CN114149980A

CN114149980A - 一种新型蛋白质生物素连接酶及基于其的邻近标记***PhastID

Info

Publication number: CN114149980A
Application number: CN202111302493.0A
Authority: CN
Inventors: 松阳洲; 冯然; 刘峰; 吴苏; 李克成; 李影影; 周志芬; 李若菲; 刘熠
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2021-11-04
Filing date: 2021-11-04
Publication date: 2022-03-08
Anticipated expiration: 2041-11-04
Also published as: CN114149980B

Abstract

本发明公开了一种新型蛋白质生物素连接酶及基于其的邻近标记***PhastID。具体公开了蛋白质生物素连接酶BPL及改造后的突变蛋白质生物素连接酶BPL*及基于上述生物素连接酶BPL或BPL*的邻近蛋白标记***PhastID。所述包含蛋白质生物素连接酶BPL*的标记***，相比与传统的BioID邻近标记***，其标记强度更高，所需标记时间更短，具有较大的应用前景。

Description

一种新型蛋白质生物素连接酶及基于其的邻近标记*** PhastID

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及新型蛋白质生物素连接酶BPL及经过突变的蛋白质生物素连接酶融合蛋白BPL*及基于上述蛋白质生物素连接酶BPL或BPL*的邻近标记***PhastID。

背景技术

蛋白质生物素连接酶可以通过活化生物素(Biotin)形成生物素酰-5’-腺苷酸Biotinyl-5’-AMP，将生物素标记到其底物上。而经过人工改造，该连接酶可失去对底物的特异性标记，释放的Biotinyl-5’-AMP化学性质极不稳定，可随机与邻近的赖氨酸残基发生反应，使其共价标记生物素，该范围约为10nm以内。结合生物素与链霉亲和素之间的高亲和力和稳定性，可对蛋白进行示踪、纯化等操作。由于其标记半径约为10nm，该距离恰好是蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)的前提，因此在蛋白质组学中具有广泛的应用前景。近年来，利用生物素连接酶进行邻近蛋白标记技术发展迅猛，这种技术首先将目的蛋白与生物素连接酶形成融合蛋白，经过一定时间的Biotin标记后，通过生物素-链霉亲和素***，纯化出目的蛋白周围被生物素连接酶标记的蛋白，再通过高通量的方法进一步鉴定出与之有相互作用的蛋白。目前，已有多种物种的生物素连接酶，经突变后发展为邻近标记技术被报道，包括BioID(BirA*，来自Escherichia coli，参考文献：Roux KJ,Kim D I,Raida M,et al.A promiscuous biotin ligase fusion protein identifiesproximal and interacting proteins in mammalian cells[J].J Cell Biol,2012,196(6):801-810.)、BioID2(BPL，来自Aquifex aeolicus，参考文献：Kim D I,Jensen S C,Noble K A,et al.An improved smaller biotin ligase for BioID proximitylabeling[J].Molecular biology of the cell,2016,27(8):1188-1196.)、RapID(BASU，来自Bacillus subtilis，参考文献：Ramanathan M,Majzoub K,Rao D S,et al.RNA–protein interaction detection in living cells[J].Nature methods,2018,15(3):207.)和TurboID(突变自BirA*，参考文献：Branon T C,Bosch J A,Sanchez AD,etal.Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID[J].Nature biotechnology,2018,36(9):880-887)。但由于这些邻近标记技术均存在一定缺陷，如：标记能力较弱，故所需时间较长，在检测瞬时或弱相互作用蛋白时能力较弱；或酶的蛋白分子量较大。因此，寻找一种新型的，在结构及功能上都更具优势的生物连接酶具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种新型蛋白质生物素连接酶BPL。

本发明的第二个目的在于提供一种突变蛋白质生物素连接酶BPL*。

本发明的第三个目的在于提供所述蛋白质生物素连接酶BPL或突变蛋白质生物素连接酶BPL*的应用。

本发明的第四个目的在于提供一种包含上述蛋白质生物素连接酶BPL或突变蛋白质生物素连接酶BPL*的邻近标记***。

本发明的第五个目的在于提供所述邻近标记***的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种蛋白质生物素连接酶(Biotin Protein Ligase，BPL)，包括来源于古细菌Pyrococcus horikoshii的BPL，称为PhBPL；来源于古细菌Pyrococcus kukulkanii的BPL，称为PkBPL；或来源于古细菌Methanocaldococcus fervens的BPL，称为MfBPL；

