KR102559311B1

KR102559311B1 - 재조합 인간 xvii형 콜라겐, 제조방법 및 응용

Info

Publication number: KR102559311B1
Application number: KR1020227028808A
Authority: KR
Inventors: 쟈쟈 리; 리핑 왕; 쑹 쳰
Original assignee: 쟝쑤 트라우텍 메디컬 테크놀로지 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2021-05-13
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2023-07-25
Also published as: CN113185604A; CN113185604B; EP4119573A1; KR20220155565A; US20230119018A1; WO2022237224A1; EP4119573A4; JP2023521531A; US11787852B2; JP7411858B2

Abstract

본 발명은 재조합 인간XVII형 콜라겐을 제공하고, 상기 콜라겐은, (A)n으로 표시된 아미노산 서열로 구성되거나 또는 이를 포함하고, A는 SEQ ID NO.2로 표시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO.2에 기초하여 일정한 아미노산 변형 후의 서열 또는 SEQ ID NO.2아미노산 서열과 80%보다 큰 상동성 아미노산 서열을 갖고; 여기서 n은 1이상의 정수이고, 각 A는 동일 또는 상이하며, A를 기본 단위로 하여 일렬로 반복되며, 각 동일 또는 상이한 A사이는 펩타이드 결합을 통해 직접 연결된다. 본 발명 중， 상기 콜라겐은 피키아 파스토리스 등의 이러한 진핵 숙주 세포에서 인간XVII형 콜라겐의 고효율의 분비 및 가용성 발현을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 상품화된 천연 인간 콜라겐보다 우수한 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성, 및 우수한 조직 재생 및 모낭 복구 재생을 촉진하는 생물학적 활성을 가지며, 공업화 생산이 가능함을 증명하였다.

Description

재조합 인간 XVII형 콜라겐, 제조방법 및 응용

본 발명은 재조합 인간 XVII형 콜라겐, 제조방법 및 응용에 관한 것으로, 유전 공학 기술 분야에 속한다.

콜라겐은 중요한 천연 생물학적 단백질로서, 화학 공업, 의약, 식품, 화장품 등 다양한 분야에서 광범위하게 응용될 수 있고, 특히 각종 생물학적 기계의 제조에 적합하며, 가장 이상적인 생물학적 재료의 공급원이며, 광범위한 응용 전망을 가진다. 시중에서 판매되는 콜라겐은 주로 동물 조직을 산, 알칼리, 효소 분해법으로 처리하여 얻은 콜라겐 추출물이다. 이러한 추출물은 가공 과정에서, 기본적으로 콜라겐의 천연 구조가 파괴되고, 분해가 심각하며, 생물학적 활성을 상실시킨다. 추출된 콜라겐 펩티드는 길이가 다르고, 성질이 균일하지 않고, 품질이 불안정하며 또한 바이러스 감염 위험이 있다. 동물-유래 콜라겐과 인간의 콜라겐의 아미노산 서열이 상당히 다르기 때문에, 면역 거부 반응 및 알레르기 증상을 일으킬 수 있다.

인간XVII형 콜라겐은 세포내, 막횡단, 세포외의 3가지 주요 도메인으로 나뉘는, 3개의 동일한 α1(XVII)사슬로 구성된 균질한 삼량체인 막횡단 비섬유모세포 콜라겐이다. 인간XVII형 콜라겐은 세포 내 반결합체의 조성 성분으로, 상피세포의 유착, 분리 및 발달 분화를 조절할 수 있는 상피세포-기저막의 역할에 중요한 역할을 하며, 각질세포의 분화 및 재생에 대해 중요한 역할을 한다. 인간XVII형 콜라겐의 인체중 함량은 매우 적고, XVII형 콜라겐은 동물 체내 함량도 마찬가지로 매우 희소하며, 추출 난이도 또한 매우 높아, 대량 생산이 불가하며, 동시에 동물-유래 콜라겐 제품은 필연적으로 면역원성, 잠재적인 바이러스, 전염병과 같은 생물학적 안전 위험이 있으며, 대량 응용이 어렵다. 법적 윤리의 제약으로 인해, 인간-유래 XVII형 콜라겐은 과학 연구에만 응용될 수 있고, 이는 또한 현재 시장에는 인간 또는 기타 동물 유래의 상품화XVII형 콜라겐 제품이 없으며, 이는 또한 인간 XVII형 콜라겐의 연구 및 응용을 더 제한하였다. 현재 이러한 문제를 해결하는 주요 방법은 유전자 공학과 같은 생물학적 기술을 이용하여 콜라겐을 완성하는 것이다.

기존의 재조합 단백질은 주로 크게 4개의 발현 시스템(원핵(대장균)발현 시스템, 피키아 파스토리스 발현시스템, 포유류 동물세포 발현 시스템 곤충 세포(바큘로바이러스) 발현 시스템)에 의해 생산된다. 포유 동물세포에서 인간XVII형 콜라겐을 발현시키는 연구는 매우 적고, 또한 모두 실험 연구 단계에 있다. 최초로 원핵 발현(대장균, pGEX발현 벡터)를 사용하는 것은 비나선 영역의 NC16서열의 융합 단백질이며, 나머지 발현 시스템은 특히 피키아 파스토리스 발현 시스템에 대한 인간XVII형 콜라겐을 발현하는 성공적인 보도는 없다.

포유 동물 세포는 발현 비용이 높고, 생산량이 낮으며, 고가의 약제학적 단백질의 발현 및 생산에 주로 사용된다. 포유 동물 세포 발현의 인간XVII형 콜라겐은 일시적 형질감염 발현이든 안정적인 형질 세포계 발현이든 상관없이, 단백질 발현량이 매우 낮고, 동시에 여기에 사용되는 배지가 고가이므로, 과학 연구에서의 미량의 사용만을 만족시킬 수 있다. 곤충 세포(바큘러바이러스)발현 시스템은 원가가 높고, 생산량이 낮고, 번역후 인간 세포와의 차이가 커, 콜라겐의 대량 생산은 2가지의 방식을 일반적으로 사용하지 않는다. 원핵 발현(대장균 발현 시스템)의 콜라겐은 단백질의 번역후 변형이 없고, 대규모 증폭이 예상되는 원핵 발현은 세포내에서만 발현될 수 있고, 균체의 분해를 진행해야 하고, 대량의 불순물 단백질이 표적 단백질과 혼합될 수 있고, 정제 공정에 대한 요구 사항이 매우 높고, 원핵 발현 체계는 자연적으로(세균세포벽 성분) 엔도톡신 및 펩티도글리칸을 함유하고 있어, 이를 제거하기 위해서는 복잡한 정제 공정이 필요하다.

이상의 몇 가지 발현 시스템에서, 서열의 단일성 및 생물학적 활성의 문제가 모두 존재하며, 서열 선택은 비교적 단일하며, 콜라겐 펩타이드는 각각 독립적으로 발현되며, 1000개에 가까운 아미노산(15개의 삼중 나선영역, 15개의 비삼중 나선영역으로 나뉨)의 인간XVII형 콜라겐 엑토도메인의 서열 풍부도와 비교하면, 양자는 부족하며, 이는 또한 생물학적 활성에 직접적인 영향을 주고, 콜라겐의 생물학적 활성중 세포 접착 활성은 가장 기본적인 것일 뿐이며, 나머지의 생물학적 활성은 모두 관련이 없다. 또한 이상의 포유 동물 세포 발현이든, 또는 대장균 발현이든 상관없이 모두 작은 실험실 수준의 배양 및 생산에만 머물려 대규모 생산은 없다. 그러나, 재조합 콜라겐의 응용 전제는 대규모, 고밀도, 고발현의 발효 생산 및 정제를 진행할 수 있으며, 일반적으로 말하면, 500L부피의 중간 발표 실험의 검증은 산업 규모, 대규모 확대 생산의 가능성이 있다.

인간XVII형 콜라겐 발현은 약간의 어려움이 존재하며, 인간XVII형 콜라겐은 세포내 영역, 막횡단 영역, 세포외 영역을 갖는 막관통형 콜라겐에 속한다. 일반적으로 말하면, 막관통형 단백질이 진핵 세포에서 발현될 때 대부분은 세포외로 분비되지 않고, 세포막에 고정될 것이고, 또한 인간XVII형 콜라겐의 아미노산 서열은 매우 길고(1497개 아미노산), 단백질 분자량이 비교적 크고(180kDa), 이론적으로 세포 외부로 효과적으로 분비되기 어렵고, 쉽게 분해되기 때문에, 성공적인 발현을 위해 관련 서열의 선택이 필요하다. 동시에, 현재 인간XVII형 콜라겐의 연구는 아미노산 서열, 구조, 기능등 방면의 연구는 거의 없다. 따라서, 피키아 파스토리스 발현 시스템의 장점(특히 분비 발현)을 유지한다는 전제하에서 더 많은 생물학적 기능을 실현하도록 어떻게 아미노산 서열을 선택하느냐는 현저한 어려움이 있으며, 물론, 이러한 점은 기타 발현 시스템에서(대장균 포함) 인간XVII형 콜라겐의 발현도 어렵다.

본 발명의 목적은, 종래 기술에 존재하는 이러한 기술문제들을 극복하는 것이며, 주로 재조합 인간XVII형 콜라겐 서열(불균일성)의 최적화 선택 및 피키아 파스토리스의 고효율 분비 발현, 종래의 재조합 XVII형 콜라겐의 세포 접착 활성, 종래의 재조합 인간 XVII형 콜라겐의 대규모 제조의 생산이 불가한 것에 관한 기술문제를 극복하는 것이다.

이를 위해, 본 발명은 콜라겐, 상기 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 조작 균주, 상기 콜라겐 제조 방법, 상기 콜라겐을 포함하는 조성물, 상기 콜라겐의 응용을 제공한다. 본 발명에서 콜라겐이 피키아 파스토리스등의 진핵 숙주 세포에서 인간형XVII형 콜라겐의 고효율의 분비 및 가용성 발현을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 상품화된 천연 인간 콜라겐보다 우수한 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성 및 우수한 조직 재생과 모낭 복구 및 재생을 촉진하는 생물학적 활성을 가지며, 공업적 응용이 가능하다.

본 발명은 콜라겐을 제공하고, 상기 콜라겐은 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성, 조직 재생과 모낭 복구 및 재생을 촉진하는 생물학적 활성을 가진다.

상기 콜라겐은, (A)_n으로 표시된 아미노산 서열로 구성되거나 또는 이를 포함하고,

A는 SEQ ID NO.2로 표시된 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO.2에 기초하여 일정한 아미노산 대체, 삽입, 치환, 추가, 결실등 변형 후의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO.2아미노산 서열과 80%보다 큰 상동성 아미노산 서열을 갖는다. 여기서 n은 1이상의 정수이고, 각 A는 동일 또는 상이하며, A를 기본 단위로 하여 직렬로 반복되며, 각 동일 또는 상이한 A사이는 펩타이드 결합을 통해 직접 연결된다.

추가적으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 콜라겐은, (A)_n으로 표시된 아미노산 서열로 구성되거나 또는 이를 포함하고, A는 SEQ ID NO.2로 표시된 아미노산 서열이고, n은 1이상의 정수이고, 각 A는 동일하고, A를 기본 단위로 하여 직렬로 반복되며, 각 A사이는 펩타이드 결합을 통해 직접 연결된다.

추가적으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 콜라겐은 (A)_n으로 표시된 아미노산 서열로 구성되고, n이 1일 경우, 상기 콜라겐의 아미노산 서열은 예를 들면 SEQ ID NO.2로 표시되고, 본 발명에서 170801로 기록되고, n이 2일 경우, 상기 콜라겐의 아미노산 서열은 예를 들면 SEQ ID NO.3로 표시되고, 본 발명에서 170802로 기록된다.

추가적으로, 본 발명의 기재에 따르면, 본 발명의 상기 콜라겐은 (A)_n으로 표시된 아미노산 서열로 구성되거나, 또는 이를 포함하고, A는 SEQ ID NO.2에 기초하여 일정한 아미노산의 삽입, 치환, 추가, 결실 등 변형 후의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO.2아미노산 서열과 80%보다 큰 상동성 아미노산 서열을 갖는다. 여기서 n은 1이상의 정수이고, 각 A는 동일 또는 상이하며, A를 기본 단위로 하여 직렬로 반복되며, 각 동일 또는 상이한 A사이는 펩타이드 결합을 통해 직접 연결된다.

본 발명은 상기 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 구체적으로 상기 (A)_n으로 표시되는 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 제공한다. 우선적으로, 피키아 파스토리스가 숙주 세포인 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO.6 또는 SEQ ID NO.7로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 SEQ ID NO.6, SEQ ID NO.7로 표시된 뉴클레오티드 서열로 구성된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 A는 SEQ ID NO.2이고, n이 1일 경우의 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO.6으로 표시되는 뉴클레오티드 서열이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 A는 SEQ ID NO.2이고, n이 2일 경우, 상기 (A)_n의 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO.7로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 코딩한다.

본 발명의 콜라겐은 인간XVII형 콜라겐의 15번째 나선 영역, 카르복실 말단 영역, 중간 영역 등과 같은 다중 나선 영역 서열로부터 최적화 스크리닝을 거쳐 선택된 조합 서열로서, 인간 XVII형 콜라겐 아미노산 서열의 상응 부분과 100% 동일하며, 콜라겐이 피키아 파스토리스등의 진핵 숙주 세포에서 인간형XVII형 콜라겐의 고효율의 분비 및 가용성 발현을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 상품화된 천연 인간 콜라겐보다 우수한 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성 및 우수한 조직 재생 및 모낭 복구재생을 촉진하는 생물학적 활성을 가진다. 이러한 조합 서열은 각 영역 서열의 기능을 통합할 수 있게 하고, 개별적으로 발현되지 않고, 하나의 전체로 발현되어, 재조합 콜라겐의 서열의 단일성을 피할 수 있다.

본 발명은 상기 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 추가로 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 상기 재조합 발현 벡터 구축 과정에서, 먼저, 상기 (A)_n으로 표시되는 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변형하고, 각각 콜라겐 아미노산 서열의 아미노산 말단에 Strep-Tag II태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하고, 카르복실 말단에 6×His Tag태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하여, 이중 특이 친화성 및 정제 태그를 포함하도록 하고, 이는 친화층 크로마토그래피 정제를 진행할 수 있고, 또한 2개의 태그 서열을 기초로 하는 면역학적 항체 검사를 용이하게 한다. 표시된 서열을 발현 벡터pPIC9K에 연결하여 재조합 발현 벡터를 구축한다(실시예에서 pPIC9K-170801, pPIC9K-170802로 표시).

본 발명은 상기 재조합 발현 벡터에 의해 구축된 조작 균주를 추가로 제공하고, 상기 조작 균주인 숙주 세포는 바람직하게는 피키아 파스토리스이다. 상기 조작 균주의 보존일자는 2020년 9월 9일이고, 기탁번호는 각각 CGMCC NO.20626, CGMCC NO. 20627이고, 분류명칭은 피키아 파스토리스Pichia pastoris이고, 보관기관은 중국 미생물 균종 보관 관리 위원회 일반 미생물 센터이고, 주소는 북경시 조양구 북진서로 1호원 3호이다.

주의할 점은, 숙주 세포는 진균, 효모, 식물 세포와 같은 진핵 세포; 장내세균과(예를 들면 대장균)과 같은 원핵 세포일 수 있고, 또한 포유 동물 세포CHO계 세포, HEK293계 세포 또는 곤충 세포와 같은 동물 세포일 수도 있다. 이해해야 할 점은, 당업자 상술한 피키아 파스토리스를 발현 숙주로서 다른 발현 숙주로 대체함으로써 동일한 아미노산 서열의 콜라겐을 발현할 수 있다.

본 발명은 상기 콜라겐의 제조 방법을 제공하며, 아래 단계를 포함한다.

(1)조작 균주의 배양 및 스크리닝 단계;

구축된 조작 균주를 스크리닝한 후, BMGY배지에 삽입하여 발현을 유도하고 발현이 높은 조작 균주를 스크리닝하였다. 상기 스크리닝된 발현량이 높은 조작 균주는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이고, 기탁번호는 CGMCC No.20626 또는 CGMCC No. 20627이다.

