CN104962497B - 一种抗柑橘溃疡病菌的双氮养弧菌菌株 - Google Patents

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Abstract

一种抗柑橘溃疡病的双氮养弧菌(Vibrio diazotrophicus)T24菌株，已于2015年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015221。本发明菌株T24的发酵液对柑橘溃疡病菌具有抑制作用，利用针刺法测得其无菌发酵液对柑橘溃疡病菌体外抑制率达到90％以上。

Description

一种抗柑橘溃疡病菌的双氮养弧菌菌株
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗柑橘溃疡病菌的双氮养弧菌菌株，具体涉及一种双氮养弧菌(Vibriodiazotrophicus)T24菌株，同时还涉及该菌株T24在防治柑橘溃疡病菌方面的应用。
背景技术
柑橘是一种亚热带常绿果树品种，其产量和种植面积在全球的水果当中位列第一，分布于热带和亚热带一些气候适宜的国家和地区。从柑橘产量上来看，北半球几乎占据了一半的产出量，而南半球则占据了大约32％的供应量，其余的部分是来自于地中海沿岸。热带和亚热带区域，发展中国家的产量占到总产额的65％。2007年，在柑橘生产大国巴西和美国等一些国家的带领下，全球的柑橘产量以及栽培面积分别达到1.2亿吨和832万公顷，总量占全球水果总产量的20％，其贸易额和产量仅次于玉米和小麦，成为世界第三大贸易农产品。
柑橘栽培在中国已经拥有几千年的历史，不仅栽培面积广，而且种植的品种非常多。在我国的福建、广东、广西、云南、湖南等一些南方城市大多都大面积的种植着橙类(如纽荷尔、朋娜等)、宽皮桔类、柚类(如沙田柚、葡萄柚等)等品种。尤其是近几年来中国的柑橘产业迎来跨越式的发展，已经成为柑橘产量位居世界第一的生产大国。
在享受柑橘产业辉煌发展的成果的同时，我们也应该重视柑橘生产过程中遇到的影响柑橘产量和品质的一些生物方面和非生物方面的因素，并且要采取相应的积极防御的措施。虫害和病害是植物种植过程中遇到的最多的问题，也是影响收成的或大或小的威胁因子，如柑橘种植中有一种被农业部列入检疫性有害生物名录的重要病害，也是全球的检疫对象的对柑橘产业具有毁灭性影响的三大病害之一，即由Xanthomonasaxonopodispv.Citri引起的柑橘溃疡病(Citrusbacterialcankerdisease)。该病不仅影响着柑橘的品质，更是大大的影响着柑橘的产量，成为柑橘种植中的一个世界性难题。
随着社会的发展进步，市场需求的逐渐扩大，以及竞争压力地不断增加，柑橘产业得以迅猛发展。但由于对一些感病品种的栽培缺乏行之有效地管理，柑橘病害的严重性逐渐递增也随之成为一种必然的趋势，如何及时采取合理有效的措施进行管理与防治，对推进柑橘种植这一支柱性产业具有非常重大和深远的意义。以往防治柑橘溃疡病大都采用化学方法为主，近年来，生物防治因其各方面的优势受到大家的关注，研究生物防治的学者越来越多，利用生物防治的方法来对付柑橘溃疡病具有很大的潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种双氮养弧菌(Vibriodiazotrophicus)T24菌株，为柑橘溃疡病菌的生物防治提供新的微生物资源。
本发明所述的双氮养弧菌T24(Vibriodiazotrophicus)T24菌株，已于2015年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2015221。
本发明菌株T24的特性：
1、培养学方面的特性
本发明的菌株T24于30℃在LB平板上呈乳白色不透明菌落，无光泽，边缘不规则，菌落看上去比较干燥平坦，正面没有突起，见图1。
