光束在原焦点前聚焦，或经过凹透镜发散使光束在原焦点后聚焦。根据菲涅尔透镜相位与其焦距的公式推导得到预设焦距参数f与偏移量δx成反比例函数关系，经过实验可验证参数f对应的偏移量δx。
103：光束通过扫描振镜形成光片，用于激发样本产生荧光信号；
其中，扫描拼接光束形成光片，从样本一侧入射，激发样本产生荧光。
104：通过相机收集分析激发光传播过程中的光强变化，改变空间光调制器上加载的不同焦距的菲涅尔透镜相位区域占比，实现激发光轴向强度调制。
其中，该步骤具体为：通过相机收集成像结果，分析激发光片在样本传播过程中的光强变化，改变空间光调制器上加载的不同焦距的菲涅尔透镜相位区域占比，实现激发光轴向强度调制，补偿样本深处由于吸收导致的光强衰减问题。
实际应用中，样本成像结果用于进行数据分析计算激发光片在传播过程中的光强变化，根据朗伯比尔定律拟合出生物样本介质中光强的指数衰减曲线，需要将收集到的图像经过数据统计与分析，首先应找到不同区域的图像光强沿轴向衰减比值，根据该参数拟合出光强沿轴向指数衰减的参数，进而调整空间光调制器液晶面板上一个调制周期内不同焦距的菲涅尔透镜相位对应的扇形区域大小，使之产生强度补偿，达到叠加衰减效果后光强重新沿轴向均匀分配的目的。
其中，生物样本介质中光强指数衰减曲线需由均匀拼接光片成像分析测得，均匀拼接光片由空间光调制器加载相同区域大小的不同焦距的菲涅尔透镜相位生成。
而最终光片需要根据生物样本介质中光强衰减曲线进行调整，使用均匀拼接光片成像分析测得的不同轴向位置的焦点处光强衰减参数对应当前样本中不同位置的衰减系数。需要调整空间光调制器上加载的图案，空间光调制器上不同区域对应样本空间处不同轴向的焦点，空间光调制器上菲涅尔透镜相位区域的大小对应不同焦点处光强分配的多少。
最终光片由空间光调制器相位生成，最终相位为极坐标周期形式的扇形分区域菲涅尔透镜相位，不同扇形区域面积分配对应不同焦点处光强分配，使用预设的光强沿轴向均匀分布的光片初次成像获得激发光片在样本中传播的光强衰减图像，其中生成光强沿轴向均匀分布的光片相位的各个扇形区域面积相等，此时不同焦点的光强相同。通过本方法生成的光片用于吸收组织的光片成像补偿传播深处光强能量衰减。
其中，本发明实施例仅以图1中的光路为例进行说明，具体实现时，本发明实施例对此不做赘述。
综上所述，本发明实施例使用激发光轴向强度可调的拼接光片解决了普通光片工作时无法补偿传播深处光强能量衰减的问题。
实施例2
下面结合具体的器件参数，对实施例1中的方案进行进一步地介绍，详见下文描述：
如图1所示，以现有技术的光片显微光路为例，本发明实施例的设计实例使用的调制元件为Thorlabs公司的空间光调制器，型号EXULUS-4K1，空间光调制器液晶面板可调制的区域为14.36mm×8.08mm，激光光源生成一束高斯光束，先经过半波片后，进入一偏振分光棱镜，将入射光变为固定方向的线偏振光，同时可以通过半波片调整入射光强。由于液晶面板可调制尺寸为14.36mm×8.08mm，所以本发明实施例将光束扩束为8mm×8mm。经过透镜6与透镜8组成的扩束***将光束扩展为直径8mm的高斯光束，在扩束***的两个凸透镜之间的焦点处放置一小孔进行空间滤波，目的是优化出射的光束质量，针孔7实质为放置在透镜傅里叶平面的低通滤波器，能够实现通过此方法滤除一些杂散光。
由光源1发出激光，通过第一λ/2玻片2与偏振分光镜3可以组合改变后续光路整体光强，同时经过偏振分光镜3出射的光为固定方向线偏振光。光阑4调整此时光束的直径，通过第二λ/2波片5，将固定方向的线偏振光调整为与原始偏振方向呈45°角，与液晶面板光轴偏振方向相同(空间光调制器工作需要)。通过第一透镜6与第二透镜8组成的扩束***，在其焦点位置放置针孔7进行空间滤波。光束经过第一透镜6、针孔7及第二透镜8进行光束整形入射到空间光调制器9的液晶面板，空间光调制器9的液晶面板上加载多轴向焦点菲涅尔透镜相位图案。第三透镜10、第四透镜11组成一中继器件，将光束中继至振镜12，同时第三透镜10、第四透镜11将光束缩束以适应振镜12的大小。振镜12放置在第五透镜13的焦点位置，第五透镜13、第六透镜14、第七透镜16及第八透镜17之中的相邻透镜组成4F***，光束经过4个透镜在照明物镜18的输入平面得到需要的光束。扫描光束经照明物镜18聚焦，在照明物镜18的焦点位置形成扫描光片，照明样本。激发产生的荧光信号经成像物镜19与筒镜20组成一个显微成像光路、滤光片21滤除除荧光外的其它波长的光在相机22处被收集。