(2)대규모 고밀도 발효, 배양 및 단백질 정제 단계;

50L-500L발효탱크로 연동 유가식 발효를 진행하고, 발효 상청액에 대해 정제하여, 고순도의 콜라겐을 얻는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 Sac I 선형화 재조합 발현 벡터를 피키아 파스토리스 적격성 세포로 전기 전환하여 조작 균주를 구축하고, 조작 균주를 MD플레이트로 1차 스크리닝한 후, 다시 서로 다른 농도G418를 포함한 YPD플레이트를 통해 스크리닝하고, 콜로니를 선택하여 BMGY배지에 삽입한 다음, 다시 BMMY배지에서 발현하도록 유도한다. 여러 균종을 선택하고, 발현량이 높은 조작 균주를 선택하여 후속 실험을 진행한다. 본 발명에서, SDS-PAGE 전기 영동, Western Blot으로 발현된 단백질에 대해 1차 감정을 진행하고, 유효한 분비 발현의 능력을 판단하여, 결과는 본 발명의 재조합 인간XVII형 콜라겐이 고효율로 분비 발현이 가능함을 증명하였다. 전체 길이의 인간XVII형 콜라겐은 주로 세포내에 집중되어 세포 외부로 효과적으로 분비할 수 없다. 전기 영동에 의해 얻은 표적 밴드는 Nano-HPLC-MS/MS질량 스펙트럼 검출을 진행하고, 그중 펩타이드 세그먼트는 인간XVII형 콜라겐 서열에서 최적으로 선택된 영역에서 유래되었으며, 본 발명의 재조합 인간XVII형 콜라겐 170801, 170802는 성공적으로 발현됨을 증명하였다.

50L-500L 발효탱크를 사용하여 48h동안 발현을 유도하는 경우, 본 발명의 콜라겐 생산량(UV정량)은 12g/L, 11g/L에 도달할 수 있다.

본 발명에서, MALDI-TOF/TOF을 사용하여 분자량의 측정을 진행하고, 170801콜라겐의 분자량은 23811.6797Da(이론값은 23800Da)이고, 170802콜라겐의 분자량은 45689.5781Da(이론값 45400Da)이고, 피키아 파스토리스는 발현 후 번역된 변형 및 분자량 실험 측정에 존재하는 시스템 오차가 존재하고, 실제 발현된 콜라겐 분자량과 이론값은 일치한다. 콜라겐에 대한 적외선 스펙트럼 스캐닝을 사용하였고, 아미드A, 아미드B, 아미드I, 아미드II, 아미드III의 파수는 모두 재조합 콜라겐 구조 특징에 부합하였다. 정제한 콜라겐 동결건조 스펀지를 전자현미경으로 스캐닝하고, 라멜라 구조를 가지고 있고, 생물 의학 재료 분야에 응용할 수 있는 잠재력을 가지고 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 획득한 콜라겐의 생물학적 활성을 검측하고, 체외 세포 실험은 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성을 검증하였다. 획득한 콜라겐의 생물학적 활성에 대한 동물 실험은, 토끼 귀 흉터 모델 실험을 통해 토끼 귀 흉터의 치유, 조직 재생을 효과적으로 촉진할 수 있고, 특히 모낭 복구 및 재생 촉진 활성이 매우 우수한 것으로 검증되었다.

이에 대해, 본 발명은 상기 콜라겐이 조직 재생 촉진, 모낭 복구 촉진 방면의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명은 조성물을 추가로 제공하고, 상기 조성물은 상기 콜라겐 또는 상기 방법에 의해 제조된 콜라겐을 포함하는, 조성물을 추가로 제공한다.

본 발명은 상기 콜라겐 또는 상기 방법에 의해 제조된 콜라겐 또는 상기 조성물을 포함하는 제품을 추가로 제공한다. 상기 제품은 약물, 약물 조성물, 의료장치, 생물학적 재료, 조직 공정 제품, 화장품 또는 건강보조식품등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 상기 콜라겐, 폴리뉴클레오티드, 제조합 발현 벡터, 조작 균주, 또는 조성물의 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구를 촉진하는 제품 제조에서의 용도를 추가로 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 제품은 외용제이고, 바람직하게는, 외용 도포 겔이고, 바람직하게는, 겔이다.

(1)본 발명은 피키아 파스토리스 발현 시스템을 선택하였고, 피키아 파스토리스는 진핵 생물의 완전한 세포 소기관을 가진 진핵 미생물로서, 번역된 단백질에 대해 일정한 번역 후 변형(특히 글리코실화 변형)을 수행할 수 있어, 단백질의 생물학적 기능을 유력하게 지원할 수 있다. 발현 시스템을 확립함과 동시에 미생물 발현 시스템의 고밀도 발효 생산, 극도로 낮은 배양 비용, 짧은 주기, 높은 발현 등 대규모화 공업 생산의 장점을 가진다. 세포 외로 분비 가능한 특성이 있고, 세포 용해로 인한 불순 단백질을 완전히 용해할 수 있다. 세포벽 성분에는 내독소, 펩티도글리칸이 포함되어 있지 않다.

(2)본 발명 중 재조합 인간XVII형 콜라겐에서 선택된 서열은 스크리닝이 최적화된 서열 조합으로 이뤄지고, 아미노산 서열은 천연 콜라겐 아미노산 서열의 상응 부분과 100% 상동성을 가지며, 면역 원성이 없고, 의약, 의료장치, 생물학적 재료, 조직 공정, 화장품 등 분야에서 광범위하게 응용될 수 있다.

(3)본 발명 중 재조합 인간 XVII형 콜라겐은 실험을 통해, 상품화된 천연 인간 콜라겐과 동일 또는 더욱 우수한 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성, 조직 재생 및 모낭 복구 및 재생 등 다양한 생물학적 활성을 가지므로, 실제 제품의 적용 목적에 도달할 수 있다.

(4)본 발명 중 재조합 인간XVII형 콜라겐은 피키아 파스토리스 발현 시스템에서 높은 효율로 분비 및 발현될 수 있고, 얻은 고순도의 콜라겐을 쉽게 정제할 수 있다. 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 DNA서열을 최적화 설계하여, 구축된 조작 균주 단백질 발현량을 높게 하고, 고밀도 발효 및 발현이 가능한 경우 더욱 높은 생산량을 얻을 수 있다. 피키아 파스토리스는 고밀도 발효 및 발현이 쉬워, 본 발명에 의해 스크리닝된 균주는 500L수준의 파일럿 규모에서 고밀도 및 고발현 발효를 달성할 수 있었고, 공업화, 대규모 생산의 조건을 갖췄다.

(5)본 발명 중의 숙주 세포인 피키아 파스토리스는 글리코실화등과 같은 발현된 외래 단백질에 대한 일정한 번역후 변형을 갖는다.

도 1은 본 발명에 의해 구축된 pPIC9K-170801벡터 맵이다.
도 2는 본 발명에 의해 구축된 pPIC9K-170802벡터 맵이다.
도 3은 본 발명에 의해 구축된 pPIC9K-col17a1벡터 맵이다.
도 4는 재조합 전장 인간XVII형 콜라겐 α1 사슬의 발현에 대한 SDS-PAGE결과도이고, 겉보기 분자량은 약 180kDa이다.
도 5는 재조합 전장인간 XVII형 콜라겐 α1 사슬이 항His태그 항체를 사용하여 Western Blot검측을 진행한 결과이다.
도 6은 24h 유도한 후 170801, 170802콜라겐의 조작 균주가 발현된 상청액의 SDS-PAGE결과이다.
도 7은 24h 유도한 후 170801, 170802 콜라겐의 조작 균주가 발현된 상청액에 항His태그 항체를 사용하여 Western Blot검측을 진행한 결과이다.
도 8은 24h 유도한 후 170801, 170802 콜라겐의 조작 균주가 발현된 상청액에 항Strap-TagII태그 항체를 사용하여 Western Blot검측을 진행한 결과이다.
도 9는 17801콜라겐의 SDS-PAGE밴드의 질량 스펙트럼 분석과 천연 인간XVII형 콜라겐 서열의 비교 결과이다.
도 10은 17802콜라겐의 SDS-PAGE밴드의 질량 스펙트럼 분석과 천연 인간XVII형 콜라겐 서열의 비교 결과이다.
도 11은 171801콜라겐의 조작 균주의 500L발효탱크에서 파일럿 발효균의 생산 실험 곡선과 콜라겐 발현 곡선이다.
도 12는 171802콜라겐의 조작 균주의 500L발효탱크에서 파일럿 발효균의 생산 실험 곡선과 콜라겐 발현 곡선이다.
도 13은 정제된 170801콜라겐HPLC스펙트럼이다.
도 14는 정제된 170802콜라겐HPLC스펙트럼이다.
도 15는 170801콜라겐 분자량의 MALDI-TOF MS검측 결과이다.
도 16은 170802콜라겐 분자량의 MALDI-TOF MS검측 결과이다.
도 17은 정제된 170801, 170802 콜라겐의 적외선 스펙트럼이다.
도 18은 170801(좌), 170802(우) 콜라겐 동결 건조 스펀지 샘플의 SEM도면(200×)이다.
도 19는 170801, 170802콜라겐의 세포 접착 활성 검측 결과이다.
도 20은 170801, 170802콜라겐과 천연 인간 콜라겐의 세포 이동 상태의 실제 대비 결과이다.
도 21은 세포 이동 24h, 48h 후, 170801, 170802콜라겐과 천연 인간 콜라겐의 세포 이동률이다.
도 22는 170801, 170802콜라겐의 토끼 귀 흉터에 대한 6주동안 흉터 사진 및 흉터 슬라이스 이미지이다.

본 발명의 기술방안을 당업자가 더욱 잘 이해하도록 하기 위해, 이하 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 자세히 설명하나, 하기 실시예는 본 발명의 보호 범위를 제한하지 않는다.

본 발명의 실시예에서, 설명되지 않은 것은 모두 일반적인 분자 생물학 실험 방법에 의해 완성되며, 실시예에서 관련된 PCR, 효소 분해, 연결, 코돈의 최적화등 과정은 모두 당업자가 제품 설명서 또는 해당 분야의 기초 지식에 따라 이해하고 쉽게 실현할 수 있으므로, 자세한 설명은 생략한다.

실시예1. 재조합 인간XVII형 콜라겐의 구축, 발현 및 감정

(1)재조합 인간 XVII형 콜라겐 단백질 아미노산 서열의 설계

본 발명에서, 인간XVII형 콜라겐 서열 최적화에 기초하여, 상기 인간XVII형 콜라겐의 구체적인 서열 참조: Uniprot Q9UMD9-1서열（https://www.uniprot.org/uniprot/Q9UMD9） 및 NCBI참조 서열Q9UMD9 .3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/Q9UMD9.3)，양자 서열은 동일하며, 구체적으로 SEQ ID NO.1으로 표시된다.

SEQ ID NO.1：

MDVTKKNKRDGTEVTERIVTETVTTRLTSLPPKGGTSNGYAKTASLGGGSRLEKQSLTHGSSGYINSTGSTRGHASTSSYRRAHSPASTLPNSPGSTFERKTHVTRHAYEGSSSGNSSPEYPRKEFASSSTRGRSQTRESEIRVRLQSASPSTRWTELDDVKRLLKGSRSASVSPTRNSSNTLPIPKKGTVETKIVTASSQSVSGTYDATILDANLPSHVWSSTLPAGSSMGTYHNNMTTQSSSLLNTNAYSAGSVFGVPNNMASCSPTLHPGLSTSSSVFGMQNNLAPSLTTLSHGTTTTSTAYGVKKNMPQSPAAVNTGVSTSAACTTSVQSDDLLHKDCKFLILEKDNTPAKKEMELLIMTKDSGKVFTASPASIAATSFSEDTLKKEKQAAYNADSGLKAEANGDLKTVSTKGKTTTADIHSYGSSGGGGSGGGGGVGGAGGGPWGPAPAWCPCGSCCSWWKWLLGLLLTWLLLLGLLFGLIALAEEVRKLKARVDELERIRRSILPYGDSMDRIEKDRLQGMAPAAGADLDKIGLHSDSQEELWMFVRKKLMMEQENGNLR GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGP MGQRGREGPMGPRGEAGPPGS GEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEK GPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKIVTSEGSSMLTVPGPPGPPGAMGPPGPPGAPGPAGPAGLPGHQEVLNLQGPPGPPGPRGPPGPSIPGPPGPRGPPGEGLPGPPGPPGSFLSNSETFLS GPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFS TSGSSSFGLNLQ GPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIP SGPSEGGSSSTMYVSGPPGPPGPPGPPGSISSSGQEIQQYISEYMQSDSIRSYLSGVQGPPGPPGPPGPVTTITGETFDYSELASHVVSYLRTSGYGVSLFSSSISSEDILAVLQRDDVRQYLRQYLMGPRGPPGPPGASGDGSLLSLDYAELSSRILSYMSSSGISIGLPGPPGPPGLPGTSYEELLSLLRGSEFRGIVGPPGPPGPPGIPGNVWSSISVEDLSSYLHTAGLSFIPGPPGPPGPPGPRGPPGVSGALATYAAENSDSFRSELISYLTSPDVRSFIVGPPGPPGPQGPPGDSRLLSTDASHSRGSSSSSHSSSVRRGSSYSSSMSTGGGGAGSLGAGGAFGEAAGDRGPYGTDIGPGGGYGAAAEGGMYAGNGGLLGADFAGDLDYNELAVRVSESMQRQGLLQGMAYTVQGPPGQPGPQGPPGISKVFSAYSNVTADLMDFFQTYGAIQ GPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ VYAGRRRRRSIAVKP

상기 서열 SEQ ID NO.1에서 볼드체로 밑줄 친 부분은 본 발명에서 선택한 서열이며, 총 233개의 아미노산이다. 본 발명에서 선택한 서열은 인간XVII형 콜라겐의 15번째 나선영역, 카르복실 말단 영역, 중간 영역 등과 같은 나선 영역 서열로부터 최적화 및 스크리닝을 거쳐 선택한 조합 서열이고, 피키아 파스토리스등의 이러한 진핵 숙주 세포에서 인간형XVII형 콜라겐의 고효율의 분비 및 가용성 발현을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 상품화된 천연 인간 콜라겐보다 우수한 세포 접착 활성, 세포 이동 활성, 및 우수한 조직 재생 및 모낭 복구재생을 촉진하는 생물학적 활성을 가진다. 이러한 조합 서열은 각 영역 서열의 기능을 통합할 수 있게 하고, 개별적으로 발현되지 않고, 하나의 전체로 발현되어, 재조합 콜라겐의 서열의 단일성을 피할 수 있고, 극강의 창조성을 가지며, 본 발명에서 이를 170801이라고 명칭하고, XVII형 콜라겐의 최적화 서열이며, 구체적일 서열은 SEQ ID NO.2로 표시된다.

SEQ ID NO.2：

GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ

170801를 코딩하는 DNA서열은 SEQ ID NO.6로 표시된다：

SEQ ID NO.6：

GGTTCTCCTGGTCCAAAAGGTGACATGGGTTCTCCAGGTCCTAAAGGTGACAGAGGTTTTCCTGGTACTCCAGGTATTCCTGGTCCATTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCAAAAGGTCAAAAGGGTTCTGTTGGTGACCCTGGTATGGAAGGTCCAGGTGAAAAGGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTCCACACGGTCCACCTGGTGTTCCAGGTTCTGTTGGTCCTAAGGGTTCTTCTGGTTCTCCTGGTCCACAAGGTCCTCCTGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAGGGTGACAAGGGTCCAATGGGTCCTCCAGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTGAAAAGGGTCCACCTGGTCCTCCTGGTCCACCTGGTCCAAAGGGTGACCAAGGTCCTCCAGGTCCTAGAGGTCATCAAGGTGAACAAGGTTTGCCTGGTTTTTCTGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCACAAGGTCCTAAAGGTGACAAAGGTGACCCAGGTGTTCCTGGTGCTTTGGGTATTCCAGGTCCACCTGGTCAAAAAGGTGAAATGGGTACTCCAGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTCCAGCTGGTCCACCTGGTCATCCTGGTCCACCAGGTCCAAGAGGTCATAAGGGTGAAAAAGGTGACAAGGGTGACCAA

본 발명중의 콜라겐은 17801을 기본 단위로 하여, n차 직렬 반복을 수행하여 얻은 아미노산 서열 조성을 포함하며, n은 1보다 크거나 같은 정수이다.