(a)其氨基酸序列分别依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所述；

或

(b)与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所述氨基酸序列具有70％以上同源性且具有生物素蛋白连接酶活性的蛋白。

一种突变蛋白质生物素连接酶BPL*，为蛋白质生物素连接酶BPL(PhBPL、PkBPL、MfBPL)的突变体；具体为SEQ ID NO.1所述PhBPL R48氨基酸残基的突变：R48G或R48S突变，即PhBPL(R48G)或PhBPL(R48S)，称为PhBPL*；或SEQ ID NO.2所述PkBPL R48氨基酸残基的突变：R48G或R48S突变，即PkBPL(R48G)或PkBPL(R48S)，称为PkBPL*；或SEQ ID NO.3所述MfBPL R40氨基酸残基的突变：R40G，即MfBPL(R40G)，称为MfBPL*。

本发明将PhBPL R48氨基酸残基，PkBPL R48氨基酸残基及MfBPL R40氨基酸残基进行了突变，从而获得了较传统的BioID标记强度更高，所需标记时间更短的蛋白质生物素连接酶BPL*。

本发明还提供一种编码上述突变蛋白质生物素连接酶BPL*的核苷酸序列。

优选地，PhBPL(R48G)、PkBPL(R48G)及MfBPL(R40G)的编码核苷酸序列依次如SEQID NO.4～6所示。

一种包含所述突变蛋白质生物素连接酶BPL*编码核苷酸序列的重组表达载体。例如：pcDNA3.1(-)-BPL*、pLenti-HA-BPL*。

一种包含上述重组表达载体的宿主细胞。例如：293T细胞、HEK293T细胞、Hela细胞。

上述每一种蛋白质生物素连接酶BPL*均可单独建立一套BPL*标记***。具体地，BPL*可快速催化ATP与生物素形成Biotinyl-5’-AMP并将之释放，后者可与邻近蛋白质赖氨酸残基发生反应，并将生物素共价结合在赖氨酸残基上，从而在生物素存在的情况下，在体内或体外对邻近蛋白质进行生物素标记。

因此本发明保护上述蛋白质生物素连接酶BPL或突变蛋白质生物素连接酶BPL*在邻近蛋白标记或在制备邻近蛋白标记***中的应用。

一种包含上述蛋白质生物素连接酶BPL或突变蛋白质生物素连接酶BPL*的邻近蛋白标记***。具体为包含待研究的“诱饵蛋白”(Bait protein)、融合表达在诱饵蛋白N-端或C-端的新型蛋白质生物素连接酶BPL*。

一种邻近蛋白标记方法，先将待研究的目的蛋白与上述的突变蛋白质生物素连接酶BPL*形成融合蛋白，经生物素标记，通过生物素-链霉亲和素***，纯化出目的蛋白周围被生物素连接酶标记的蛋白，再通过高通量的方法进一步鉴定出与之有相互作用的蛋白。

具体为：

(1)通过重组或敲入等方法，在待研究的“诱饵蛋白”的N端或C端融合表达蛋白质生物素连接酶BPL*；

(2)在体外或体内，具有ATP和Biotin等底物存在的情况下，标记15min以上；

(3)将细胞或组织裂解，用偶联在固相上的(Strept-)avidin亲和纯化被Biotin标记的蛋白；

(4)利用ELISA、Western Blot、质谱等方法鉴定被标记的蛋白，以发现新的互作蛋白。

优选地，所述生物素浓度为5μM～50μM。

优选地，所述标记时间为10min～16h。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种蛋白质生物素连接酶BPL、改造后的突变蛋白质生物素连接酶BPL*及基于其的邻近标记***。所述包含蛋白质生物素连接酶BPL*的标记***，相比与传统的BioID邻近标记***，其标记强度更高，所需标记时间更短。具有较大的应用前景。

附图说明

图1为新型生物素酶标记蛋白免疫印迹(Western blot)检测结果图(左为检测结果图，右为统计图)。

图2为新型生物素酶在不同时间标记蛋白免疫印迹(Western blot)检测结果图(图A)及统计图(图B)。

图3为具有核定位信号的新型生物素酶PhBPL*与BioID2标记强度比较图(左为检测结果图，右为统计图)。

图4为新型生物素酶在不同浓度标记蛋白免疫印迹(Western blot)检测结果图。

图5为体外利用亲和链霉素检测新型生物素酶融合蛋白(TRF1)与端粒结合蛋白RAP1的相互作用图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1蛋白质生物素连接酶BPL*(PhBPL*、PkBPL*和MfBPL*)的获得

