CN114146096A - 一种富含细胞因子的条件血清的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种富含细胞因子的条件血清的制备方法和应用,该条件血清的制备方法包括以下步骤:取新鲜血液,离心,取PRP部分冻融加离心得到富血小板因子血浆,其余部分加入无菌玻璃小珠进行恒温振荡孵育,离心过滤后得到富含IL‑1Ra的条件血清,将富血小板因子血浆和富含IL‑1Ra的条件血清混合,得到富含细胞因子的条件血清。通过该方法制备的富含细胞因子的条件血清,血小板因子和IL‑1Ra得到充分富集,含量大大提高,且同时具有修复组织损伤、恢复功能和治疗组织发炎、退化的功效,可用于炎性关节炎及其他由创伤、炎症、感染、退化等因素引起的炎性疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种富含细胞因子的条件血清的制备方法及应用。
背景技术
关节炎泛指发生在人体关节及其周围组织,由炎症、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病,临床表现为关节的红、肿、热、痛、功能障碍及关节畸形,严重者可能导致关节残疾,非常影响患者的生活质量。
炎性关节炎(Inflammatory Arthritis,IA)的病因及发病机制目前尚未完全明确,但是许多证据已经表明,一些细胞因子尤其是白细胞介素-1(IL-1)在IA关节发病的慢性炎性过程中具有重要作用,白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)近年来亦被用于IA的治疗。
现有的富含血小板(L-1Ra)I的条件血清的制备方法是用硫酸铬(CrSO4)包被过表面的医疗级玻璃小珠与新鲜血液混合刺激,37℃静置24小时后提取血清,即可得到富含IL-1Ra等抗炎因子的条件血清给患者进行回输治疗。
但是,现有技术获得的条件血清中IL-1Ra单位含量较低,且单纯的富含抗炎因子的条件血清在修复组织损伤、促进愈合、恢复功能等方面的功效不明显。
富血小板血浆(PRP)法在受损或退化的组织部位进行注射,以试图达到修复组织损伤、及恢复功能的目的,并发症极少,是相对安全的治疗方式,但是,传统制作的血小板浓厚血浆不能同时治疗发炎和退化,因此,有进一步改善的空间。研究得知外周血液中IL-1Ra主要来源于白细胞层,PRP在制备过程中是没有提取白细胞层,制备富血小板因子的血清,可以改善传统制作的PRP所无法达到的治疗功效,其优点为血清中可同时包含生长因子与IL-1Ra,优化传统相关技术。与富血小板血浆技术不同,富细胞因子的血清在制备时已经活化了血小板和免疫细胞,能够在制备过程中就获得足够量的细胞因子和生长因子,使用时得到最高的生物效力。最原始的自体血清制备方法是用硫酸铬(CrSO4)包被过表面的医疗级玻璃小珠与新鲜血液混合刺激,37℃静置24小时后提取血清,即可得到富含大量白细胞介素1受体拮抗物、抗炎因子等多种细胞因子的血清给患者进行回输治疗。
发明内容
鉴于此,本发明提供一种富含细胞因子的条件血清的制备方法,一方面,本发明提供一种富含IL-1Ra的条件血清的制备方法,可大大提高IL-1Ra的含量。进一步,本发明还提供一种富血小板因子条件血清及其制备方法,该条件血清同时包含富血小板因子血浆与富含IL-1Ra的条件血清,能够同时达到修复组织损伤、恢复功能和治疗组织发炎、退化的功效目的,且本发明在同一个血样中完成PRP和IL-1Ra的充分富集,操作简便,节约成本。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
一种富含细胞因子的条件血清的制备方法,包括如下步骤:
S1、将新鲜血液装入采血管,充分摇匀;
S2、将步骤S1装有新鲜血液的采血管放置于恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育,然后离心,将红细胞沉淀去除,收集上清液一;
S3、将上清液一用无菌滤器过滤,收集滤液一,获得富含细胞因子的条件血清一;
或,
A、将新鲜血液装入采血管,充分摇匀;
B、将步骤A装有新鲜血液的采血管进行低速离心使血液分层,吸取收集上清中的PRP层,获得PRP粗提液,剩余血液置于采血管备用,将所述PRP粗提液进行冻融处理后离心,收集PRP上清液,无菌过滤后,收集的滤液为富血小板因子血浆;将装有剩余血液的采血管放置于恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育,然后离心,将红细胞沉淀去除,收集上清液二;
C、将上清液二用无菌滤器过滤,收集滤液二,将步骤B所述富血小板因子血浆和所述滤液二混合,获得富含细胞因子的条件血清二。