170801을 기본 단위로 하여, n이 2일 경우, 170801을 2차 직렬 반복을 수행하여, 얻은 아미노산 서열은 총 466개의 아미노산이고, 이를 170802로 명명하고, 그 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3으로 표시된다.

SEQ ID NO.3：

GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQ

170802을 코딩하는 DNA서열은 SEQ ID NO.7로 나타낸다.

SEQ ID NO.7：

GGTTCTCCAGGTCCTAAAGGTGACATGGGTTCTCCAGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTTTTCCAGGTACTCCAGGTATTCCAGGTCCTTTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCTAAAGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGTGACCCTGGTATGGAAGGTCCTGGTGAAAAAGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTCCACACGGTCCTCCAGGTGTTCCTGGTTCTGTTGGTCCAAAAGGTTCTTCTGGTTCTCCTGGTCCACAAGGTCCTCCAGGTCCTGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAAGGTGACAAAGGTCCAATGGGTCCTCCAGGTCCAAAGGGTGACCAAGGTGAAAAAGGTCCACCTGGTCCTCCTGGTCCACCAGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTCACCAAGGTGAACAAGGTTTGCCTGGTTTTTCTGGTCCTCCAGGTCCTCCTGGTCCTCAAGGTCCAAAGGGTGACAAGGGTGACCCTGGTGTTCCAGGTGCTTTGGGTATTCCTGGTCCTCCAGGTCAAAAGGGTGAGATGGGTACTCCTGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTCCAGCTGGTCCTCCTGGTCACCCAGGTCCTCCTGGTCCTAGAGGTCATAAAGGTGAAAAAGGTGACAAGGGTGACCAAGGTTCTCCAGGTCCAAAGGGTGACATGGGTTCTCCTGGTCCAAAAGGTGACAGAGGTTTCCCTGGTACTCCAGGTATTCCTGGTCCATTGGGTCACCCAGGTCCACAAGGTCCAAAAGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGTGACCCAGGTATGGAAGGTCCAGGTGAAAAGGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCAGGTCCTCATGGTCCACCAGGTGTTCCAGGTTCTGTTGGTCCAAAGGGTTCTTCTGGTTCTCCAGGTCCACAAGGTCCTCCAGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCTGGTGTTAAGGGTGACAAAGGTCCTATGGGTCCTCCTGGTCCTAAAGGTGACCAAGGTGAAAAGGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCACCTGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTCCACCAGGTCCTAGAGGTCATCAAGGTGAACAAGGTTTGCCAGGTTTTTCTGGTCCACCAGGTCCACCAGGTCCTCAAGGTCCTAAGGGTGACAAAGGTGACCCAGGTGTTCCTGGTGCTTTGGGTATTCCTGGTCCACCTGGTCAAAAGGGTGAAATGGGTACTCCTGGTCCTAAAGGTGACAGAGGTCCTGCTGGTCCACCTGGTCATCCAGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTCACAAAGGTGAAAAGGGTGACAAGGGTGACCAA

단백질의 기능은 아미노산 잔기의 질서 있는 배열에 의해서만 실현되고, 본 발명 중 재조합 인간XVII형 콜라겐의 모든 혁신적 생물학적 활성은 최적화 스크리닝에 의해 선택된 아미노산 서열을 확립하는 것에 기초하여, 유한한 서열 변형 또는 일정 비율의 상동성(80%보다 큼)이 여전히 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 실현할 수 있다.

상기 본 발명에서, 상기 콜라겐은 상기 아미노산 서열을 기본 단위로, SEQ ID NO.2에 기초하여 일정한 아미노산 삽입, 치환, 추가, 결실 등 변형 후의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO.2아미노산 서열과 80%보다 큰 상동성 아미노산 서열을 가진다. n차 직렬 반복하여 아미노산 서열을 얻는다. N은 1보다 크거나 같은 정수이고, 각 기본 단위는 동일하거나 다르다.

본 발명의 상기 상동성이란 부분 동일, 유사한 백분율과 같이 두 서열의 직접적인 연결의 수량적 관계일 수 있는 서열의 중첩률을 의미한다. 두 서열이 동일 위치점의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 완전히 동일한 서열 비율을 더 포함하며, 또한 임의의 공통 조상으로부터 분기 진화에 의해 형성된 상이한 서열일 수도 있다. 일반적인 생물정보학 방법으로 서열 정보를 비교 대조하여 얻을 수 있다.

상기 아미노산 삽입이란, SEQ ID NO.2 또는 SEQ ID NO.3서열과 같은 아미노산 서열에서, 적합한 위치에 아미노산 잔기를 삽입하는 것을 의미하고, 삽입된 아미노산 잔기는 또한 전체 또는 부분적으로 인접하거나, 삽입된 아미노산 사이는 모두 서로 인접하지 않을 수 있다. 상기 단백질이 170801, 170802콜라겐과 유사한 생물학적 활성을 가져야만, 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성, 조직 재생 촉진 및 모낭 복구 재생 촉진의 활성을 포함한다.

상기 아미노산 치환이란 SEQ ID NO.2 또는 SEQ ID NO.3서열과 같은 아미노산 서열에서 특정 위치에 있는 어느 하나 또는 복수의 아미노산 잔기(복수의 아미노산 잔기에 연결되거나 또는 연결되지 않은 복수의 아미노산 잔기를 포함)가 기타 아미노산 잔기에 의해 대체되는 것을 의미하고, 상기 단백질이 170801, 170802콜라겐과 유사한 생물학적 활성을 가져야 하고, 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성, 조직 재생 촉진 및 모낭 복구 재생 촉진의 활성을 포함한다.

상기 아미노산 추가란 SEQ ID NO.2 또는 SEQ ID NO.3서열과 같은 아미노산 서열의 C말단 또는 N말단에 아미노산을 추가하는 것을 의미하며, 상기 단백질이 170801, 170802콜라겐과 유사한 생물학적 활성을 가져야 하고, 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성, 조직 재생 촉진 및 모낭 복구 재생 촉진의 활성을 포함한다.

상기 아미노산의 결실이란 SEQ ID NO.2 또는 SEQ ID.3서열과 같은 아미노산 서열로부터, 1,2 또는 3개 또는 3개 이상의 아미노산을 제거할 수 있음을 의미하고, 상기 단백질이 170801, 170802콜라겐과 유사한 생물학적 활성을 가져야 하고, 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성, 조직 재생 촉진 및 모낭 복구 재생 촉진의 활성을 포함한다.

본 발명 중 상기 아미노산은 바람직하게는 L형 아미노산이고, 동시에 그중 하나 또는 복수(예를 들면 2-5개, 2-4개 또는 2-3개)아미노산은 폴리펩타이드의 생물학적 이용도, 안정성 및/또는 항바이러스 활성을 증가시키도록 또한 D형의 아미노산, 인공적으로 변형된 아미노산, 자연계에 존재하는 희귀 아미노산 등으로 대체될 수 있다. D형 아미노산은 단백질을 구성하는 L형 아미노산과 대응되는 아미노산이다. 인공적으로 변경된 아미노산은 메틸화, 인산화등으로 변형된 단백질을 구성하는 일반적인 L형 아미노산이다. 자연계에 존재하는 희귀 아미노산은 단백질을 구성하는 비일반적인 아미노산 및 단백질을 구성하지 않는 아미노산이며, 예를 들면5-하이드록시라이신, 메틸히스티딘, 감마아미노부티르산, 호모세린 등이다.

(2)재조합 인간 XVII형 콜라겐 아미노산 서열 및 DNA서열 최적화

본 발명에서, 17801, 17802의 DNA서열에 대해 변형을 진행하고, 각각 양자 아미노산 말단에 Strep-Tag II태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하고, 카르복실 말단에 6×His Tag태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하여, 이중 특이 친화성 및 정제 태그를 포함하도록 하고, 이는 친화층 크로마토그래피 정제를 진행할 수 있고, 또한 2개의 태그 서열을 기초로 하는 면역학적 항체 검사를 용이하게 한다. 구체적으로, 170801, 170802의 아미노산 서열 및 이들의 유전자 서열을 기반으로, DNA서열의 코돈 편향성 및 그 전사, 번역 과정 중 관련 최적화 매개변수를 계산하고, 재조합 및 최적화를 병합하여, 피키아 파스토리스에서 고효율 발현에 더욱 적합한 DNA서열을 합성한다.

본 발명에서, 170801양단에서 각각 변형시키고, 아미노산에 Strep-Tag II태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하고, 카르복실 말단에 6×His Tag태그를 코딩하는 DNA서열을 추가한 후, 170801이 최종적으로 발현하여 얻은 것은 태그를 포함하는 단백질이며, 총 249개 아미노산이며, 최적화된 170801의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4로 표시된다. 170801양단에서 각각 변형시키고, 아미노산에 Strep-Tag II태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하고, 카르복실 말단에 6×His Tag태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하고, 종결 코돈(TAA) 및 Not I의 효소 절단 위치의 DNA서열은 SEQ ID NO.8로 표시된다.

SEQ ID NO.4：

YVWSHPQFEKGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQHHHHHH

SEQ ID NO.8：

TACGTATGGTCTCATCCACAATTCGAGAAGGGTTCTCCTGGTCCAAAAGGTGACATGGGTTCTCCAGGTCCTAAAGGTGACAGAGGTTTTCCTGGTACTCCAGGTATTCCTGGTCCATTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCAAAAGGTCAAAAGGGTTCTGTTGGTGACCCTGGTATGGAAGGTCCAGGTGAAAAGGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTCCACACGGTCCACCTGGTGTTCCAGGTTCTGTTGGTCCTAAGGGTTCTTCTGGTTCTCCTGGTCCACAAGGTCCTCCTGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAGGGTGACAAGGGTCCAATGGGTCCTCCAGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTGAAAAGGGTCCACCTGGTCCTCCTGGTCCACCTGGTCCAAAGGGTGACCAAGGTCCTCCAGGTCCTAGAGGTCATCAAGGTGAACAAGGTTTGCCTGGTTTTTCTGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCACAAGGTCCTAAAGGTGACAAAGGTGACCCAGGTGTTCCTGGTGCTTTGGGTATTCCAGGTCCACCTGGTCAAAAAGGTGAAATGGGTACTCCAGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTCCAGCTGGTCCACCTGGTCATCCTGGTCCACCAGGTCCAAGAGGTCATAAGGGTGAAAAAGGTGACAAGGGTGACCAACACCATCATCACCATCATTAAGCGGCCGC

동일하게, 170802 양단에서 각각 변형시키고, 아미노산에 Strep-Tag II태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하고, 카르복실 말단에 6×His Tag태그를 코딩하는 DNA서열을 추가한 후, 170802가 최종적으로 발현하여 얻은 것은 태그를 포함하는 단백질이며, 총 482개 아미노산이며, 최적화된 170802의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시된다. 170802양단에서 각각 변형시키고, 아미노산에 Strep-Tag II태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하고, 카르복실 말단에 6×His Tag태그를 코딩하는 DNA서열을 추가하고, 종결 코돈(TAA) 및 Not I의 효소 절단 위치의 DNA서열은 SEQ ID NO.9로 표시된다.

SEQ ID NO.5：

YVWSHPQFEKGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGPPGPPGPKGDQGPPGPRGHQGEQGLPGFSGPPGPPGPQGPKGDKGDPGVPGALGIPGPPGQKGEMGTPGPKGDRGPAGPPGHPGPPGPRGHKGEKGDKGDQHHHHHH

SEQ ID NO.9：

TACGTATGGTCTCATCCTCAATTTGAAAAGGGTTCTCCAGGTCCTAAAGGTGACATGGGTTCTCCAGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTTTTCCAGGTACTCCAGGTATTCCAGGTCCTTTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCTAAAGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGTGACCCTGGTATGGAAGGTCCTGGTGAAAAAGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCTGGTCCACACGGTCCTCCAGGTGTTCCTGGTTCTGTTGGTCCAAAAGGTTCTTCTGGTTCTCCTGGTCCACAAGGTCCTCCAGGTCCTGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAAGGTGACAAAGGTCCAATGGGTCCTCCAGGTCCAAAGGGTGACCAAGGTGAAAAAGGTCCACCTGGTCCTCCTGGTCCACCAGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTCACCAAGGTGAACAAGGTTTGCCTGGTTTTTCTGGTCCTCCAGGTCCTCCTGGTCCTCAAGGTCCAAAGGGTGACAAGGGTGACCCTGGTGTTCCAGGTGCTTTGGGTATTCCTGGTCCTCCAGGTCAAAAGGGTGAGATGGGTACTCCTGGTCCTAAGGGTGACAGAGGTCCAGCTGGTCCTCCTGGTCACCCAGGTCCTCCTGGTCCTAGAGGTCATAAAGGTGAAAAAGGTGACAAGGGTGACCAAGGTTCTCCAGGTCCAAAGGGTGACATGGGTTCTCCTGGTCCAAAAGGTGACAGAGGTTTCCCTGGTACTCCAGGTATTCCTGGTCCATTGGGTCACCCAGGTCCACAAGGTCCAAAAGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGTGACCCAGGTATGGAAGGTCCAGGTGAAAAGGGTGAAAGAGGTGCTGCTGGTGAACCAGGTCCTCATGGTCCACCAGGTGTTCCAGGTTCTGTTGGTCCAAAGGGTTCTTCTGGTTCTCCAGGTCCACAAGGTCCTCCAGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCTGGTGTTAAGGGTGACAAAGGTCCTATGGGTCCTCCTGGTCCTAAAGGTGACCAAGGTGAAAAGGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCACCTGGTCCAAAAGGTGACCAAGGTCCACCAGGTCCTAGAGGTCATCAAGGTGAACAAGGTTTGCCAGGTTTTTCTGGTCCACCAGGTCCACCAGGTCCTCAAGGTCCTAAGGGTGACAAAGGTGACCCAGGTGTTCCTGGTGCTTTGGGTATTCCTGGTCCACCTGGTCAAAAGGGTGAAATGGGTACTCCTGGTCCTAAAGGTGACAGAGGTCCTGCTGGTCCACCTGGTCATCCAGGTCCACCTGGTCCAAGAGGTCACAAAGGTGAAAAGGGTGACAAGGGTGACCAACACCATCACCATCATCATTAAGCGGCCGC

본 발명에서, 전장인간 XVII형 콜라겐 아미노산 서열(즉 인간XVII형 콜라겐 α1사실)을 코딩하는 DNA서열(아미노산 말단에 EcoR I의 효소 절단점, Step-TagII태그의 DNA서열에 추가, 카르복실 말단에 6×His Tag태그를 코딩하는 DNA서열 및 종결 코돈(TAA) 및 Not I의 효소 절단 위치점에 추가)은 SEQ ID NO.10으로 표시된다.