在NCBI上获取多种物种的生物素连接酶序列，包括来源于古细菌Pyrococcushorikoshii的BPL，称为PhBPL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；来源于古细菌Pyrococcus kukulkanii的BPL，称为PkBPL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；和来源于古细菌Methanocaldococcus fervens的BPL，称为MfBPL，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；分析其GNGR motif(N表示碱性氨基酸)，并将上述蛋白突变为GNGG形式；PhBPL R48氨基酸残基突变：R48G或R48S突变，即PhBPL(R48G)或PhBPL(R48S)，称为PhBPL*；PkBPL R48氨基酸残基突变：R48G或R48S突变，即PkBPL(R48G)或PkBPL(R48S)，称为PkBPL*；MfBPL R40氨基酸残基突变：R40G，即MfBPL(R40G)，称为MfBPL*。

PhBPL(R48G)、PkBPL(R48G)及MfBPL(R40G)的编码核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4～6所示。

SEQ ID NO.1：

MLGLKTSIIGRRVIYFQEITSTNEFAKTSYLEEGTVIVADKQTMGHGRLNRKWESPEGGLWLSIVLSPKVPQKDLPKIVFLGAVGVVETLKEFSIDGRIKWPNDVLVNYKKIAGVLVEGKGDKIVLGIGLNVNNKVPNGATSMKLELGSEVPLLSVFRSLITNLDRLYLNFLKNPMDILNLVRDNMILGVRVKILGDGSFEGIAEDIDDFGRLIIRLDSGEVKKVIYGDVSLRFL；

SEQ ID NO.2：

MLSLKTSIIGKKVIYYQEISSTNDVAKSLDVEEGTVIVADRQTKGRGRLNRKWISPEGGLWLSVVLKPKVAPQDIPKIVFLGAIGVVRTLEELSIPGRIKWPNDVLVNFRKISGILTEKVGEKVILGIGINVNNNTPENGIAVKNVLGKEVSLVHVFKILLENLDELYEIYLKSPGTIVELARELMILNVPVKVLGNGEVVGIAEDIDEDGRLVLRLGNGEIRKIIYGDVSLRFL；

SEQ ID NO.3：

MEIIHLSEVDSTNEYAKKLAKEGKRNFVVLADKQSTGKGRWGRVWYSDEGGLYFTIVLDSNEYDPKVINLITPISIIETLKNYTDKELGIKFPNDIMVKVNGDYKKLGGILAELINGYMIIGIGINVNNPIRKEIREIAVSLKEVVGKEIDRVEIFNDFLKRFEDYLKKLKNNEIDDYEILKNYKKYSITIGRTVKILLSNNEVITGKVYDIDFDGIVLGTEEGIEKIPTGICIHVR；

SEQ ID NO.4

atgctgggcctgaagacaagcatcatcggccggcgggtcatctacttccaggagatcaccagcaccaacgagttcgccaagaccagctacctggaggagggaaccgtgatcgtggccgataagcagaccatgggccacggaggcctgaacagaaagtgggagtccccagaaggaggcctgtggctgtctatcgtgctcagccctaaagtgccccagaaggacctgcctaagatcgtgttcctgggagcagtgggcgtggtggaaaccctgaaggagttcagcatcgacggcagaatcaagtggcccaacgacgtgctcgtgaactacaagaagatcgccggcgtgctggtcgagggcaaaggcgacaagatcgtgctgggcatcggcctgaacgtgaacaacaaggtgcccaacggcgccacaagcatgaaactggagctgggatcagaagtgcctctgctgagcgtgttcaggagcctgatcaccaacctggaccggctgtacctgaacttcctgaagaaccccatggacatcctgaacctcgtgcgggacaacatgatcctgggcgtgagagtgaagatcctgggcgacggcagcttcgagggcatcgccgaggatatcgacgacttcgggcggctgatcatcaggctggacagcggcgaggtcaagaaggtcatctacggcgacgtgtccctgagattcctgtag；