2、形态学方面的特性
菌体为革兰氏染色阴性，有鞭毛(图2)，无荚膜，无芽孢，菌体呈细长的杆状。
3、生理生化特征
淀粉水解：阴性；纤维素分解：阴性；甲基红(M.R.)：阳性；乙酰甲基甲醇(V.P.)：阳性；过氧化氢酶：阴性；明胶液化：阳性；产硫化氢：阴性；硝酸盐还原：阳性；吲哚：阴性。
本发明菌株T24的鉴定：
1、本发明菌株T24的Biolog鉴定
采用的是快速鉴定微生物的Biolog微生物鉴定***，具体步骤参照Biolog公司的MicroLogTMSystem的指导手册。
1)、平板选择：针对菌株T24选择BiologGN2板
样品制备：将在固体培养基上培养好的菌株T24接种于Biolog接种液(GN/GP-IF)中，控制好适宜的浓度，使接种浊度为52％T；
2)、加样：取一定体积的菌液(150ul/孔)，平行加入BiologGN2板各孔中(共96孔)；
3)、培育与读数：放置于30℃恒温箱中恒温培育4-6h，即可进行第一次读数，16-24h可进行第二次读数，对于在4-6小时读取的结果，SIM值必需≥0.75才是可以接受的结果。在16-24小时培养后读取结果时，SIM值必需≥0.5才是可以接受的结果。本菌株T24的鉴定结果如下表1：
表1菌株T24的Biolog鉴定结果
物种 可能性 相似性 位距 类型
＝〉1)双氮养弧菌 84 0.548 5.39 GN-NENT OXI+
2)哈氏弧菌 13 0.077 6.04 GN-NENT OXI+
3)辛辛那提弧菌 3 0.015 6.57 GN-NENT OXI+
4)气单胞菌组10 0 0.000 7.75 GN-NENT OXI+
5)梅氏弧菌 0 0.000 7.84 GN-NENT OXI-
6)弗尼斯弧菌 0 0.000 8.09 GN-NENT OXI+
7)河流孤菌 0 0.000 8.68 GN-NENT OXI+
8)中间气单胞菌组5B 0 0.000 8.70 GN-NENT OXI+
9)豚鼠气单胞菌组4 0 0.000 9.00 GN-NENT OXI+
10)鳗利斯顿氏菌 0 0.000 9.14 GN-NENT OXI+
提取本发明菌株的细菌基因组DNA，16SrDNA片段采用通用引物27F/1492R进行PCR扩增，扩增片段由铂尚生物技术(上海)有限公司测序，测得的序列于NCBI上进行同源性比较。结果显示其16SrDNA序列与双氮养弧菌同源性最高，达到99％以上。经Biolog检测，本菌株T24与Vibriodiazotrophicus相似性为0.548，远大于其它菌株相似度，符合鉴定条件。通过形态观察和ITS序列分子鉴定，确定本发明菌株为双氮养弧菌(Vibriodiazotrophicus)的一新种，命名为双氮养弧菌(Vibriodiazotrophicus)T24菌株。
将本发明菌株T24以4-5％接种重量接入LB液体培养基中发酵培养可制得发酵液，发酵培养条件为：温度28-37℃、pH6.5-7.5、时间24-36h及转速180-200r/min，最佳发酵培养条件为：温度30℃、pH7.0、时间24h及转速180r/min。该发酵液对柑橘溃疡病菌具有抑制作用，利用局部病斑法测得其无菌发酵液对柑橘溃疡病菌体外抑制率达到90％以上。
因此，本发明菌株T24能有效抑制柑橘溃疡病菌，为柑橘溃疡病菌的生物防治提供新的微生物资源；且本发明通过生理生化检测、Biolog微生物鉴定***以及此菌16SrDNA序列分析均表明此菌为双氮养弧菌中的成员，可以精确的将本发明的T24分类为双氮养弧菌，从而建立了分类鉴定微生物的一种快速(利用Biolog微生物鉴定***，4-6h或16-24h即可得到鉴定结果)、可靠、准确的途径。
附图说明
图1是本发明菌株T24的单菌落图。
图2是本发明菌株T24的鞭毛图。
图3为本发明菌株T24的抑菌图。
图4为本发明菌株T24的发酵液对柑橘溃疡病菌的拮抗效果图。