SEQ ID NO.10：

GAATTCTGGAGTCATCCTCAATTCGAAAAAATGGATGTCACTAAAAAGAACAAGAGAGACGGAACTGAGGTCACTGAGAGAATCGTTACCGAAACTGTCACCACAAGACTTACTTCATTACCTCCAAAGGGTGGAACTTCTAATGGTTACGCAAAGACAGCATCATTAGGAGGTGGTTCAAGACTTGAGAAACAATCCCTTACTCATGGTTCAAGTGGATACATAAATTCAACTGGTTCAACAAGAGGACATGCAAGTACTTCTTCTTATAGAAGAGCACATAGTCCAGCATCAACTTTGCCCAACTCTCCTGGTTCAACATTTGAGAGAAAAACTCATGTAACCAGACATGCCTATGAGGGTTCTAGTTCTGGTAATTCATCTCCAGAATACCCTAGAAAAGAGTTTGCATCATCCTCAACTAGAGGTAGATCACAGACTAGAGAATCTGAAATCAGAGTCAGATTACAATCAGCATCTCCTTCAACTAGATGGACTGAGTTAGACGACGTGAAAAGATTATTAAAGGGATCAAGAAGTGCAAGTGTTTCCCCTACAAGAAATTCTTCCAACACCCTTCCCATTCCTAAGAAAGGAACCGTTGAAACTAAAATCGTTACAGCATCATCTCAGTCTGTATCCGGAACCTACGACGCTACCATTCTGGACGCCAACTTACCTTCTCATGTCTGGTCTTCAACTTTACCCGCAGGTTCCTCAATGGGAACTTACCACAATAACATGACTACTCAATCAAGTTCTCTTCTGAATACCAATGCATACTCAGCCGGTTCCGTTTTTGGAGTCCCTAACAATATGGCCTCTTGCTCCCCAACTCTTCATCCAGGTCTTTCAACCTCATCAAGTGTATTTGGTATGCAGAACAACTTAGCCCCTTCCTTGACAACCCTGTCTCATGGTACTACTACCACTAGTACAGCATATGGAGTCAAGAAGAACATGCCACAGTCACCTGCTGCCGTTAACACTGGAGTTTCAACATCTGCTGCCTGCACTACATCTGTTCAATCAGATGATCTTCTGCATAAGGACTGCAAGTTTTTAATTTTAGAGAAAGACAATACCCCTGCCAAAAAGGAAATGGAGTTACTTATAATGACCAAAGATTCTGGTAAAGTATTCACTGCTTCTCCCGCTAGTATCGCCGCAACTTCATTCTCTGAAGATACTTTAAAGAAGGAAAAACAAGCCGCATACAACGCAGACTCAGGTTTAAAAGCAGAAGCAAACGGTGACCTTAAAACAGTGTCAACTAAGGGAAAGACTACAACCGCAGACATCCATTCATATGGTTCTTCAGGTGGAGGAGGATCTGGAGGAGGTGGTGGAGTGGGAGGTGCTGGAGGAGGTCCATGGGGTCCTGCACCTGCATGGTGCCCTTGCGGTTCTTGCTGCAGTTGGTGGAAGTGGCTTCTGGGTTTATTATTAACTTGGCTGCTTTTACTGGGTCTTTTATTCGGTCTTATCGCATTAGCAGAAGAGGTCAGAAAACTTAAGGCCAGAGTTGATGAGTTAGAGAGAATCAGAAGATCAATCCTTCCCTATGGAGACTCCATGGACAGAATCGAAAAGGATAGACTTCAGGGTATGGCCCCTGCAGCAGGAGCTGATCTGGATAAAATCGGACTTCATTCAGATTCTCAAGAGGAATTATGGATGTTTGTTAGAAAGAAACTTATGATGGAGCAGGAGAACGGTAACCTGAGAGGTTCTCCTGGTCCAAAAGGAGATATGGGTTCACCCGGTCCCAAAGGAGATAGAGGATTCCCTGGTACTCCAGGTATCCCCGGTCCCCTGGGTCACCCTGGACCTCAAGGTCCTAAAGGTCAAAAGGGTTCTGTAGGAGATCCAGGTATGGAGGGTCCCATGGGTCAGAGAGGTAGAGAAGGTCCCATGGGACCAAGAGGTGAAGCTGGACCTCCCGGAAGTGGTGAAAAAGGAGAAAGAGGAGCAGCAGGAGAACCTGGACCCCATGGACCTCCAGGAGTTCCTGGATCAGTCGGACCCAAAGGTTCATCCGGTTCTCCTGGACCTCAAGGTCCACCAGGACCCGTCGGATTGCAAGGATTGAGAGGAGAAGTTGGACTTCCCGGAGTTAAGGGTGACAAGGGTCCTATGGGTCCTCCTGGTCCAAAGGGAGATCAGGGTGAAAAGGGTCCTAGAGGTCTGACTGGTGAACCAGGAATGAGAGGACTTCCCGGTGCCGTGGGTGAACCCGGTGCAAAAGGAGCAATGGGTCCTGCCGGTCCTGATGGACACCAGGGACCCAGAGGAGAGCAGGGATTAACAGGAATGCCTGGTATCAGAGGTCCCCCAGGTCCCTCAGGAGACCCAGGAAAGCCAGGACTTACTGGTCCCCAGGGTCCTCAAGGTCTGCCTGGAACTCCCGGAAGACCCGGAATCAAAGGTGAACCAGGAGCCCCAGGAAAAATCGTTACTAGTGAAGGATCTTCAATGCTGACTGTGCCAGGTCCACCTGGTCCTCCTGGAGCTATGGGTCCTCCCGGTCCCCCTGGAGCACCCGGTCCTGCAGGTCCTGCCGGATTACCTGGACATCAGGAAGTCTTAAACCTGCAAGGTCCACCAGGTCCTCCTGGTCCAAGAGGACCCCCTGGTCCTTCAATCCCTGGTCCACCTGGACCTAGAGGTCCACCCGGAGAGGGACTTCCCGGACCACCAGGACCTCCTGGATCATTTCTGTCTAATTCTGAGACATTTCTTTCAGGACCTCCTGGTCCTCCCGGACCACCTGGACCAAAAGGAGATCAGGGACCACCTGGTCCCAGAGGACATCAAGGAGAGCAGGGTCTTCCAGGTTTCTCTACTTCTGGATCATCATCATTTGGTCTTAATCTTCAAGGTCCTCCTGGACCCCCAGGACCACAGGGACCCAAGGGTGACAAGGGAGACCCTGGAGTCCCAGGTGCACTGGGAATCCCTTCAGGTCCTTCAGAAGGTGGTTCATCTTCAACCATGTATGTGTCTGGACCCCCAGGACCTCCCGGACCTCCAGGTCCTCCTGGTTCAATCTCTTCTTCTGGTCAAGAAATTCAGCAGTATATTTCTGAGTACATGCAATCTGACTCTATTAGAAGTTATTTGTCTGGTGTGCAGGGTCCACCAGGTCCTCCAGGTCCCCCTGGACCAGTCACTACTATCACTGGAGAGACATTTGATTATAGTGAATTAGCATCACACGTCGTTTCTTATCTGAGAACTTCAGGTTATGGTGTTTCATTATTTTCCTCCTCAATCTCTTCAGAAGACATCTTAGCCGTACTGCAGAGAGATGATGTAAGACAGTACCTTAGACAATACTTGATGGGTCCAAGAGGACCACCAGGTCCACCCGGTGCATCAGGAGACGGATCATTATTATCTTTGGATTACGCTGAATTATCATCAAGAATCCTTAGTTACATGTCCTCTTCTGGTATCTCCATAGGTCTGCCCGGTCCTCCTGGTCCTCCCGGACTTCCTGGTACTTCTTACGAAGAGCTTCTGTCACTTTTAAGAGGATCTGAGTTTAGAGGTATAGTTGGTCCCCCAGGACCTCCAGGTCCTCCAGGTATCCCAGGTAACGTGTGGTCATCTATCTCAGTTGAGGATCTTTCATCTTATCTTCACACCGCCGGATTGTCCTTTATACCTGGTCCTCCAGGACCCCCTGGACCTCCTGGACCCAGAGGTCCTCCAGGAGTATCCGGTGCTTTAGCAACTTATGCAGCAGAAAACTCCGATTCTTTTAGATCAGAATTGATCTCCTACCTTACTTCTCCTGATGTTAGATCATTCATCGTCGGACCTCCAGGACCACCTGGACCTCAAGGACCTCCTGGAGATTCAAGATTACTGAGTACAGATGCATCACATTCAAGAGGTTCAAGTTCTTCTTCTCACTCCTCTTCTGTTAGAAGAGGATCATCATATTCATCAAGTATGTCAACTGGTGGAGGAGGAGCTGGTTCATTGGGTGCCGGAGGTGCATTTGGTGAGGCCGCTGGTGACAGAGGACCTTATGGTACTGACATTGGACCTGGTGGAGGTTATGGTGCAGCAGCAGAAGGTGGAATGTATGCTGGTAATGGAGGTTTACTGGGAGCCGACTTTGCCGGAGACCTGGACTACAACGAGTTAGCTGTTAGAGTGTCAGAGTCAATGCAGAGACAAGGATTATTACAGGGTATGGCTTATACAGTTCAGGGACCCCCAGGTCAGCCAGGTCCTCAAGGACCCCCTGGTATTTCAAAAGTCTTCTCCGCTTATTCTAACGTTACTGCAGACCTGATGGATTTCTTCCAGACTTACGGTGCCATCCAAGGTCCTCCAGGACAGAAGGGTGAAATGGGAACTCCCGGTCCCAAGGGTGACAGAGGTCCTGCAGGACCTCCTGGTCACCCTGGACCACCTGGACCTAGAGGACACAAAGGTGAGAAGGGTGACAAGGGAGACCAGGTTTACGCAGGAAGAAGAAGAAGAAGAAGTATTGCCGTCAAGCCTCACCATCACCATCATCACTAAGCGGCCGC

(3)DNA서열의 합성과 재조합 발현 벡터의 구축

본 발명에서, 최적화된 서열 SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9 및 SEQ ID NO.10은 난징 진쓰루이 생물과학기술 주식유한공사에 위탁하여 합성하였고, 3개의 유전자 단편은 pUC57-170801, pUC57-170802, pUC57-col17a1로 기록한다. 합성된 유전자 단편 SEQ ID NO.8, SEQ ID NO.9을 SnaB I 및 Not I이중 효소로 절단하고, 비교로서, 효소 절단 후 얻은 표적 단편을 동일하게 이중으로 효소를 절단한 pPIC9K빈 벡터에 연결한다.

단계 a. 표적 유전자, 발현 벡터의 증폭: 플라스미드 미니 프렙 키트(SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd에서 구입)로 pUC57-170801, pUC57-170802, pUC57-col17a1, pPIC9K빈 벡터의 플라스미드를 추출하고, 구체적인 작동은 키트 설명서에 따라 진행한다.

단계b. 단계a에서 얻은 표적 유전자 단편과 pPIC9K벡터의 플라스미드를 37℃에서 30min동안 이중 효소 절단하고, 효소 절단 반응 체계는 아래와 같다(사용된 QuickCut™제한성 효소는 대련TaKaRa 회사에서 구입했으며, 효소 절단 과정은 설명서에 따라 진행함):

획득한 표적 유전자 단편과 벡터 단편을 PCR생성물 정제 키트를 이용하여 정제한다(대련TaKaRa 회사에서 구입했으며, 구체적인 작동은 키트 설명서에 따라 진행함). 이중 효소 절단 처리된 표적 유전자 단편과 벡터pPIC9K선형화 단편을 회수하고, SolutionⅠ결합 시약(결합 키트는 대련TaKaRa회사에서 구입)로 결합(16℃에서 30min동안 결합)을 진행하고, 표적 유전자 단편을 분비 신호 α-인자가 포함된 분비형 벡터 리딩 프레임 내에 정확히 삽입하고, 결합 반응 체계는 다음과 같다(결합 키트 설명서에 따라 진행).

결합 생성물을 적격성 대장균DH5α（SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd에서 구입）으로 형질전환하고, Amp가 포함된 LB내성 플레이트에서 양성 클론을 스크리닝하고, 콜로니PCR을 진행하여 확인하며, 재조합 플라스미드를 추출하여 시퀀싱 감정을 진행하고(SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd에 의해 인계), 시퀀싱 검증을 통해 본 실시예에서 재조합 발현 벡터 pPIC9K-170801, pPIC9K-170802, pPIC9K-col17a1을 성공적으로 구축했음을 정확히 증명하였고, 관련 플라스미드 스펙트럼은 도1, 도2 및 도 3에 도시한 바와 같다.

(4）재조합 조작 균주의 구축, 균종 스크리닝

각각 단계(3)에서 얻은 재조합 발현 벡터 플라스미드10 μg을 SacI(효소 절단 키트는 대련TaKaRa 회사에서 구입했으며, 구체적인 작동은 키트 설명서에 따라 진행함)를 사용하여 37℃에서 효소를 밤새 절단하여, 이를 선형화하고, 다시 PCR생성물 정제 키트（SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd에서 구입）를 사용하여 선형화된 플라스미드를 회수하고, 회수된 부피를 약10μL로 제어한다.

선형화된 플라스미드를 빈 숙주 균종 피키아 파스토리스GS115(중국 공업 미생물 균종 보관 관리센터)의 적격성 세포로 전기 형질 전환시키고, 전기 형질 전환된 균주 용액을 MD플레이트에 도포하고, 하나의 플레이트에 100μL～200Μl씩 도포하고, 실온에서 10min동안 정치시키고, 단일 콜로니(양성 형질전환체)가 나타날 때까지 30℃에서 뒤집어 2-5일 배양한다.

MD플레이트 표면에 2mL멸균된 이중 증류수를 추가한 후, 멸균 삼각 스프레더로 플레이트 표면의 His+형질 전환체(양성 형질전환체)를 부드럽게 긁어내고, 50mL원심 분리 튜브로 옮겨, 멸균된 이중 증류수로 희석하여 세균 현탁액을 형성하고, 105개 세포를 포함하는 세균 현탁액을 0.5mg/mL G418를 포함하는 YPD플레이트에 도포하고, 뒤집어, 단일 콜로니가 나타날 때까지 30℃에서 3~4d 배양한다. YPD플레이트로부터 콜로니를 선택하여 멸균90웰 플레이트(각 웰은 200μL YPD를 포함)에 넣고, 균일하게 혼합하고, 30℃에서 48h 배양한다. 웰에 세균 용액을 균일하게 혼합하여, 10μL씩 취하여 하나의 새로운 멸균된 96웰 플레이트로 옮겨, 30℃에서 24h 배양한 후 다시 상기 단계를 한번 반복한다. 24h 후, 세번째 96웰 플레이트로부터 1μL를 취하여 각각 1.0mg/mL와 4mg/mL G418를 포함하는 YPD플레이트에 각각 배치하고, 30℃에서 계속하여 96h~120h를 배양한다. 피키아 파스토리스 형질 전환체가 고농도G418을 포함한 플레이트에서 성장할 수 있다는 것은 상기 형질 전환체가 다중 카피된 표적 유전자를 포함한다는 것을 의미하며, 즉 복수의 재조합 단편이 효모 체내에 들어가 상동 재조합을 통해 효모 염색체에 통합된다. 이러한 단계 스크리닝을 통해 얻는 높은 카피, 높은 효율로 발현 가능한 재조합 효모 조작 균주를 얻을 수 있다.

각각 pPIC9K-col17a1, pPIC9K-170801, pPIC9K-170802 3종류의 조작 균주 샘플을 구축하여 중국 미생물 균종 보관 관리 위원회 일반 미생물 센터로 보냈고, 균종 기탁번호는 각각 CGMCC No.18659, CGMCC No.20626, CGMCC No. 20627이다. 주소는 주소는 북경시 조양구 북진서로 1호원 3호이고, 보관 일자: CGMCC No.18659는 2019년 10월 10일이고, CGMCC No.20626, CGMCC No. 20627는 2020년 09월 09日일이다. 분류 명칭은 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이다.

(5)유도 발현과 재조합 콜라겐의 감정

단계(4)에서 1.0mg/mL및 4mg/mL의 G418을 포함하는 YPD플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고, 10Ml의 BMGY배지가 설치된 100 mL 의 삼각 플라스크에 넣고, 28-30℃에서, OD₆₀₀ 가 2~6(16-18 h)될 때까지 220rpm으로 배양한다. 실온에서 1500~3000g을 5min동안 원심 분리하고, 균체를 수집하고, BMMY배지를 이용하여 재현탁하여, OD₆₀₀ 가 약2가 되도록하고, 28-30℃에서, 220rpm의 쉐이커에 넣고 3일동안 계속 성장시키고, 농도가 1.0%가 될 때까지 배지에 100%의 메탄올을 매 24h마다 첨가한다. 시간점(≥24h, 필요한 경우, 24h, 48h, 72h, 96h는 모두 샘플링됨)에 따라 각각 세균액 샘플을 취하고, 채취량은 1mL이고, 1.5ml의 EP관에 넣고, 최대 회전속도로 2~3min동안 원심 분리하고, 발현 상청액과 균체를 수집하였다. 균체를 유리 균주의 파쇄법으로 용해하고, 용해 완충액(1mM PMSF, 10mM Tris，pH7.4)을 4℃에서 12000g으로 5min동안 원심 분리하고, 세포내 용해 상청액을 취하고, 다시 8M의 우레아를 첨가하고 흔들어 침전물을 용해시키고, 표적 단백질의 발현량 및 균액의 최적 수확 시간을 분석한다. 검측 대상 샘플은 사용을 위해 -80℃에서 보관한다.