步骤S1或步骤A中,所述采血管中不添加抗凝剂。
步骤S1中,在所述采血管中,加入无菌玻璃小珠。
步骤B中,装有剩余血液的采血管中加入无菌玻璃小珠,然后放置于恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育,然后离心,将红细胞沉淀去除,收集上清液二。步骤S1或步骤B中,无菌玻璃小珠按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中。
步骤S2或步骤B中,所述恒温振荡孵育的条件为35-38℃;转速为60-120r/min,振荡孵育的时间为12-24h。
步骤B中,所述低速离心的条件为,离心力为500×g~800×g,离心时间为7-9min。
步骤B中,所述冻融处理为-80℃-210℃环境下冷冻12-24h后,再解冻融化。
优选的,所述冻融处理为-80℃或液氮环境下冷冻12-24h后,在37℃解冻融化。
步骤S2或步骤B中,所述无菌过滤器为0.22μm无菌滤器。
本发明还提供一种如上所述的方法制备的条件血清。
本发明所述条件血清在用于炎性关节炎及其他由创伤、炎症、感染、退化等因素引起的炎性疾病的治疗中的应用,也属于本发明的保护范围。
作为本发明的又一实施方式,一种富含细胞因子的条件血清的制备方法,包括如下步骤:
(1)材料的准备:准备无抗凝剂的普通玻璃采血管;
(2)富含IL-1Ra条件血清的制备:将新鲜的血液装入无抗凝剂的普通玻璃采血管,充分缓慢摇匀,保证新鲜血液充分接触玻璃采血管,将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速60-120r/min的恒温摇床培养箱内,进行24h的恒温振荡孵育,用离心机以2500-3500r/min的转速,离心8-10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,即得到富含IL-1Ra的条件血清。
作为本发明的又一实施方式,一种富含细胞因子的条件血清的制备方法,包括如下步骤:
(1)准备无抗凝剂的普通玻璃采血管和医疗级玻璃小珠,按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中;
(2)将新鲜血液装入采血管,充分缓慢摇匀,保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触,将装有血液和玻璃小珠的采血管放置于37℃、转速60-120r/min的恒温摇床培养箱内,进行24h的恒温振荡孵育,再用离心机以2500-3500r/min的转速,离心8-10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,即得到富含IL-1Ra的条件血清。
作为本发明的又一实施方式,一种富含细胞因子的条件血清的制备方法,包括如下步骤:
(1)准备无菌玻璃采血管;
(2)PRP制备:将新鲜血液,600g离心8min后,吸取收集上清中的PRP层(其中PRP是中间部分,上清是贫血小板血浆PPP),保留剩余的血液备用,将收集的PRP层在-80℃冷冻24h后,在37℃解冻后2500-3500r/min离心8-10min,进一步收集上清液PRP,将收集的上清液PRP使用0.22μm无菌滤器过滤,收集的滤液为富血小板因子血浆;
(3)富含IL-1Ra血清的制备:PRP采集后,将步骤(2)保留的剩余血液充分缓慢摇匀,将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速60-120r/min的恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育24h后,用离心机以2500-3500r/min离心8-10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,滤液为富含IL-1Ra血清;
(4)富含细胞因子的条件血清:将得到的富血小板因子血浆与富含IL-1Ra血清混合,得到富含细胞因子的条件血清。
作为本发明的又一实施方式,一种富含细胞因子的条件血清的制备方法,包括如下步骤:
(1)准备无菌玻璃采血管和医疗级玻璃小珠;
(2)PRP制备:将新鲜血液装入采血管,600g离心8min后,吸取收集上清中的PRP层,-80℃冷冻24h后,在37℃解冻后2500-3500r/min离心8-10min,收集上清PRP,使用0.22μm无菌滤器过滤,收集的滤液为富血小板因子血浆;