SEQ ID NO.5：

atgctgagcctgaagaccagcatcatcggcaagaaggtcatctactaccaggagatcagcagcaccaacgacgtggctaagagcctggacgtggaggaaggaaccgtgatcgtggccgataggcagaccaagggaaggggaggcctgaatcgcaagtggatcagcccagaaggaggactctggctgtcagtggtgctcaagcctaaagtggcccctcaggacatccccaagatcgtgtttctgggcgccatcggcgtcgtgagaacactggaggagctgagcatccccggcagaatcaagtggcccaacgacgtgctcgtgaacttccggaagatcagcggcatcctgaccgagaaggtcggcgagaaggtcatcctgggcatcggcatcaacgtgaacaacaacacccccgagaacggcattgccgtgaagaacgtgctgggcaaggaagtgtctctggtgcacgtgttcaagatcctgctggagaacctggacgagctgtacgagatctacctgaagagccccggcaccatcgtggaactggccagggagctgatgatcctgaacgtgcccgtgaaggtgctgggaaacggagaggtcgtgggaatcgccgaggatatcgacgaggacggcagactggtgctgagactgggaaacggcgagatccggaagatcatctacggcgacgtgtccctgagattcctgtag；

SEQ ID NO.6：

atggagatcatccacctgagcgaagtggacagcaccaacgagtacgccaagaagctggccaaggagggcaagcggaacttcgtggtgctggccgacaagcagagcacaggaaaaggcggctggggcagagtgtggtatagcgacgagggaggcctgtacttcaccatcgtgctggacagcaacgagtacgaccccaaggtcatcaacctgatcacccccatcagcatcatcgagaccctgaagaactacaccgacaaggagctgggcatcaagttccccaacgacatcatggtgaaggtcaacggcgactacaagaagctgggcggaatcctggccgaactgatcaacggctacatgatcatcggcatcggcatcaacgtgaacaaccccatccggaaggagatccgggagatcgcagtgtccctgaaggaggtcgtgggaaaggagatcgaccgggtggagatcttcaacgacttcctgaagcgcttcgaggactacctgaagaagctgaagaacaacgagatcgacgactacgagatcctgaagaactacaagaagtacagcatcaccatcggccggaccgtgaagatcctgctgagcaacaacgaggtcatcaccggcaaggtgtacgacatcgacttcgacggcatcgtgctgggaacagaggagggcatcgagaagatccccaccggcatttgcatccacgtccgatag。

实施例2蛋白质生物素连接酶BPL*重组质粒构建及表达

(1)重组质粒的构建

将真核表达载体pcDNA3.1(-)用BamHI和HindIII双酶切后回收，然后与经BamHI和HindIII双酶切后回收的新型生物素连接酶BPL*(PhBPL*、PkBPL*和MfBPL*)PCR片段(SEQID NO.4～6)在T4连接酶作用下连接，转化DH5α感受态细胞后涂布在含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，进行测序鉴定，鉴定的阳性质粒即为所需重组质粒。

(2)哺乳动物细胞瞬时表达新型生物素连接酶

为构建表达新型生物素连接酶的哺乳细胞系，利用Lipofectamine 2000转染法将步骤(1)的pcDNA3.1重组质转染入293T细胞，具体步骤如下：

转染前一天，在六孔板中接种293T细胞，于37℃、5％CO₂、含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基中培养，至转染时细胞密度为40％～60％。在250μL Opti-MEM减血清培养基中稀释2μg重组质粒，并轻轻混匀。另取10μL Lipofectamine 2000，稀释于250μL Opti-MEM减血清培养基中。室温下静置5分钟。混合Lipofectamine 2000和线性化质粒的稀释液。轻轻混匀并在室温下静置20分钟。向细胞板上接种293T细胞的孔中加混合液500μL，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀，转入CO₂培养箱中培养。次日更换新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基中继续培养。

(3)Western blotting检测生物素标记

转染24h后收取细胞，Western blot检测标记效果，如图1(左为检测结果图，右为统计图)所示，PhBPL*、PkBPL*和MfBPL*同已被发表的AaBPL*(BioID2)类似，均展现出标记活性。

Western blotting具体实施方法如下：

(a)SDS—PAGE胶的配制

首先选取合适厚度的长玻璃板(1mm或0.75mm)，与短玻璃板对齐夹在制胶夹上，用洗瓶向两板间空隙加满ddH₂O进行验漏，如一至两分钟水平面没有下降说明两胶板配合严密，此时将水倒出并用吸水纸吸干。取干净烧杯按下表1配制分离胶(以一块10％的分离胶为例)：