수집된 발현 상청액, 세포내 용해 상청액, 세포내 침전 용해액에 5×로딩 완충액(250mM Tris-HCl, pH값 6.8，10％SDS，0.5％의 브로모페놀 블루，50％의 글리세롤，5％의 β-머캅토에탄올)을 첨가하고, 100℃의 금속욕조에 넣고, 10min동안 가열하여, SDS-PAGE검측을 진행한다. 발현된 표적 단백질 아미노 말단에 Srtep-TagⅡ, 카르복실기 말단에 6×His태그가 있기 때문에, 항 Srtep-Tag Ⅱ, 항6×His Tag의 항체일 수 있으며(난징 진쓰루이 생물과학기술 주식유한공사에서 구입), Western Blot을 이용하여 검측한다.

재조합 전장인간 XVII형 콜라겐 α1사슬의 발현 및 감정

도 4의 SDS-PAGE결과에 도시한 바와 같이, 발현 상청액에는 예기한 목표 밴드가 없다(겉보기 분자량은 약 180kDa임).

항6×His Tag항체를 사용하여 Western Blot검측을 진행하고, 결과는 도5에 도시한 바와 같으며, 발현 상청액에서 극소량의 분해된 표적 단백질만을 검출되는 것으로 밝혀졌고(겉보기 분자량은 예상보다 작았으며, 약 120kDa임), 또한 장시간 동안 발현을 유도한 후에야 볼 수 있었으며, 세포내 용해 상청액에는 비교적 많은 분해된 표적 단백질이 있으며(겉보기 분자량은 예상보다 작음), 겉보기 분자량은 120kDa였다(인간 XVII형 콜라겐 세포외 도메인의 겉보기 분자량과 일치). 세포내 침전물 및 용해부분에서만 겉보기 분자량 크기(180kDa)가 예상되는 표적 단백질이 존재한다. 실험 결과에 의하면, 막관통형의 콜라겐으로, 세포내의 막시스템에 고정되어야 하며, 분해된 후에야 떨어져 나와 세포내에 용해될 수 있으며, 발현 상청액에서 검측한 분해된 표적 단백질은 배양에서 장기간 사멸된 세포의 용해후 발현 상청액으로 방출될 가능성이 가장 높지만, 어느 경우든, 전장의 재조합 인간XVII형 콜라겐은 피키아 파스토리스 세포 외에서 효율적으로 분비될 수 없다.

170801, 170802콜라겐의 발현 및 감정:

도 6은 24h 유도한 후, 170801, 170802콜라겐의 조작 균주 발현 상청액의 SDS-PAGE결과이고, 도 6에 도시한 바와 같이, 170801, 170802콜라겐은 24h동안 발현을 유도한 후 세포외의 배양 상청액에 고효율로 분비 발현될 수 있고, 170801의 겉보기 분자량은 약 30kDa이고, 170802의 겉보기 분자량은 약 52kDa이다.

도 7은 24h 유도 후, 170801, 170802콜라겐의 조작 균주 발현 상청액의 Western Blot결과이고(Anti-His이고, 항체는 SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd에서 구입, 마우스 항-His모노클로날 항체, 품목 번호 D199987임), 도 8은 24h유도한 후, 170801, 170802콜라겐의 조작 균주 발현 상청액의 Western Blot결과이다(Anti-Strep-Tag II, 항체는 난징 진쓰루이 생물과학기술 주식유한공사에서 구입, 토끼 항Strep-Tag폴리클로날 항체, 품목번호 A00626임), 도7 및 도8의 결과로부터(ECL화학 발광 발색, 전자동 화학 발광 이미지 분석 시스템 Tanon 5200은 단백질 분자 질량 표준을 합성함)에서 볼 수 있듯이, 아미노산 말단 Srtep-TagⅡ태그, 카르복실기 말단6×His태그는 모두 검측할 수 있고, 표적 밴드 크기는 약 SDS-PAGE의 겉보기 분자량 크기와 동일하므로, 재조합 인간XVII형 콜라겐 170801, 170802는 고효율의 분비 발현을 성공하였음을 설명해준다.

절단에 의해 유도 발현된 단백질 밴드를 회수하여, 트립신으로 효소 분해하고, Nano-HPLC-MS/MS질량스펙트럼으로 재조합 콜라겐의 트립신 펩티드를 검출하고(수저우 푸타이 생물 기술 유한공사에 위탁), 검출된 펩티드를 서열 비교하였다(Uniprot데이터 베이스). 결과는 도9, 도 10에 도시한 바와 같으며, 170801, 170802콜라겐은 효소 분해한 후 검측된 펩티드는 모두 아미노산 서열의 선택 설계시 선택된 인간XVII형 콜라겐 서열의 관련 영역에 속하며, 이는 170801, 17802콜라겐의 발현이 성공했음을 설명한다.

실시예2. 유전자 조작 균주의 파일럿 발효 및 단백질 정제

(1）파일럿 발효

구축된 pPIC9K-170801, pPIC9K-170802를 각각 포함하는 조작 균주에 대해 50L-500L연동 파일럿 발효를 진행하고, 재조합 인간XVII형 콜라겐이 포함된 발효액을 얻고, 재조합 인간XVII형 콜라겐 170801, 170802의 대규모 발현 생산을 실현하였다.

종자배지 YPG(배합 방법:효모 분말 10g/L, 효모 펩톤FP102 20g/L, 무수 글리세롤 10g/L); 발효 배지(배합 방법：NH₄H₂PO₄ 190.4 g/L, KH₂PO₄　10.06 g/L, CaSO₄·2H₂O 1.18 g/L, K₂SO₄ 18.2 g/L, MgSO₄·7H₂O 14.9 g/L, 글리세롤40 g/L; 피드 배지(50%W/V글리세롤，리터당12mL PTM₁미량 원소）; 유도 배지(100%메탄올，리터당12Ml의 PTM₁미량 원소 추가); 그중 PTM₁은 0.22μm의 필터로 여과하여 세균을 멸균하고, 4℃에서 보관했다. 발효 배지를 고온 멸균한 후 실온으로 온도를 하강시킨 후 PTM₁를 첨가하고, 암모니아수로 pH값을 5.0으로 조정하였다.

구축된 조작 균주 배치 배양 조건과 유도 발현 조건은 다음과 같다:

유가식 배양방법을 이용하고, 배양 온도는 30℃이다. 구축된 조작 균주를 종자 배지YPG가 설치된 쉐이커에 넣고, 약병 용량은 2L，220rpm이고, 30℃에서 24h동안 배양한다. 10%접종량으로 발효 배지를 포함하는 종자발효탱크에 접종하고(접종후 OD₆₀₀는 5임), 발효 탱크 용량은 50L이고, 배양을 확장하고, 교반 속도를 200r/min-600r/min로 조절하고, 공기유량은 2VVM이고, DO≥30%이며, 탄소원이 소진될때까지 배양한 후, 발효 배지를 포함하는 발효 탱크로 옮겨 발효 배양을 시작하고, 발효 탱크 용량은 500L이다. 발효 배양 조건은, 교반 속도는 150r/min-500r/min이고, 탱크 압력은 0-0.05MPa이고, 공기 유량은 1VVM이고，DO≥30%이며, 유가 보충 배지의 용존 산소를 반등시키고, 유가속도는 DO≥30%를 유지하고, OD₆₀₀가 190-210으로 성장하면, 재료 공급을 중단한다. 용존 산소가 DO≥70%로 반등하면, 유도 배지를 공급하여 유도 발현을 진행하고, 회전 속도, 통기량, 탱크 압력 및 유속 가속도를 DO≥30%로 조절한다. 40-72h유도한 후, UV측정 단백질 농도 증가폭이 확실치 않거나 또는 감소한 경우 탱크에 넣을 수 있다.

UV단백질 정량 공식：C(mg/mL)＝0.144*(A215-A225)，A215<1.5.

구축된 조작 균주에 대해 고밀도에서 파일럿 발효하고, 결과에 의하면, 48h 유도할 경우, 균 농도(OD₆₀₀)는 모두 250이상에 도달할 수 있고, 균 습윤 중량은 300g/L정도이고，발효액중 단백질 농도는 약10g/L(UV정량)보다 컸다. 결과는 도 11 및 도 12와 같고, 도 11에서 볼 수 있듯이, 171801의 조작 균주의 성장이 양호하고, 48h유도할 경우 균 농도(OD₆₀₀）는 270에 도달할 수 있고， 균 습윤 중량은 355g/L에 도달하고，발효액 중 단백질 농도는 12g/L(UV정량)에 도달할 수 있다. 도 12에서 볼 수 있듯이, 171802의 조작 균주의 성장이 양호하고, 48h유도할 경우 균 농도(OD₆₀₀）는 250에 도달할 수 있고， 균 습윤 중량은 293g/L에 도달하고，발효액중 단백질 농도는 11g/L(UV정량)에 도달할 수 있다.

(2)정제

본 실시예에서 이용한 완충액은 다음과 같다:

완충액A：20mM KH₂PO₄, pH 값 4.0;

완충액B：20mM KH₂PO₄, 1M NaCl ，pH값 4.0.

얻은 조작 균주의 발효액을 수집하고, 세라믹 막 분리 시스템(Jiangsu Jiuwu High-Tech Co., Ltd., JWCMF-9)을 이용하여 균체와 발효 상청액을 분리하였다. A215흡광값과 전도율값이 모두 변하지 않을때까지 양이온 교환 매질(크로마토그래피 포장재는 Suzhou마이크로 생산 UniGel-80sp, Jiangsu hanbang과학기술에서 생산하는 전자동 크로마토그래피 시스템에 장착)을 완충액A로 평형을 유지하고, 로딩 유속을 100us/cm, 로딩 부피 20L/회로 설정하고, 자외선 A215흡광값을 검측하고, 상승하면, 샘플링을 시작한다. 로딩이 끝나면, 샘플링을 닫고, 완충액A로 양이온 크로마토그래피 매체를 평형화하고, A215흡광값이 하강하면, 샘플링을 열고, 자외선 및 전도율이 최저로 하강하고 더 이상 변하지 않을때까지 샘플링을 중지한다. 각각 500Mm 및 1M의 염화나트륨으로 용출하여 용출액을 수집하고, 각각 500mM의 용출액 및 1M용출액 성분에서 정제된 단백질을 검측하고, 성분을 결정한 후, 투석(투석액은 초순수임)후, 농축, 동결 건조 및 동결 건조 콜라겐 스폰지 수집을 진행한다.

170801, 170802콜라겐 동결 건조 스폰지를 초순수로 2mg/mL로 녹이고, 0.22μm필터로 여과하여, 샘플10μL(Sepax Bio-C18크로마토그래피 컬럼, 고성능 액상 크로마토 그래프는 Waters2695 또는 Agilent LC1260)을 주입하여, 정제된 콜라겐170801, 170802의 순도를 분석한다.

정제 결과는 도 13, 도 14에 도시한 바와 같이, 도에서 볼 수 있듯이, 정제된 170801, 170802콜라겐은 단일 피크가 명백하고, 순도가 높으며(91.2%, 90%), 본 정제 방법은 신뢰할 수 있고 효과적이며, 얻은 콜라겐 순도가 높다는 것을 설명한다.

본 실시예에서 이용하는 정제 방법 외에, 170801, 170802콜라겐의 아미노 말단에는 Srtep-TagⅡ태그가 있고, 카르복실 말단에는 6×His태그가 있고, 모두 Ni-NTA, Strep-Tactin등 친화성 매질을 사용하여 단일 또는 이중 친화 정제를 진행할 수 있고, 또한 본 실시예와 유사한 효과에 도달할 수 있다.

(3)재조합 콜라겐의 성질 특징

분자량 크기 측정:

획득한 170801, 170802 단백질의 이론적 예측 분자량은 각각 23.8kDa, 45.4kDa이고，SDS-PAGE에서 검측한 겉보기 분자량은 이론적으로 예측한 값보다 컸다. 재조합 인간XVII형 콜라겐170801, 170802단백질을 정제한 후 동결 건조한 제품에 대해 Maldi-tof MS(Matrix-assisted laser desorptionionization-time of flight mass spectrometry)(AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF)를 진행하여 그 상대 분자량을 검측하고, 단백질의 실제 분자량을 판단하였으며, SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd에 위탁하여 검측하였다. 결과는 도 15, 도 16에 도시한 바와 같으며, MALDI-TOF MS(전하수+1)로 검측한 170801콜라겐의 분자량은 23811.6797Da(이론값 23800Da)이고, 170802콜라겐의 분자량은 45689.5781Da（이론값45400Da）이고，피키아 파스토리스 발현후 번역후 변형 및 분자량 실험 측정에 존재하는 시스템 오차가 존재하므로, 발현된 콜라겐 분자량과 이론값은 일치한다.

푸리에 변환 적외선 분광법(FT-IR)분석:

콜라겐 그룹의 특징적인 흡수 피크는 적외선 분광분석으로 검측할 수 있고, 실험에서의 미량의 170801, 170802콜라겐을 취하여 정제한 후 동결 건조 샘플을 각각 KBr로 연마하여 분말로 만든 후 정제로 압축하였고, 실온에서, 4000~400 cm ^-1범위 내에서 스캐닝하고(Thermo Scientific，Nicolet™ iS™ 10 FT-IR 분광계), 방법 및 결과 분석은 (Jeong, H., J. Venkatesan and S. Kim, Isolation and characterization of collagen from marine fish (Thunnus obesus). Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2013. 18(6): p. 1185-1191.)을 참고한다.

170801, 170802콜라겐 정제 샘플의 적외선 스펙트럼 스캐닝 도면 17로부터 아미드A, 아미드B, 아미드I, 아미드II, 아미드III의 파수는 모두 재조합 콜라겐 구조의 특징에 부합함을 알 수 있다(참고 문헌[1]천 징타오, 재조합 콜라겐과 소I형 콜라겐의 적외선 분광기 연구, Materials Review 2008(03): 제 119-121페이지, [2].Doyle, B.B., E.G. Bendit and E.R. Blout, Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides. Biopolymers, 1975. 14(5): p. 937-957. [3].조우마이메이등, 재조합 인간 유래 콜라겐의 분리 정제화 및 그 구조 특징, 식품과 발효 공업, 2015(03): 제46-52페이지).

콜라겐의 동결건조 스폰지 샘플의 주사전자현미경 스캐닝 분석:

주사전자현미경(Hitachi TM3030PLUS)을 이용하여 170801, 170802콜라겐 동결 건조 스폰지 샘플 표면을 스캐닝하고, 결과는 도 18에 도시한 바와 같으며, 도면에서 알 수 있듯이, 재조합 인간XVII형 콜라겐170801, 170802은 모두 명확한 라멜라 구조를 가지며, 인체중 인간XVII형 콜라겐의 기저막 라멜라 분포와 유사하며, 이러한 구조는 생물학적 의학 재료 분야에 응용 가능한 잠재력을 가짐을 예시한다.

실시예3. 재조합 콜라겐 세포의 접착 활성 검측

재조합 콜라겐의 세포 접착 활성 검측 방법은 문헌Juming Yao,Satoshi Yanagisawa,Tetsuo Asakura. Design,Expression and Characterization of Collagen-Like Proteins Based on the Cell Adhesive and Crosslinking Sequences Derived from Native Collagens ,J Biochem .136,643-649(2004)을 참고한다. Changzhou 대학 의학원의 기능 나노 재료와 생물 의학 검측 실험실에 의뢰하였다.