其中，第五透镜13、第六透镜14作为相邻透镜组成一个***，第七透镜16及第八透镜17作为相邻透镜组成另一个***。第五透镜13、第六透镜14、第七透镜16及第八透镜17组成的2个***，起到中继作用，将振镜12的图案中继到照明物镜18中。
针对实际需要光束的产生方式以及空间光调制器拼接光束轴向偏移参数，确定空间光调制器上加载的相位图案。如图3所示，在不需要空间光调制器实现额外调制功能的情况下，几个简单的加载相位如图3所示，将空间光调制器的液晶面板周期性的分为不同的扇形区域，不同扇形区域加载的相位调制图案区别在于对应菲涅尔透镜相位的参数。
分区域依据如下，若需要拼接n个不同的、强度均匀的轴向焦点，单个周期中对应相位的扇形夹角为αs，则全部不同轴向焦点相位的周期为α＝nαs，需要满足knαs＝kα＝2π，k为整数。实际设计相位图过程中，使k尽可能大，对应α尽可能小，但是同时需要兼顾空间光调制器液晶面板的像素实际大小。
不同区域加载的相位图依据所对应焦点的偏移量决定，构造偏移透镜焦距函数f(δx)，复振幅分布依据公式空间光调制器相位调制使用需加载复振幅E的相位部分。叠加的菲涅尔透镜相位实际是等同于透镜光学元件，引入不同焦距的菲涅尔透镜相位相当于使正常传播的光束，经过凸透镜汇聚使光束在原焦点前聚焦，或经过凹透镜发散使光束在原焦点后聚焦。根据菲涅尔透镜相位与其焦距的公式推导得到预设焦距参数f与偏移量δx成反比例函数关系，经过实验可验证参数f对应偏移量δx。
其中，本实例的偏移透镜焦距函数f(δx)根据实验测得，即输入不同参数实验测得偏移量δx，由组合透镜焦距公式可以推出偏移透镜焦距函数f与偏移量δx成反比例函数，将测得的参数f对应偏移量δx使用插值法得到对应的各个具体参数。
可选的，输入空间光调制器液晶面板的预设光束不局限于高斯光束，可以输入诸如：贝塞尔光束、艾里光束、旋转艾里光束等无衍射光束，此时，空间光调制器直接分区域加载不同焦距的菲涅尔透镜相位即可实现特殊光束的拼接，本发明具有普遍适用性。
可选的，若使用除高斯光片以外的其他光片形式，可以选择由空间光调制器经过相位调制生成其他光束，本发明实施例所使用的空间光调制器功能可叠加，例如：选择使用空间光调制器生成艾里光束、贝塞尔光束且进行轴向多焦点拼接，可将生成艾里光束的复振幅与本发明实施例使用的多焦点相位/>叠加，复振幅E＝Ea×Em，即相位/>将获得的调制相位除以2π取余，同时将数值调整到0-1，输出图像即可加载到空间光调制器上，此时，不同扇形区域生成的光束聚焦在轴向不同位置，拼接形成多焦点光束。
调制后的拼接光束再次经过光学***整形，经振镜扫描形成光学切片，振镜处理后续光路透镜的前焦点，组成f-theta振镜***，生成均匀光片。同时，在物镜的输入平面，光束振动只改变其入射角，在生物样本位置光片上下依然平行。
使用预设的光强沿轴向均匀分布的光片初次激发样本，使用相机收集生物样本发射的荧光信号，得到激发光片在样本中传播的光强衰减图像，根据成像结果得到光片沿传播方向的光强衰减参数。首先应找到不同区域的光强图像沿轴向衰减比值，使用此衰减参数，根据朗伯比尔定律拟合出生物样本介质中光强的指数衰减曲线，构造针对当前生物样本的光强衰减模型。
如图3所示，本发明实施例将根据上述不同样本模型的衰减参数，确定不同轴向焦点位置处的补偿后光强占比，重新分配空间光调制器上密集的扇形区域，按照不同焦点需要的能量占比调整不同焦点所占扇形面积，即调整对应的夹角大小。例如：不同焦点对应的单个区域的扇形夹角为αi，全部不同轴向焦点相位的周期α＝α1+…+αn，此时α1的大小对应其焦点的光强，通过调整αi的大小，可控制拼接光片轴向光强分布的作用。
图4为利用本发明实施例进行的荧光微球实验测定，分别对比了普通均匀拼接光片与本发明实施例生成的强度补偿光片应用的实际荧光微粒成像XZ方向结果。成像设置为10倍激发物镜与10倍检测物镜，光片扫描步长为0.5微米。根据有无强度补偿的荧光微球成像结果，在光片传播浅层，两种光片成像荧光微球强度基本一致，而在光片传播深处，由于光片强度衰减，均匀光片的成像相较补偿光片有明显的降低。荧光微球实验测定说明本发明实施例的激发光轴向强度可调拼接方法能够补偿传播深处光强能量衰减的问题，提高组织深处成像的信号背景比，优化成像质量。