表1分离胶配制成分

将分离胶溶液倒入两板间空隙，用洗瓶沿着玻璃板壁在胶上层加入ddH₂O，约20min后可看到胶与水明显分层，说明胶已凝固；

将上层水倒出并用吸水纸吸干，准备与胶板厚度对应的梳子(10孔or 15孔)，按下表2配制浓缩胶：

表2浓缩胶配制成分

将浓缩胶溶液小心加入分离胶上层，尽量避免气泡产生。胶板加满后，小心插上梳子，约10min后可见梳齿边缘明显轮廓，说明胶已凝固。将胶板从制胶夹中拿出，用水冲洗后待用。

(b)SDS-PAGE凝胶电泳

将胶连同胶板安装在电泳槽上，内槽加满电泳缓冲液，外槽加至指示刻度。将准备好的蛋白样品点入胶孔后盖好盖子连接电源，设置两步电泳程序：80V15min，150V 45min,待溴酚蓝指示带跑至胶的下边缘是停止。在流水下撬开两玻璃板，将胶取出，根据需要泡入不同溶液中，如考马斯亮蓝染液，硝酸银染色固定液或转膜缓冲液。

(c)膜转印

准备与胶差不多大小的NC膜，并准备滤纸，同样泡入预冷的转膜缓冲液中。依照海绵、滤纸、NC膜、胶、滤纸、海绵的顺序将其叠放好(注意胶与膜间不应有气泡)，用转膜夹夹紧后安装在转膜槽，加满转膜液。转膜槽置于冰浴中或者放入4度冰箱，200-250mA转膜1小时。

(d)蛋白信号检测

将转膜完毕的NC膜置于封闭液中摇动1h，转移至稀释的Streptavidin-HRP中孵育1h或者4度过夜，孵育后将膜在TBST溶液中漂洗3次，采用Luminata^TM Forte作为底物显色，在BioRad ChemiDoc XRS+凝胶成像***中拍照。

或者，封闭后的NC膜用稀释的Streptavidin-Alexa Fluor 680孵育1h，孵育后将膜在TBST溶液中漂洗3次。蛋白条带信号用Odyssey双色红外激发光成像***检测并记录。

实施例3采用蛋白质生物素连接酶BPL*标记邻近蛋白的条件探索

分别将新型生物素连接酶BPL*(PhBPL*、PkBPL*和MfBPL*)(SEQ ID NO.4～6)与端粒结合蛋白TRF1一起重组克隆到慢病毒载体上，在其N端加入HA抗原，形成pLenti-HA-BPL*-TRF1载体，同时构建pLenti-HA-BPL*-NLS载体。

将HEK293T细胞传至6cm²培养皿，代其密度达到70％-80％进行转染。转染前，根据需要选择配制表3所示下列转染体系：

表3转染体系

体系配好后用移液枪吹打混匀，室温静置15min。加至培养的细胞培养基中，前后摇动混匀；6小时后换新鲜培养基，继续培养至48小时；收集病毒液上清。

病毒收集后，进行病毒感染目的细胞。首先要将HeLa细胞进行铺板，保证细胞的浓度低于60％，在病毒液中加入浓度为10mg/ml的polybrene，使得终浓度为8μg/ml，均匀混合好。吸取目的细胞中的培养基，加入病毒混合液，并加入新鲜培养基补充至5ml，将细胞静置于37度培养箱中。感染结束后，收取样品进行Western blot检测融合蛋白的表达。

确认细胞过表达生物素连接酶-端粒结合蛋白TRF1融合蛋白后，采用去除内源性Biotin的培养基培养细胞，进行以下条件的摸索：

(1)标记时间：0min，1min，10min，30min，1h，2h，4h，8h和16h；

结果如图2～3所示，图2为新型生物素酶BPL*在不同时间标记蛋白免疫印迹(Western blot)检测结果图(图2A)及统计图(图2B)，结果表明，标记强度随标记时间加长而更强，PhBPL*-TRF1在2h就趋近标记饱和，PkBPL*、MfBPL*和AaBPL*(BioID2)则不存在饱和现象。图3为具有核定位信号的新型生物素酶PhBPL*与BioID2标记强度比较图(左为检测结果图，右为统计图)，结果表明，PhBPL*-NLS标记活性远远强于AaBPL*(BioID2)，PhBPL*标记10分钟即可具有一定效果，4h可以达到AaBPL*标记16h效果。

(2)生物素浓度：0μM，0.5μM，5μM和50μM

图4为新型生物素酶BPL*在不同生物素浓度下，对蛋白质进行标记的效果。结果表明，新型生物素酶BPL*在0.5μM，5μM和50μM均显示出标记活性，其中，优选的生物素浓度为5μM-50μM。