구체적인 실시방법:

NIH/3T3세포를 정상적으로 배양한다(중국 과학원 세포 데이터, 품목 번호GNM6, 배양, 계대 방법은 세포 설명서를 참고하여 수행). 170801, 170802단백질 정제 동결 건조 제품, 대조품인 천연 인간 콜라겐(Sigma에서 구입, 품목 번호 C7774 및 소혈청 단백질(BSA, (SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd에서 구입)을 취하여 용해시키고(초순수 또는 1M의 HCl용액), UV단백질 정량 공식：C(mg/mL)＝0.144*(A215-A225)으로 단백질 농도를 측정하고, 다시 PBS(pH 7.4)로 0.5mg/mL까지 희석시켰다. 96웰 세포 배양 플레이트에 100μL각종 단백질 용액 및 블랭크 PBS용액대조를 넣고 상온에서 60min동안 방치하였다. 다시 각 웰에 10⁵개의 배양 상태가 우수한 3T3세포를 추가하고, 37℃, 5%CO₂로 60min동안 인큐베이션하였다. PBS로 웰의 세포를 4회 세척하였다. LDH검측 키트(Roche，04744926001)를 사용하여 OD492nm의 흡광도값을 검측하였다(구체적인 작동은 설명서를 참고하여 수행됨).

OD492nm의 흡광도는 이에 따라 콜라겐 샘플의 세포 접착 활성을 특성화할 수 있다. 흡광도값이 높을수록, 단백질이 더 많은 세포에 접착함을 의미하며, 접착 활성이 높을수록, 콜라겐은 단시간 내에 세포 접착벽을 돕거나 또는 세포외 기질에 부착하는 것을 도울 있을수록, 더 나은 세포외 환경을 구축하는데 유리하다. 도 19결과에 도시한 바와 같이, 재조합 인간XVII형 콜라겐 170801, 170802와 상품화된 천연 인간 콜라겐과 비교하면, 더욱 좋은 세포 접착 활성을 가진다.

실시예4. 스크래치 방법에 의한 재조합 콜라겐 세포 이동 활성 검측

재조합 콜라겐의 세포 이동 활성 검측 및 분석 방법은 문헌Bobadilla, A., et al., In vitro cell migration quantification method for scratch assays. J R Soc Interface, 2019. 16(151): p. 20180709을 참고한다. Changzhou 대학 의학원의 기능 나노 재료와 생물 의학 검측 실험실에 의뢰하였다.

구체적인 실시 방법:

170801, 170802콜라겐 정제 동결 건조 제품, 대조품인 천연 인간 콜라겐(Sigma에서 구입, 품목 번호 C7774 및 소혈청 단백질(BSA, (SANGON BIOTECH (SHANGHAI) CO Ltd에서 구입)을 취하여 용해시키고(초순수 또는 1M의 HCl용액), UV단백질 정량 공식：C(mg/mL)＝0.144*(A215-A225)으로 단백질 농도를 측정하고, 다시 DMEM무혈청 배양액（GIBCO, 품목 번호12800017, Ph7.4）를 0.5mg/mL로 희석시켰다(희석 후, pH를 7.0~7.4에서 안정화되도록 조정). NIH/3T3세포(중국 과학원 세포 데이터, 품목 GNM6, 배양, 계대 방법은 세포 설명서를 참고하여 수행)를 정상적으로 배양, 계대한다. 상태가 우수한 세포를 6웰 플레이트에 삽입하고, 각 웰에 2mL의 세포 현탁액을 20000cells/mL의 밀도로 접종하여, 36h 배양하였다. 200μL피펫 팁으로 스크래치를 준비하고, PBS로 세포fmf 3회 세척하여, 스크래치된 세포를 제거하였다. DMEM무혈청 배지에 희석된 단백질 용액을 웰에 추가하고, 37℃, 5%CO₂배양 탱크에 넣고 계속 배양하고, 0h, 24h, 48h 샘플을 취하여, 촬영한다. Image J소프트웨어를 사용하여 세포 이동의 사진을 처리하여, 초기 스크래치 면적과 무세포 공백영역 면적 데이터를 획득하고, 이동률을 계산하고, 이동률=(1-무세포 공백영역 면적/초기 스크래치 면적)*100%이다.

체외 세포 이동 실험은 일정정도로 체내 세포 이동의 과정을 시뮬레이션하고, 세포와 세포외 기질 및 기질 영향을 받는 세포사이의 상호 작용을 직접적으로 반영한다.

세포 이동 활성은 콜라겐의 생물학적 활성을 더 효과적으로 나타내는 지표이며, 이동률이 높을수록, 속도가 빠를수록, 콜라겐의 생물학적 활성이 좋아짐을 의미한다. 결과는 도 20에 도시한 바와 같으며, 다른 시간 하에서 촬영한 세포 이동 실제 대비도이며(두 개의 검은색 내부는 초기 및 세포 이동 후의 긁힌 상처 부위임), 도 21에 도시된 계산된 세포 이동률(Image J는 무세포 공백 영역을 계산함)의 비교를 통해 알 수 있듯이, 재조합 인간XVII형 콜라겐170801, 170802는 모두 상품화된 천연 인간 콜라겐보다 우수한 세포 이동 활성을 가진다.-

실시예5. 170801, 170802 재조합 콜라겐 겔 제조 및 토끼 귀 흉터 모델 실험

카르복시메틸셀룰로오스 나트륨을 취하고, 170801, 170802콜라겐 정제 동결 제품을 초순수에 용해시키고, 농도가 0.01%인 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 5%의 콜라겐을 얻고, 0.01%의 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 5%의 콜라겐을 균일하게 혼합한 후 콜라겐 겔을 제조하였고, 콜라겐을 포함하지 않는 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 겔을 음성 대조군으로 사용하였다.

뉴질랜드 흰 토끼(중국 인민해방국 해군 의과 대학 실험동물센터에서 구입)는 체중이 2-3kg이다. 뉴질랜드 흰토끼는 통풍이 좋은 방에서 사육되었고 실온 21℃, 주야 12시간 주기, 단일 케이지에서 사용하였고, 실험 전 2주 동안 적응 환경에서 사육하였다. 이후 흉터 모델을 구축하였다. 실험 동물에 귀 정맥 마취를 위해 30g/L펜토바르비탈 나트륨 1.0mL/kg (30mg/kg)을 투여하였다. 마취 확인 후, 피부를 알코올로 문지르고 3회 세척하였다. 토끼 귀 내측은 직경이 1cm의 피부 생검 장치로 피부 가장자리를 절개하고, 안과용 가위로 직경이1cm인 전층 피부 결손 상처를 잘라내어, 귀연골 골면까지 노출시켰다. 살균된 바셀린 거즈로 상처를 덮고, 살균된 거즈로 외부를 덮고, 붕대를 감아 고정한다. 2-3일마다 요오드포로 상처를 소독하고 상처를 제거하고, 상처 드레싱을 교체한다.

21일째 상처가 치유된 후 각 그룹에 대해 흉터 중재 처리를 진행하고, 각각 170801콜라겐 겔, 170802콜라겐 겔을 상처에 도포하고, 흉터 중재 처리를 위해 요오드 함유 항균성 수술 필름(Drape Antimicrob®, Minnesota Mining and Manufacturing Company， USA)과 자가 접착성 실리콘 필름 드레싱으로 배합하였다.

디지털 카메라와 더모스코피를 사용하여 1-6주 동안 흉터 중재 실험 과정중의 흉터 전체를 기록하고, 6주차 마취 후 귀정맥에 과포화 염화칼륨용액을 주입하여 사멸시키고, 귀의 흉터 샘플을 채취하여, 고정액에 적신 후, HE염색, MASSON염색하고, 현미경으로 관찰, 사진 촬영하였고, 구체적인 방법은 [1]liu tong, 재조합 인간 하이드로겔과 인공 진피를 각각 미세 입자 피부 이식 덮개로 사용하여 전층 피부 결함을 복구하는 실험 연구[D].중국인민해방군 해군 의과 대학, 2019.[2]lijicheng편저. 조직학 및 발생학 실험 지침[M]. 베이징：인민위생출판사, 2018.09.를 참고할 수 있다.

실험결과는 도 22에 도시한 바와 같이, 170801, 170802콜라겐 겔을 중재한 토끼 귀의 피부 상처가 치유된 후 회복이 잘 되었고, 토끼 귀 내측에는 확실하게 새로운 모발 성장이 있어, 생물학적 기능의 모낭 형성과 모발 성장이 있음을 알 수 있으며, 조직 절편의 Masson염색, HE염색 결과로부터 알 수 있듯이, 조직 중 콜라겐 섬유는 질서있게 배열되고, 진피 조직의 형성이 이미 시작되었으며, 특히 새로운 모낭 구조가 와 확실한 모발의 성장(도면에서 화살표로 표시된 원)이 존재하며, 이는 효과적인 진피 조직의 회복 및 생물학적 기능(모발 생성)을 가진 모낭의 새로운 명백한 징후이다. 대조군에서, 예후 흉터는 규칙적이고 조밀한 콜라겐 침착이 여전히 많고, 흉터 구조와 유사하며, 모낭 구조는 없으며, 진피 조직이 형성되지 않고, 또한 어떠한 회복 성장된 토끼 털이 없다. 실험 결과에 따르면, 재조합 인간XVII형 콜라겐170801, 170802는 우수한 조직 복구 및 모낭 복구 및 재생을 촉진하는 생물학적 활성이 있음을 알 수 있다.