(3)富含IL-1Ra条血清的制备:PRP采集后,将剩余血液充分缓慢摇匀,按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中,保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触,将装有血液和玻璃小珠的特制采血套装放置于37℃、转速60-120r/min的恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育24h后,用离心机以2500-3500r/min离心8~10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,即得到富含IL-1Ra血清;
(4)富含细胞因子的条件血清:将得到的PRP与富含IL-1Ra血清混合,得到富含细胞因子的条件血清。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1、本发明提供的条件血清的制备方法,可显著提高IL-1Ra的含量,从而增强条件血清治疗组织发炎和退化的功效;
2、和现有技术的静置孵育相比,本发明采用振荡培养,可增大血液与玻璃小珠的接触面积,从而使血液与玻璃小珠充分接触进行特异性刺激,产生大量细胞因子,使细胞因子充分富集;
3、本发明提供的富血小板因子条件血清及其制备方法,使血液中的生长因子和抗炎因子充分富集,能够同时达到修复组织损伤、促进愈合、恢复功能和治疗组织发炎、退化的功效目的,更适用于炎性关节炎及其他由创伤、炎症、感染、退化等因素引起的炎性疾病的治疗;
4、本发明提供的制备方法可在同一个血样中完成血小板因子和IL-1Ra的充分富集,操作简便,节约成本。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为实施例3的制备方法流程示意图;
图2为(实施例1和实施例3和对比例1、对比例3)不加玻璃珠的情况下比较振荡-静置,有PRP-无PRP的情形;
图3为(实施例2和实施例4和对比例2、对比例4)加玻璃珠的情况下比较振荡-静置,有PRP-无PRP的情形。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现:
<第一方面>
本发明提供一种富含IL-1Ra的条件血清的制备方法,包括如下步骤:
步骤S1、将新鲜血液装入含无菌玻璃小珠的玻璃采血管,充分摇匀;
步骤S2、将装有全血的玻璃采血管放置于恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育,然后离心,将红细胞沉淀去除,收集上清液;
步骤S3、将步骤S2的上清液用无菌滤器过滤,获得的滤液即为富含IL-1Ra的条件血清。
步骤S1中无菌玻璃小珠按每3mL全血加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中。
步骤S2中恒温摇床培养箱的温度为37℃、转速为60-120r/min,振荡孵育的时间为12-24h。
步骤S2中离心转速为2500-3500r/min,离心时间8-10min。
步骤S3中无菌滤器为0.22μm。
<第二方面>
本发明提供一种富血小板因子条件血清及其制备方法,包括如下步骤:
步骤a)将全血低速离心使血液分层;
步骤b)吸取PRP层,进行冻融处理后离心,收集上清,无菌过滤后,收集滤液得到富血小板因子血浆;
步骤c)剩余血液加入无菌玻璃小珠后充分摇匀,放置于恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育,然后离心,将红细胞沉淀去除,收集上清,无菌过滤后即得到富含IL-1Ra的条件血清;
步骤d)将富血小板因子血浆和富含IL-1Ra的条件血清混合,得到富含细胞因子的条件血清
步骤a)中离心力为500×g-800×g,离心时间为7-9min。
步骤b)中冻融处理为-80℃或液氮环境下冷冻12-24h后,在37℃解冻融化。
步骤b)中离心转速为2500-3500r/min,离心时间8-10min。
步骤b)无菌滤器为0.22μm。
步骤c)中无菌玻璃小珠按每3mL全血加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中。
步骤c)中恒温摇床培养箱的温度为37℃、转速为60-120r/min,振荡孵育的时间为12-24h。
步骤c)中离心转速为2500-3500r/min,离心时间8-10min。
步骤c)中无菌滤器为0.22μm。
实施例1
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养
(2)材料的准备:准备无抗凝剂的普通玻璃采血管;