(3)链霉亲和素纯化实验

裂解过表达生物素连接酶-TRF1的Hela细胞，利用链霉亲和素纯化被标记上Biotin的蛋白，检测基于新型生物素连接酶的标记***，是否可以标记到TRF1的邻近(而非直接互作)蛋白RAP1。

具体实施流程如下：

收集细胞样品(6cm培养皿)，使用480μL RIPA裂解细胞15min，于4℃15,000g离心15min。取400μL上清与偶联链霉亲和素的磁珠于4℃三维旋转孵育2h。取40μL作为Input样品。完成下拉的磁珠样品用1mL 2％SDS、500μL TBST和500μL TBS分别洗涤两次。将洗涤过的磁珠样品加入含SDS的洗脱液在沸水中煮10分钟后进行Western blot检测。

结果如图5所示，表明基于PhBPL*、PkBPL*和MfBPL*的标记***，同BioID2类似，均展现出对RAP1的标记能力，其中PhBPL*标记能力最强，PkBPL*的标记特异能力较高。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种新型蛋白质生物素连接酶及基于其的邻近标记***PhastID

<141> 2021-11-04

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> 古细菌(Pyrococcus horikoshii)

<400> 1

Met Leu Gly Leu Lys Thr Ser Ile Ile Gly Arg Arg Val Ile Tyr Phe

1 5 10 15

Gln Glu Ile Thr Ser Thr Asn Glu Phe Ala Lys Thr Ser Tyr Leu Glu

20 25 30

Glu Gly Thr Val Ile Val Ala Asp Lys Gln Thr Met Gly His Gly Arg

35 40 45

Leu Asn Arg Lys Trp Glu Ser Pro Glu Gly Gly Leu Trp Leu Ser Ile

50 55 60

Val Leu Ser Pro Lys Val Pro Gln Lys Asp Leu Pro Lys Ile Val Phe

65 70 75 80

Leu Gly Ala Val Gly Val Val Glu Thr Leu Lys Glu Phe Ser Ile Asp

85 90 95

Gly Arg Ile Lys Trp Pro Asn Asp Val Leu Val Asn Tyr Lys Lys Ile

100 105 110

Ala Gly Val Leu Val Glu Gly Lys Gly Asp Lys Ile Val Leu Gly Ile

115 120 125

Gly Leu Asn Val Asn Asn Lys Val Pro Asn Gly Ala Thr Ser Met Lys

130 135 140

Leu Glu Leu Gly Ser Glu Val Pro Leu Leu Ser Val Phe Arg Ser Leu

145 150 155 160

Ile Thr Asn Leu Asp Arg Leu Tyr Leu Asn Phe Leu Lys Asn Pro Met

165 170 175

Asp Ile Leu Asn Leu Val Arg Asp Asn Met Ile Leu Gly Val Arg Val

180 185 190

Lys Ile Leu Gly Asp Gly Ser Phe Glu Gly Ile Ala Glu Asp Ile Asp

195 200 205

Asp Phe Gly Arg Leu Ile Ile Arg Leu Asp Ser Gly Glu Val Lys Lys

210 215 220

Val Ile Tyr Gly Asp Val Ser Leu Arg Phe Leu

225 230 235

<210> 2

<211> 235

<212> PRT

<213> 古细菌(Pyrococcus kukulkanii)