China General Microbiological Culture Collection Center

CGMCC18659

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20200909

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SEQUENCE LISTING <110> JIANGSU TRAUTEC MEDICAL TECHNOLOGY CO., LTD. <120> RECOMBINANT HUMAN TYPE XVII COLLAGEN, AND PREPARATION METHOD AND USE THEREOF <130> ZZLJSU220038US-PCT <150> PCT/CN2022/071968 <151> 2022-01-14 <150> CN202110520499.9 <151> 2021-05-13 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1497 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Val Thr Lys Lys Asn Lys Arg Asp Gly Thr Glu Val Thr Glu 1 5 10 15 Arg Ile Val Thr Glu Thr Val Thr Thr Arg Leu Thr Ser Leu Pro Pro 20 25 30 Lys Gly Gly Thr Ser Asn Gly Tyr Ala Lys Thr Ala Ser Leu Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Arg Leu Glu Lys Gln Ser Leu Thr His Gly Ser Ser Gly Tyr 50 55 60 Ile Asn Ser Thr Gly Ser Thr Arg Gly His Ala Ser Thr Ser Ser Tyr 65 70 75 80 Arg Arg Ala His Ser Pro Ala Ser Thr Leu Pro Asn Ser Pro Gly Ser 85 90 95 Thr Phe Glu Arg Lys Thr His Val Thr Arg His Ala Tyr Glu Gly Ser 100 105 110 Ser Ser Gly Asn Ser Ser Pro Glu Tyr Pro Arg Lys Glu Phe Ala Ser 115 120 125 Ser Ser Thr Arg Gly Arg Ser Gln Thr Arg Glu Ser Glu Ile Arg Val 130 135 140 Arg Leu Gln Ser Ala Ser Pro Ser Thr Arg Trp Thr Glu Leu Asp Asp 145 150 155 160 Val Lys Arg Leu Leu Lys Gly Ser Arg Ser Ala Ser Val Ser Pro Thr 165 170 175 Arg Asn Ser Ser Asn Thr Leu Pro Ile Pro Lys Lys Gly Thr Val Glu 180 185 190 Thr Lys Ile Val Thr Ala Ser Ser Gln Ser Val Ser Gly Thr Tyr Asp 195 200 205 Ala Thr Ile Leu Asp Ala Asn Leu Pro Ser His Val Trp Ser Ser Thr 210 215 220 Leu Pro Ala Gly Ser Ser Met Gly Thr Tyr His Asn Asn Met Thr Thr 225 230 235 240 Gln Ser Ser Ser Leu Leu Asn Thr Asn Ala Tyr Ser Ala Gly Ser Val 245 250 255 Phe Gly Val Pro Asn Asn Met Ala Ser Cys Ser Pro Thr Leu His Pro 260 265 270 Gly Leu Ser Thr Ser Ser Ser Val Phe Gly Met Gln Asn Asn Leu Ala 275 280 285 Pro Ser Leu Thr Thr Leu Ser His Gly Thr Thr Thr Thr Ser Thr Ala 290 295 300 Tyr Gly Val Lys Lys Asn Met Pro Gln Ser Pro Ala Ala Val Asn Thr 305 310 315 320 Gly Val Ser Thr Ser Ala Ala Cys Thr Thr Ser Val Gln Ser Asp Asp 325 330 335 Leu Leu His Lys Asp Cys Lys Phe Leu Ile Leu Glu Lys Asp Asn Thr 340 345 350 Pro Ala Lys Lys Glu Met Glu Leu Leu Ile Met Thr Lys Asp Ser Gly 355 360 365 Lys Val Phe Thr Ala Ser Pro Ala Ser Ile Ala Ala Thr Ser Phe Ser 370 375 380 Glu Asp Thr Leu Lys Lys Glu Lys Gln Ala Ala Tyr Asn Ala Asp Ser 385 390 395 400 Gly Leu Lys Ala Glu Ala Asn Gly Asp Leu Lys Thr Val Ser Thr Lys 405 410 415 Gly Lys Thr Thr Thr Ala Asp Ile His Ser Tyr Gly Ser Ser Gly Gly 420 425 430 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly Gly Pro 435 440 445 Trp Gly Pro Ala Pro Ala Trp Cys Pro Cys Gly Ser Cys Cys Ser Trp 450 455 460 Trp Lys Trp Leu Leu Gly Leu Leu Leu Thr Trp Leu Leu Leu Leu Gly 465 470 475 480 Leu Leu Phe Gly Leu Ile Ala Leu Ala Glu Glu Val Arg Lys Leu Lys 485 490 495 Ala Arg Val Asp Glu Leu Glu Arg Ile Arg Arg Ser Ile Leu Pro Tyr 500 505 510 Gly Asp Ser Met Asp Arg Ile Glu Lys Asp Arg Leu Gln Gly Met Ala 515 520 525 Pro Ala Ala Gly Ala Asp Leu Asp Lys Ile Gly Leu His Ser Asp Ser 530 535 540 Gln Glu Glu Leu Trp Met Phe Val Arg Lys Lys Leu Met Met Glu Gln 545 550 555 560 Glu Asn Gly Asn Leu Arg Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Met Gly 565 570 575 Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Ile 580 585 590 Pro Gly Pro Leu Gly His Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Gln Lys 595 600 605 Gly Ser Val Gly Asp Pro Gly Met Glu Gly Pro Met Gly Gln Arg Gly 610 615 620 Arg Glu Gly Pro Met Gly Pro Arg Gly Glu Ala Gly Pro Pro Gly Ser 625 630 635 640 Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Pro His Gly 645 650 655 Pro Pro Gly Val Pro Gly Ser Val Gly Pro Lys Gly Ser Ser Gly Ser 660 665 670 Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Leu Gln Gly Leu Arg 675 680 685 Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Pro Met Gly 690 695 700 Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys Gly Pro Arg Gly Leu 705 710 715 720 Thr Gly Glu Pro Gly Met Arg Gly Leu Pro Gly Ala Val Gly Glu Pro 725 730 735 Gly Ala Lys Gly Ala Met Gly Pro Ala Gly Pro Asp Gly His Gln Gly 740 745 750 Pro Arg Gly Glu Gln Gly Leu Thr Gly Met Pro Gly Ile Arg Gly Pro 755 760 765 Pro Gly Pro Ser Gly Asp Pro Gly Lys Pro Gly Leu Thr Gly Pro Gln 770 775 780 Gly Pro Gln Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gly Arg Pro Gly Ile Lys Gly 785 790 795 800 Glu Pro Gly Ala Pro Gly Lys Ile Val Thr Ser Glu Gly Ser Ser Met 805 810 815 Leu Thr Val Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ala Met Gly Pro Pro 820 825 830 Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Leu Pro Gly 835 840 845 His Gln Glu Val Leu Asn Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro 850 855 860 Arg Gly Pro Pro Gly Pro Ser Ile Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly 865 870 875 880 Pro Pro Gly Glu Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Phe 885 890 895 Leu Ser Asn Ser Glu Thr Phe Leu Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 900 905 910 Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His 915 920 925 Gln Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Phe Ser Thr Ser Gly Ser Ser Ser 930 935 940 Phe Gly Leu Asn Leu Gln Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly 945 950 955 960 Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Ala Leu Gly Ile 965 970 975 Pro Ser Gly Pro Ser Glu Gly Gly Ser Ser Ser Thr Met Tyr Val Ser 980 985 990 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ile Ser 995 1000 1005 Ser Ser Gly Gln Glu Ile Gln Gln Tyr Ile Ser Glu Tyr Met Gln 1010 1015 1020 Ser Asp Ser Ile Arg Ser Tyr Leu Ser Gly Val Gln Gly Pro Pro 1025 1030 1035 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Val Thr Thr Ile Thr Gly Glu 1040 1045 1050 Thr Phe Asp Tyr Ser Glu Leu Ala Ser His Val Val Ser Tyr Leu 1055 1060 1065 Arg Thr Ser Gly Tyr Gly Val Ser Leu Phe Ser Ser Ser Ile Ser 1070 1075 1080 Ser Glu Asp Ile Leu Ala Val Leu Gln Arg Asp Asp Val Arg Gln 1085 1090 1095 Tyr Leu Arg Gln Tyr Leu Met Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro 1100 1105 1110 Pro Gly Ala Ser Gly Asp Gly Ser Leu Leu Ser Leu Asp Tyr Ala 1115 1120 1125 Glu Leu Ser Ser Arg Ile Leu Ser Tyr Met Ser Ser Ser Gly Ile 1130 1135 1140 Ser Ile Gly Leu Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Leu Pro Gly 1145 1150 1155 Thr Ser Tyr Glu Glu Leu Leu Ser Leu Leu Arg Gly Ser Glu Phe 1160 1165 1170 Arg Gly Ile Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Ile 1175 1180 1185 Pro Gly Asn Val Trp Ser Ser Ile Ser Val Glu Asp Leu Ser Ser 1190 1195 1200 Tyr Leu His Thr Ala Gly Leu Ser Phe Ile Pro Gly Pro Pro Gly 1205 1210 1215 Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Val Ser Gly 1220 1225 1230 Ala Leu Ala Thr Tyr Ala Ala Glu Asn Ser Asp Ser Phe Arg Ser 1235 1240 1245 Glu Leu Ile Ser Tyr Leu Thr Ser Pro Asp Val Arg Ser Phe Ile 1250 1255 1260 Val Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Asp 1265 1270 1275 Ser Arg Leu Leu Ser Thr Asp Ala Ser His Ser Arg Gly Ser Ser 1280 1285 1290 Ser Ser Ser His Ser Ser Ser Val Arg Arg Gly Ser Ser Tyr Ser 1295 1300 1305 Ser Ser Met Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ala 1310 1315 1320 Gly Gly Ala Phe Gly Glu Ala Ala Gly Asp Arg Gly Pro Tyr Gly 1325 1330 1335 Thr Asp Ile Gly Pro Gly Gly Gly Tyr Gly Ala Ala Ala Glu Gly 1340 1345 1350 Gly Met Tyr Ala Gly Asn Gly Gly Leu Leu Gly Ala Asp Phe Ala 1355 1360 1365 Gly Asp Leu Asp Tyr Asn Glu Leu Ala Val Arg Val Ser Glu Ser 1370 1375 1380 Met Gln Arg Gln Gly Leu Leu Gln Gly Met Ala Tyr Thr Val Gln 1385 1390 1395 Gly Pro Pro Gly Gln Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ile Ser 1400 1405 1410 Lys Val Phe Ser Ala Tyr Ser Asn Val Thr Ala Asp Leu Met Asp 1415 1420 1425 Phe Phe Gln Thr Tyr Gly Ala Ile Gln Gly Pro Pro Gly Gln Lys 1430 1435 1440 Gly Glu Met Gly Thr Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Pro Ala 1445 1450 1455 Gly Pro Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Lys 1460 1465 1470 Gly Glu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Gln Val Tyr Ala Gly Arg Arg 1475 1480 1485 Arg Arg Arg Ser Ile Ala Val Lys Pro 1490 1495 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant human type XVII collagen 170801 <400> 2 Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Met Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly 1 5 10 15 Asp Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Pro Leu Gly His 20 25 30 Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Ser Val Gly Asp Pro 35 40 45 Gly Met Glu Gly Pro Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Glu 50 55 60 Pro Gly Pro His Gly Pro Pro Gly Val Pro Gly Ser Val Gly Pro Lys 65 70 75 80 Gly Ser Ser Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly 85 90 95 Leu Gln Gly Leu Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly Asp 100 105 110 Lys Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys 115 120 125 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly 130 135 140 Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Gln Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Phe 145 150 155 160 Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Lys 165 170 175 Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Ala Leu Gly Ile Pro Gly Pro Pro Gly 180 185 190 Gln Lys Gly Glu Met Gly Thr Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Pro 195 200 205 Ala Gly Pro Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Lys 210 215 220 Gly Glu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Gln 225 230 <210> 3 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant human type XVII collagen 170802 <400> 3 Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Met Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly 1 5 10 15 Asp Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Pro Leu Gly His 20 25 30 Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Ser Val Gly Asp Pro 35 40 45 Gly Met Glu Gly Pro Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Glu 50 55 60 Pro Gly Pro His Gly Pro Pro Gly Val Pro Gly Ser Val Gly Pro Lys 65 70 75 80 Gly Ser Ser Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly 85 90 95 Leu Gln Gly Leu Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly Asp 100 105 110 Lys Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys 115 120 125 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly 130 135 140 Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Gln Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Phe 145 150 155 160 Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Lys 165 170 175 Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Ala Leu Gly Ile Pro Gly Pro Pro Gly 180 185 190 Gln Lys Gly Glu Met Gly Thr Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Pro 195 200 205 Ala Gly Pro Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Lys 210 215 220 Gly Glu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Gln Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly 225 230 235 240 Asp Met Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Pro Gly Thr 245 250 255 Pro Gly Ile Pro Gly Pro Leu Gly His Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys 260 265 270 Gly Gln Lys Gly Ser Val Gly Asp Pro Gly Met Glu Gly Pro Gly Glu 275 280 285 Lys Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Pro His Gly Pro Pro 290 295 300 Gly Val Pro Gly Ser Val Gly Pro Lys Gly Ser Ser Gly Ser Pro Gly 305 310 315 320 Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Leu Gln Gly Leu Arg Gly Glu 325 330 335 Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Pro Met Gly Pro Pro 340 345 350 Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly 355 360 365 Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His 370 375 380 Gln Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Phe Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro 385 390 395 400 Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly 405 410 415 Ala Leu Gly Ile Pro Gly Pro Pro Gly Gln Lys Gly Glu Met Gly Thr 420 425 430 Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly His Pro 435 440 445 Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Lys Gly Glu Lys Gly Asp Lys Gly 450 455 460 Asp Gln 465 <210> 4 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized amino acid sequence of 170801 <400> 4 Tyr Val Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ser Pro Gly Pro Lys 1 5 10 15 Gly Asp Met Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Pro Gly 20 25 30 Thr Pro Gly Ile Pro Gly Pro Leu Gly His Pro Gly Pro Gln Gly Pro 35 40 45 Lys Gly Gln Lys Gly Ser Val Gly Asp Pro Gly Met Glu Gly Pro Gly 50 55 60 Glu Lys Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Pro His Gly Pro 65 70 75 80 Pro Gly Val Pro Gly Ser Val Gly Pro Lys Gly Ser Ser Gly Ser Pro 85 90 95 Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Leu Gln Gly Leu Arg Gly 100 105 110 Glu Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Pro Met Gly Pro 115 120 125 Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro 130 135 140 Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly 145 150 155 160 His Gln Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Phe Ser Gly Pro Pro Gly Pro 165 170 175 Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp Pro Gly Val Pro 180 185 190 Gly Ala Leu Gly Ile Pro Gly Pro Pro Gly Gln Lys Gly Glu Met Gly 195 200 205 Thr Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly His 210 215 220 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Lys Gly Glu Lys Gly Asp Lys 225 230 235 240 Gly Asp Gln His His His His His His 245 <210> 5 <211> 482 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Optimized amino acid sequence of 170802 <400> 5 Tyr Val Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ser Pro Gly Pro Lys 1 5 10 15 Gly Asp Met Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Pro Gly 20 25 30 Thr Pro Gly Ile Pro Gly Pro Leu Gly His Pro Gly Pro Gln Gly Pro 35 40 45 Lys Gly Gln Lys Gly Ser Val Gly Asp Pro Gly Met Glu Gly Pro Gly 50 55 60 Glu Lys Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Glu Pro Gly Pro His Gly Pro 65 70 75 80 Pro Gly Val Pro Gly Ser Val Gly Pro Lys Gly Ser Ser Gly Ser Pro 85 90 95 Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Pro Val Gly Leu Gln Gly Leu Arg Gly 100 105 110 Glu Val Gly Leu Pro Gly Val Lys Gly Asp Lys Gly Pro Met Gly Pro 115 120 125 Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Glu Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro 130 135 140 Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly 145 150 155 160 His Gln Gly Glu Gln Gly Leu Pro Gly Phe Ser Gly Pro Pro Gly Pro 165 170 175 Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Asp Lys Gly Asp Pro Gly Val Pro 180 185 190 Gly Ala Leu Gly Ile Pro Gly Pro Pro Gly Gln Lys Gly Glu Met Gly 195 200 205 Thr Pro Gly Pro Lys Gly Asp Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly His 210 215 220 Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Lys Gly Glu Lys Gly Asp Lys 225 230 235 240 Gly Asp Gln Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Asp Met Gly Ser Pro Gly 245 250 255 Pro Lys Gly Asp Arg Gly Phe Pro Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Pro 260 265 270 Leu Gly His Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly Ser Val 275 280 285 Gly Asp Pro Gly Met Glu Gly Pro Gly Glu Lys Gly Glu Arg Gly Ala 290 295 300 Ala Gly Glu Pro Gly Pro His Gly Pro Pro Gly Val Pro Gly Ser Val 305 310 315 320 Gly Pro Lys Gly Ser Ser Gly Ser Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly 325 330 335 Pro Val Gly Leu Gln Gly Leu Arg Gly Glu Val Gly Leu Pro Gly Val 340 345 350 Lys Gly Asp Lys Gly Pro Met Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly Asp Gln 355 360 365 Gly Glu Lys Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Lys Gly 370 375 380 Asp Gln Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly His Gln Gly Glu Gln Gly Leu 385 390 395 400 Pro Gly Phe Ser Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Lys 405 410 415 Gly Asp Lys Gly Asp Pro Gly Val Pro Gly Ala Leu Gly Ile Pro Gly 420 425 430 Pro Pro Gly Gln Lys Gly Glu Met Gly Thr Pro Gly Pro Lys Gly Asp 435 440 445 Arg Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly His Pro Gly Pro Pro Gly Pro Arg 450 455 460 Gly His Lys Gly Glu Lys Gly Asp Lys Gly Asp Gln His His His His 465 470 475 480 His His <210> 6 <211> 699 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding 170801 <400> 6 ggttctcctg gtccaaaagg tgacatgggt tctccaggtc ctaaaggtga cagaggtttt 60 cctggtactc caggtattcc tggtccattg ggtcatccag gtcctcaagg tccaaaaggt 120 caaaagggtt ctgttggtga ccctggtatg gaaggtccag gtgaaaaggg tgaaagaggt 180 gctgctggtg aacctggtcc acacggtcca cctggtgttc caggttctgt tggtcctaag 240 ggttcttctg gttctcctgg tccacaaggt cctcctggtc cagttggttt gcaaggtttg 300 agaggtgaag ttggtttgcc aggtgttaag ggtgacaagg gtccaatggg tcctccaggt 360 ccaaaaggtg accaaggtga aaagggtcca cctggtcctc ctggtccacc tggtccaaag 420 ggtgaccaag gtcctccagg tcctagaggt catcaaggtg aacaaggttt gcctggtttt 480 tctggtccac caggtcctcc aggtccacaa ggtcctaaag gtgacaaagg tgacccaggt 540 gttcctggtg ctttgggtat tccaggtcca cctggtcaaa aaggtgaaat gggtactcca 600 ggtcctaagg gtgacagagg tccagctggt ccacctggtc atcctggtcc accaggtcca 660 agaggtcata agggtgaaaa aggtgacaag ggtgaccaa 699 <210> 7 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding 170802 <400> 7 ggttctccag gtcctaaagg tgacatgggt tctccaggtc ctaagggtga cagaggtttt 60 ccaggtactc caggtattcc aggtcctttg ggtcatccag gtcctcaagg tcctaaaggt 120 caaaaaggtt ctgttggtga ccctggtatg gaaggtcctg gtgaaaaagg tgaaagaggt 180 gctgctggtg aacctggtcc acacggtcct ccaggtgttc ctggttctgt tggtccaaaa 240 ggttcttctg gttctcctgg tccacaaggt cctccaggtc ctgttggttt gcaaggtttg 300 agaggtgaag ttggtttgcc aggtgttaaa ggtgacaaag gtccaatggg tcctccaggt 360 ccaaagggtg accaaggtga aaaaggtcca cctggtcctc ctggtccacc aggtccaaaa 420 ggtgaccaag gtccacctgg tccaagaggt caccaaggtg aacaaggttt gcctggtttt 480 tctggtcctc caggtcctcc tggtcctcaa ggtccaaagg gtgacaaggg tgaccctggt 540 gttccaggtg ctttgggtat tcctggtcct ccaggtcaaa agggtgagat gggtactcct 600 ggtcctaagg gtgacagagg tccagctggt cctcctggtc acccaggtcc tcctggtcct 660 agaggtcata aaggtgaaaa aggtgacaag ggtgaccaag gttctccagg tccaaagggt 720 gacatgggtt ctcctggtcc aaaaggtgac agaggtttcc ctggtactcc aggtattcct 780 ggtccattgg gtcacccagg tccacaaggt ccaaaaggtc aaaaaggttc tgttggtgac 840 ccaggtatgg aaggtccagg tgaaaagggt gaaagaggtg ctgctggtga accaggtcct 900 catggtccac caggtgttcc aggttctgtt ggtccaaagg gttcttctgg ttctccaggt 960 ccacaaggtc ctccaggtcc agttggtttg caaggtttga gaggtgaagt tggtttgcct 1020 ggtgttaagg gtgacaaagg tcctatgggt cctcctggtc ctaaaggtga ccaaggtgaa 1080 aagggtccac caggtcctcc aggtccacct ggtccaaaag gtgaccaagg tccaccaggt 1140 cctagaggtc atcaaggtga acaaggtttg ccaggttttt ctggtccacc aggtccacca 1200 ggtcctcaag gtcctaaggg tgacaaaggt gacccaggtg ttcctggtgc tttgggtatt 1260 cctggtccac ctggtcaaaa gggtgaaatg ggtactcctg gtcctaaagg tgacagaggt 1320 cctgctggtc cacctggtca tccaggtcca cctggtccaa gaggtcacaa aggtgaaaag 1380 ggtgacaagg gtgaccaa 1398 <210> 8 <211> 758 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA sequence <400> 8 tacgtatggt ctcatccaca attcgagaag ggttctcctg gtccaaaagg tgacatgggt 60 tctccaggtc ctaaaggtga cagaggtttt cctggtactc caggtattcc tggtccattg 120 ggtcatccag gtcctcaagg tccaaaaggt caaaagggtt ctgttggtga ccctggtatg 180 gaaggtccag gtgaaaaggg tgaaagaggt gctgctggtg aacctggtcc acacggtcca 240 cctggtgttc caggttctgt tggtcctaag ggttcttctg gttctcctgg tccacaaggt 300 cctcctggtc cagttggttt gcaaggtttg agaggtgaag ttggtttgcc aggtgttaag 360 ggtgacaagg gtccaatggg tcctccaggt ccaaaaggtg accaaggtga aaagggtcca 420 cctggtcctc ctggtccacc tggtccaaag ggtgaccaag gtcctccagg tcctagaggt 480 catcaaggtg aacaaggttt gcctggtttt tctggtccac caggtcctcc aggtccacaa 540 ggtcctaaag gtgacaaagg tgacccaggt gttcctggtg ctttgggtat tccaggtcca 600 cctggtcaaa aaggtgaaat gggtactcca ggtcctaagg gtgacagagg tccagctggt 660 ccacctggtc atcctggtcc accaggtcca agaggtcata agggtgaaaa aggtgacaag 720 ggtgaccaac accatcatca ccatcattaa gcggccgc 758 <210> 9 <211> 1457 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA sequence <400> 9 tacgtatggt ctcatcctca atttgaaaag ggttctccag gtcctaaagg tgacatgggt 60 tctccaggtc ctaagggtga cagaggtttt ccaggtactc caggtattcc aggtcctttg 120 ggtcatccag gtcctcaagg tcctaaaggt caaaaaggtt ctgttggtga ccctggtatg 180 gaaggtcctg gtgaaaaagg tgaaagaggt gctgctggtg aacctggtcc acacggtcct 240 ccaggtgttc ctggttctgt tggtccaaaa ggttcttctg gttctcctgg tccacaaggt 300 cctccaggtc ctgttggttt gcaaggtttg agaggtgaag ttggtttgcc aggtgttaaa 360 ggtgacaaag gtccaatggg tcctccaggt ccaaagggtg accaaggtga aaaaggtcca 420 cctggtcctc ctggtccacc aggtccaaaa ggtgaccaag gtccacctgg tccaagaggt 480 caccaaggtg aacaaggttt gcctggtttt tctggtcctc caggtcctcc tggtcctcaa 540 ggtccaaagg gtgacaaggg tgaccctggt gttccaggtg ctttgggtat tcctggtcct 600 ccaggtcaaa agggtgagat gggtactcct ggtcctaagg gtgacagagg tccagctggt 660 cctcctggtc acccaggtcc tcctggtcct agaggtcata aaggtgaaaa aggtgacaag 720 ggtgaccaag gttctccagg tccaaagggt gacatgggtt ctcctggtcc aaaaggtgac 780 agaggtttcc ctggtactcc aggtattcct ggtccattgg gtcacccagg tccacaaggt 840 ccaaaaggtc aaaaaggttc tgttggtgac ccaggtatgg aaggtccagg tgaaaagggt 900 gaaagaggtg ctgctggtga accaggtcct catggtccac caggtgttcc aggttctgtt 960 ggtccaaagg gttcttctgg ttctccaggt ccacaaggtc ctccaggtcc agttggtttg 1020 caaggtttga gaggtgaagt tggtttgcct ggtgttaagg gtgacaaagg tcctatgggt 1080 cctcctggtc ctaaaggtga ccaaggtgaa aagggtccac caggtcctcc aggtccacct 1140 ggtccaaaag gtgaccaagg tccaccaggt cctagaggtc atcaaggtga acaaggtttg 1200 ccaggttttt ctggtccacc aggtccacca ggtcctcaag gtcctaaggg tgacaaaggt 1260 gacccaggtg ttcctggtgc tttgggtatt cctggtccac ctggtcaaaa gggtgaaatg 1320 ggtactcctg gtcctaaagg tgacagaggt cctgctggtc cacctggtca tccaggtcca 1380 cctggtccaa gaggtcacaa aggtgaaaag ggtgacaagg gtgaccaaca ccatcaccat 1440 catcattaag cggccgc 1457 <210> 10 <211> 4550 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA sequence <400> 10 gaattctgga gtcatcctca attcgaaaaa atggatgtca ctaaaaagaa caagagagac 60 ggaactgagg tcactgagag aatcgttacc gaaactgtca ccacaagact tacttcatta 120 cctccaaagg gtggaacttc taatggttac gcaaagacag catcattagg aggtggttca 180 agacttgaga aacaatccct tactcatggt tcaagtggat acataaattc aactggttca 240 acaagaggac atgcaagtac ttcttcttat agaagagcac atagtccagc atcaactttg 300 cccaactctc ctggttcaac atttgagaga aaaactcatg taaccagaca tgcctatgag 360 ggttctagtt ctggtaattc atctccagaa taccctagaa aagagtttgc atcatcctca 420 actagaggta gatcacagac tagagaatct gaaatcagag tcagattaca atcagcatct 480 ccttcaacta gatggactga gttagacgac gtgaaaagat tattaaaggg atcaagaagt 540 gcaagtgttt cccctacaag aaattcttcc aacacccttc ccattcctaa gaaaggaacc 600 gttgaaacta aaatcgttac agcatcatct cagtctgtat ccggaaccta cgacgctacc 660 attctggacg ccaacttacc ttctcatgtc tggtcttcaa ctttacccgc aggttcctca 720 atgggaactt accacaataa catgactact caatcaagtt ctcttctgaa taccaatgca 780 tactcagccg gttccgtttt tggagtccct aacaatatgg cctcttgctc cccaactctt 840 catccaggtc tttcaacctc atcaagtgta tttggtatgc agaacaactt agccccttcc 900 ttgacaaccc tgtctcatgg tactactacc actagtacag catatggagt caagaagaac 960 atgccacagt cacctgctgc cgttaacact ggagtttcaa catctgctgc ctgcactaca 1020 tctgttcaat cagatgatct tctgcataag gactgcaagt ttttaatttt agagaaagac 1080 aatacccctg ccaaaaagga aatggagtta cttataatga ccaaagattc tggtaaagta 1140 ttcactgctt ctcccgctag tatcgccgca acttcattct ctgaagatac tttaaagaag 1200 gaaaaacaag ccgcatacaa cgcagactca ggtttaaaag cagaagcaaa cggtgacctt 1260 aaaacagtgt caactaaggg aaagactaca accgcagaca tccattcata tggttcttca 1320 ggtggaggag gatctggagg aggtggtgga gtgggaggtg ctggaggagg tccatggggt 1380 cctgcacctg catggtgccc ttgcggttct tgctgcagtt ggtggaagtg gcttctgggt 1440 ttattattaa cttggctgct tttactgggt cttttattcg gtcttatcgc attagcagaa 1500 gaggtcagaa aacttaaggc cagagttgat gagttagaga gaatcagaag atcaatcctt 1560 ccctatggag actccatgga cagaatcgaa aaggatagac ttcagggtat ggcccctgca 1620 gcaggagctg atctggataa aatcggactt cattcagatt ctcaagagga attatggatg 1680 tttgttagaa agaaacttat gatggagcag gagaacggta acctgagagg ttctcctggt 1740 ccaaaaggag atatgggttc acccggtccc aaaggagata gaggattccc tggtactcca 1800 ggtatccccg gtcccctggg tcaccctgga cctcaaggtc ctaaaggtca aaagggttct 1860 gtaggagatc caggtatgga gggtcccatg ggtcagagag gtagagaagg tcccatggga 1920 ccaagaggtg aagctggacc tcccggaagt ggtgaaaaag gagaaagagg agcagcagga 1980 gaacctggac cccatggacc tccaggagtt cctggatcag tcggacccaa aggttcatcc 2040 ggttctcctg gacctcaagg tccaccagga cccgtcggat tgcaaggatt gagaggagaa 2100 gttggacttc ccggagttaa gggtgacaag ggtcctatgg gtcctcctgg tccaaaggga 2160 gatcagggtg aaaagggtcc tagaggtctg actggtgaac caggaatgag aggacttccc 2220 ggtgccgtgg gtgaacccgg tgcaaaagga gcaatgggtc ctgccggtcc tgatggacac 2280 cagggaccca gaggagagca gggattaaca ggaatgcctg gtatcagagg tcccccaggt 2340 ccctcaggag acccaggaaa gccaggactt actggtcccc agggtcctca aggtctgcct 2400 ggaactcccg gaagacccgg aatcaaaggt gaaccaggag ccccaggaaa aatcgttact 2460 agtgaaggat cttcaatgct gactgtgcca ggtccacctg gtcctcctgg agctatgggt 2520 cctcccggtc cccctggagc acccggtcct gcaggtcctg ccggattacc tggacatcag 2580 gaagtcttaa acctgcaagg tccaccaggt cctcctggtc caagaggacc ccctggtcct 2640 tcaatccctg gtccacctgg acctagaggt ccacccggag agggacttcc cggaccacca 2700 ggacctcctg gatcatttct gtctaattct gagacatttc tttcaggacc tcctggtcct 2760 cccggaccac ctggaccaaa aggagatcag ggaccacctg gtcccagagg acatcaagga 2820 gagcagggtc ttccaggttt ctctacttct ggatcatcat catttggtct taatcttcaa 2880 ggtcctcctg gacccccagg accacaggga cccaagggtg acaagggaga ccctggagtc 2940 ccaggtgcac tgggaatccc ttcaggtcct tcagaaggtg gttcatcttc aaccatgtat 3000 gtgtctggac ccccaggacc tcccggacct ccaggtcctc ctggttcaat ctcttcttct 3060 ggtcaagaaa ttcagcagta tatttctgag tacatgcaat ctgactctat tagaagttat 3120 ttgtctggtg tgcagggtcc accaggtcct ccaggtcccc ctggaccagt cactactatc 3180 actggagaga catttgatta tagtgaatta gcatcacacg tcgtttctta tctgagaact 3240 tcaggttatg gtgtttcatt attttcctcc tcaatctctt cagaagacat cttagccgta 3300 ctgcagagag atgatgtaag acagtacctt agacaatact tgatgggtcc aagaggacca 3360 ccaggtccac ccggtgcatc aggagacgga tcattattat ctttggatta cgctgaatta 3420 tcatcaagaa tccttagtta catgtcctct tctggtatct ccataggtct gcccggtcct 3480 cctggtcctc ccggacttcc tggtacttct tacgaagagc ttctgtcact tttaagagga 3540 tctgagttta gaggtatagt tggtccccca ggacctccag gtcctccagg tatcccaggt 3600 aacgtgtggt catctatctc agttgaggat ctttcatctt atcttcacac cgccggattg 3660 tcctttatac ctggtcctcc aggaccccct ggacctcctg gacccagagg tcctccagga 3720 gtatccggtg ctttagcaac ttatgcagca gaaaactccg attcttttag atcagaattg 3780 atctcctacc ttacttctcc tgatgttaga tcattcatcg tcggacctcc aggaccacct 3840 ggacctcaag gacctcctgg agattcaaga ttactgagta cagatgcatc acattcaaga 3900 ggttcaagtt cttcttctca ctcctcttct gttagaagag gatcatcata ttcatcaagt 3960 atgtcaactg gtggaggagg agctggttca ttgggtgccg gaggtgcatt tggtgaggcc 4020 gctggtgaca gaggacctta tggtactgac attggacctg gtggaggtta tggtgcagca 4080 gcagaaggtg gaatgtatgc tggtaatgga ggtttactgg gagccgactt tgccggagac 4140 ctggactaca acgagttagc tgttagagtg tcagagtcaa tgcagagaca aggattatta 4200 cagggtatgg cttatacagt tcagggaccc ccaggtcagc caggtcctca aggaccccct 4260 ggtatttcaa aagtcttctc cgcttattct aacgttactg cagacctgat ggatttcttc 4320 cagacttacg gtgccatcca aggtcctcca ggacagaagg gtgaaatggg aactcccggt 4380 cccaagggtg acagaggtcc tgcaggacct cctggtcacc ctggaccacc tggacctaga 4440 ggacacaaag gtgagaaggg tgacaaggga gaccaggttt acgcaggaag aagaagaaga 4500 agaagtattg ccgtcaagcc tcaccatcac catcatcact aagcggccgc 4550