(2)富含IL-1Ra条件血清的制备,将新鲜的血液装入无抗凝剂的普通玻璃采血管,充分缓慢摇匀,保证新鲜血液充分接触玻璃采血管,将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内,进行24h的恒温振荡孵育,用离心机以3500r/min的转速,离心10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,即得到富含IL-1Ra的条件血清。
实施例2
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+玻璃小珠
(1)准备无抗凝剂的普通玻璃采血管和医疗级玻璃小珠,按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中;
(2)将新鲜血液装入采血管,充分缓慢摇匀,保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触,将装有血液和玻璃小珠的采血管放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内,进行24h的恒温振荡孵育,再用离心机以3500r/min的转速,离心10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,即得到富含IL-1Ra的条件血清。
实施例3
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+PRP(流程图如图1)
(1)准备无菌玻璃采血管;
(2)PRP制备:将新鲜血液,600g离心8min后,吸取收集上清中的PRP层(其中PRP是中间部分,上清是贫血小板血浆PPP),保留剩余的血液备用,将收集的PRP层在-80℃冷冻24h后,在37℃解冻后3500r/min离心10min,进一步收集上清液PRP,将收集的上清液PRP使用0.22μm无菌滤器过滤,收集的滤液为富血小板因子血浆;
(3)富含IL-1Ra血清的制备:PRP采集后,将步骤(2)保留的剩余血液充分缓慢摇匀,将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育24h后,用离心机以3500r/min离心10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,滤液为富含IL-1Ra血清;
(4)富含细胞因子的条件血清:将得到的富血小板因子血浆与富含IL-1Ra血清混合,得到富含细胞因子的条件血清;
(5)采用Elisa试剂盒对制备的富含细胞因子的条件血清进行生长因子和IL-1Ra含量检测。
实施例4
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+玻璃小珠+PRP
(1)准备无菌玻璃采血管和医疗级玻璃小珠;
(2)PRP制备:将新鲜血液装入采血管,600g离心8min后,吸取收集上清中的PRP层,-80℃冷冻24h后,在37℃解冻后2500r/min离心8min,收集上清PRP,使用0.22μm无菌滤器过滤,收集的滤液为富血小板因子血浆;
(3)富含IL-1Ra条血清的制备:PRP采集后,将剩余血液充分缓慢摇匀,按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中,保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触,将装有血液和玻璃小珠的特制采血套装放置于37℃、转速60r/min的恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育24h后,用离心机以2500r/min离心8~10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,即得到富含IL-1Ra血清;
(4)富含细胞因子的条件血清:将得到的PRP与富含IL-1Ra血清混合,得到富含细胞因子的条件血清;
(5)采用Elisa试剂盒对制备的富含细胞因子的条件血清进行生长因子和IL-1Ra含量检测。
实施例5
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+PRP
(1)准备无菌玻璃采血管;
(2)PRP制备:将新鲜血液,600g离心8min后,吸取收集上清中的PRP层(其中PRP是中间部分,上清是贫血小板血浆PPP),保留剩余的血液备用,将收集的PRP层在-80℃冷冻24h后,在37℃解冻后3500r/min离心10min,进一步收集上清液PRP,将收集的上清液PRP使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,收集的滤液为富血小板因子血浆