<400> 2

Met Leu Ser Leu Lys Thr Ser Ile Ile Gly Lys Lys Val Ile Tyr Tyr

1 5 10 15

Gln Glu Ile Ser Ser Thr Asn Asp Val Ala Lys Ser Leu Asp Val Glu

20 25 30

Glu Gly Thr Val Ile Val Ala Asp Arg Gln Thr Lys Gly Arg Gly Arg

35 40 45

Leu Asn Arg Lys Trp Ile Ser Pro Glu Gly Gly Leu Trp Leu Ser Val

50 55 60

Val Leu Lys Pro Lys Val Ala Pro Gln Asp Ile Pro Lys Ile Val Phe

65 70 75 80

Leu Gly Ala Ile Gly Val Val Arg Thr Leu Glu Glu Leu Ser Ile Pro

85 90 95

Gly Arg Ile Lys Trp Pro Asn Asp Val Leu Val Asn Phe Arg Lys Ile

100 105 110

Ser Gly Ile Leu Thr Glu Lys Val Gly Glu Lys Val Ile Leu Gly Ile

115 120 125

Gly Ile Asn Val Asn Asn Asn Thr Pro Glu Asn Gly Ile Ala Val Lys

130 135 140

Asn Val Leu Gly Lys Glu Val Ser Leu Val His Val Phe Lys Ile Leu

145 150 155 160

Leu Glu Asn Leu Asp Glu Leu Tyr Glu Ile Tyr Leu Lys Ser Pro Gly

165 170 175

Thr Ile Val Glu Leu Ala Arg Glu Leu Met Ile Leu Asn Val Pro Val

180 185 190

Lys Val Leu Gly Asn Gly Glu Val Val Gly Ile Ala Glu Asp Ile Asp

195 200 205

Glu Asp Gly Arg Leu Val Leu Arg Leu Gly Asn Gly Glu Ile Arg Lys

210 215 220

Ile Ile Tyr Gly Asp Val Ser Leu Arg Phe Leu

225 230 235

<210> 3

<211> 237

<212> PRT

<213> 古细菌(Methanocaldococcus fervens)

<400> 3

Met Glu Ile Ile His Leu Ser Glu Val Asp Ser Thr Asn Glu Tyr Ala

1 5 10 15

Lys Lys Leu Ala Lys Glu Gly Lys Arg Asn Phe Val Val Leu Ala Asp

20 25 30

Lys Gln Ser Thr Gly Lys Gly Arg Trp Gly Arg Val Trp Tyr Ser Asp

35 40 45

Glu Gly Gly Leu Tyr Phe Thr Ile Val Leu Asp Ser Asn Glu Tyr Asp

50 55 60

Pro Lys Val Ile Asn Leu Ile Thr Pro Ile Ser Ile Ile Glu Thr Leu

65 70 75 80

Lys Asn Tyr Thr Asp Lys Glu Leu Gly Ile Lys Phe Pro Asn Asp Ile

85 90 95

Met Val Lys Val Asn Gly Asp Tyr Lys Lys Leu Gly Gly Ile Leu Ala

100 105 110

Glu Leu Ile Asn Gly Tyr Met Ile Ile Gly Ile Gly Ile Asn Val Asn

115 120 125

Asn Pro Ile Arg Lys Glu Ile Arg Glu Ile Ala Val Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Val Val Gly Lys Glu Ile Asp Arg Val Glu Ile Phe Asn Asp Phe Leu

145 150 155 160

Lys Arg Phe Glu Asp Tyr Leu Lys Lys Leu Lys Asn Asn Glu Ile Asp

165 170 175

Asp Tyr Glu Ile Leu Lys Asn Tyr Lys Lys Tyr Ser Ile Thr Ile Gly

180 185 190

Arg Thr Val Lys Ile Leu Leu Ser Asn Asn Glu Val Ile Thr Gly Lys

195 200 205

Val Tyr Asp Ile Asp Phe Asp Gly Ile Val Leu Gly Thr Glu Glu Gly

210 215 220

Ile Glu Lys Ile Pro Thr Gly Ile Cys Ile His Val Arg

225 230 235

<210> 4

<211> 708

<212> DNA

<213> 古细菌(Pyrococcus horikoshii)

<400> 4

atgctgggcc tgaagacaag catcatcggc cggcgggtca tctacttcca ggagatcacc 60

agcaccaacg agttcgccaa gaccagctac ctggaggagg gaaccgtgat cgtggccgat 120

aagcagacca tgggccacgg aggcctgaac agaaagtggg agtccccaga aggaggcctg 180

tggctgtcta tcgtgctcag ccctaaagtg ccccagaagg acctgcctaa gatcgtgttc 240

ctgggagcag tgggcgtggt ggaaaccctg aaggagttca gcatcgacgg cagaatcaag 300

tggcccaacg acgtgctcgt gaactacaag aagatcgccg gcgtgctggt cgagggcaaa 360

ggcgacaaga tcgtgctggg catcggcctg aacgtgaaca acaaggtgcc caacggcgcc 420

acaagcatga aactggagct gggatcagaa gtgcctctgc tgagcgtgtt caggagcctg 480

atcaccaacc tggaccggct gtacctgaac ttcctgaaga accccatgga catcctgaac 540

ctcgtgcggg acaacatgat cctgggcgtg agagtgaaga tcctgggcga cggcagcttc 600

gagggcatcg ccgaggatat cgacgacttc gggcggctga tcatcaggct ggacagcggc 660

gaggtcaaga aggtcatcta cggcgacgtg tccctgagat tcctgtag 708

<210> 5

<211> 708

<212> DNA

<213> 古细菌(Pyrococcus kukulkanii)