Claims

재조합 인간XVII형 콜라겐에 있어서,
상기 콜라겐의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2 또는 SEQ ID NO.3로 표시된 아미노산 서열로부터 선택되는, 재조합 인간XVII형 콜라겐.
제1항에 있어서,
상기 콜라겐의 펩타이드 사슬의 아미노 말단과 카르복실 말단은 단백질 태그를 추가하도록 설계되고, 상기 아미노 말단에는 Strep-Tag II태그를 추가하고, 카르복실 말단에는 6×His Tag태그를 추가하는, 재조합 인간XVII형 콜라겐.
제1항에 있어서,
상기 콜라겐은 세포 접착 활성, 세포 이동 촉진 활성, 조직 재생 촉진 및 모낭 복구재생 촉진의 활성을 갖는, 재조합 인간XVII형 콜라겐.
제1항에 따른 콜라겐을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제4항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 SEQ ID NO.6 또는 SEQ ID NO.7 로 표시되는 염기 서열로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드.
제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
제5항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
제6항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는, 조작 균주.
제7항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는, 조작 균주.
제8항 또는 제9항에 있어서,
상기 조작 균주는 피키아 파스토리스인, 조작 균주.
제1항에 따른 콜라겐을 제조하는 방법으로서,
단계 (1) - 제6항 또는 제7항에 따른 재조합 발현 벡터로 조작된 피키아 파스토리스를 구축하여 조작 피키아 파스토리스 균주를 수득하는 단계;
단계 (2) - 조작 피키아 파스토리스 균주를 배양하고 발현량이 높은 조작 피키아 파스토리스 균주를 스크리닝하는 단계;
단계(3) - 스크리닝된 발현량이 높은 조작 피키아 파스토리스 균주를 대규모 고밀도 발효, 배양 및 단백질을 정제하는 단계로서, 발효탱크로 발효하고, 발효 상청액에 대해 정제하여, 고순도의 콜라겐을 얻는 단계
를 포함하는, 콜라겐을 제조하는 방법.
제11항에 있어서,
단계 (2)에서 스크리닝된 발현량이 높은 조작 피키아 파스토리스 균주는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이고, 기탁번호는 CGMCC No.20626 또는 CGMCC No. 20627인, 콜라겐을 제조하는 방법.
제1항에 따른 콜라겐을 포함하는, 흉터 치유, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 조성물.
제11항에 따른 방법에 의해 제조된 콜라겐을 포함하는, 흉터 치유, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 조성물.
제1항에 따른 콜라겐, 제4항 또는 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항에 따른 재조합 발현 벡터, 제8항 또는 제9항에 따른 조작 균주, 또는 제13항에 따른 조성물을 포함하는, 흉터 치유, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 약물.
제1항에 따른 콜라겐, 제4항 또는 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항에 따른 재조합 발현 벡터, 제8항 또는 제9항에 따른 조작 균주, 또는 제13항에 따른 조성물을 포함하는, 흉터 치유, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 의료 장치.
제1항에 따른 콜라겐, 제4항 또는 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항에 따른 재조합 발현 벡터, 제8항 또는 제9항에 따른 조작 균주, 또는 제13항에 따른 조성물을 포함하는, 흉터 치유, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 화장품.
제1항에 따른 콜라겐, 제4항 또는 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항에 따른 재조합 발현 벡터, 제8항 또는 제9항에 따른 조작 균주, 또는 제13항에 따른 조성물을 포함하는, 흉터 치유, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 건강 보조 식품.
제1항에 따른 콜라겐, 제4항 또는 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항에 따른 재조합 발현 벡터, 제8항 또는 제9항에 따른 조작 균주, 또는 제13항에 따른 조성물을 포함하는, 흉터 치유, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 생물학적 재료.
제1항에 따른 콜라겐, 제4항 또는 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제6항 또는 제7항에 따른 재조합 발현 벡터, 제8항 또는 제9항에 따른 조작 균주, 또는 제13항에 따른 조성물을 포함하는, 흉터 치유, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 조직 공정 제품.
제1항에 따른 콜라겐을 포함하는, 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 제품.
제4항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 제품.
제5항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 제품.
제6항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는, 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 제품.
제7항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는, 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 제품.
제8항에 따른 조작 균주를 포함하는, 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 제품.
제9항에 따른 조작 균주를 포함하는, 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 제품.
제13항에 따른 조성물을 포함하는, 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 제품.
제14항에 따른 조성물을 포함하는, 흉터 치유 촉진, 조직 복구 또는 모낭 복구 촉진용 제품.
제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제품은 외용제인 제품.
제30항에 있어서,
상기 제품은 외용 도포제인, 제품.
제30항에 있어서,
상기 제품은 외용 겔인, 제품.
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