(3)富含IL-1Ra血清的制备:富血小板因子血浆采集后,将步骤(2)保留的剩余血液充分缓慢摇匀,将装有血液的玻璃采血管放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育24h后,用离心机以3500r/min离心10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,收集滤液,得到富含IL-1Ra血清;
(4)富含细胞因子的条件血清:将得到的富血小板因子血浆与富含IL-1Ra血清混合,得到富含细胞因子的条件血清。
实施例6
无抗凝剂的普通玻璃采血管+振荡培养+玻璃小珠+PRP
(1)准备无菌玻璃采血管和医疗级玻璃小珠;
(2)PRP制备:将新鲜血液装入采血管,600g离心8min后,吸取收集上清中的PRP层,-80℃冷冻24h后,在37℃解冻后~3500r/min离心10min,收集上清PRP,使用0.22μm无菌滤器过滤,收集的滤液为富血小板因子血浆;
(3)富含IL-1Ra条血清的制备:PRP采集后,将剩余血液充分缓慢摇匀,按每3mL血液加入30-60颗的比例加入玻璃采血管中,保证玻璃小珠与新鲜血液充分接触,将装有血液和玻璃小珠的特制采血套装放置于37℃、转速120r/min的恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育24h后,用离心机以3500r/min离心8~10min,将多余的红细胞沉淀去除,最后使用0.22μm无菌滤器过滤上层血清,即得到富含IL-1Ra血清;
(4)富含细胞因子的条件血清:将得到的PRP与富含IL-1Ra血清混合,得到富含细胞因子的条件血清;
(5)采用Elisa试剂盒对制备的富含细胞因子的条件血清进行生长因子和IL-1Ra含量检测。
对比例1
无抗凝剂的普通玻璃采血管+静置培养。
本对比例与实施例1的区别仅在于,步骤(2)中,恒温振荡孵育替换为静置培养。
对比例2
无抗凝剂的普通玻璃采血管+静置培养+玻璃小珠。
本对比例与实施例2的区别仅在于,步骤(2)中,恒温振荡孵育替换为静置培养。
对比例3
无抗凝剂的普通玻璃采血管+静置培养+PRP
本对比例与实施例3的区别仅在于,步骤(2)中,恒温振荡孵育替换为静置培养。
对比例4
无抗凝剂的普通玻璃采血管+静置培养+玻璃小珠+PRP
本对比例与实施例4的区别仅在于,步骤(2)中,恒温振荡孵育替换为静置培养。
实施例5IL-1Ra含量测定
采用Elisa试剂盒对实施例1-4,以及对比例1-4制备的血清中IL-1Ra的含量进行检测;以及采用Elisa试剂盒对实施例3、4,以及对比例3-4制备的血清中PRP含量进行测试。
图2为(实施例1和实施例3和对比例1、对比例3)不加玻璃珠的情况下比较振荡-静置,有PRP-无PRP的情形。
采血后就离心过滤得到的血清IL-1Ra检测值为94.58pg/mL,37℃静置24h后制备得到的血清IL-1Ra检测值为135.8pg/mL,37℃静置24h加PRP后制备得到的血清IL-1Ra检测值为108.43pg/mL,单独的PRP的IL-1Ra检测值为171.31pg/mL,即含量都非常低,接近于无。
37℃下120r/min摇床振荡24h后制备得到的血清IL-1Ra检测值为1683.13pg/mL,37℃下120r/min摇床振荡24h后加入PRP制备得到的血清IL-1Ra检测值为1773.17pg/mL,证明摇床振荡的步骤可显著提高血清中IL-1Ra的含量;
图3为(实施例2和实施例4和对比例2、对比例4)加玻璃珠的情况下比较振荡-静置,有PRP-无PRP的情形。
同样的,采血后就离心过滤得到的血清IL-1Ra检测值为180.67pg/mL,单独的PRP的IL-1Ra检测值为171.31pg/mL,即含量都非常低,接近于无。
现有技术加入玻璃珠后37℃静置24h制备得到的血清IL-1Ra检测值为4833.18pg/mL,在现有技术基础上加上120r/min摇床振荡24h后制备得到的血清IL-1Ra检测值为6640.64pg/mL,同样证明摇床振荡的步骤可显著提高血清中IL-1Ra的含量。
加入玻璃珠后37℃静置24h制备得到的含PRP的血清IL-1Ra检测值为5351.19pg/mL,加入玻璃珠后37℃加上120r/min摇床振荡24h制备得到的含PRP的血清IL-1Ra检测值为13157.65pg/mL,在玻璃珠、摇床振荡、PRP三种促进因素的共同作用下,IL-1Ra的含量出现巨大增长。
试验结果表明:
实施例1(无抗凝剂的普通玻璃采血管与新鲜血液混合,37℃摇床振荡24小时后,离心提取上层血清,用0.22μm无菌滤器过滤后)得到无玻璃溶解物残留的安全性更高的富含IL-1Ra的条件血清。
实施例3的方法制备的血清同时包含PRP与IL-1Ra,能够同时达到修复组织损伤、恢复功能、治疗发炎和退化的功效的目的,且在同一个血样中完成PRP和IL-1Ra的分离,操作简便,节约成本,使得PRP和IL-1Ra得到充分富集;
实验采用Elisa试剂盒检测IL-1Ra的含量,与用现有的含玻璃小珠的采血套装与新鲜血液混匀后37℃静置24h提取的富含细胞因子条件血清比较,富血小板因子条件血清一中,IL-1Ra含量由4833.2pg/mL提高到5351.2pg/mL;富血小板因子条件血清二中,IL-1Ra含量由6640.64pg/mL提高到13157.65pg/mL;IL-1Ra含量与空白对照N组和PRP组比较均明显得到提高;如图2。与空白对照N血清组和单纯PRP组比较,富血小板因子条件血清三中,IL-1Ra含量无明显变化;富血小板因子条件血清四中,IL-1Ra含量由1683.13pg/mL提高到1773.17pg/mL;IL-1Ra含量与空白对照N组和PRP组比较均明显得到提高;如图3。
以上数据结果显示了本发明的优点,本发明制备的得到富血小板因子条件血清均可提高IL-1Ra的含量,其中富血小板因子条件血清二可很大程度提高IL-1Ra的含量;将静置的制备方法改为摇床可明显提高富血小板因子条件血清中IL-1Ra的含量,得到同时包含生长因子和IL-1Ra的富血小板因子条件血清。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种富含细胞因子的条件血清的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、将新鲜血液装入采血管,充分摇匀;
S2、将步骤S1装有新鲜血液的采血管放置于恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育,然后离心,将红细胞沉淀去除,收集上清液一;
S3、将上清液一用无菌滤器过滤,收集滤液一,获得富含细胞因子的条件血清一;
或,
A、将新鲜血液装入采血管,充分摇匀;
B、将步骤A装有新鲜血液的采血管进行低速离心使血液分层,吸取收集上清中的PRP层,获得PRP粗提液,剩余血液置于采血管备用,将所述PRP粗提液进行冻融处理后离心,收集PRP上清液,无菌过滤后,收集的滤液为富血小板因子血浆;将装有剩余血液的采血管放置于恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育,然后离心,将红细胞沉淀去除,收集上清液二;
C、将上清液二用无菌滤器过滤,收集滤液二,将步骤B所述富血小板因子血浆和所述滤液二混合,获得富含细胞因子的条件血清二。
2.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于:步骤S1或步骤A中,所述采血管中不添加抗凝剂。
3.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于:步骤S1中,在所述采血管中,加入无菌玻璃小珠。
4.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于:步骤B中,装有剩余血液的采血管中加入无菌玻璃小珠,然后放置于恒温摇床培养箱内,恒温振荡孵育,然后离心,将红细胞沉淀去除,收集上清液二。
5.根据权利要求3或4所述制备方法,其特征在于:无菌玻璃小珠按每3mL血液加入30-60颗的比例加入采血管中。
6.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于:步骤S2或步骤B中,所述恒温振荡孵育的条件为35-38℃;转速为60-120r/min,振荡孵育的时间为12-24h。
7.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于:步骤B中,所述低速离心的条件为,离心力为500×g~800×g,离心时间为7-9min。
8.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于:步骤B中,所述冻融处理为-80℃-210℃环境下冷冻12-24h后,解冻融化。
9.一种如权利要求1所述的方法制备的条件血清。
10.一种如权利要求9所述的条件血清在制备炎性关节炎及其他由创伤、炎症、感染、退化因素引起的炎性疾病的药物中的应用。
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