本发明属于显微成像技术领域，公开了一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法。可针对不同生物组织样本，满足不同衰减生物样本的不同成像需求。本发明实施例将输入的光强沿轴向进行重新分配，有别于简单地依靠提高激发光功率来补偿介质的吸收，不会造成组织浅层额外的光损伤。该拼接方法通过将空间光调制器调制的圆形区域细分为密集的扇形区域，根据需要的焦点个数确定相位变化的周期。同时根据初步样本成像结果找到不同区域的图像光强沿轴向衰减比值，根据该参数拟合出光强沿轴向指数衰减的参数，进而调整空间光调制器液晶面板上一个调制周期内不同焦距的菲涅尔透镜相位对应的扇形区域大小，使之产生强度补偿，达到叠加衰减效果后光强重新沿轴向均匀分配的目的。本发明提供了一种光强衰减补偿方法，可将光片的轴向强度重新分配，解决了普通光片工作时无法补偿高吸收介质传播深处光强能量衰减的问题。实现了在光片显微成像领域的进一步应用。
本发明实施例对各器件的型号除做特殊说明的以外，其他器件的型号不做限制，只要能完成上述功能的器件均可。
本领域技术人员可以理解附图只是一个优选实施例的示意图，上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法，其特征在于，所述方法包括：
将光源发出的光束整形滤波成预设参数的光束，利用光束加载不同焦距的菲涅尔透镜相位对经过λ/2玻片和小孔整形滤波后预设参数的光束进行相位调制；
光束通过扫描振镜形成光片，用于激发样本产生荧光信号；
通过相机收集分析激发光传播过程中的光强变化，改变空间光调制器上加载的不同焦距的菲涅尔透镜相位区域占比，实现激发光轴向强度调制，补偿样本深处由于吸收导致的光强衰减问题；
其中，样本成像结果用于进行数据分析计算激发光片在传播过程中的光强变化，根据朗伯比尔定律拟合出生物样本介质中光强的指数衰减曲线，将收集到的图像经过数据统计与分析，找到不同区域的图像光强沿轴向衰减比值，根据比值拟合出光强沿轴向指数衰减的参数，调整空间光调制器液晶面板上一个调制周期内不同焦距的菲涅尔透镜相位对应的扇形区域大小，产生强度补偿，达到叠加衰减效果后光强重新沿轴向均匀分配的目的；
光片由空间光调制器进行相位调制生成，空间光调制器上生成的最终相位为极坐标周期形式的扇形分区域菲涅尔透镜相位，不同扇形区域面积分配对应不同焦点处光强分配，使用预设的光强沿轴向均匀分布的光片初次成像获得激发光片在样本中传播的光强衰减图像，其中生成光强沿轴向均匀分布的光片相位的各个扇形区域面积相等，生成的光片用于吸收组织的光片成像补偿传播深处光强能量衰减；
将空间光调制器调制的圆形区域细分为密集的扇形区域，根据焦点个数确定相位变化的周期；根据不同样本模型的衰减参数，确定不同轴向焦点位置处的补偿后光强占比，重新分配空间光调制器上密集的扇形区域，按照不同焦点需要的能量占比调整不同焦点所占扇形面积，可控制拼接光片轴向光强分布的作用。
2.根据权利要求1所述的一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法，其特征在于，所述预设参数的光束在进入空间光调制器之前生成，或在空间光调制器上调制生成，
所述空间光调制器通过相位调制同时完成生成预设光束及分区域加载菲涅尔透镜相位的任务，最终由空间光调制器产生轴向强度可调的拼接复杂光束，并经过振镜扫描形成光片。
3.根据权利要求1所述的一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法，其特征在于，所述预设参数的光束为：高斯光束、贝塞尔光束、艾里光束、旋转艾里光束，所述空间光调制器的不同扇形区域生成的光束聚焦在轴向不同位置，分区域加载不同焦距的菲涅尔透镜相位即实现不同光束的拼接。
4.根据权利要求1所述的一种基于光片成像的激发光轴向强度可调拼接方法，其特征在于，所述方法根据成像结果得到光片沿传播方向的光强衰减参数，找到不同区域的光强图像沿轴向衰减比值，根据朗伯比尔定律拟合出生物样本介质中光强的指数衰减曲线，构造针对当前生物样本的光强衰减模型。
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