其中，A：喷有本发明菌株发酵液的叶片；B：清水处理的叶片(对照叶片)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步地详细说明。
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1本发明菌株T24的制备
从湘西自治州龙山县采集土样，每种土样取10g，分别加到装有90ml无菌水(有玻璃珠)的三角瓶中，震荡1h，过滤去沉淀，将菌悬液依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。细菌采用混匀法，真菌和放线菌采用涂沫法进行分离。28℃下LB液体培养基培养48h，选取形态、大小、色泽不同的菌落，进行纯化，斜面培养基保存。
将柑桔溃疡病菌制成菌液与融化的LB固体培养基混匀后倒入灭菌培养皿中，在凝固的凝胶平板上打一孔，将分离得到的菌株分别制成一定浓度的菌悬液，用移液枪取100ul菌液加到相应平板的圆孔中，设3个平行。将标记好的培养皿置于28℃的恒温箱中，每隔24h观察一次抑菌圈的形成情况。选择有拮抗效果的菌株用牛津杯法进行复筛。
实施例2本发明菌株T24对柑橘溃疡病菌的室内抑制作用
将柑桔溃疡病菌制成菌液与融化的LB固体培养基混匀后倒入灭菌培养皿中，在凝固的凝胶平板上打一孔，将分离得到的T24菌株分别制成一定浓度的菌悬液，用移液枪取100ul菌液加到相应平板的圆孔中，设3个平行。将标记好的培养皿置于30℃的恒温箱中，每隔24h观察一次抑菌圈的形成情况。结果形成的抑菌圈直径的平均值在45mm左右，抑菌圈边缘略微***，见图3。
实施例3本发明菌株T24用于柑橘活体上防治柑橘溃疡病菌
挑取本发明菌株T24接种到25mlLB液体培养基中，37℃，180r/min培养24h，得到发酵液。选取生长状况相似的柑橘树3棵，每棵树上选取生长发育程度相似的已完全展开的新叶四片，用已灭菌的接种针将叶片上表皮刺破(每叶20孔)，先用喷雾法将柑橘溃疡病菌喷于叶片上表面及下表面，1d后将制得的本发明菌株T24的发酵液喷于柑橘溃疡病菌处理过的每个处理组中的3片柑橘新叶作为处理，剩余的1叶为对照，对照叶片上不喷本发明菌株的发酵液而喷清水，喷施本菌株T24发酵液一个月后观察发病情况。每棵树为一个处理组，结果见下表2，结合参见图4。
结果显示，3个处理组中对照(CK)均形成柑橘溃疡病典型病斑，而喷施过本发明菌株T24发酵液的叶片的病斑抑制率达到90％以上。
表2本发明菌株T24发酵液对柑橘溃疡病的抑制作用

Claims (8)

1.一种抗柑橘溃疡病的双氮养弧菌(Vibriodiazotrophicus)T24菌株，已于2015年4月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2015221。
2.如权利要求1所述的菌株在抑制柑橘溃疡病菌中的应用。
3.如权利要求1所述的菌株在防治柑橘溃疡病菌中的应用。
4.一种制备抗柑橘溃疡病菌发酵液的方法，其特征在于，该方法是将权利要求1所述的菌株以4-5％接种量接入LB液体培养基中发酵培养。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：温度28-37℃、pH6.5-7.5、时间24-36h及转速180-200r/min。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：温度30℃、pH7.0、时间24h及转速180r/min。
7.如权利要求4-6中任一项所述方法制备的发酵液在抑制柑橘溃疡病菌中的应用。
8.如权利要求4-6中任一项所述方法制备的发酵液在防治柑橘溃疡病菌中的应用。
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