<400> 5

atgctgagcc tgaagaccag catcatcggc aagaaggtca tctactacca ggagatcagc 60

agcaccaacg acgtggctaa gagcctggac gtggaggaag gaaccgtgat cgtggccgat 120

aggcagacca agggaagggg aggcctgaat cgcaagtgga tcagcccaga aggaggactc 180

tggctgtcag tggtgctcaa gcctaaagtg gcccctcagg acatccccaa gatcgtgttt 240

ctgggcgcca tcggcgtcgt gagaacactg gaggagctga gcatccccgg cagaatcaag 300

tggcccaacg acgtgctcgt gaacttccgg aagatcagcg gcatcctgac cgagaaggtc 360

ggcgagaagg tcatcctggg catcggcatc aacgtgaaca acaacacccc cgagaacggc 420

attgccgtga agaacgtgct gggcaaggaa gtgtctctgg tgcacgtgtt caagatcctg 480

ctggagaacc tggacgagct gtacgagatc tacctgaaga gccccggcac catcgtggaa 540

ctggccaggg agctgatgat cctgaacgtg cccgtgaagg tgctgggaaa cggagaggtc 600

gtgggaatcg ccgaggatat cgacgaggac ggcagactgg tgctgagact gggaaacggc 660

gagatccgga agatcatcta cggcgacgtg tccctgagat tcctgtag 708

<210> 6

<211> 714

<212> DNA

<213> 古细菌(Methanocaldococcus fervens)

<400> 6

atggagatca tccacctgag cgaagtggac agcaccaacg agtacgccaa gaagctggcc 60

aaggagggca agcggaactt cgtggtgctg gccgacaagc agagcacagg aaaaggcggc 120

tggggcagag tgtggtatag cgacgaggga ggcctgtact tcaccatcgt gctggacagc 180

aacgagtacg accccaaggt catcaacctg atcaccccca tcagcatcat cgagaccctg 240

aagaactaca ccgacaagga gctgggcatc aagttcccca acgacatcat ggtgaaggtc 300

aacggcgact acaagaagct gggcggaatc ctggccgaac tgatcaacgg ctacatgatc 360

atcggcatcg gcatcaacgt gaacaacccc atccggaagg agatccggga gatcgcagtg 420

tccctgaagg aggtcgtggg aaaggagatc gaccgggtgg agatcttcaa cgacttcctg 480

aagcgcttcg aggactacct gaagaagctg aagaacaacg agatcgacga ctacgagatc 540

ctgaagaact acaagaagta cagcatcacc atcggccgga ccgtgaagat cctgctgagc 600

aacaacgagg tcatcaccgg caaggtgtac gacatcgact tcgacggcat cgtgctggga 660

acagaggagg gcatcgagaa gatccccacc ggcatttgca tccacgtccg atag 714

Claims

1.一种蛋白质生物素连接酶BPL，其特征在于，

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所述；

或

2.一种突变蛋白质生物素连接酶BPL*，其特征在于，为SEQ ID NO.1所述氨基酸序列R48G或R48S突变；或SEQ ID NO.2所述氨基酸序列R48G或R48S突变；或SEQ ID NO.3所述氨基酸序列R40G突变。

3.一种编码权利要求2所述突变蛋白质生物素连接酶BPL*的核苷酸序列。

4.一种包含权利要求3所述突变蛋白质生物素连接酶BPL*编码核苷酸序列的重组表达载体。

5.一种包含权利要求4所述重组表达载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的蛋白质生物素连接酶BPL或权利要求2所述突变蛋白质生物素连接酶BPL*在邻近蛋白标记或在制备邻近蛋白标记***中的应用。

7.一种包含权利要求1所述蛋白质生物素连接酶BPL或权利要求2所述突变蛋白质生物素连接酶BPL*的邻近蛋白标记***。

8.一种邻近蛋白标记方法，其特征在于，先将待研究的目的蛋白与权利要求2的突变蛋白质生物素连接酶BPL*形成融合蛋白，经生物素标记，通过生物素-亲和素***，纯化出目的蛋白周围被生物素连接酶标记的蛋白，再通过高通量的方法进一步鉴定出与之有相互作用的蛋白。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述生物素浓度为0.5μM～50μM。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述标记时间为10min～16h。